JP2004536573A - 植物における遺伝子発現を調節するための組換えウイルススイッチ - Google Patents

植物における遺伝子発現を調節するための組換えウイルススイッチ Download PDF

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Abstract

本発明は一方では遺伝子導入植物中の異種ＤＮＡ配列及び他方では植物ウイルス遺伝子導入ベクター中の異種ＤＮＡ配列の間の相互作用過程を使用して植物における生化学過程または生化学連鎖を調節する方法を記述している。さらに、この相互作用過程は低分子量成分を必要とする。この相互作用過程はウイルス遺伝子導入ベクターを遺伝子「スイッチ」とするものであり、これは例えば核酸組換え、複製、転写、制限、翻訳、タンパク折り畳み、集合、ターゲティング、翻訳後プロセッシング、または酵素反応のような種々の反応により目的の生化学過程または連鎖のスイッチを入れる。さらに、遺伝子導入植物中における製品の製造方法及びこの方法のための部品のキットが提供されている。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は請求項１に記載したように植物における目的とする生化学的反応または生化学的反応連鎖を調節する方法に関するものである。さらに、本発明は目的とする生化学的反応または生化学的反応連鎖を調節する方法を使用して遺伝子導入植物において製品を生産する方法に関するものである。さらに本発明は本発明を実施するための部品のキットにも関係している。植物ではこれまで実現できなかった目的とする生化学反応または生化学反応連鎖を予定した時期に選択的にスイッチをいれて開始することにより、本発明の方法は遺伝子導入植物において導入遺伝子発現の選択的調節を可能にする。
【０００２】
発明の背景
植物における調節可能な導入遺伝子発現システム
植物バイオテクノロジーにおける大きな問題の一つは導入遺伝子の信頼し得る調節を行なうことである。導入遺伝子発現の結果生じる生成物が、例えば生物分解性プラスチック（Ｎａｗｒａｔｈ， Ｐｏｉｒｉｅｒ ＆ Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９１， １２７６０−１２７６４； Ｊｏｈｎ ＆ Ｋｅｌｌｅｒ， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３， １２７６８−１２７７３； ＵＳ６１０３９５６； ＵＳ５６５０５５５）またはタンパクトキシン（ＵＳ６１４００７５）のように、成長抑制的であるかまたは毒性がある場合には、遺伝子発現の厳密な調節が必須である。
【０００３】
植物における遺伝子発現を調節するための現存する技術は通常組織特異的及び誘導性プロモーターに基づいており、そしてそれらの全ては実際上誘導しないのに存在する、すなわち「漏洩」する発現作用に悩まされている。組織特異的プロモーター（ＵＳ０５９５５３６１； ＷＯ０９８２８４３１）は強力な道具であるが、非常に特異な分野に応用が限られている、例えば、無菌植物の作成（ＷＯ９８３９４６２）または種子における目的遺伝子の発現（ＷＯ０００６８３８８；ＵＳ０５６０８１５２）。誘導性プロモーターはその誘導条件により２種類に分類することが出来る−非生物的因子（温度、光、化学物質）により誘導されるもの及び生物的因子、例えば病原体またはペスト刺激、により誘導し得るもの。最初の分類に属するものは熱誘導性（ＵＳ０５１８７２８７）及び寒冷誘導性（ＵＳ０５８４７１０２）プロモーター、銅誘導系（Ｍｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９０， ４５６７−４５７１）、ステロイド誘導系（Ａｏｙａｍａ ＆ Ｃｈｕａ， １９９７， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １１， ６０５−６１２； ＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １４，２４７−２５７； ＵＳ０６０６３９８５）、エタノール誘導系（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １６， １７７−１８０； ＷＯ０９３２１３３４）、及びテトラサイクリン誘導系（Ｗｅｉｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ５，５５９−５６９）がある。植物における化学誘導系分野の最近の開発例はグルココルチコイド・デキサメサゾンによりスイッチが入り、テトラサイクリンによりスイッチが切れるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １９， ８７−９５）。化学誘導系に関する総説はＺｕｏ ＆ Ｃｈｕａ （２０００， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １１， １４６−１５１）を参照。その他の誘導性プロモーターの例は植物における病原性関連（ＰＲ）遺伝子の発現を調節するプロモーターである。これらのプロモーターはサリチル酸、病原体の攻撃に応答する植物シグナル伝達系の重要な成分、またはＰＲ遺伝子発現を開始することができるその他の化学物質（ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールまたはイソニコチン酸）により植物を処理することにより誘導することが出来る（ＵＳ０５９４２６６２）。
【０００４】
ウイルス感染により供給されるウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを使用する導入遺伝子発現系の調節が報告されている（例えば、ＵＳ６０９３５５４； ＵＳ５９１９７０５参照）。これらの系において、組換え植物ＤＮＡ配列はウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるウイルスゲノムのヌクレオチド配列を含んでいる。これらの系の有効性は、トランスで機能するウイルスポリメラーゼの能力が低く、そしてＲＮＡ増幅以外の過程を調節することが出来ないために限られている。
【０００５】
上記の系は導入遺伝子発現の望ましいパターンを知る手がかりとしては非常に関心があるが、誘導薬（銅）またはその同族体（ステロイド調節系におけるブラシノステロイド）は残余発現を発生させるに充分な濃度で植物組織内に存在し得るので、それらは発現パターンを厳密に調節することは出来ない。さらに、化学誘導物質として抗生物質及びステロイドの使用は大規模に適用するには好ましくない。導入遺伝子調節手段としてＰＲ遺伝子またはウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合には、偶発的病原体感染またはストレスにより発現を生じることがあるので、導入遺伝子の厳密な調節の条件はやはり充たされていない。組織または器官特異的プロモーターは、その発現が特異な器官または植物発生の時期に限られるので、非常に狭い分野に応用が限られており、また望む時に導入遺伝子のスイッチを入れることが出来ない。
【０００６】
応用植物ウイルス学分野における植物ウイルスベクター及びその使用
現在応用植物ウイルス学の領域に大きな３つの異なる分野がある：ａ）導入遺伝子の過剰発現用ベクターとしてウイルスの使用；ｂ）植物機能ゲノム用ベクターとしてウイルスの使用；及びｃ）ウイルス抵抗性遺伝子導入植物作成のための植物病理学分野におけるウイルス成分の使用。
【０００７】
植物ウイルスは宿主植物種における導入遺伝子の高レベル発現のための有用な道具として使用することが出来る。野外における植物ウイルスの使用による生物安全性上の問題は無いようである。例えば、ＵＳＤＡ（米国農務省）の動植物検疫部局は医薬品用の異種遺伝子を含む遺伝的に修飾したＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）及びタバコエッチウイルスの野外試験の後に明らかな問題を観察しなかった。その結果として、１９９６年及び１９９８年に２つは許可された。発現を目的として植物宿主に外来遺伝物質を導入するためのウイルスベクターを開発する分野で仕事は行なわれた（ＵＳ４８８５２４８； ＵＳ５１７３４１０）。植物において遺伝子導入物質を全身的に発現するのに適した最初のウイルスベクターを記載した特許がある（ＵＳ５３１６９３１； ＵＳ５５８９３６７； ＵＳ５８６６７８５）。一般的に、ウイルスタンパクとの翻訳融合体として（ＵＳ５４９１０７６； ＵＳ５９７７４３８）またはドイツ特許出願番号１００４９５８７．７に対応する付属文書Ａに記載した独立タンパク翻訳用ＩＲＥＳ配列を使用する、ここにも使用されている、ポリシストロン性ＲＮＡの翻訳融合体として、これらのベクターは他のサブゲノムプロモーター（ＵＳ５４６６７８８； ＵＳ５６７０３５３； ＵＳ５８６６７８５）の外来遺伝子を発現することが出来る。Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （ＵＳ５４９１０７６）はウイルスポリプロテインから異種タンパクを切り離すために内在性ウイルスタンパク分解酵素を使用することを記述している。ウイルスベクターを応用するその他の領域は植物機能ゲノムである。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．， （ＷＯ９９３６５１）は内在性遺伝子を抑制する目的で植物ｃＤＮＡライブラリー発現用のＴＭＶ由来ウイルスベクターの使用を記述している。
【０００８】
Ａｎｇｅｌｌ ＆ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ （１９９７， ＥＭＢＯ Ｊ， １６， ３６７５−３６８４； ＷＯ９８３６０８３）は植物における標的遺伝子の下方調節用に設計した「ＡｍｐｌｉｃｏｎＴＭ」と呼ばれるＰＶＸ由来のシステムを記述している。植物において導入遺伝子抑制をはずすＨｃ−Ｐｒｏと組合わせた同じシステム（Ｐｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ９， ８５９−８６８； ＵＳ５９３９５４１）が導入遺伝子の過剰発現のために使用されている。ＵＳ特許５９３９５４１は植物におけるいずれの遺伝子の発現も増強するためにポチウイルスの５’中心領域（Ｈｃ−Ｐｒｏ遺伝子を含むブースター配列）を使用することに基づく方法を記述している。この配列は植物ゲノムの中に安定的に組込むことができ、またはウイルスによって送り込むことができる。Ｈｃ−Ｐｒｏは明らかな多面的効果を有し、そして導入遺伝子及び内在性遺伝子の両者の発現を増強することは注目に値する。したがって、この発現系は存在する方法の中では全タンパク発現について最善の量的改良を提供する。それらは未知の機序によりまた調節が困難な方法でタンパク製造装置の多くの要素に影響している。
【０００９】
ウイルス遺伝子またはウイルスＲＮＡの突然変異型の発現によるウイルス抵抗性植物の設計を記述した特許出願を含む文献は大量にある（例えば、ＵＳ５７９２９２６； ＵＳ６０４０４９６）。攻撃ウイルス及び導入ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの間に生じる組換えによる新規ウイルス形成の可能性があるためにそのような植物の使用による環境リスクに言及することは意味がある（Ａｄａｉｒ ＆ Ｋｅａｒｎｅｙ， ２０００， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ， １４５， １８６７−１８８３）。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、予定した時期に選択的に過程または連鎖のスイッチを入れることにより、植物中の目的の生化学的過程または生化学的連鎖を調節する環境に安全な方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、環境に対して安全でそして潜在的に有害な機能の導入遺伝子を環境に放出しない方法によって、植物が望ましい段階まで成長した後に選択的に生成物の生産にスイッチを入れることができる遺伝子導入植物中において生成物を生産する方法を提供することである。
【００１２】
その他の本発明の目的はそのような方法を実施するためのキットを提供することである。
【００１３】
発明の一般的な説明
これらの目的は請求項１に記述した方法により達成される。より特異的には、これらの目的は、植物中における目的とする生化学過程または生化学連鎖を調節する方法により達成され、該方法は以下の段階を含むことが特徴である：
（ａ） 植物の核ゲノム中に一つまたはそれ以上の第一異種ＤＮＡ配列を導入する、
（ｂ） 自身のゲノム中に一つまたはそれ以上の第二異種ＤＮＡ配列を含む少なくとも一つのウイルス導入ベクターに植物を感染させる、このようにして植物中において下記の間の相互作用過程を開始し
（ｉ） 核ゲノムの一つまたはそれ以上の第一異種ＤＮＡ配列及び／または第一異種ＤＮＡ配列の発現生成物、及び
（ｉｉ） 遺伝子導入ベクターの一つまたはそれ以上の第二異種ＤＮＡ配列及び／または第二異種ＤＮＡ配列の発現生成物、及び
（ｉｉｉ） さらに外部から加えた一つまたはそれ以上の低分子量化合物、
このようにして該相互作用の以前には生じなかった目的の生化学過程または連鎖のスイッチを入れる。望ましくは、上記方法における該第一異種ＤＮＡ配列は非植物ウイルス起源のものである、すなわち植物ウイルスに由来しない。
【００１４】
さらに本発明は、本発明に従って植物中の目的とする生化学過程または生化学連鎖を調節する方法を含む遺伝子導入植物における生成物の生産方法を提供する。特に、この方法はさらに以下の段階を含む：
（ａ） 遺伝子導入植物を望む段階に成長させる、次いで
（ｂ） 一つまたはそれ以上のベクターに植物を感染させ、そして追加して一つまたはそれ以上の低分子量化合物と接触させて、該過程または連鎖は該相互作用の以前には作動しない、生成物を生産するために必要な生化学過程または連鎖のスイッチを入れ、そして
（ｃ） 植物中で生成物を生産する、
この該ベクターは望ましくはウイルストランスフェクションベクターである。
【００１５】
さらにその遺伝子導入植物または種子及びウイルス由来ベクターを含む上記方法に使用するキットが提供される。また、遺伝子導入植物及び、一つまたはそれ以上のウイルストランスフェクションベクターを植物中において発生することができる、一つまたはそれ以上のベクターを含むキットが提供される。該遺伝子導入植物は本発明の段階（ａ）の第一異種ＤＮＡ配列を含むことが望ましい。
【００１６】
さらに、本発明の方法の段階（ｂ）を実施するためのベクター及び本発明の方法により得たまたは得られる植物が提供される。
【００１７】
本発明により、一つまたはそれ以上のウイルストランスフェクションベクターに遺伝子導入植物を感染させることにより遺伝子導入植物における生化学過程または生化学連鎖に選択的にスイッチを入れることが可能である。生化学過程または連鎖は、生化学過程または連鎖を行なうために必要な必須配列または機能が欠如しているためにウイルスベクターに感染する以前には遺伝子導入植物中において作動しない。必須配列は、例えば、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ、転写因子などである。必須機能は、例えば、発現すべき下流配列とプロモーターの機能的結合が欠如しているために作動しない転写、翻訳または酵素作用である。生化学過程または連鎖は感染により開始する相互作用の過程により作動するようになる。植物内における相互作用の過程は、核ゲノムの一つまたはそれ以上の第一異種ＤＮＡ配列及び／または第一異種ＤＮＡ配列の発現生成物、及びトランスフェクションベクターの一つまたはそれ以上の第二異種ＤＮＡ配列及び／または第二異種ＤＮＡ配列の発現生成物、及びさらに一つまたはそれ以上の外部から加えた低分子量化合物を必要とする。望ましくは目的とする生化学過程または連鎖にスイッチを入れる相互作用過程は一つの核ゲノムの第一異種ＤＮＡ配列及び／または第一異種ＤＮＡ配列の発現生成物、及び一つのトランスフェクションベクターの第二異種ＤＮＡ配列及び／または第二ＤＮＡ配列の発現生成物を必要とする。
【００１８】
本発明に従って使用されるＤＮＡ配列はＲＮＡ配列を使用することにより得ることも出来る。特に、段階（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列はＲＮＡ配列の、例えばＲＮＡウイルスの、発現生成物のこともある。
【００１９】
相互作用の過程に必要な第一及び第二異種ＤＮＡ配列または第一及び第二異種ＤＮＡ配列の発現生成物のいずれか一つが存在しない場合には、第一及び第二異種ＤＮＡ配列、第一及び第二異種ＤＮＡ配列の発現生成物または外部から加えた低分子量化合物のどれも、単独または組合せで、目的の生化学過程または連鎖のスイッチを入れることができない。さらに、目的の生化学過程または連鎖は、低レベルでは作動し続けることができる転写後遺伝子抑制のような機序による抑制過程ではない。目的の生化学過程または生化学連鎖は対応するウイルストランスフェクションベクターの感染の以前及び低分子量化合物の追加以前には作動しない。さらに、本発明のウイルストランスフェクションベクターは本発明に必要な対応する第一異種ＤＮＡ配列を持たない植物においては目的の生化学過程または生化学連鎖のスイッチを入れることはできない。最後に、目的の生化学過程または連鎖は、本発明の目的の過程または連鎖にスイッチを入れるのに必要な第一及び第二異種ＤＮＡ配列または発現生成物が存在しない場合には、植物を低分子量化合物と接触させても植物においてスイッチを入れることができない。
【００２０】
本発明の方法はこれまで達成できなかった精度と環境安全性をもって生化学過程または連鎖の調節を提供する。これによる植物バイオテクノロジーにおける新規な応用は、その植物における基礎的導入遺伝子発現作用を必要とする従来の技術では、特に毒性物質または生物分解性ポリマーの製造の際に、解決できない問題を解決するのに有用である。
【００２１】
さらに、本発明による正確な調節は、植物の成長を遅延させる基礎的発現作用による植物に対する負荷をかけることなく、目的の生化学過程または連鎖を開始するのに適した望ましい段階まで遺伝子導入植物を成長させることを可能にする。一度目的の生化学過程または連鎖を有効に実施する準備が整えば、目的の生化学過程または連鎖のスイッチを入れ、そして効率よく実施する。したがって、本発明の方法は遺伝子導入植物の成長期と生産期を分離することを可能にする。
【００２２】
さらに、一つまたはそれ以上の過程または連鎖のスイッチを選択的に入れることができるような、目的とする多数の過程または連鎖に対する多成分システムを設計することが可能である。
【００２３】
最初の態様において、システムは、ウイルストランスフェクションベクターによりコードされる目的生成物の発現を調節するのに必要な発現生成物を提供する異種ＤＮＡ配列を含む遺伝子導入植物からなる。このシステムはさらに遺伝子導入植物内において発現される異なる生成物をそれぞれコードする異なるウイルスベクターを含んでいる。したがって、使用したウイルスベクターによって異なる生成物の生産に同一の遺伝子導入植物を安全に使用することが可能である。ウイルスベクターの調製は数週間で行なえるが、安定した遺伝子導入植物を得るには数年を要することを考慮するとこのシステムの利点は明らかである。
【００２４】
第二の態様において、遺伝子導入植物は、目的とする種々の遺伝子産物をコードする多数の異種ＤＮＡ配列を含んでいる。多数の異種ＤＮＡ配列は異なるウイルスベクターにより調節することができる。したがって、対応するウイルスベクターを選択することにより、遺伝子導入植物の異種ＤＮＡ配列を選択的に調節することが可能である。
【００２５】
さらに、第三の態様において、目的とする生化学過程または連鎖にスイッチを入れる相互作用過程が１以上のウイルスベクターによる感染及び一つまたはそれ以上の外部から加えた低分子量成分の追加適用を必要とするようなシステム、これにより本技術が安全に作動する、を設計することが可能である。
【００２６】
本発明により調節される生化学過程または連鎖は生きた植物系において行われる過程または連鎖のいずれでも良い。望ましい生化学過程または連鎖は植物中において製品の生産に至るものである。本発明の方法により得られる目的の製品の例は、一次産物としてのポリペプチドまたはタンパク、（翻訳後）修飾またはその他の処理を受けた酵素のようなタンパク、必要な糖化様式のタンパク、非タンパク性低分子量産物及び炭水化物または生物分解性プラスチックのようなオリゴマー生成物などである。最も望ましいのは医薬用ポリペプチドである。
【００２７】
該生化学過程または連鎖、特にタンパクの発現はサブゲノムＲＮＡ、特にウイルストランスフェクションベクターの生成を必要とするであろう。
【００２８】
生化学過程または連鎖の調節方法には少なくとも次の２成分が必要である：
（１）望ましくは植物ウイルス由来でない第一異種ＤＮＡ配列を含む遺伝子導入植物及び
（２）第二異種ＤＮＡ配列を含むウイルストランスフェクションベクター。
【００２９】
本発明の目的には、異種ＤＮＡ配列は、使用した植物種中に天然には存在しないしまたウイルスベクターの起源である野生型ウイルス中にも存在しない配列である。しかし、その配列は異種部分の他に使用した植物及び／またはウイルスが元来持つ配列部分を含んでいるであろう。該異種ＤＮＡ配列は１以上の機能配列を含んでいるであろう。そのような機能配列の例としてはプロモーター、エンハンサー、転写終結領域、コード領域、非翻訳スペーサー領域、翻訳開始領域、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）領域、停止コドンなど、及びそれらの部分がある。
【００３０】
該第一異種ＤＮＡ配列は該宿主植物に対して異種であることが望ましい。該第一異種ＤＮＡ配列はウイルス由来であろう。しかし、望ましくは該第一異種ＤＮＡ配列は非植物ウイルス由来である、すなわち植物ウイルス起源でない。該第二異種ＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列はウイルスベクターが由来したウイルスに対して異種であることが望ましい。該第二異種ＤＮＡ配列は植物由来であろう。
【００３１】
遺伝子導入植物（１）のウイルスベクター（２）による感染により少なくとも該第一及び第二異種ＤＮＡ配列またはその発現生成物の相互作用過程を開始し、これにより目的の生化学過程または連鎖のスイッチがはいる。少なくとも二つの要素（１）及び（２）が必要であるという事実は、該要素の相互作用が該生化学過程または連鎖のスイッチを入れるための必要条件であることを意味している。該相互作用の以前には、該生化学過程は作動せず、それによる導入遺伝子の「漏洩」発現は起こり得ない。先行技術では、導入遺伝子の発現は、低いレベルであるが既に存在する発現を量的に増加または増強することによってのみ誘導することができる。本発明は量的な増加のみならず、従来作動させることができなかった過程または連鎖を作動するようにする質的変化も提供する。目的の生化学過程または連鎖が、毒性があったり成長抑制がある産物を生成する場合には、本発明の利点が特に重要である。本発明によれば、植物の成長と、該生成物の生産を完全に分離することが可能であり、それにより成長しつつある植物における目的産物の存在による成長の阻害及び遅延を回避する。したがって、バイオマスの蓄積段階及び目的産物の生産段階は分離することができる。
【００３２】
本発明の遺伝子導入植物及び遺伝子導入ベクターは、対応する異種ＤＮＡ配列を含まないウイルスまたは植物のいずれでも生化学過程または生化学連鎖の調節機能を持たない。したがって、本発明は植物バイオテクノロジーにおける生物学的安全性に関して著しい進歩を示している。
【００３３】
遺伝子導入植物のウイルスベクターによる感染で開始し、そして生化学過程のスイッチを入れることになる該相互作用過程は、ＤＮＡ組換え、ＤＮＡ複製、転写、制限、結合、ハイブリダイゼーション、ＲＮＡ複製、逆転写、ＲＮＡプロセッシング、スプライシング、翻訳、タンパク折り畳み、集合、ターゲティング、翻訳後プロッセシング、酵素作用である。該第一または該第二異種ＤＮＡ配列の該発現産物はＲＮＡ，特にｍＲＮＡ，及びポリペプチドまたはタンパクである。
【００３４】
該第一及び該第二異種配列（及びさらに追加の配列）間の該相互作用過程はウイルス機能または感染性ウイルスベクターの相補性（遺伝子の再構築）を含まないことが望ましい。
【００３５】
本発明は望ましくは多細胞植物に関するものである。重要な植物種の例はコムギ、トウモロコシ、コメ、オオムギ、エンバク、アワなどの単子葉植物またはアブラナ、キャノーラ、テンサイ、ダイズ、エンドウ、アルファルファ、ワタ、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、タバコなどの双子葉植物である。これらの植物のそれぞれに特異的なウイルスが存在することが本発明の広範な多能性と応用性に役立ている。本発明に使用されるウイルストランスフェクションベクターは植物特異的ウイルスのいずれかから誘導することができる。ウイルスベクターはＲＮＡ又はＤＮＡ二本鎖又は一本鎖ウイルスに基づいている。ウイルストランスフェクションベクターの特異的例は下記及び付属文書Ａ及び付属文書Ｂに示されている。
【００３６】
段階（ａ）において、植物は天然植物または遺伝子を修飾された植物であり得る。遺伝子修飾は植物の核ゲノムかまたは色素体のような細胞小器官ゲノムまたはミトコンドリアゲノムのいずれかの中に存在する。段階（ａ）において異種配列は核ゲノム中に導入され、そして望ましくは適当なゲノム修飾が施される。段階（ａ）は１以上の異種ＤＮＡ配列を導入するために１回以上行なうことができる。このようにして、例えば生化学経路全体を操作するために、いくつかの異種機能を標的植物に導入することができる。
【００３７】
段階（ｂ）において、段階（ａ）により得られた遺伝子導入植物をウイルストランスフェクションベクターに感染させる。感染は植物に集合ウイルス粒子または感染性ウイルス核酸を与えることにより、または予め植物ゲノム内に組込んでおいたウイルス核酸の放出によるトランスフェクション過程の活性化により行なうことができる。集合ウイルス粒子はＲＮＡを含むことができ、そして感染性ウイルス核酸はＲＮＡであり得る、特にそれらがＲＮＡウイルス由来であるならば（例２及び３参照）。
【００３８】
１以上のベクターを目的の生化学過程または生化学連鎖を調節するために使用することができる。方法の再現性の理由から、必要な異種配列を含む一つのベクターのみを使用することが望ましい。感染はウイルスベクターと該遺伝子導入植物を接触させることにより行なう。望ましくは、葉またはその他の植物組織をこすったりまたは引っかいたりするような機械的刺激を感染促進のために使用することができる。感染は宿主植物のゲノムの中に予め組込んでおいたウイルスベクターを活性化させることにより行なうこともできる。植物全体を感染することができるウイルスベクターが望ましい。
【００３９】
段階（ｂ）における植物の感染は、該植物の細胞中への核酸配列のアグロバクテリウム介在輸送を含んでいる。アグロバクテリウム介在輸送は、例えば宿主植物のゲノム中に配列を組込むために使用することができる。ウイルスベクターは植物ゲノム中に組込まれたそのような配列から活性化することができる。ＲＮＡウイルス由来のベクターは、例えば該ウイルスのｃＤＮＡコピーを転写する、特にゲノムの中に組込まれたｃＤＮＡコピーを転写することにより活性化することができる。しかし、アグロバクテリウム介在輸送により植物細胞中に導入された配列の組み込みはゲノム中に組込む必要はない。アグロバクテリウム介在輸送はＴ−ＤＮＡに隣接する遺伝子の一過性発現を生じることができる。特に、Ｔｉ−プラスミド上にある配列はゲノムに組込まれること無くまたはそれ以前に本発明の方法における機能を発揮することができる。もし１以上のベクターが段階（ｂ）において導入されるならば、同一または異なる方法をこれらのベクターに対して使用することができる。特に、１以上のベクターを、異なるアグロバクテリウム株を同時に（例えば、アグロバクテリウム混合物を使用して）または続けて使用するアグロバクテリウム介在輸送により導入することができる。
【００４０】
本発明の一態様において、本発明の方法の段階（ｂ）において該ウイルス感染ベクターに加えてその他のベクターを導入することができる。該その他のベクターはウイルストランスフェクションベクターのこともありまたはそうでないこともある。該その他のベクターは本発明の該生化学過程のスイッチを入れるための必要条件としてのその他の核酸配列となり得るものである（例６参照）。
【００４１】
本発明のその他の態様において、段階（ｂ）における植物の感染は該植物の細胞中に１またはそれ以上のベクターを導入することにより行われる、これによって該ベクターは該植物の細胞中におけるウイルストランスフェクションベクターを発生させる過程を進行させられるようになる。この態様において３、４またはそれ以上のベクターを該植物の細胞中に導入することができる。望ましくは、２ベクターが導入される。該ベクターはウイルストランスフェクションベクターでもあるし、またはそうでないこともある。望ましくは、該ベクターの少なくとも一つはウイルストランスフェクションベクターである（例６参照）。しかし、この態様の方法にしたがうと、ウイルストランスフェクションベクターはウイルストランスフェクションベクターでない導入ベクターから発生させることもできる。該生化学過程または経路は、本発明の方法の段階（ａ）及び（ｂ）により開始する該過程により植物細胞中にウイルストランスフェクションベクターが集合及び出現することによりスイッチが入る。
【００４２】
本発明の方法の段階（ａ）及び（ｂ）は同一の植物で行うことができる。しかし、安定した植物系は、少なくとも一つの目的の第一異種ＤＮＡ配列は段階（ａ）により導入された植物から従来の方法に従って得られことが望ましい。次いで遺伝子導入植物は安定した遺伝子導入植物の種子から成長させ、そして該生化学過程の開始が必要な時期に段階（ｂ）による感染を行なうことができる。段階（ｂ）は温室内で実施することが望ましい。
【００４３】
ウイルストランスフェクションベクターは核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）または核タンパクであり、これらは野生型または遺伝子操作宿主に侵入して該宿主の細胞中で複製または増幅することができ、そして目的の異種配列の増幅及び／または発現をすることができる。望ましくは、該ウイルストランスフェクションベクターはさらに細胞から細胞へ移動することができる。さらに望ましいのは、ウイルスベクターは長距離移動、ウイルス粒子の構築または感染性のようなウイルスの能力を保持していることである。本発明の方法において、ウイルスベクターは上記性質の全ては保有しないが、そのような機能は宿主細胞に関連する別の場所に提供することができる。望ましいウイルストランスフェクションベクターは移動タンパクをコードしそして発現する。さらに、それらはウイルス特異的ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）をコードしている；ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）が望ましい。
【００４４】
本発明の最初の特異的態様において、目的の生化学過程は目的の異種ＤＮＡ配列の発現である。この過程は一次生化学過程と呼ぶことができる。この一次過程によりＲＮＡまたはポリペプチド分子を生じる。単純な場合には、ＲＮＡまたはポリペプチド分子の一つが目的の生産物である。生化学連鎖において、その一次過程の産物が、例えば、その触媒作用により、または他の生化学過程を調節することにより二次生化学過程を生じ、そのような各過程が先行する生化学過程に依存する１以上の生化学過程が発生する。この態様において該調節またはスイッチは望ましくは該一次生化学過程を指向している。
【００４５】
最初の特異的態様において、発現される目的の異種ＤＮＡ配列は植物核ゲノムの第一異種ＤＮＡ配列であるかまたは該ウイルストランスフェクションベクターの第二異種ＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列のいずれかであり得る。
【００４６】
本発明の第二の特異的態様において、目的の生化学過程はその植物による目的の非タンパク性化合物の生産である。
【００４７】
本発明のその他の特異的態様において、植物における生化学過程（ＩＩ）または生化学連鎖（ＩＩＩ）の調節過程が提供され、該過程は以下の段階を含むことが特徴である：
（ａ） 植物の核ゲノム中へ１またはそれ以上の第一異種核酸配列の導入、
（ｂ） そのゲノム中に１またはそれ以上の第二異種核酸配列を含む少なくとも１つのベクターによる植物の感染、
こうして下記の間の相互作用の過程（Ｉ）を開始し
（ｉ） 核ゲノムの１またはそれ以上の第一異種核酸配列及び／または第一核酸配列の発現産物、および
（ｉｉ） トランスフェクションベクターの１またはそれ以上の第二異種核酸配列及び／または第二異種核酸配列の発現産物、及び
（ｉｉｉ） 追加の１またはそれ以上の外部から加えた低分子量成分、
これによりウイルストランスフェクションベクターが該植物の細胞中に発生し、こうして該相互作用の以前には作動しない目的の生化学過程（ＩＩ）または生化学連鎖（ＩＩＩ）のスイッチが入る。
さらに、本段階の特異的態様は、適用可能な場合は、上記した通りである。
【００４８】
発明の詳細な説明
図１Ａに示すように、本発明は植物中における目的の生化学過程または生化学連鎖を調節する方法を提供し、これによる方法は相互作用の過程（Ｉ）、目的の生化学過程のスイッチを入れ（ＩＩ）、その過程は翻って目的の生化学連鎖の原因となり得る（ＩＩＩ）。相互作用の過程は続くＤＮＡ，ＲＮＡ及びタンパクの反応またはそれらの組合せのいずれか一つを含んでいる。本発明に包含されるＤＮＡ反応は制限、組換え、複製、転移、増幅、及び転写である。本発明に包含されるＲＮＡ反応はＲＮＡプロセッシング、複製、逆転写、ハイブリダイゼーション、及び翻訳である。本発明に包含されるタンパク反応はタンパクプロッセシング、折り畳み、集合、翻訳後修飾、活性化、ターゲティング、結合活性修飾、シグナル伝達である。過程（ＩＩＩ）はある場合もあり、無い場合もある。製品の生産は本発明の方法の望ましい結果である。
【００４９】
図１Ｂに示すように、相互作用の可能な過程は図に示された相互作用の１またはそれ以上の形に属するであろう。図の中では、ウイルストランスフェクションベクターに感染した遺伝子導入植物細胞は図形化して示されている。組換え植物ゲノムは、１またはそれ以上の発現産物を生じることになる１またはそれ以上の異種ＤＮＡ配列を含んでいる。ウイルストランスフェクションベクターのゲノムは、１またはそれ以上の発現産物を生じることになる１またはそれ以上の異種ＤＮＡ配列を含んでいる。遺伝子導入植物は、細胞に入り込むことができる１またはそれ以上の低分子量の成分と接触させることができる。生化学過程または生化学連鎖のスイッチを入れる相互作用の過程において、図１Ｂ中において矢印で示した以下の相互作用が生じるであろう。１またはそれ以上の組換え植物ゲノムの異種ＤＮＡ配列は、１またはそれ以上のウイルストランスフェクションベクターの異種ＤＮＡ配列と相互作用することができる。１またはそれ以上の組換え植物ゲノムの異種ＤＮＡ配列は、１またはそれ以上のウイルストランスフェクションベクターの異種ＤＮＡ配列の発現産物と相互作用することができる。１またはそれ以上の組換え植物ゲノムの異種ＤＮＡ配列の発現産物は、１またはそれ以上のウイルストランスフェクションベクターの異種ＤＮＡ配列の発現産物と相互作用することができる。発現産物はＲＮＡまたはポリペプチドであり得る。またこれらの相互作用のいずれも外部から感染遺伝子導入植物細胞に加えられる１またはそれ以上の低分子量成分の存在を伴うかまたは必要とする。この低分子量成分は目的の生化学過程または生化学連鎖のスイッチを入れたり、または推進するために必要であるかまたは望ましいであろう。この低分子量成分は、ウイルストランスフェクションベクターまたは植物の核ゲノム中に異種ＤＮＡ配列が存在しない場合には目的の過程または連鎖にスイッチを入れることができない。
【００５０】
本発明の最初の特異的態様によると、安定的に植物中に組込まれた導入遺伝子の発現または遺伝子導入植物宿主の中にあるウイルスベクターの遺伝子の発現に対するトランスフェクションに基づく信頼し得る調節を行なうための新規方法が提供される。この方法は、ウイルスベクターの感染過程が始まった時にのみ開始する少なくとも二つの異種ＤＮＡ配列またはその発現産物の相互作用を利用する。これらの配列の一つは植物核ゲノム中に安定的に取込むことができ、そしてもう一つは該ウイルスベクターにより供給される。そのようなスイッチを入れることができる２成分発現系は、例えば、限定するものではないが、ＤＮＡ組換え、複製、転写、制限、ＲＮＡ複製、逆転写、プロッセシング、翻訳、タンパク折り畳み、集合、ターゲティング、翻訳後プロッセシング、酵素作用、などのような相互作用を開始することにより、種々のレベルで調節することができる生化学過程または連鎖を調節するために使用することができる。
【００５１】
この方法は少なくとも遺伝子導入植物中の異種ＤＮＡ及び異種ＤＮＡまたはＲＮＡを含む組換えウイルス由来ベクターを必要とする。この方法の一般的図式を図１に示す。その核ゲノム中に１またはそれ以上の安定的に組込まれた目的の異種ＤＮＡ配列を含む遺伝子導入植物は標準的な転写または翻訳ベクター及び標準的形質転換プロトコールを使用して作製することができる。安定な植物形質転換のための転写ベクター構築は多数の著者により記述されている（総説としては、Ｈａｎｓｅｎ ＆ Ｗｒｉｇｈｔ， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４， ２２６−２３１； Ｇｅｌｖｉｎ， Ｓ．Ｂ．， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ９， ２２７−２３２参照）。これらの構築全ての基本的原理は同一である：植物特異的プロモーター、目的の遺伝子の構造部分及び転写終結部を５’から３’の方向に含む完全機能転写単位を植物細胞中に導入し、そして目的遺伝子の発現を行なうためにゲノム中に安定的に組込まなければならない。翻訳植物ベクターの構築はドイツ特許出願番号１００ ４９ ５８７．７及び１００６１１５０．８（付属文書Ａ及び付属文書Ｂ）に記述されている。転写ベクターの主要な相違は、翻訳ベクターは目的の遺伝子の発現に転写プロモーターを必要とせず、植物ゲノム中に組み込まれている植物の転写機構に依存していることである。
【００５２】
植物細胞中に発現ベクターを輸送するために、微小弾丸の発射、電気穿孔またはプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換の方法により該ベクターを細胞中に直接導入するような種々の方法を使用することができる。アグロバクテリウム介在植物形質転換もまたベクター輸送の有効な方法である。こうして、アグロバクテリウムにより運ばれるＴｉ−プラスミドベクターによる（ＵＳ ５，５９１，６１６； ＵＳ ４，９４０，８３８； ＵＳ ５，４６４，７６３）、粒子または微小弾丸発射による（ＵＳ ０５１００７９２； ＥＰ ００４４４８８２Ｂ１； ＥＰ ００４３４６１６Ｂ１）ような種々の適当な技術によりＤＮＡを植物細胞中に導入することができる。アグロバクテリウムは安定な核形質転換のみならず、目的の遺伝子の一過性発現のためのＴ−ＤＮＡの有効な輸送にも使用することができる。このアグロインフィルトレーションと呼ばれる方法は最初外来遺伝子発現及び植物における遺伝子抑制を分析するために開発された（Ｋａｐｌｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １２２， １０１−１０８； Ｓｃｈｏｂ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２５６， ５８１−５８８）。
【００５３】
原則として、他の植物形質転換方法も使用することができる、例えば、微小注射（ＷＯ ０９２０９６９６； ＷＯ ０９４００５８３Ａ１； ＥＰ １７５９６６Ｂ１）、電気穿孔（ＥＰ ００５６４５９５Ｂ１； ＥＰ ００２９０３９５Ｂ１； ＷＯ ０８７０６６１４Ａ１）など。形質転換方法の選択は形質転換する植物による。例えば、微小弾丸発射は単子葉植物の形質転換に適しており、一方双子葉植物にはアグロバクテリウム介在形質転換が一般的に良い結果を生じる。
【００５４】
植物中における非ウイルス遺伝子発現のための植物ウイルス構築はいくつかの文献に記述されており（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １７２， ２８５−２９３； Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １１８， ６５９； ＭａｃＦａｒｌａｎｅ ＆ Ｐｏｐｏｖｉｃｈ， ２０００， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２６７， ２９−３５； Ｇｏｐｉｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２６７， １５９−１７３； Ｖｏｉｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６， １４１４７−１４１５２）、そして当業者によって容易に実施することができる。
【００５５】
本発明の一特異的態様において、植物ゲノム中の導入遺伝子は充分長いＤＮＡ挿入によりそのプロモーターから分離され、該導入遺伝子の転写を阻止している。（図２，３）。該ＤＮＡ挿入は、例えば、非自律転移配列または部位特異的ＤＮＡ組換え酵素により認識される一方向部位に挟まれたＤＮＡフラグメントであり得る。適当なトランスポゼースまたは部位特異的ＤＮＡ組換え酵素は、ベクタースイッチとして機能するウイルスベクターによって輸送され得る（図２，３）。該ベクターがコードするトランスポゼースまたは組換え酵素の発現の後、その酵素の触媒作用によりプロモーターを導入遺伝子から分離していたＤＮＡ挿入またはフラグメントが除去され、導入遺伝子の発現にスイッチが入る（図６）。
【００５６】
バクテリオファージ及びイーストの部位特異的組換え酵素／インテグラーゼはインビトロ及び植物中におけるＤＮＡ操作に広く使用されている。本発明に使用するための望ましい組換え酵素−組換え部位は下記のようなものである：Ｃｒｅ組換え酵素−ＬｏｘＰ組換え部位、ＦＬＰ組換え酵素−ＦＲＴ組換え部位、Ｒ組換え酵素−ＲＳ組換え部位、など。トランスポゾンは植物における遺伝子機能の発見のために広く使用される。本発明に使用する望ましいトランスポゾンはＡｃ／Ｄｓ，Ｅｎ／Ｓｐｍ，「マリナー」ファミリーに属するトランスポゾン、などである。
【００５７】
本発明のその他の態様において、遺伝子導入植物は二つの逆向きｌｏｘＰ部位に挟まれたプロモーターの無い導入遺伝子配列を持つことがある（図４）。そのような組換えの方向は、Ｃｒｅ組換え酵素に遭遇すると、挟まれたＤＮＡ配列の逆転を生じ得る。そのような逆転の結果として、ｎｏｓターミネーターを持つプロモーターの無い遺伝子は構成的プロモーターに対してアンチセンスから正しい方向に置かれるであろう。例４はｎｏｓターミネーターを持つプロモーターの無いＧＵＳ遺伝子を使用する方法を示している。
【００５８】
本発明のその他の態様は、インビボにおいて操作植物細胞中において機能的ウイルスベクター構築を組み立てる可能性を記述している。ウイルスベクター（前駆体）の配列を必要とするこの手段は２（図７）またはそれ以上の構築によって別々に植物細胞中に輸送される。例えば、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素（図８）を発現する前駆体を植物細胞中へＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにより輸送した後、部位特異的組換えにより目的の導入遺伝子を発現する機能的ウイルスベクターを構築させることができる（例６、図９）。
【００５９】
異種転写因子及びＲＮＡポリメラーゼもまた導入遺伝子スイッチとして使用することができる。この方法は例５に示されており、この中では遺伝子導入植物はバクテリオファージＴ７プロモーターの調節下にあるＧＵＳ遺伝子を持っている（図５参照）。原核プロモーターを認識しない植物ＲＮＡポリメラーゼのような構築を含む遺伝子導入ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてはＧＵＳ発現は検出することができない。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのウイルス輸送によりＧＵＳ遺伝子の発現は開始する（図５）。
【００６０】
ウイルスベクターにより輸送される対応ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを有するバクテリオファージプロモーター（例えば、Ｔ３，Ｔ７，ＳＰ６，Ｋ１１）の調節下にある植物導入遺伝子の発現は、本発明に包含される導入遺伝子スイッチ開発のもう一つの有効な方法であり得る。もう一つの有用な方法は異種またはキメラまたはその活性化に異種または操作した転写因子を必要とするその他の人工的プロモーターを使用することであろう。ある場合には、導入遺伝子発現のために存在する誘導システムを使用することができる。例としては銅調節（Ｍｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９０， ４５６７−４５７１）及びエタノール調節遺伝子発現システム（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １６， １７７−１８０）があり、これは転写因子（銅誘導に対してＡＣＥ １またはエタノール誘導に対してＡＬＣＲ）がウイルス輸送によりトランスに供給されるように修飾され、これにより発現システムの漏洩を減少させている。そのほかに、異種転写因子は転写因子を活性状態にするのにリガンド誘導活性化を必要としないように修飾することもできる。
【００６１】
本発明に包含されるその他の態様はＤＮＡ制限及び／またはＤＮＡ複製のような開始反応を含む。制限により開始できる生化学連鎖の例は２成分系であり、その中で複製の起点を含みそして核ゲノムの中に組込まれているＤＮＡ配列は特異的に切り出されそしてウイルスベクターによって運ばれる少量切断制限酵素により常染色体複製プラスミドの中に変換され、こうして連鎖を開始する。その他には、複製開始の修飾系を持つＤＮＡウイルスベクターは問題の修飾ウイルスベクターの有効な複製ができる遺伝子導入宿主中において一つの因子の存在下にのみ作動するようにすることができる。
【００６２】
本発明の連鎖の有効な開始装置として使用することができるＲＮＡ分子に影響する多くの反応がある。これらは、なかんずく、ＲＮＡ複製、逆転写、編集、サイレンシング、または翻訳のような反応を含む。例えば、ウイルスＲＮＡベクターから由来したＤＮＡは遺伝子導入宿主によってＤＮＡの中に逆転写され、これは翻って核ゲノム中へのＤＮＡ組み込みまたはＤＮＡ介在突然変異誘起のような過程に関与することができる。
【００６３】
本発明に包含されるその他の組換えウイルススイッチは１またはそれ以上の導入遺伝子発現産物の翻訳後修飾による過程である。ポリペプチド折り畳み、多量体形成、ターゲティングシグナルの除去、プロ酵素の酵素への変換、酵素作用の阻害、などのような調節段階により作動するようなスイッチに可能な道具立ては多くある。例えば、ウイルス発現ベクターからポリペプチドの発現は、遺伝子操作宿主がプロ酵素を切り離し、そしてそれを活性酵素に変換した時、ターゲティングモチーフを切り離すか修飾する宿主の能力により生成物が特別な細胞局所に到達した時、または特異的結合配列の除去により生成物が特異的に可動になった時にのみ、目的とする生化学過程を開始することができる。
【００６４】
本発明の方法は少なくとも２成分の相互作用に基づいているが、宿主核ゲノム中または１以上のウイルストランスフェクションベクター中の１以上の異種ＤＮＡ間の相互作用に基づく多成分系もやはり包含される。上記２成分（宿主植物中の異種ＤＮＡまたはその産物及びウイルスベクター中の異種ＤＮＡまたはその産物）に加えて植物染色体に組込まれていない低分子量作用物質または核酸またはタンパクのような追加成分を含む多成分系についても同じことが言える。その低分子量成分は分子量５ｋＤ以下の非タンパク性分子またはイオンとして定義される。ここに包含される組換えスイッチシステムの最終的目的は、目的とする生化学経路または生化学反応連鎖のような植物生産システムにおける過程を作動的に調節することである。経路または生化学連鎖は、完結した時に特定の生成物、効果または特徴を生じる宿主生産システム内の生化学反応の連鎖のことである。
【００６５】
ここに記述した方法は、万能でありそして漏洩の無い遺伝子スイッチであることに加えて、有効な生産調節方法を提供する。上記の２成分過程は本質的に「キーロック」システムであり、これによってトランスフェクションスイッチ成分の販売により企業は生産開始を有効に調節することができる。
【００６６】
例
以下の例中に使用されている特定のベクター及び構築の追加開示に関しては、付属文書Ａ及び付属文書Ｂに引用されている。
【００６７】
例１
ＤＮＡ組換えに必要な遺伝子：Ａｃトランスポゼース及びＣｒｅ組換え酵素を持つ植物感染用ウイルスベクターの構築
ＤＮＡ組換えに必要な遺伝子を持つ一連のｃｒＴＭＶ由来ウイルス発現ベクターは標準的分子生物学プロトコールに従って構築された（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。この例及び以下の例に使用される一般的に使用されているベクター、遺伝子及び遺伝子フラグメントに関する詳細な情報は一般公開データベースで見ることができる。２段階クローニング方法が全ての構築に使用された。最初に、中間構築が作製され、目的の遺伝子（ＧＵＳ）と適当なＩＲＥＳ配列及びｃｒＴＭＶ（シュードノット及びｔ−ＲＮＡ様構造）の３’−非翻訳領域（ＮＴＲ）と融合した。ＩＲＥＳｍｐ７５ＣＲ及びＩＲＥＳｃｐ１４８ＣＲ−融合（Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３， １３９−１５４）のために、目的の遺伝子（ＧＵＳ）をプラスミドｐｌＣ７６６（ＩＲＥＳｍｐ７５ＣＲ−ＧＵＳ−３’−ＮＴＲ ｉｎ ｐＢＳ（ＳＫ＋）及びプラスミドｐｌＣ７５１（ＩＲＥＳｃｐ１４８ＣＲ−ＧＵＳ−３’−ＮＴＲ ｉｎ ｐＢＳ（ＳＫ＋）中にそれぞれ再クローン化した。目的の遺伝子の５’−末端のＮｃｏ Ｉ及び ＢａｍＨ Ｉ−または３’−末端のＸｂａ Ｉのような、再クローニング用の便利な制限部位を必要があればＰＣＲにより導入した。ＤＮＡ配列分析を行ない構築のＰＣＲ増幅部分全てについて確認した。
【００６８】
クローニングの最終段階において、ＩＲＥＳ／ＧＵＳ／３’−ＮＴＲ−フラグメントをさらにウイルス発現ベクターｐｌＣ７９７（ｐＵＣ１９中のウイルスＣＰ遺伝子 （ＲｄＲｐ−ＭＰ−ＣＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＩＲＥＳｍｐ２２８ＣＲ−ＧＵＳ−３’−ＮＴＲ）−Ｎｏｔｌ−ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩに続くＧＵＳ遺伝子を持つＴ７プロモーター−ｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡ）中にＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｏｔｌフラグメントとして再クローニングした。この目的のために、プラスミドｐｌＣ７９７はＳａｃＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、大きなフラグメントをゲル精製し、同じプラスミドの１．３ ｋｂ ＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント及び中間構築（Ｃｒｅ組換え酵素用のｐｌＣ２２５１）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ−フラグメントと結合した。Ａｃ−トランスポゼースの場合にはＡｃ遺伝子のコード部分にＨｉｎｄＩＩＩ−制限サイトが存在したために４フラグメント結合が必要であった。最終的構築（Ａｃトランスポゼース用のｐｌＣ１１１１及びｐｌＣ１１２３；Ｃｒｅ組換え酵素用のｐｌＣ２５４１及びｐｌＣ２５３１）を図２及び４にそれぞれ示す。
【００６９】
例２
ウイルスベクター構築のインビトロ転写
プラスミドｐｌＣ１１１１，ｐｌＣ１１２３，ｐｌＣ２５４１及びｐｌＣ２５３１（それぞれ図２及び４）をＮｏｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化することにより直線化した。直線化プラスミドをＤａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８３， １８３２−１８３６）の記述に従ってインビトロで転写した。全長ＲＮＡ転写物の質及び量をアガロースゲル電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により分析した。
【００７０】
例３
植物ゲノム中に安定的に組み込まれた導入遺伝子のウイルス輸送Ａｃトランスポゼースによる活性化
プラスミドｐＳＬＪ７４４（Ｊ．Ｊｏｎｅｓ，Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＪＩＣ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫから入手）（図２）のＴ−ＤＮＡをＢｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５， １８５６−１８６０）の記述に従ってＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ （ＣｏＩ−０）植物に導入した。バキューム−インフィルトレーションの後３週間で種子を採取し、消毒し、５０ ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＧＭ＋１％グルコース培地上で形質転換体の検索を行なった（Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ５５３６−５５４０）。５週齢のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ形質転換体のロゼッタ葉に機械的に傷を付けることにより例２で得た全長転写ＲＮＡを接種した。この目的のために、ＲＮＡを３ｘＧＫＰ−緩衝液（５０ ｍＭグリシン、３０ ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４， ３％セライト、３％ベントナイト）と混合し、葉の上側に付けて穏やかに引っかいた。プラスミドＳＬＪ７４４のＴ−ＤＮＡはＣａＭＶ ３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子の間に挿入された非自律的Ｄｓ配列を含んでいた（図２）。ウイルスに輸送されたＡｃトランスポゼースの作用により生じたＤｓ配列の除去はＧＵＳ遺伝子の発現を生じ、これは接種葉の組織化学的な染色により容易に監視することができる（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， １９８７， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｏｒｔｅｒ， ５， ３８７−４０５）。接種葉を全長転写ＲＮＡでトランスフェクションした後９−１４日に採取した。検体をＸ−グルコース溶液を使用して浸潤した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， １９８７， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ， ５， ３８７−４０５）。３７℃で終夜培養した後、葉は７０％エタノールで脱色し、光学顕微鏡で検査した。ＧＵＳ染色組織の大きな範囲が主として接種葉に観察された。蒸留水を接種した対照遺伝子導入植物ではＧＵＳ染色は認められなかった。結果を図６に示す。ＧＵＳ染色の範囲は最初に接種した葉のウイルス感染の範囲と一致している。これはこの方法の高い有効性の証拠である：Ｄｓ除去及び、その結果として、ＧＵＳ発現は感染細胞の全てに生じた。これと比較して、ゲノム中に安定的に組み込まれているＡｃ導入遺伝子のコピーを持つ植物において常に存在するＡｃトランスポゼースのＤｓ除去を受ける範囲は植物組織の小部分に過ぎない（結果は示していない）。
【００７１】
例４
植物ゲノム中に安定的に組み込まれた導入遺伝子のウイルス輸送Ｃｒｅ組換え酵素による活性化
ｌｏｘＰ−組換え部位を伴う二つの異なる構築ｐｌＣ２５６１及びｐｌＣ１６４１（それぞれ図３及び４）をＣｒｅ−介在組換えの標的として設計した。ｐｌＣ２５６１の構築において、３’ＮＯＳ転写終結シグナルを持つＧＵＳ遺伝子は二つの直列ｌｏｘＰ−部位に挟まれている。このフラグメントはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及び合成ＧＦＰ遺伝子（ｓＧＦＰ）の間に挿入した。ウイルス輸送Ｃｒｅ組換え酵素に遭遇すると、二つのｌｏｘＰ部位の間の組換えによりＧＵＳ遺伝子の除去を生じる。この結果はＧＦＰ発現及び接種葉におけるＧＵＳ活性の欠如により容易に監視することができる。
【００７２】
プラスミドｐｌＣ２５６１を構築するために、ＳＬＪ４Ｋ１（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９２， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １， ２８５−２９２）ＧＵＳ遺伝子をｌｏｘＰ部位を持つプライマーで増幅し、そしてＣｌａ１（５’ＣＣＧ ＡＴＣ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡＧ ＴＴＡ ＴＡＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＴＣＣ ＴＧＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＣＣ３’）及びＮｃｏ１（５’ＧＧＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＴＴ ＣＧＴ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧＴ ＣＧＡ ＴＣＴ ＡＧＴ ＡＡＣ３’）制限部位を遺伝子の５’末端及び３’末端にそれぞれ導入した。該ＰＣＲ産物はＣｌａ１及びＮｃｏ１制限酵素で消化し、プラスミドｐｌＣ５９１（ｐＨＢＴ：Ｃｌａ／ＮｃｏＩ−ｓＧＦＰ−３’ＮＯＳ）のＮｃｏ１−Ｃｌａ１部位中に再クローニングした。この中間構築のＨＢＴプロモーター（Ｓｈｅｅｎ， Ｊ． １９９５， ＥＭＢＯ Ｊ．， １２， ３４９７−３５０５）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中では機能しない）はＳＬＪ４Ｋ１の（３５Ｓプロモーター）の１．４ ｋｂ ＥｃｏＲ１／Ｋｌｅｎｏｗ−Ｃｌａ１フラグメントを持つゲル精製した大きなＨｉｎｄＩＩＩ／Ｋｌｅｎｏｗ−Ｃｌａ１フラグメントと結合することによりＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターで置換した。機能的クローンはｐｌＣ１４２２（ＨＢＴプロモーターに調節されるｃｒｅ組換え酵素）のＤＮＡと共に微小弾丸発射実験により確認した。さらにバイナリーベクターｐｌＣＢＶ１（Ｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＡＧ，ミュンヘン、ドイツ、の独占開発権、しかし他のバイナリーベクターはどれも同様に適する）、ｐｌＣＢＶ１−ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＥｃＩ１３６ＩＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、そして該機能的中間クローンの大きなＸｈｏ１／Ｋｌｅｎｏｗ−ＥｃｏＲ１フラグメント（ｐ３５Ｓ：−ｌｏｘＰ−ＧＵＳ−３’ＯＣＳ−ｌｏｘＰ−ｓＧＦＰ−３’ＮＯＳ）と結合した。最終構築ｐｌＣ２５６１のＴ−ＤＮＡ領域を図３に示す。
【００７３】
二つの逆向きｌｏｘＰに挟まれたＧＵＳ遺伝子を持つ第二の構築を図４に示す。この構築を作るために、１８ ｂｂの相補性３’末端を持つ二つのＰＣＲプライマー（５’ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡＧ ＴＴＡ ＴＡＣ ＣＡＴ ＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＴＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＡＴ３’ ａｎｄ ５’ＧＣＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＴＡＡ ＣＴＴ ＣＧＴ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＧＡ ＡＧ ＴＴ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＡ３’）を設計し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントとアニール処理しそして補充した。
【００７４】
最終的ＤＮＡフラグメントは、Ｐｓｔ１、Ｎｃｏ１により分離され、Ｘｈｏ１（Ｐｓｔ１側から）及びＨｉｎｄ１１１制限部位に挟まれた二つの逆向きｌｏｘＰ部位を含んでいる。Ｘｈｏ１−Ｈｉｎｄ１１１消化の後、フラグメントはｐＳＬＪ４Ｄ４（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １， ２８５−２９２）の大きなＸｈｏ１−Ｈｉｎｄ１１１フラグメントと結合する。生成したプラスミドをＰｓｔ１−Ｎｃｏ１で消化し、ゲル精製しそしてｐＳＬＪ４Ｄ４の２．６ｋｂ Ｎｃｏ１−Ｐｓｔ１フラグメントを結合した。
【００７５】
クローニングの最終段階として、全カセット（ＣａＭＶ ｐ３５Ｓ−ｌｏｘＰ−３’ｎｏｓ−ＧＵＳ−ｌｏｘＰ）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ−フラグメントとしてバイナリーベクターｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ， Ｍ． １９８４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １２， ８７１１−８７２１）中に再クローニングした。この構築（ｐｌＣ１６４１）のＴ−ＤＮＡを図４に示す。遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系統は、Ｂｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６５， １８５６−１８５９）の改良真空浸潤プロトコールによってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを形質転換することにより得た。隔離したＴ１集団における導入遺伝子の存在はＰＣＲ分析により確認した。
【００７６】
ウイルスｃＤＮＡクローン（ｐｌＣ２５３１）の転写及び遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系統のウイルスＲＮＡ接種はそれぞれ例２及び３の記述に従って実施した。
【００７７】
ＧＦＰ及びＧＵＳの検出
ＧＦＰ発現の監視のためにＬＥＩＣＡ立体蛍光顕微鏡を使用した（４５０−４９０ ｎｍで励起、５００−５５０ ｎｍで発光）。我々の実験に使用したｓＧＦＰは青及びＵＶ光線により励起した。ＧＵＳの検出は例３の記述に従って実施した。
【００７８】
例５
植物ゲノム中に安定的に組み込まれた導入遺伝子のウイルス輸送Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる活性化
ベクターの構築
Ｔ７プロモーターによって調節されるＧＵＳ遺伝子レポーターを持つ植物形質転換用バイナリーベクターは以下のように作製した。Ｔ７プロモーター−ＧＵＳ遺伝子構築を持つｐｌＣ０５７のゲル精製２ｋｂ ＢｓｓＨ１１／Ｔ４ポリメラーゼ−Ｓａｌ１フラグメントをＳｍａ１−Ｓａｌ１消化した発現ベクターｐｌＣ０５６と結合し、ＧＵＳ遺伝子の３’末端に３５Ｓ転写終結シグナルを加えた。得られた構築ｐｌＣ２６４１をＳａｃ１及びＸｈｏ１で消化し、ベクター骨格からゲル生成し、そしてＳａｃ１／Ｓａｌ１消化ｐＢＩＮ１９と結合した。最終構築物ｐＩＣ２６５１（図５）を前期のようにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの形質転換に使用した。Ｔ７ポリメラーゼを発現するウイルスベクターは次ぎのように作製した。プラスミドｐｌＣ２６０３をＳｐｈ１及びＳａｌ１で消化し、そしてＴ７ポリメラーゼ遺伝子を持つゲル精製２．８ｋｂフラグメントをｐｌＣ１０１８の大きなＮｃｏ１−Ｓａｌ１フラグメントと結合した。生成したプラスミドｐｌＣ２６２１は５’末端のＩＲＥＳｍｐ７５ＣＲ及び３’末端のｃｒＴＭＶの３’非翻訳領域（ＮＴＲ）に挟まれたＴ７遺伝子を持っている。最終クローニング段階はｐｌＣ２６２１の小さなＨｉｎｄ１１１−Ｎｏｔ１フラグメントとｐｌＣ１０８７の大きなＳａｃ１１−Ｎｏｔ１及び小さなＳａｃ１１−Ｈｉｎｄ１１１フラグメントの結合を含んでいた。ｃｒＴＭＶウイルスベクター中にＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含む最終構築ｐｌＣ２６３１（図５）は例２及び３にそれぞれ記述したように転写及び植物トランスフェクションに使用した。
【００７９】
例６
ウイルス増幅単位前駆体からの導入遺伝子の活性化
ベクターの構築
Ｃｒｅ組換え酵素により認識されるＬｏｘＰ部位を基本構築に導入するために、使いやすい制限部位（プライマー１：５’−ＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧ ＡＧＣＴＣＡＴＡＡＣ ＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴ ＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡ ＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡ ＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣ ＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡ Ｃ−３’、プライマー２：５’−ＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡ ＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡ ＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣ ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴ ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧ ＡＡＴＴＣＧＧＣＧＴ ＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣ Ａ−３’）に逆方向に挟まれたＬｏｘＰ部位を含むプライマーでＩＰＣＲを行なった。ＩＰＣＲ反応において全プラスミドを増幅するために、これらのプライマーをｐＵＣ１１９のマルチクローニング部位にアニール処理させた。プライマーの重複配列はＰｓｔＩ制限部位を含んでいた。ＩＰＣＲ産物をＰｓｔＩで制限及び再結合した後、中間構築ｐｌＣＨ１２１２（付図１）を得た。
【００８０】
天然の翻訳終結シグナルの前の翻訳終結コドン２５ ＡＡを含むＭＰ−遺伝子のＸｈｏ１−ＥｃｏＲ１フラグメントをｐｌＣＨ１２１２のＸｈｏ１−ＥｃｏＲ１大フラグメントと結合した。生成した構築ｐｌＣＨ３４３１（付図２）において、３’−ＭＰ部分はＬｏｘＰ−部位の次に位置している。このＭｐ−ＬｏｘＰ配列をベクター中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓアクチン２プロモーター及びＲｄＲｐ−ポリメラーゼも含んでいるＭｐ−遺伝子の５’−部分に融合するために、ｐｌＣＨ３４３１のＭＰ−ＬｏｘＰ配列をＥｃｏＲＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩフラグメントとしてＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切断したプラスミドｐｌＣＨ３３０１（付図３）中に再クローニングし、プラスミドｐｌＣＨ３４６１（付図４）を生成した。ＮｔｏＩ制限部位は再クローニングの前にＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理した。生成したベクターの５’−末端にあるＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ及びＸｈｏ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントはさらにＫｐｎ１及びＨｉｎｄＩＩＩ処理バイナリーベクターｐｌＣＢＶ１０（ｐｌＣＢＶ１０のＴ−ＤＮＡ領域を付図５に示す）中にクローニングするために３フラグメント結合反応に使用した。最終構築ｐｌＣＨ４３７１を図７に示した。
【００８１】
ウイルスベクター前駆体の３’−末端を作製するために、構築ｐｌＣＨ２７４４（付図６）のオメガ−リーダー配列の隣りにＬｏｘＰ部位を含むＸｈｏＩ−ＮｃｏｌフラグメントをプラスミドｐｌＣＨ１７２１（付図７）中に再クローニングし、３’−末端に３’ＮＴＲ−配列が結合するｓＧＦＰ−遺伝子の５’−末端にＬｏｘＰ−部位／オメガ−リーダー配列を融合した（構築ｐｌＣＨ３４２１，付図８）このＯＲＦにノパリン合成酵素転写終結シグナルを加えるために、プラスミドｐｌＣＨ３４２１をＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、そして生成した小フラグメントを構築ｐｌＣＨ３４４１（付図９）中に生成するプラスミドｐｌＣＨ３２３２中にクローニングした。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる輸送のために、ウイルス前駆体ベクターのこの３’−末端を更にバイナリーベクターｐｌＣＢＶ１０（付図５）中にＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして再クローニングした。最終構築ｐｌＣＨ４４６１を図７に示す。
【００８２】
Ｃｒｅ組換え酵素構築ｐｌＣＨ５２９（コムギヒストンＨ４プロモーター−ＬｏｘＰ−Ｃｒｅ組換え酵素−ＮＯＳターミネーター、付図１０参照）を修飾し、Ｃｒｅ組換え酵素をＮｉｃｏｔｉａｎａの核形質転換をするために使用されるバイナリーベクター中にクローニングした。最初に、構築ｐｌＣ０４（イントロンの無いＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアクチン２プロモーター、図示せず）のＥｃｌ１３６ＩＩ／ＰｓｔＩ−フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ（感度が低い）及びＰｓｔＩで消化したｐｌＣＨ５２９中に再クローニングすることによりコムギＨ４プロモーターをＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアクチン２プロモーターに置換した。この結果構築ｐｌＣＨ１２６２（付図１１）を得た。５’−末端においてＬｏｘＭ組換え酵素部位と隣接するＯＣＳ−ターミネーターによりＮＯＳ−ターミネーターを置換するために、ＯＣＳ−ターミネーターをプラスミドｐｌＣＨ４９５（ＮＯＳプロモーター−ＢＡＲ遺伝子−ＯＣＳターミネーター、図示せず）からＰＣＲ増幅し、そしてさらにＳｐｈＩ／ＳａｃＩフラグメントとしてプラスミドｐｌＣＨ１２６２中に再クローニングして、構築ｐｌＣＨ１３２１（図示せず）を作製した。この増幅に使用した促進プライマー（５’−ＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴ ＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴ ＡＡＴＣＴＡＴＡＣＴ ＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴ ＡＧＧＡＴＣＧＡＴＣ ＣＴＡＧＡＧＴＣＣＴ ＧＣ−３’）の配列はＳｐｈＩ−制限部位及びＬｏｘＭ−組換え部位を含んでいた。ＰＣＲ産物の３’−末端にあるＳａｃＩ−制限部位は逆プライマー（５’−ＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴ ＣＡＡＧＧＴＴＴＧＡ ＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣ−３’）の配列により導入した。最終的に、生成した構築（アクチン２プロモーター−ＬｏｘＰ−Ｃｒｅ組換え酵素−ＬｏｘＭ−ＯＣＳターミネーター）をさらにバイナリーベクターｐｌＣ０００１５中にＮｏｔＩ／ＳａｃＩフラグメントとして再クローニングし、構築ｐｌＣＨ１７５４（図８）を得た。このフラグメントをバイナリーベクター中にクローニングするために、このフラグメントのＮｏｔＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位をバイナリーベクターのポリリンカー中に組込む必要があった。
【００８３】
タバコ葉ディスクの形質転換
ｐｌＣＨ１７５４のＴ−ＤＮＡを含む遺伝子導入Ｎｉｃｏｔｉａｎａ系統（ｔａｂａｃｕｍ及びｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ種）はＨｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， （１９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２７， １２９−１３１）の記述に従って葉ディスクのアグロバクテリウム介在形質転換により得た。葉ディスクを構築ｐｌＣＨ１７５４で形質転換したアグロバクテリウムＧＶ３１０１株と３０分間インキュベートした。選択薬無しで培地（ＭＳ−培地 ０．１ ｍｇ／ｌ ＮＡＡ， １ ｍｇ／ｌ ＢＡＰ）上で３日間インキュベートした後、１００ ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加した同じＭＳ−培地上で形質転換体の選別を行なった。アグロバクテリウムの増殖を抑制するために、培地には３００ ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び３００ ｍｇ／Ｌセファタキシムも添加した。再生したものをホルモンを含まず同量の選択薬を添加したＭＳ−培地上でインキュベートし、発根を誘導した。分離したＴ２−集団における導入遺伝子の存在はＰＣＲ分析により確認した。
【００８４】
アグロ浸潤によるウイルスベクター前駆体の輸送
遺伝子導入タバコ植物のアグロ浸潤はＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，２２（６）， ５４３−５５１により記述されている改良プロトコールに従って実施した。構築（ｐｌＣＨ４３７１及びｐｌＣＨ４４６１）でそれぞれ形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ３１０１株をリファンピシン５０ ｍｇ／ｌ，カルベニシリン５０ ｍｇ／ｌ及び１００μＭアセトシリンゴンを添加したＬＢ−培地中２８℃で増殖した。終夜培養したアグロバクテリウム細胞（５ ｍｌ）を遠心分離（１０分間、４５００ ｇ）により採取し、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４及び１００μＭアセトシリンゴンを添加した１０ ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ５．５）緩衝液に再懸濁した。細菌懸濁は０．８の最終的ＯＤ６００に調節した。数種の構築を輸送する場合には、浸潤の前に異なる構築を持つアグロバクテリウムクローンを混合した。
【００８５】
アグロ浸潤は植物本体に生着しほぼ完全に展開した葉の上で実施した。細菌懸濁を５ ｍｌシリンジで浸潤させた。各スポット（典型的に３−４ ｃｍ２の浸潤面積）に細菌懸濁１００μｌを適用し、一枚のタバコ葉上に葉脈により分離された８から１６個のスポットを置いた。浸潤の後植物を２２℃及び１６時間照明の条件の温室内でさらに育成した。
【００８６】
浸潤１６日後、構築ｐｌＣＨ４３７１及びｐｌＣＨ４４６１を浸潤させた遺伝子導入タバコ植物（ｐｌＣＨ１７５４、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）の葉は育成植物上にＵＶ光線により観察することができる強いＧＦＰ発現部分を示した。同じアグロバクテリウム懸濁混合物で浸潤した非形質転換タバコの葉にはＧＦＰ発現は認められなかった。
【００８７】
付属文書Ａ
植物のベクターシステム
発明の分野
本発明は植物における遺伝子の増幅及び発現及び／または抑制ができるベクター、並びにその使用、及び該ベクターを発生させる方法及びプロベクターに関するものである。
【００８８】
発明の背景
遺伝子操作用の植物ベクターはタンパクの生産用に、宿主植物に新しい特徴を付与するために、宿主植物の遺伝子を抑制するために、または遺伝子、特にゲノミックスにより発見された遺伝子の機能を特定するために、非常に望まれている。
【００８９】
植物の遺伝子操作用のベクター、特にウイルスベクターは既知である。これらは遺伝子発現または抑制のための少なくとも一つの配列を有すると共に感染、増幅及び植物内の移動（細胞間及び長距離のいずれも）ができなければならない。先行技術のベクターは転写因子をサブゲノムプロモーターに依存している。サブゲノムプロモーターは、遺伝子導入植物細胞において、ベクター核酸配列の転写は該サブゲノムプロモーターの部分で開始し、植物翻訳機構により該プロモーターの遺伝子下流の翻訳ができるような短いＲＮＡを発生する作用を有している。次いで翻訳はキャップに依存して進行することができる。そのような多重転写は複製酵素の能力の浪費のために動力学的に不利である。
【００９０】
そのようなベクターはさらに多くの欠点がある。ベクター配列へのウイルスサブゲノムプロモーターの導入は該配列を長くはするが、効率は落ちる。さらに、宿主における転写に良く適する同一または類似のいくつかのサブゲノムプロモーターが存在するとしばしば組換え反応を生じ、そして配列の部分的欠失による不安定性を生じる。一方、もし著しく異なるサブゲノムプロモーターを使用するならば、組換えは抑制されるがそのプロモーターは余りにも異なっているので転写システムによって有効に認識されず、有効性の消失を意味する。さらに、ベクターは通常配列中に密に詰め込まれたいくつかの相互に依存する配列または遺伝子を高度に集積したものである。これがある異種遺伝子などに対するベクターの作動性が若干特異的でありそしてしばしば、特に感染性及び発現に関して予想し難い結果を生じる理由である。さらに、もし上流遺伝子と配列重複が存在するならば、プロモーター用の有効配列空間は通常制約されている。
【００９１】
したがって、本発明の目的は宿主植物中において有効にして安定な作動をすることができる植物遺伝子操作用の新規ベクターを提供することである。その他の目的は植物中において高レベルの発現を可能にするベクターを提供することである。
【００９２】
植物中の遺伝子の増幅及び発現をすることができる少なくとも一つの発現される非ウイルス遺伝子を有するかまたは少なくとも一つのその下流遺伝子の翻訳に必要なＩＲＥＳ配列をコードする核酸を含むベクターによりこれらの目的を達成し得ることを驚くことに発見した。
【００９３】
（宿主ゲノム中に組み込まれた後に）遺伝子発現の機能のみを有する組換えＤＮＡ分子中に植物ＩＲＥＳ配列を使用することは既に示されていた（ＷＯ ９８／５４３４２）。しかし、発現レベルは低い。この低い発現レベルの正確な理由は不明である。とにかく、発現は形質転換植物細胞に限られており、植物全体の総合的効率は極めて低い。
【００９４】
植物細胞中に導入した時に、遺伝子発現の能力のみならず、増幅に必要な全ての追加機能を持ち、総合効率が極めて高くなるように植物全体に分布する植物ベクターを構築することが可能であることを驚くべきことに発見した。これらの機能には感染、増幅、細胞間移動及び長距離移動が含まれる。ベクター上の機能的及び構造的配列の高度な集積は該ベクターの遺伝子発現を障害しないことは驚くべきことである。
【００９５】
該ベクターのＩＲＥＳ配列はその翻訳を直接支援するために発現する該非ウイルス遺伝子の上流に位置させることができる。その他に、該ＩＲＥＳ配列は、該ベクターの感染、増幅及び細胞間または長距離移動の群から選択された該ベクターの機能に必須な別の遺伝子翻訳の直接支援により発現する該遺伝子の翻訳を間接的に支援することができる。
【００９６】
その他の目的は植物中において遺伝子の有効な抑制をすることができるベクターを提供することである。この目的は植物中において、該ベクターの増幅に必要でありそして該ＩＲＥＳ配列の下流に位置する遺伝子の翻訳に必要な少なくとも一つのＩＲＥＳ配列を持つかまたはコードする核酸を含む増幅ができるベクターにより達成することができる、該ベクターはさらに宿主植物のゲノムを抑制するために宿主植物ゲノムの配列の少なくとも部分をアンチセンスの方向に含んでいる。
【００９７】
その他の望ましい態様はサブクレーム中に明示する。
【００９８】
ここで、植物活性翻訳（ＩＲＥＳ）配列に基づく最初の植物発現及び増幅ベクターを記述する。動物ウイルスから単離した現存するＩＲＥＳ配列は植物細胞中では翻訳を支援しない。したがって、動物発現システムにおいて蓄積された知識は植物に応用できない。動物ＩＲＥＳ配列は残余プロモーター作用のような他の機能的性質を試験されていなかったので、本発明は、その下流遺伝子の発現に必要なサブゲノムプロモーターによる転写よりも翻訳に優先的に依存する植物における遺伝子発現の最初の望ましい例を開示する。
【００９９】
本発明のベクターは、キャップ依存翻訳を抑制することにより植物中の目的の遺伝子の調節及び優先的発現を可能にする。その他の望ましい態様において、非常に短い同種または人工的ＩＲＥＳ配列が使用され、そのため生成したベクターの安定性が増加する。
【０１００】
この方法の望ましい利点は、ＩＲＥＳ遺伝子、例えば、下流外来遺伝子またはウイルス遺伝子、それぞれの翻訳をキャップ非依存内部リボソーム侵入経路により生じ得るようなタバコモザイクウイルスのコートタンパク遺伝子、をウイルス遺伝子の上流または下流に挿入することができることである。この様に、外来遺伝子の該キャップ非依存的翻訳は２シストロン性または／及び多シストロン性ＲＮＡにより生じる。
【０１０１】
一般的問題及び定義
ウイルスによる植物の感染に際してウイルス感染の初期現象（侵入及びゲノムの脱殻）を生じる。次いでウイルスはそのゲノムを発現しそして複製する作用を発揮しなければならない。ウイルスゲノムは一つの（モノパータイル）または複数の（マルチパータイル）ＲＮＡまたはＤＮＡ部分から成り立っており、これらの部分のそれぞれはある条件下において感染細胞中で複製することができる。ウイルスレプリコンは「ウイルスの増殖サイクルの間に宿主細胞中で複製されるウイルス配列のポリヌクレオチド」と定義されている（Ｈｕｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， ”Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ”， Ｔ．Ｍ．Ａ． Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｗ． Ｄａｖｉｅｓ ｅｄｓ．， １９９２， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）。本発明において我々は、（ｉ）野生型植物ウイルスにとって非天然外来配列を含みそして発現でき、（ｉｉ）それ自身またはヘルパーウイルスの補助により複製するかまたは遺伝子導入植物宿主の生産物により複製する全長ウイルスゲノムまたはウイルスＲＮＡまたはＤＮＡのフラグメントを特定するために、用語「増幅に基づく発現システム」を使用する。この用語「増幅に基づく発現システム」及び「組換えウイルスベクター」は極めて近似している。これらのシステムはウイルスゲノムに対して同種（自身の）または外来、異種（自身のでない）追加の配列を含む組換え核酸を意味している。用語「自身のものでない」とは、この核酸配列がそのウイルスの野生型ゲノム中に天然には認められずそして他のウイルスから由来するかまたは人工的に合成されたヌクレオチド配列であることを意味する。そのようなウイルス配列から由来する増幅に基づくシステムは、正常または／及び遺伝子修飾遺伝子導入宿主植物において、複製することができ、そして多くの場合に細胞間並びに長距離移動をすることができる。後の場合に、遺伝子導入植物は、ある機能を消失したベクターのウイルス成分を補足しなければならない、すなわち、ベクター複製及び／またはその遺伝子の発現または長距離輸送に必須な導入遺伝子の生産物は遺伝子導入植物によって供給されなければならない。
【０１０２】
モノパータイト（例えば、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）またはマルチパータイト（例えば、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するもの）ゲノムから由来する植物ウイルス増幅に基づくベクターは宿主植物中に外来遺伝子を発現することが示されている（総説として、”Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ”， Ｔ．Ｍ．Ａ． Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｗ． Ｄａｖｉｅｓ ｅｄｓ．， １９９２， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．参照）。
【０１０３】
既知植物ウイルスの大部分（約８０％）は遊離ＲＮＡの形でビリオンから単離した時に感染性を持つ（＋）一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ゲノムを含んでいる。これはウイルス複製サイクルの最初の段階においてゲノムＲＮＡは、非感染植物には存在せず、したがってウイルスＲＮＡ複製には必須であるウイルス特異的ＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）を作るために翻訳されなければならないということを意味する（総説として、Ｙ． Ｏｋａｄａ， １９９９， Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈ． Ｔｒａｎｓａｃｔ． ｏｆ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ．， Ｂ， ３５４， ５６９−５８２参照）。ゲノム発現に使用される翻訳方法において（＋）ｓｓＲＮＡウイルスは異なることに言及する必要がある：いわゆるピコルナ様ウイルスのゲノムはリボソームによって大きなポリタンパクに翻訳される一つの連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、このポリタンパクは次いでタンパク分解的に処理されて機能的に作用するウイルス−コードタンパクになる。ウイルス特異的タンパク分解酵素はポリタンパクのプロセシングに必要である。ピコルナ様ウイルスの第二の特徴は、そのゲノムＲＮＡは、キャップ構造の代わりに、小さなウイルスタンパクをゲノムの５’−末端に共有結合していることである。
【０１０４】
本発明において、多くの植物ウイルス、特に、Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ属に１ダース以上のウイルスが属している所謂Ｓｉｎｄｂｉｓ様上科のウイルスに非常に期待して注目した（総説として、Ａ． Ｇｉｂｂｓ， １９９９， Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈ． Ｔｒａｎｓａｃｔ． ｏｆ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ．， Ｂ， ３５４， ５９３−６０２参照）。この技術は外来遺伝子のキャップ非依存及びウイルスプロモーター非依存発現を保証する。
【０１０５】
トバモウイルス（ＴＭＶ Ｕ１はタイプメンバー）のゲノムは４つの大きなＯＲＦを含んでいる。レプリカーゼの２成分（１３０−ｋＤａ及びその読み過ごし１８３−ｋＤａタンパク）はゲノムＲＮＡの５’−近位領域によってコードされており、そしてゲノムＲＮＡによって直接翻訳される。ＴＭＶ Ｕ１の１８０−ｋＤａタンパク遺伝子の３’−末端１５ヌクレオチドはＴＭＶ感染の細胞間移動に対応する３０−ｋＤａタンパク（移動タンパク、ＭＰ）をコードするＯＲＦと重複している。ＴＭＶ Ｕ１においてこの遺伝子は、２０４ヌクレオチド（ＴＭＶ Ｕ１では）からなる３’−近位非翻訳領域（３’−ＮＴＲ）の上流に位置する１７−ｋＤａコートタンパク（ＣＰ）をコードする最後の遺伝子の開始コドンの前２ヌクレオチドで終結している。
【０１０６】
トバモウイルスのＲＮＡの翻訳は真核性ｍＲＮＡの大部分に共通のリボソーム走査機構により生じる（総説として、Ｋｏｚａｋ， １９８９， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １０８， ２２９−２４１； Ｐａｉｎ， １９９６； Ｍｅｒｒｉｃｋ ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｅｙ， １９９６， Ｉｎ ”Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ”， ｅｄｓ． Ｈｅｒｓｈｅｙ， Ｍａｔｔｈｅｗｓ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ３１−６９； Ｓａｃｈｓ ａｎｄ Ｖａｒａｎｉ， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７， ３５６−３６０参照）。この機構に従って、構造的ポリシストトン性トバモウイルスＲＮＡは機能的にはモノシストロン性である、すなわち、複製可能なタンパク（１３０−ｋＤａタンパク及びその読み過ごし産物）をコードする５’−近位ＯＲＦのみが全長ゲノムＲＮＡから翻訳される（Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ ａｎｄ Ｚａｉｔｌｉｎ， １９８６， Ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ”， ｖａｎ Ｒｅｇｅｒｍｏｒｔｅｌ ａｎｄ Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ ｅｄｓ．， ｖｏｌ．２， ｐｐ． １０５−１３１， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹによる総説）。オメガ（Ω）と命名されたＴＭＶ Ｕ１の６８−ヌクレオチド５’−末端非翻訳リーダー配列は５’−末端近位ＯＲＦの翻訳を促進する有効な翻訳エンハンサーの役割を演ずることが示されている。
【０１０７】
５’−遠位ＭＰ及びＣＰ遺伝子は全長ＴＭＶ Ｕ１ ＲＮＡ中では翻訳に対してサイレントであるが、サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に関係する別のｍＲＮＡから翻訳される。明らかに、トバモウイルスｓｇＲＮＡはネガティブセンスゲノムＲＮＡから転写されそして共通の３’−末端を持っている。ｓｇＲＮＡから翻訳されるＴＭＶ遺伝子の発現は量的にそして時期的にも独立して調節されている：ＭＰは感染の初期段階のうちに一過性に生産されそして比較的低レベルに蓄積する（総植物タンパクの約１％）が、一方ＣＰは総植物タンパク合成の７０％を占めそしてＣＰは全細胞タンパクの１０％に達する蓄積をすることがある（Ｆｒａｓｅｒ， １９８７， Ｉｎ ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ”， ｐｐ． １−７， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， Ｌｅｔｃｈｗｏｒｔｈ， Ｅｎｇｌａｎｄ）。
【０１０８】
各ｓｇＲＮＡの生成は「サブゲノムｍＲＮＡプロモーター」（ｓｇＰＲ）と呼ばれる異なるシス作動性配列によって調節されていることは明らかである。一般的に、この用語は、ｓｇＲＮＡを生産するための内部に存在するｓｇＰＲからの転写を開始するレプリカーゼ複合体により認識され得るウイルスゲノム（多分マイナスセンスＲＮＡコピー）の領域を示している。しかし、便宜上、用語「サブゲノムプロモーター」により我々はコード配列及びｓｇＲＮＡの開始点の上流に通常位置するプラスウイルスＲＮＡ中のヌクレオチド配列を通常意味し、そしてそれはｓｇＲＮＡ合成を開始するのに機能的に必要である。しかし、一部のｓｇＰＲは調節されるウイルス遺伝子の上流のみならず、この遺伝子と重なり合うこともある（Ｂａｌｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ （Ｐａｒｉｓ） ７５， ５１７−５２１）。
【０１０９】
各ｓｇＰＲはＴＭＶゲノムの異なる位置をコピーする。ＴＭＶのｓｇＰＲのいずれも正確にマップされていないが、ＣＰ遺伝子の上流の２５０ヌクレオチドはＣＰ ｓｇＲＮＡの合成を促進することが示されている（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７２， ２８５−２９２）。
【０１１０】
Ｌｅｈｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４， １４５−１５７）は、ＣＰ ｓｇＰＲの大きさを推定するために、ＴＭＶゲノム中（ＭＰ遺伝子の前に）にＣＰ遺伝子に先行する配列（２５３及び４９ヌクレオチド）を挿入した。この挿入は元来のＭＰ ｓｇＰＲを除去しなかったが、それをＭＰ ＯＲＦから分離した。挿入された２５３ｎｔプロモーター領域を持つ変異体（ＫＫ６と呼ばれる）は安定的に複製し、そして感染植物全体に移動した。ＫＫ６変異体において挿入がＭＰ ｓｇＲＮＡリーダーの長さを変えたことは予想しないことであった（Ｌｅｈｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４， １４５−１５７）（図１８参照）。ＫＫ６ ＭＰ ｓｇＲＮＡリーダーは、ＣＰ ｓｇＲＮＡでは９ ｂ．ｐ．であったのに対し、２４ヌクレオチドであった。
【０１１１】
これに対して、プロモーター領域の４９−ｎｔフラグメントを挿入した変異体は一過性に複製したのみで、挿入が除去された野生型ウイルスの子孫と交代した。さらに、ＣＰ ｓｇＰＲに由来する９６−ｎｔを使用した場合にはＣＰ ｓｇＲＮＡの生成の減少が示された（Ｍｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７， ＥＭＢＯ Ｊ．， ６， ２５５７−２５６３）。ＣＰ遺伝子の上流４９−９６ｎｔ配列はＴＭＶ Ｕ１ ＣＰ遺伝子の全ｓｇＰＲを含まず、一方２５０−ｎｔ配列は完全なｓｇＰＲを含むことが結論された。ＴＭＶ ＭＰ遺伝子の発現を調節するｓｇＰＲの構造及びマッピングに関する情報は少ない。理論的ＭＰ ｓｇＰＲ配列は１８３−ｋＤａレプリカーゼタンパクと重なり合っているため、ＭＰ ｓｇＰＲの突然変異分析は複雑である。最近Ｗ．Ｄａｗｓｏｎ及び共同研究者は予備的成績からＴＭＶ Ｕ１の最小及び全長ＭＰ ｓｇＰＲの範囲を概説した（Ｇｒｄｚｅｌｉｓｈｖｉｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７６， 印刷中）。ＭＰ遺伝子の上流領域のコンピューター上の折り畳みによりＭＰ遺伝子のＡＵＧコドンに先行する７５−ｎｔ領域に５’−近位に位置する二つのステムループ構造が明らかとなった。
【０１１２】
ゲノムＲＮＡ及びＣＰ ｓｇＲＮＡとは対照的に、ＭＰ遺伝子のｓｇＲＮＡ（所謂Ｉ２ ｓｇＲＮＡ）はキャップ構造が無い（総説として、Ｏｋａｄａ， １９９９， Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈ． Ｔｒａｎｓａｃｔ． ｏｆ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ．， Ｂ， ３５４， ５６９−５８２）。本発明はＴＭＶ Ｕ１及び ｃｒＴＭＶ両者のＩ２ ｓｇＲＮＡにキャップ構造が無いことを確認した結果を提供する（図１６）。
【０１１３】
ベクターウイルスからの外来遺伝子発現に影響する重要な要因はウイルスゲノムの３’−末端に対する外来遺伝子の相対的位置であることがＷ． Ｄａｗｓｏｎ及び共同研究者により示されている：遺伝子が３’−末端に近くに位置しているほど、発現の効率は劇的に増加した（Ｃｕｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ２０５５−２０５９）。最高に発現した遺伝子は、ｔＲＮＡ−様構造に続く３個のシュードノットを（ＴＭＶ Ｕ１ ＲＮＡ中に）含む３’−ＮＴＲに隣接しているＣＰ遺伝子である。３−末端よりもシュードノットに近い遺伝子の方が外来遺伝子の発現を増加する主な要因であることが示されている（Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５５， ３１２−３２３）。ＴＭＶ ｓｇＰＲ構造の多くの重要な局面がＷ． Ｄａｗｓｏｎのグループの努力により解明されたが、しかし、これらの著者の一般的結論は「我々はまだベクター構築の経験的段階にいる」というものである（Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．， １９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５５， ３１２−３２３）。
【０１１４】
ＴＭＶゲノムの５’−遠位遺伝子の発現には、これらの遺伝子が全長ＲＮＡ中では翻訳にサイレントであるので、ｓｇＲＮＡの合成が必須であることを上記は示している。サブゲノム化による遺伝子自律化の機構は真核リボソームではポリシストロン性ｍＲＮＡから５’−遠位遺伝子の翻訳ができないことを克服するためにＴＭＶによって使用される方法であると見なすことができる。従来のリボソーム走査モデルにしたがうと（Ｋｏｚａｋ， １９９９， Ｇｅｎｅ ２３４，１８７−２０８）、ポリシストロン性真核ｍＲＮＡの内部遺伝子はリボソームに接近することができない。
【０１１５】
最近、我々はＯｌｅｒａｃｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．植物から十字花科植物感染トバモウイルス（ｃｒＴＭＶ）を単離した。ｃｒＴＭＶの特徴はＢｒａｓｓｉｃａｓｅａｅ科に属するもの全てに感染することができることであった。さらに、このウイルスはＳｏｌａｎａｃｅａｅ科及びその他のＴＭＶ Ｕ１に感受性の植物全てに感染することができた。ｃｒＴＭＶのゲノム（６３１２ヌクレオチド）は配列分析され（Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５０， ５−８）そして１２２−ｋＤａ（ＯＲＦ−１），１７８−ｋＤａ（ＯＲＦ−２），１２２−ｋＤａタンパクの読み過ごし産物、３０−ｋＤａ ＭＰ（ＯＲＦ３），及び１７−ｋＤａ ＣＰ（ＯＲＦ４）のタンパクをコードする４個の古典的ＯＲＦを含むことが示された。ｃｒＴＭＶ ＲＮＡの独特の構造的特徴は、他のトバモウイルスと異なり、ｃｒＴＭＶのＭＰ及びＣＰ遺伝子のコード領域は７５ヌクレオチド重なり合っている、すなわち、ＣＰコード領域の５’−近位部分はＭＰのＣ−末端部分もコードしている。
【０１１６】
そのような用語で示される範囲を含め、明細書及び請求項を明確にしまたその理解を一致させるために、以下の定義を提供する：
隣接：ヌクレオチド配列中の特定の配列に直接接している３’または５’の位置。
増幅ベクター：宿主細胞中に導入された時にその中で複製することができる遺伝子ベクターの一種。
アンチセンス機構：細胞内に少なくとも翻訳されるｍＲＮＡの部分に相補的なＲＮＡ分子の存在により、ｍＲＮＡをタンパクに翻訳する速度を調節することに基づいた遺伝子調節の一種。
キメラ配列または遺伝子：少なくとも二つの異種部分から誘導されたヌクレオチド配列。配列はＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。
コード配列：転写または翻訳された時に、細胞性ポリペプチドを生成するかまたは、翻訳された時に、細胞性ポリペプチドを生成するリボヌクレオチド配列を生成するデオキシリボヌクレオチド配列。
適合：システムの他の成分と共に作動できること。宿主に適合するベクターまたは植物ウイルスはその宿主中において複製できるものである。ウイルスヌクレオチド配列に適合するコートタンパクはそのウイルス配列をキャプシドで被うことができるものである。
遺伝子：個別の細胞生産物に対応する個別のヌクレオチド配列。
発現される遺伝子：発現される技術的目的の遺伝子。
宿主：ベクターまたは植物ウイルス核酸を複製することができる細胞、組織または生物体であり、またそれはウイルスベクターまたは植物ウイルス核酸を含むウイルスに感染することができる。この用語は、適宜、原核及び真核細胞、器官、組織または生物体を含むことを意図している。
宿主植物ゲノム：この用語は望ましくは宿主植物細胞のゲノムを意味するが、ミトコンドリアまたはクロロプラストＤＮＡも含むことがある。
感染：核酸を宿主に移転するまたは宿主中に核酸を導入し、その中でウイルス核酸またはベクターが複製し、ウイルスタンパクが合成され、そして新しいウイルス粒子が組み立てられる、ウイルスまたは増幅用ベクターの能力。これに関係して、用語「伝播」と「感染」はここでは互換的に使用される。
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、またはＩＲＥＳ：翻訳の段階において内部から開始するためのウイルス、細胞または合成のヌクレオチド配列。
その下流遺伝の翻訳に必要なＩＲＥＳ配列：そのＩＲＥＳ配列無しにはこの遺伝子の技術的に意味のある翻訳が生じないという意味において、該遺伝子の翻訳に有効なＩＲＥＳ配列。
非ウイルス遺伝子：ウイルスの生命循環には機能しない遺伝子。
表現型特徴：遺伝子の発現により生じる観察し得る特徴。
植物細胞：プロトプラスト及び細胞壁からなる、植物の構造的及び生理的単位。
植物器官：例えば根、幹、葉または胚のように、明らかにそして可視的に識別される植物の部分。
植物組織：プランターまたは培養中の植物の組織。この用語は植物全体、植物細胞、植物器官、プロトプラスト、細胞培養、または構造的及び機能的単位に組織されている植物細胞の群を含むことを意図している。
生産細胞：ベクターまたはウイルスベクターを複製することができる組織または生物体の細胞であるが、ウイルスの宿主である必要はない。この用語は、細菌、イースト、菌及び植物組織のような原核及び真核細胞、器官、組織または生物体を含むことを意図している。
プロモーター：コード配列の上流にありそしてそれに作動的に接続している、コード配列の転写を開始するのに必要な５’−非コード配列。
プロトプラスト：細胞培養または完全な植物に再生する能力を持つ、細胞壁の無い単離植物細胞。
組換え植物ウイルス核酸：天然に無い核酸配列を含むように修飾された植物ウイルス核酸。
組換え植物ウイルス：組換え植物ウイルス核酸を含む植物ウイルス。
レポーター遺伝子：容易に検出し得る遺伝子産物を提供する遺伝子。
サブゲノムプロモーター（ｓｇＰＲ）：ベクターまたはウイルス核酸のサブゲノムｍＲＮＡのプロモーター。
実質的配列相同性：実質上機能的に相互に同等であるような相同性のヌクレオチド配列を示す。実質的配列相同性を持つ配列間のヌクレオチドの相違は、そのような配列によってコードされている遺伝子産物またはＲＮＡの機能への影響は少ない。
転写：ＤＮＡ配列の相補的コピーとしてＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの生産。
翻訳：（多くはメッセンジャーＲＮＡを走査することによる）リボソームによるポリペプチドの生産。
ベクター：宿主細胞を遺伝的に修飾することができる核酸。ベクターは１本鎖（ｓｓ）（＋）、ｓｓ（−）または二本鎖（ｄｓ）のことがある。
ウイルス：タンパクのカプシドに覆われた核酸からなる感染物質。ウイルスにはモノ−、ジ−、トリ−またはマルチ−パータイトウイルスがある。
【０１１７】
本発明の利点
本発明は、外来（異種、非天然）遺伝子発現のために、これらの遺伝子の翻訳が内部リボソーム侵入機構によりポリシストロン性ＲＮＡから及び／またはＩＲＥＳ介在キャップ非依存内部リボソーム侵入機構により感染細胞中でベクターから生産されたビ−及びマルチ−シストロン性ｓｇＲＮＡから生じることができるような、増幅に基づくベクターを構築する新規方法を提供する。いずれにしても、ＩＲＥＳ配列は遺伝子の翻訳に必要である。この方法の一つの利点はｓｇＰＲに関する特別な操作を必要としないことである：ベクターに挿入するべき唯一の配列は翻訳する遺伝の上流のＩＲＥＳ配列（天然または／及び非天然）である。結果として、下流遺伝子の翻訳は挿入したＩＲＥＳ配列により促進される、すなわちキャップ非依存である。ＩＲＥＳ配列を含む配列部分は技術的意味がある程度にはサブゲノムプロモーターとして機能しないことが望ましい。このことは、この配列部分が対応するサブゲノムＲＮＡの検出できるような生産を行なわないし、また、該配列部分の残余サブゲノムプロモーター活性により生成した場合でも、そのサブゲノムＲＮＡを翻訳するために下流遺伝子の翻訳にはこのＩＲＥＳ配列がなお必要であることを意味する。したがって、特別な場合に、ベクターによって生産された一次組換えＲＮＡは、望ましくはウイルス起源の一つまたはそれ以上の構造遺伝子、該ＩＲＥＳ配列、ＩＲＥＳの下流に位置する目的の（外来）遺伝子及び３’−ＮＴＲを含む。この方法はそれぞれが分離したＩＲＥＳによって調節される２（またはそれ以上）の外来遺伝子の直列挿入による１以上の外来遺伝子の同時発現を可能にすることは重要である。本発明は、ウイルスゲノムまたはそのサブゲノムＲＮＡまたは非天然（外来）核酸配列のキャップ非依存発現により特徴づけられ、そして追加の植物特異的ＩＲＥＳ配列によりその外来配列を宿主植物中全体に発現できる核酸及び組換えウイルスに向けられることが望ましい。
【０１１８】
最初の望ましい態様において、その中のウイルス核酸から天然コートタンパクコード配列及び天然ＣＰサブゲノムプロモーターが削除され、そして宿主植物中においてキャップ非依存発現を可能にする植物ウイルスＩＲＥＳ配列を持つ非天然植物ウイルスコートタンパクコード配列が上流に挿入され、組換え植物ウイルス核酸の構造及び組換え植物ウイルス核酸によるその後の宿主全体の感染は維持されているような植物ウイルス核酸が提供される。
【０１１９】
組換え植物ウイルス核酸は、翻訳配列として機能しそして転写作用を持たない、つまり、サブゲノムプロモーターとして有効に機能することができない、１またはそれ以上の追加の天然または非天然ＩＲＥＳ配列を含むことができる。各天然または非天然ＩＲＥＳ配列は、宿主植物において隣接遺伝子または核酸配列のキャップ非依存発現を行なうことができる。
【０１２０】
第二の望ましい態様において、外来核酸配列の上流に位置する天然または非天然植物ウイルスＩＲＥＳ配列が天然コートタンパク遺伝子の下流に挿入されている増幅及び発現ベクターが提供される。挿入された植物ウイルスＩＲＥＳは宿主植物における隣接遺伝子のキャップ非依存発現を指令することができる。望む生成物を合成するためにＩＲＥＳ配列の翻訳調節の下に宿主植物中において該配列が発現するように非天然核酸配列をＩＲＥＳ配列に隣接して挿入することができる。
【０１２１】
第三の望ましい態様において、下流に位置する外来核酸配列をもつ天然または非天然植物ウイルスＩＲＥＳ配列が天然コートタンパクサブゲノムプロモーター及びコートタンパク遺伝子の上流に挿入されていることを除いて、第二の態様におけると同様に組換えベクター核酸が提供される。
【０１２２】
第四の望ましい態様において、天然または非天然植物ウイルスＩＲＥＳ配列がウイルスゲノムの５’末端にまたは下流遺伝子の翻訳をキャップ非依存にするようにウイルスサブゲノムＲＮＡ中に使用されている組換えベクター核酸が提供される。
【０１２３】
第五番目の態様において、キャップ依存翻訳の抑制が該ベクターからのキャップ非依存翻訳のレベルを増加させるために使用される。
【０１２４】
ウイルス由来増幅ベクターは組換え植物ウイルスを産生する組換え植物ウイルス核酸によってコードされているコートタンパクにより覆われている。組換え植物ウイルス核酸は宿主中において複製し、宿主全体に拡散し、そして外来遺伝子のキャップ非依存発現または目的とする生産物を生産するために全ウイルスゲノムまたはサブゲノムＲＮＡのキャップ非依存発現を行なうことができる。その生産物は、例えば、これに限定しないが、酵素、２分子複合体、またはポリペプチドまたは特性またはアンチセンスＲＮＡ生成により得られる産物のような医療用及びその他の有用なポリペプチドまたはタンパクを含んでいる。望ましい導入特性の例は除草剤抵抗性、耐昆虫性、抗菌性、ウイルス耐性、細菌耐性、抗生ストレス耐性、及びエネルギー及び物質利用効率改善である。望ましい生産物特性の例は、改良炭水化物、改良多糖類、改良脂質、改良アミノ酸組成及び量、改良二次代謝物、及び酵素、抗体、抗原などを含む医療用タンパクである。特性調節成分の例は、遺伝子スイッチ、遺伝子発現の調節、交雑種子生産の調節、及びアポミクシスの調節である。
【０１２５】
本発明は、植物細胞（そして多分さらにイーストまたは動物細胞）中において目的遺伝子のキャップ非依存及びプロモーター非依存発現を行なう人工的、非天然ＩＲＥＳ配列（生きている生物体から単離したＩＲＥＳに対するものとして）を創り出す方法も指向している。ＩＲＥＳを取出すことができる生きた生物体の例は動物ウイルス及び植物ウイルスである。動物ウイルスの例はＣ型肝炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、ポリオウイルス及び脳心筋炎ウイルスのようなピコルナウイルス、及びモロニーネズミ白血病ウイルスのようなレトロウイルス、及びハーベイネズミ肉腫ウイルスである。植物ウイルスの例はポテトウイルスＸ、ポテトウイルスＹ及びカブモザイクウイルス、十字花感染トバモウイルスのようなトバモウイルス、及びササゲモザイクウイルスのようなコモウイルスである。その他に、天然ＩＲＥＳは、アンテナペディアホメオティック遺伝子、人繊維芽細胞増殖因子２、及び翻訳開始因子ｅｌＦ−４Ｇから由来する細胞性メッセンジャーＲＮＡから単離することができる。
【０１２６】
第六の望ましい態様において、人工的、非天然ＩＲＥＳは、イースト、動物及び植物を含む真核細胞の１８Ｓ ｒＲＮＡに対する相補性に基づいて創出される。
【０１２７】
第七の望ましい態様において、人工的、非天然ＩＲＥＳはアデノシン／グアノシン塩基の短い鎖の反復に基づいて創出される。
【０１２８】
本発明の第八の望ましい態様において、ウイルス由来増幅ベクターの操作及び使用方法が示され、その中において植物細胞中においてウイルスゲノムの発現は植物特異的人工的転写プロモーターの調節の下に生じる。
【０１２９】
本発明の第九の望ましい態様において、ウイルス由来増幅ベクターの構築及び使用方法が示され、そのベクターは一次核転写処理の結果として植物細胞内に生成したレプリコンからの発現を可能にする。
【０１３０】
本発明の第十の望ましい態様において、植物中において外来遺伝子をキャップ非依存的に発現するために環状１本鎖ウイルス由来増幅ベクターを使用する方法が記述される。
【０１３１】
本発明の第十一の望ましい態様において、キャップ非依存翻訳に好ましい条件下で細胞中において目的の遺伝子を発現することを可能にする方法が示される。一例において、増幅ベクターに感染した細胞はキャップ依存翻訳を抑制する化合物で処理される。別の例では、ベクター自身が遺伝子、その生成物が宿主中においてキャップ依存翻訳に対して抑制作用を有するかまたは該機能を持つアンチセンス配列を有している。
【０１３２】
本発明の第十二の態様において、インビボ遺伝子選択を使用することにより、目的の遺伝子または発現ベクター中のレポーター遺伝子のキャップ非依存的発現をするＩＲＥＳ配列を同定することを可能にする方法が記述される。
【０１３３】
発明の詳細な説明
本発明の第一の目的は、その遺伝子の翻訳がＩＲＥＳ介在キャップ非依存内部リボソーム結合機構により、増幅ベクター、望ましくは植物細胞においてウイルスベクター、によって生産されたポリシストロン性ゲノムウイルスＲＮＡから及び／またはビ−及びマルチシストロン性ｓｇＲＮＡから生じるような、外来（異種、非天然）遺伝子発現用の増幅に基づくベクターを構築する方法を提供することである。
【０１３４】
組換え植物ウイルスＲＮＡの構築及び植物中において外来遺伝子の導入及び発現をするための増幅に基づくベクターの創製は種々の分類学上の群に属するウイルスのゲノムを使用して多数の著者により提示されている（総説として、”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ”， １９９２， ｅｄｓ． Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．参照）。トバモウイルスはウイルスベクターの構築に便利な材料と考えられている。Ｄｏｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔｓ Ｎｏ． ５，３１６，９３１； ５，５８９，３６７及び５，８６６，７８５）は宿主植物において種々の外来遺伝子を発現することができるＴＭＶ由来ベクターを創製した。このようにして、ネオマイシンリン酸転移酵素、ａ−トリコサンチン及びその他数種の外来遺伝子がＴＭＶ ＣＰのサブゲノムプロモーター（ｓｇＰＲ）に隣接して挿入された。Ｄｏｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３， ＰＣＴ ＷＯ ９３／０３１６１）はトバモウイルスに基づいて「該非天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターは宿主植物中の隣接核酸配列の転写を開始することができそして組換え植物ウイルス核酸サブゲノムプロモーターとの組換えができずそして組換え植物ウイルス核酸は宿主植物全体に感染することができるような、天然植物ウイルスサブゲノムプロモーター、少なくとも一つの非天然植物ウイルスサブゲノムプロモーター及び植物ウイルスコートタンパクをコードする配列を含む組換え植物ウイルス核酸」を開発した。
【０１３５】
Ｄｏｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，の技術とは異なり、本発明はウイルスレプリコンに基づく植物発現システムを構築するためにｓｇＰＲに関係していない。ｓｇＰＲの代わりに、我々の技術は種々の起源（ウイルスにとって固有または非固有）のＩＲＥＳ配列、有効なｓｇＰＲ作用のない、すなわち、ｓｇＲＮＡ生成を促進することができない配列、を扱う。したがって、このＩＲＥＳ配列はｓｇＰＲの機能しない部分である場合でもｓｇＰＲと見なすべきではない。
【０１３６】
ｃＤＮＡクローンのインビトロ転写後に得られる全長ウイルスＲＮＡのキャップの無い転写物は一般的に完全植物及び単離プロトプラストに対する感染性はない、と一般的に考えられている。したがって、ウイルス発現ベクターＲＮＡ転写物のキャップ付加がインビトロ転写物感染のために予め必要であると一般に考えられている。キャップ付加ＲＮＡ転写物は植物にウイルスベクターＲＮＡを導入するために広く使用される。ある場合にはウイルスＲＮＡは簡単なインビトロ集合方法を使用してコートタンパクによりキャプシドで被うことができる。このように、ベクターＲＮＡを含むＴＭＶビリオン並びに擬ビリオンを容易にＣＰ及びインビトロ転写物または精製真正ウイルスＲＮＡから作製することができる。約１５年前、Ｍｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ５０４３−５０４７） により、（１）インビトロで作製された全長ＴＭＶ ＲＮＡのキャップの無い転写物はキャップ同族体が無いのに感染性であり、しかし固有感染性は非常に低いことが示された。
【０１３７】
本発明において、ＴＭＶ ＣＰと再構成したキャップの無い発現ベクターＲＮＡはその低感染性を克服するために植物の接種のために使用することができる。本発明に記述されている少なくとも１つの追加の方法はキャップ非依存植物ウイルスベクターによる植物感染の技術的可能性を開示する。これは適当なＤＮＡプロモーターの調節下にウイルスベクターの全長１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡコピーの挿入方法である。宿主植物に組換えウイルスＤＮＡを接種した後、複製しそして植物中に拡散することができる植物ウイルスベクターの感染性全長ＲＮＡが生産される。言い換えると、これらの方法は、ＩＲＥＳにより促進される外来遺伝子のキャップ非依存発現を利用して、両過程、つまり宿主植物接種及び外来遺伝子発現を完全にキャップ非依存にする。
【０１３８】
本発明の重要な望ましい目的はＣＰ遺伝子及び３’−ＮＴＲの間に挿入された「ＩＲＥＳ−外来遺伝子」ブロックを持つ一連のｃｒＴＭＶゲノム由来ウイルスベクターを創製することである。種々のＩＲＥＳ及び対照配列は二つの異なるレポーター遺伝子（ＧＵＳ及びＧＦＰ）と組合わせて使用された（図１１参照）。本発明の独特の特徴は、ベクターによって生産されたゲノム及びｓｇＲＮＡの３’−近位位置からウイルスｓｇＰＲ配列の外側に位置する外来遺伝子がキャップ非依存的に感染植物中において発現したことである。特に、ｃｒＴＭＶ ｓｇＲＮＡ Ｉ２の５’−非翻訳リーダー配列の３’−末端部分であるＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ配列は、ウイルスベクターに感染した植物における３’−近位の外来遺伝子のキャップ非依存発現を有効に仲介した。該ｃｒＴＭＶ由来ウイルスベクターは感染植物中に３型のウイルス（＋）ｓｓＲＮＡを生産する、それらは：ｉ）全長ゲノムＲＮＡ、ｉｉ）トリシストロン性Ｉ２ ｓｇＲＮＡ （我々のデータは全長ＲＮＡとは逆に後のｓｇＲＮＡはキャップが無いことを示している）、及びｉｉｉ）第一ＣＰ遺伝子及び第二外来遺伝子を含むビシストトン性ｓｇＲＮＡ。したがって、これらのＲＮＡは全て３’−共通末端でありそしてキャップのある（全長及びビシストロン性）またはキャップの無い（トリシストロン性）ＲＮＡのいずれの３’−近位遺伝子のキャップ非依存翻訳も先行するＩＲＥＳ配列によって促進される。
【０１３９】
ウイルス由来ベクターの重要な特性はその安定性である。しかし、外来遺伝子を持つＴＭＶ由来ベクターは通常野生型ウイルスには全身感染する植物の篩管を通じて有効に移動しない。これは組換えウイルスＲＮＡの長さが増加したことによる及び／または野生型への復帰を生じる組換え及び削除をすることができる反復配列の存在によるであろう。後継集団の野生型ウイルスへの変換が全体的に感染した葉において生じる。
【０１４０】
ウイルス由来ベクターの重要な特性は外来タンパク遺伝子の発現レベル及びタンパク蓄積のレベルである。このベクターはＳＤＳ−ＰＡＧＥ中において容易に認め得る染色されたＧＵＳバンドを生産することができる。
【０１４１】
宿主植物中において外来配列を発現することができる増幅に基づくベクターを構築するのに適した技術は種々のウイルスゲノムに基づいて開発されてきた（例えば、Ｇ． Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＰＣＴ ＷＯ ９９／３６５１６参照）。これらの発明者の中心的特徴は、組換え植物ウイルス核酸が「宿主植物中において隣接する核酸配列を転写または発現することができる１またはそれ以上の非天然サブゲノムプロモーターを含むことであった。組換え植物ウイルス核酸はさらに修飾されて、天然コートタンパクコード配列の全部または一部が削除され、そして天然または一つの非天然宿物ウイルスサブゲノムプロモーターの調節を受ける非天然コートタンパクコード配列を含むか、または天然コートタンパクコード配列を非天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターの調節下に置く」。言い換えると、その発明の最も重要な配列は、ウイルスベクターによる人工的ｓｇＲＮＡ生産に使用される天然及び非天然ｓｇＰＲ配列である。我々によって提出された発明の重要な特徴は、ＷＯ ９９／３６５１６によると、外来遺伝子は必然的にｓｇＰＲ配列のすぐ下流に位置しなければならない、すなわち、宿主植物中においてウイルスベクターにより生産されたキメラｓｇＲＮＡの５’−近位位置に局在しなければならないとする他の発明とは区別される。これに対して、我々の発明は、該外来遺伝子が３’−近位に存在するかまたはベクターによって作られた機能的に活性なキメラｓｇＲＮＡの内部に局在するように、外来遺伝子はｓｇＰＲ（もし存在すれば）から少なくとも１（またはそれ以上）のウイルス遺伝子で分離されている。この様に、外来遺伝子発現は野生型ウイルスの天然または非天然ＩＲＥＳ配列によって促進される。
【０１４２】
本発明の次の望ましい目的は新しい型の非天然ＩＲＥＳ配列、つまり真核ポリシストロン性ｍＲＮＡから５’−遠位遺伝子のキャップ非依存翻訳をすることができる人工的、非天然合成ＩＲＥＳを構築することである。我々は、種々の長さ及び組成の１８Ｓ ｒＲＮＡに相補的なシストロン間スペーサーがビシストロン性Ｈ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＧＵＳ ｍＲＮＡの３’−近位ＧＵＳ遺伝子のキャップ非依存翻訳を仲介することができることを示す（図２２）。
【０１４３】
本発明により提供される最後のしかし最小でない利点は、増幅に基づくベクターゲノム中の天然または非天然ＩＲＥＳ配列に先行する２以上の外来遺伝子それぞれの反復を結合する可能性である。「ＩＲＥＳ−外来遺伝子」のカセットの発現はベクターによる２以上の外来タンパクの同時生産を可能にするであろう。
【０１４４】
異なる分類群に属するウイルスを本発明の原理に従ってウイルス由来ベクターの構築に使用することができる。これはＲＮＡ−及びＤＮＡ−含有ウイルスのいずれにも当てはまり、その例を以下に示す（この文書を通して、各型種の名称はそれが属す目、科及び属の名称の順に示す。目、科及び属の名称は、それがＩＣＴＶにより承認されていれば、イタリック体で表示する。引用譜中の分類名（及びイタリック体でない）はこの分類が国際ＩＣＴＶ承認の名称でないことを示す。種（俗称）名は標準体で示される。正式な属または科の分類がされていないウイルスはその旨示される）：
【０１４５】
ＤＮＡウイルス：
環状ｄｓＤＮＡウイルス：
科：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ，型種：ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，属：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，属 ”ＳｂＣＭＶ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ”，型種：Ｓｏｙｂｅａｎ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，属 ”ＣｓＶＭＶ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ”，型種：Ｃａｓｓａｖａ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，属 ”ＲＴＢＶ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ”，型種：Ｒｉｃｅ ｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ，属：”Ｐｅｔｕｎｉａ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ”，型種：Ｐｅｔｕｎｉａ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ；
【０１４６】
環状ｓｓＤＮＡウイルス：科：Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ （亜属 Ｉ Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ），型種：ｍａｉｚｅ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ，属：Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ （亜属ＩＩ Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ），型種：ｂｅｅｔ ｃｕｒｌｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ，属：Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ （亜属ＩＩＩ Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ），型種：ｂｅａｎ ｇｏｌｄｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ；
【０１４７】
ＲＮＡウイルス：
ｓｓＲＮＡウイルス：科：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ，属：Ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，属：Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ，型種：ｔｏｂａｃｃｏ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ，属：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，属：Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ；
科：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ，型種：ｂｅｅｔ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ，属：Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ，型種：Ｌｅｔｔｕｃｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ，科：Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｃｏｗｐｅａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，属：Ｆａｂａｖｉｒｕｓ，型種：ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ １，属：Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ，型種：ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ；
科：Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ，型種：ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ，属：Ｒｙｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｒｙｅｇｒａｓｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，属：Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｂａｒｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ；
科：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓ，型種：ｐａｒｓｎｉｐ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ，属：Ｗａｉｋａｖｉｒｕｓ，型種：ｒｉｃｅ ｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｖｉｒｕｓ；
科：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，属：Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ，型種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，属：Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｍａｉｚｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，属：Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ，型種：ｔｏｂａｃｃｏ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，属：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ，型種：ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ，属が特定されないｓｓＲＮＡウイルス、
属：Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ，型種；ａｐｐｌｅ ｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇ ｖｉｒｕｓ；
属：Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ，型種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ；
属：Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｐｅａ ｅｎａｔｉｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，
属：Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ，型種：ｓｏｉｌ−ｂｏｒｎ ｗｈｅａｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，属：Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ，型種：ｂａｒｌｅｙ ｓｔｒｉｐｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，属：Ｉｄａｅｏｖｉｒｕｓ，型種：ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ｂｕｓｈｙ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ；
属：Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ，型種：ｂａｒｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ；
属：Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ，型種：ｍａｉｚｅ ｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏ ｖｉｒｕｓ；
属：Ｐｏｔｅｘｖｕｉｒｕｓ，型種：ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ；
属：Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ，型種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ， 属：Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ， 型種：ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ，
属：Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，
属：Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ，型種：ｔｏｂａｃｃｏ ｒａｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，
属：Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ，型種：ａｐｐｌｅ ｃｈｏｌｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，
属：Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ，型種：ｔｕｒｎｉｐ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，
属：Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ，型種：ｃａｒｒｏｔ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ；
【０１４８】
（−）ｓｓＲＮＡウイルス：目：Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ，科：Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ，型種：ｌｅｔｔｕｃｅ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ，属：Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ，型種：ｐｏｔａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ；
（−）ｓｓＲＮＡウイルス：科：Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ，型種：ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ；
【０１４９】
ｄｓＲＮＡウイルス：科：Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ，属：Ａｌｐｈａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ，型種：ｗｈｉｔｅ ｃｌｏｖｅｒ ｃｒｙｐｔｉｃ ｖｉｒｕｓ １，属：Ｂｅｔａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ，型種：ｗｈｉｔｅ ｃｌｏｖｅｒ ｃｒｙｐｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ２，科：Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ，属：Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ，型種：Ｆｉｊｉ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，属：Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ，型種：ｗｏｕｎｄ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ，属：Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ，型種：ｒｉｃｅ ｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ；
【０１５０】
分類されていないウイルス：ゲノムｓｓＤＮＡ：種ｂａｎａｎａ ｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ，種ｃｏｃｏｎｕｔ ｆｏｌｉａｒ ｄｅｃａｙ ｖｉｒｕｓ，種ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃｌｏｖｅｒ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ，
ゲノムｄｓＤＮＡ、種ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ ｖｉｒｕｓ，
ゲノムｄｓＲＮＡ、種ｔｏｂａｃｃｏ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ，
ゲノムｓｓＲＮＡ、種Ｇａｒｌｉｃ ｖｉｒｕｓ Ａ， Ｂ， Ｃ， Ｄ，種ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ，種ｍａｉｚｅ ｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，種ｏｌｉｖｅ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ ２，種ｏｕｒｍｉａ ｍｅｌｏｎ ｖｉｒｕｓ，種Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ；
【０１５１】
サテライト及びウイロイド：サテライト：ｓｓＲＮＡサテライトウイルス；亜群２サテライトウイルス、型種：ｔｏｂａｃｃｏ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ，
サテライトＲＮＡ、亜群２ Ｂ型ｍＲＮＡサテライト、亜群３ Ｃ型線状ＲＮＡサテライト、亜群４ Ｄ型環状ＲＮＡサテライト、
ウイロイド、型種：ｐｏｔａｔｏ ｓｐｉｎｄｌｅ ｔｕｂｅｒ ｖｉｒｏｉｄ。
【０１５２】
特に、本発明の方法は、望ましくはＴｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ属またはＢｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ科またはＰｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ科に属するプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス並びにＤＮＡ含有ウイルスの組換えゲノムを使用してウイルスレプリコン由来ベクターの構築に望ましく適用することができる。後の場合には外来遺伝子は望ましくはウイルス遺伝子の下流に存在すべきでありそしてその発現はゲノム転写プロモーターのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたビシストロン性またはポリシストロン性ｍＲＮＡのＩＲＥＳ配列により仲介され得る。
【０１５３】
本発明の別の望ましい態様は、ｓｓＤＮＡ由来ベクターの構築に本発明の方法を適用することに関係している。ＩＲＥＳ配列の調節下に外来遺伝子を発現するジェミニウイルス由来ベクターはこの態様を代表することができる。ジェミニウイルスは、双球形準２０面体粒子のモノパルタイトまたはビパルタイト環状ｓｓＤＮＡの植物ウイルス群である（総説：Ｈｕｌｌ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， １９８３， Ａｄｖ． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ２８， １−４５； Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９９２， ”Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ”， Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， ｅｄｓ．， １９９２， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）。ビパルタイトジェミニウイルスの２個のｓｓＤＮＡ成分はそれぞれ４及び２タンパクをコードするＡ及びＢと呼ばれる。ＤＮＡ ＡはＣＰ遺伝子及びＤＮＡ複製に必要な３遺伝子を含み、一方ＤＮＡ Ｂはウイルス移動に必須な２タンパクをコードしている。トマト金色モザイクウイルス（ＴＧＭＶ）及びマメ金色モザイクウイルス（ＢＧＭＶ）のようなＢｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ属に属するビパルタイトジェミニウイルスのゲノムはＣＰ遺伝子が欠失しているにもかかわらず複製しそしてある植物全体に拡散することができる（Ｇａｒｄｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＥＭＢＯ Ｊ． ７， ８９９−９０４； Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２３， ２０８−２１８； Ａｚｚａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４， ２８９−２９６）。ＢＧＭＶを含む一部のｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓは篩管限定を示し、管系の細胞に限定される。この様にＢＧＭＶは篩管限定的であるが、ＴＧＭＶは感染した葉全体の中葉組織に侵入することができる（Ｐｅｔｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｒａ， ２０００， Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ １９ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ｐ．１２７）。本発明はビパルタイトジェミニウイルスゲノム中に二つの方法により外来遺伝子を挿入することを提案する：（ｉ）その（例えば、ＢＧＭＶ）遺伝子、特にＣＰ ＯＲＦが完全であるかまたは３’−短縮があるようなＣＰ遺伝子、の一つの下流でそして外来遺伝子の上流にＩＲＥＳ配列が挿入されている。したがって、ｍＲＮＡ転写は固有のＤＮＡプロモーターにより進行し、第一ウイルス遺伝子（またはその一部）、ＩＲＥＳ配列及び３’−近位外来遺伝子のＩＲＥＳ仲介発現を含むビシストロン性キメラｍＲＮＡを生成する。その他に、（ｉｉ）ウイルスベクターのＲＮＡゲノムの全長ＤＮＡコピーをＣＰ遺伝子プロモーターの調節下にＣＰ欠失ビパルタイトジェミニウイルスのＤＮＡ中に挿入することができる。ＲＮＡベクターウイルスのＲＮＡゲノムは、組換えＤＮＡ Ａ及び非修飾ＤＮＡ Ｂの混合物を接種された植物細胞中におけるＤＮＡ Ａの転写の結果として生産される。本方法の利点は、ジェミニウイルスが一次接種細胞へベクターを輸送するためにのみ使用される担体として必要であることである：その他の全ての段階、細胞性ＲＮＡポリメラーゼによるジェミニウイルスベクターＤＮＡの転写の後のＩＲＥＳ含有ベクターＲＮＡの生産、その複製、翻訳及び宿主植物全体への拡散及び外来遺伝子の発現、はトバモウイルスベクター自身によって実行されるであろう。ｓｓＤＮＡベクターの創製に関するその他の可能性として、ウイルスｃＤＮＡ及び外来遺伝子のファージミドベクターへのクローニング及び標準的方法によるｓｓＤＮＡの作製について言及することができる。
【０１５４】
トバモウイルス由来ＩＲＥＳ配列は動物細胞において機能的作用をもつことが示されている（我々の以前の特許出願）ことを考慮して、本発明の方法は組換えウイルスＲＮＡの構築及び植物ウイルス由来ＩＲＥＳ配列の調節の下に外来遺伝子を発現する新規ベクターを作製するために動物ウイルス、例えば、科Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ， Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ， Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ， Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ， Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅに属するウイルスを基にしたウイルスベクターの作製、に使用することができる。植物及び動物のためのそのような動物ウイルス由来ベクターはワクチン生産分野または遺伝子治療に有用であり得る。
【０１５５】
しかし、Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓの桿状ビリオン及び、特に、Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ，Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ，Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ及びＣｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓの柔軟なそして長いビリオンは本発明方法を実現する最良のモデルを提供する。
【０１５６】
本発明の次の望ましい目的は、ウイルス由来増幅ベクターがその５’−ＮＴＲの中にＩＲＥＳを含むようにＩＲＥＳを使用することである。ＩＲＥＳ配列の挿入はウイルス複製を阻害せずに、ゲノムベクターＲＮＡの転写物の有効なキャップ非依存翻訳を保証すると考えられている。したがって該構築は以下を含むことができる：（ｉ）５’−非翻訳リーダー配列の中または下流にある該ウイルスベクターにとって固有または非固有でありそしてウイルス５’−近位遺伝子（ＲｄＲｐ）のキャップ非依存発現を促進するＩＲＥＳ配列、及び（ｉｉ）１またはそれ以上のウイルス構造遺伝子の下流及びそのキャップ非依存翻訳を促進するために外来遺伝子の上流に位置する少なくとも一つの天然または非天然ＩＲＥＳ配列。本方法によると、キャップの無い全長ベクター転写物の固有感染性は一次接種細胞における親ＲＮＡ分子の有効な５’−ＩＲＥＳ仲介翻訳のために増加するであろう。
【０１５７】
本発明のさらに他の望ましい目的は、モノまたはポリシストロン性ｍＲＮＡ配列から外来遺伝子を導入しそして該外来遺伝子の上流に位置する植物特異的ＩＲＥＳ配列により仲介される発現をさせることに基づいて植物細胞において目的の１個または数個のタンパクを生産する方法である。本方法の特徴は、ある化学物質の助けにより細胞性キャップ依存ｍＲＮＡ翻訳のスイッチを選択的に切ることができる方法をこの技術が含んでいることである。しかし、この方法は植物細胞に人工的に導入したｍＲＮＡのキャップ非依存ＩＲＥＳ仲介翻訳には影響しないので、キャップ非依存発現を調節及び増強することが可能である。
【０１５８】
その他に、キャップのある細胞性ｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法をキャップ非依存様式で外来遺伝子を発現する該ウイルスベクター自身を感染させた植物に適用することができる。キャップのある細胞性ｍＲＮＡの翻訳が抑制される条件下において該ウイルスベクターの外来遺伝子の選択的発現が生じる。
【０１５９】
本発明のベクターはＲＮＡまたはＤＮＡベクターであり得る。ｓｓ（＋）， ｓｓ（−）またはｄｓであろう。既知のウイルス増幅様式のいずれかを示すであろう。これにはベクター核酸の増幅及び追加してコートタンパクの生産及び細胞間移動または長距離移動のためのタンパクの生産が含まれる。必要な複製及び／またはコート及び／または移動のための遺伝子は全体的にまたは部分的に適当に操作された宿主植物中にコードすることができる。この様にして、相互に適合したベクター及び宿主植物からなるシステムが創られる。
【０１６０】
ベクターは修飾によりウイルスから誘導されるかまたは新しく合成することができる。それはサブゲノムプロモーター作用を有効に排除したＩＲＥＳ配列のみを持つことができる。しかし、プロモーターの数よりもシストロンの数が大きくなるように、ベクターは１個または数個のサブゲノムプロモーターとサブゲノムプロモーター機能を有効に排除したＩＲＥＳ配列の１個または数個とを結合することができる。
【０１６１】
１個のＩＲＥＳ配列の最も簡単な場合を考えると、該配列は直接該ＩＲＥＳ配列によって発現される目的の（外来）遺伝子の上流にそしてさらにＩＲＥＳ非依存的に発現される（複製という）ために（ウイルス）遺伝子の下流に位置させることができる。その他には、目的の遺伝子はＩＲＥＳ配列の上流に存在し、そしてＩＲＥＳ非依存発現されそして下流ウイルス遺伝子の発現に対してＩＲＥＳ配列として役立つことができる。この最も単純なケースは勿論より複雑なベクターに一つまたは多数組込むことができる。
【０１６２】
ベクターは宿主遺伝子を抑制するためにアンチセンス方向に配列を含むことができる。抑制機能は単独にまたは目的の（外来）遺伝子の発現と組合わせて存在することができる。特に望ましい場合は、宿主植物の翻訳機構が完全にベクター遺伝子の翻訳に使用されるように、キャップ依存翻訳に必須な遺伝子、例えば、キャップ依存性翻訳に関連する翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４）の遺伝子、の抑制を必要とする。この場合に、ベクターは完全にキャップ非依存でなければならない。勿論、ベクターは植物細胞内で植物核酸プロセッシング機構、例えば、イントロンスプライシングによりプロベクターから発生することができる。
【０１６３】
ＩＲＥＳ配列は植物ウイルス起源であり得る。その他には、植物細胞中における作動性の要求を充たす限り、その他のいずれのウイルス起源であっても良い。さらに、植物細胞中において作動するＩＲＥＳ配列は合成的または人工的配列であっても良い。合成は宿主植物の１８Ｓ ｒＲＮＡの配列、つまり、ＩＲＥＳ結合に作動的部分、に続けて行われる。それに充分相補的でなければならない。相補性の程度はＩＲＥＳ機能を試験することにより簡単に調べることができる。この意味における相補性はＧＣ，ＡＵ及びある程度はＧＵ塩基のペアリングに関係している。さらに、そのＩＲＥＳ配列は有効性を増加させるためにその相補配列の多量体になっていることがある。多量体は同一の本質的相補性配列単位からかまたは異なる本質的相補性配列単位から構成される。さらに、高い翻訳効率及びサブゲノムプロモーター作用を全く持たない人工的ＩＲＥＳ配列は直接発生の方法により作製することができる（例えばＵＳ ６，０９６，５４８またはＵＳ ６，１１７，６７９に記述されているように）。これは、それ自体既知であるランダム化したＩＲＥＳ配列を持つベクター集団のインビトロ細胞培養において実施することができる。潜在的なＩＲＥＳ配列と作動的に結合したレポーター遺伝子を発現するクローンをそれ自体既知の方法により選択する。サブゲノムプロモーター作用を示すクローンを除去する。さらに、ランダム化及び選択の循環を続けることができる。
【０１６４】
本発明のベクターのＩＲＥＳ配列はプロモーター作用を有効に除去すことができる。これはＩＲＥＳ配列に作動的に結合した遺伝子の発現は残るサブゲノムプロモーター作用によって生じているのではないことを意味する。この作用様式は、ノーザンブロット、プライマー伸長分析（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｄ． Ｂｙ Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、５’ＲＡＣＥ技術 （ＧｉｂｃｏＢＲＬ， ＵＳＡ）などのような標準的分子生物学的方法により決定することができる。検出可能なサブゲノムプロモーター作用を示すが本質的には転写よりは翻訳配列として作動するＩＲＥＳ配列も我々の発明の対象であることは付け加える必要がある。その識別は、例えば、二つの型のｍＲＮＡの相対的量をノーザンブロット上で定量的に測定することにより、すなわち短いｍＲＮＡはｓｇＰＲ作用が原因であり、長いｍＲＮＡはｓｇＰＲ作用が原因ではない事から導かれる。もしＩＲＥＳ配列が残余ウイルスサブゲノムプロモーターとして本質的に作動しないならば、短ｍＲＮＡに相当する相対的量は短および長ｍＲＮＡの合計の２０％以下、望ましくは１０％以下そして最も望ましいのは５％以下でなければならない。このように我々は望ましい態様として、該遺伝子の発現が本質的に分子生物学の標準的方法により測定された時に該ＩＲＥＳ配列の転写よりも翻訳の性質から引き出されるという条件付きで、発現される少なくとも一つの非ウイルス遺伝子を持ちそして該植物中の該遺伝子の翻訳に必要な少なくとも一つのＩＲＥＳ配列を持つかまたはコードする核酸を含む植物中において遺伝子の増幅をすることができるベクターを提供する。
【０１６５】
本発明の新規ベクターは植物の遺伝子修飾に新しい道を開くものである。最初の可能性として我々は植物の構造遺伝子の機能決定のために使用することを示す。これはゲノミクスにとって特に重要である。したがって、ゲノムが配列分析された植物は特に重要である。これは小規模（植物毎）な応用である。本発明のベクターは、目的の遺伝子の抑制及び／または遺伝子の過剰発現をして発見すべき遺伝子機能を強調した形で引き出すことができるので、この応用に高い有効性を示す。
【０１６６】
大規模な応用においてベクターを宿主植物中における特性の付加またはタンパクの生産のために使用することができる。ベクターによる植物の感染は非修飾植物を予め植えた農場において行なうことができる。これは最初に農場における植物の遺伝子修飾を可能にするので、これにより農民は望むタンパクまたは特性を生産するために種々の資源から種子及びベクターを選択することに関して最大の自由度を持てる。
【０１６７】
本発明の応用のために重要な植物種の例は、コムギ、トウモロコシ、コメ、オオムギ、エンバク、アワ、などの単子葉植物またはアブラナ種子、キャノーラ、サトウダイコン、ダイズ、エンドウマメ、アルファルファ、ワタ、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、タバコなどのような双子葉植物である。
【０１６８】
以下に、個別例をひいてさらに本発明を記述する。標準的分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に従って行なった。本発明に使用したプラスミドは全て当業者が容易に入手し得る原料を使用し、過度の実験を行なうことなく、明細書の指示に従って当事者により調製することが出来る。
【０１６９】
例１
アブラナ科植物に感染するトバモウイルスベクターの構築
アブラナ科植物全体に感染することができるアブラナ科トバモウイルス（ｃｒＴＭＶ）と呼ばれる既知トバモウイルスのビリオンはモザイク症状のあるＯｌｅａｒａｃｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．から単離した。ＴＭＶ宿主範囲試験の結果を表１に示す。
【０１７０】
プラスミド構築
ＣｒＴＭＶ ｃＤＮＡはジデオキシヌクレオチド配列分析により分析した（Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５０， ５−８）。全長Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター由来感染性ｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡクローンをオリゴヌクレオチドｃｒＴＭＶ１−Ｋｐｎ ５’−ｇｃａｔｇｇｔａｃｃｃｃｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ、（この中でイタリック太字はＫｐｎＩ部位の配列であり、下線付きの小文字はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列であり、大文字はｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡの５’−末端からのものである）；及びｃｒＴＭＶ２ ５’−ｇｃａｔｇｃｇｇｃｃｇｃＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＣＣＧＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（下流）、（この中でイタリック太字はＮｏｔＩ部位であり、小文字はｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡの３’−末端からのものでありそしてｐＵＣ１９のＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限部位の間にクローニングする（図１０））を使用してｃｒＴＭＶ ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得た。
【０１７１】
全長ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター由来感染性ｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡクローンはオリゴヌクレオチドｃｒＴＭＶ１−ＳＰ６ ５’−ｇｃａｔｇｇｔａｃｃａｔｔｔａｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａｃｔｃＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（上流）、（この中でイタリック太字はＫｐｎＩ部位の配列であり、下線付き小文字はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列であり、大文字はｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡの５’−末端からのものである）；及びｃｒＴＭＶ２ ５’−ｇｃａｔｇｃｇｇｃｃｇｃＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＣＣＧＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（下流）、（この中でイタリック太字はＮｏｔＩ部位であり、小文字はｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡの３’−末端からのものでありそしてｐＵＣ１９のＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限部位の間にクローニングする（図１０））を使用してｃｒＴＭＶ ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得た。
【０１７２】
全長ｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡクローンはジデオキシヌクレオチド配列分析により分析した。ｃｒＴＭＶ感染性転写物のＮｉｃｏｔｉａｎａ及びアブラナ種に対する全体感染の能力はそれぞれＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｖａｒ． Ｓａｍｓｕｎ及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおける感染試験により確認した。
Figure 2004536573
【０１７３】
例２
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ及びｃｒｕｃｉｆｅｒ植物におけるウイルスＩＲＥＳによるＧＵＳ遺伝子発現用トバモウイルスベクターの構築
一連のＩＲＥＳ仲介発現ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＧＵＳは以下のように構築した。最初に、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＸｂａ Ｉ部位をＴ７／ｃｒＴＭＶベクター（図１０）のＳａｃ ＩＩ／Ｎｏｔ ＩフラグメントのＣＰ遺伝子の末端にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び２対の特異的プライマーにより挿入した。二番目に、Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３， １３９−１５４）に記述されているＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ， ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＵＩ−ＧＵＳ， ＩＲＥＳＭＰ，２２８ ＣＲ−ＧＵＳ， ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ−ＧＵＳ， ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＵＩ−ＧＵＳ， ＰＬ−ＧＵＳ ｃＤＮＡを、Ｔ７／ｃｒＴＭＶベクターのＳａｃ ＩＩ／Ｎｏｔ Ｉフラグメントを含むＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＸｂａ Ｉに挿入し、Ｓａｃ Ｉ−ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉ， Ｓａｃ ＩＩ−ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＵＩ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉ， Ｓａｃ ＩＩ−ＩＲＥＳＭＰ，２２８ ＣＲ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉ， Ｓａｃ ＩＩ−ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉ， Ｓａｃ ＩＩ−ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＵＩ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉ， Ｓａｃ ＩＩ−ＰＬ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉ ｃＤＮＡをそれぞれ得た。三番目に、Ｔ７／ｃｒＴＭＶベクターのＳａｃ ＩＩ−Ｎｏｔ Ｉ ｃＤＮＡフラグメントをＳａｃ Ｉ−ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉまたは Ｓａｃ ＩＩ−ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＵＩ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉまたは Ｓａｃ ＩＩ−ＩＲＥＳＭＰ，２２８ ＣＲ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉまたは Ｓａｃ ＩＩ−ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉまたは Ｓａｃ ＩＩ−ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＵＩ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉまたは Ｓａｃ ＩＩ−ＰＬ−ＧＵＳ−Ｎｏｔ Ｉ ｃＤＮＡで置換し、それぞれベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＵＩ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，２２８ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１）， ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＵＩ−ＧＵＳ（図１１）及びベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＰＬ−ＧＵＳ（図１１）を得た。
【０１７４】
例３
感染Ｎｉｃｏｔｉａｎａ及びｃｒｕｃｉｆｅｒ植物におけるウイルスＩＲＥＳによるＧＵＳ遺伝子の発現
この例はｃｒＴＭＶ由来ベクター：Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＵＩ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，２２８ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１）， ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＵＩ−ＧＵＳ（図１１）及びベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＰＬ−ＧＵＳ（図１１）、に感染したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植物におけるＧＵＳ遺伝子のトバモウイルスＩＲＥＳ仲介発現を明示するものである。
【０１７５】
インビトロ転写
プラスミドＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＵＩ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，２２８ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１），ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ−ＧＵＳ（図１１）， ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＵＩ−ＧＵＳ（図１１）及びベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＰＬ−ＧＵＳ（図１１）、をＮｏｔ Ｉにより直線化した。組換えプラスミドをインビトロにおいてＤａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， １８３２−１８３６）の記述のように転写した。ＲＮＡ転写物のアガロースゲル電気泳動によりそれらが完全であることを確認した。ＲＮＡ濃度はアガロースゲル電気泳動及び分光測定により定量化した。
【０１７６】
ＧＵＳ検出
キャップのある全長転写物で感染した１０−１４日後に接種葉を採集した。ＩＲＥＳ作用は既に記述されているように（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， １９８７， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５， ３８７−４０５）ＧＵＳ発現を組織化学的に検出することにより監視した。検体を比色分析用ＧＵＳ基質を使用して検体を浸漬したが、反応中間生成物の核酸を制限するために方法（Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ ａｎｄ Ｄｅｂｒｏｕｗｅｒ， １９９２， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２， ２６１−２６６）を改良した：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）６００μｇ／ｍｌ； ３ ｍＭフェリシアンカリウム； １０ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１１５ Ｍリン酸緩衝液， ｐＨ ７．０。終夜３７℃でインキュベートした後、葉を７０％エタノール中で脱色しそして光学顕微鏡で検査した。
【０１７７】
例４
ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲはＭＰサブゲノムプロモーターとしては機能しないが、ＴＭＶ−感染植物中においてキャップ非依存内部開始翻訳によりＭＰ遺伝子発現をもたらす。この例は目的の遺伝子のキャップ非依存発現のためのウイルスベクターに使用されたＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲの可能性を確認する別の方法を使用する。
【０１７８】
ＣｒＴＭＶ ＭＰサブゲノムＲＮＡは１２５−ｎｔの長さの５’−非翻訳領域（５’ＮＴＲ）を有しまた翻訳抑制ステムループ二次構造を含む。
ＴＭＶ ＵＩ及び ｃｒＴＭＶ ＭＰサブゲノムＲＮＡ （Ｉ２ ｓｇＲＮＡ） ５’ＮＴＲの長さ及びヌクレオチド配列を決定するために、Ｌｅｈｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４， １４５−１５７）により記述されているプライマー伸長実験のプロトコールを次のように変更した：（ｉ）ＡＭＶ逆転写酵素（ＲＴ）； （ｉｉ）ＲＴ反応４５℃以下； （ｉｉｉ）ＧＣ−リッチプライマー； （ｉｖ）増加したｄＮＴＰ濃度； （ｖ）二次構造を回避するためのｄＩＴＰ。ｃｒＴＭＶ Ｉ２ ｓｇＲＮＡの５’ＵＴＲ配列は１２５ヌクレオチドからなることが示された（図１２）。この結果は直接５’ＵＴＲ ＲＴ配列分析により確認された。図１２Ｂは、ｃｒＴＭＶ ５’ＮＴＲが安定したヘアピン−ループ構造を含むことを示している。人工的転写物のＭＰ遺伝子のすぐ上流に配置されることにより、インビトロにおけるＭＰ遺伝子翻訳を抑制することができる（図１３）。このことは、５’ＨＩ２ ＣＲ及びＭＰ遺伝子の間に位置するＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲは有効な翻訳のキャップ非依存内部開始を生じることができることを意味する。図１４は、５’ＨＩ２ ＣＲ及び理論的翻訳抑制ヘアピン−ループ構造の同族体がその他のトバモウイルスのＭＰ遺伝子の上流１２５−ｎｔ配列中に認められることを示している。
【０１７９】
ＣｒＴＭＶ及びＴＭＶ ＵＩ ＭＰサブゲノムＲＮＡはキャップがない。
ｃｒＴＭＶの３０Ｋ移動タンパク（ＭＰ）遺伝子をコードするサブゲノムＲＮＡの５’−末端の構造を調べるために、活性モチーフによって与えられる”Ｊｕｍｐ−Ｓｔａｒｔ”法を使用した。Ｊｕｍｐ−ＳｔａｒｔＴＭはＲＮＡタグを特異的にキャップされたｍＲＮＡの５’末端に化学的に結合する方法である。逆転写の間に、既知配列のリボ−オリゴヌクレオチドタグは第一鎖ｃＤＮＡの３’−末端に組込まれる。これはＰＣＲに適する既知開始部位を創る。
【０１８０】
初めに、キャップされたＲＮＡの５’−末端２’−３’−シス−グリコール基を過ヨウ素酸ナトリウム酸化により反応性のジアルデヒドに変換した。被検ＲＮＡ（１μｇ／μｌ）の１−２μｌを１４μｌの純水及び１μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と混合し、次いで４μｌの０．１ Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムを加え、そして反応混合物を１時間インキュベートした。
【０１８１】
次いで、３’−アミノアルキル化合成リボ−オリゴヌクレオチドタグをナトリウムシアノボロヒドリドの存在下に還元的アミノ化により酸化ＲＮＡのジアルデヒド末端に化学的に結合した。５μｌの次亜リン酸ナトリウムを加えそして反応混合物を１０分間インキュベートした。次いで２３μｌの水、１μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）及び２μｌのリボ−オリゴヌクレオチドタグ ５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（２８．５ ｐｍｏｌ／μｌ）を反応混合物に加えそして１５分間インキュベートした。次いで１０μｌのナトリウムシアノボロヒドリドを加えそして２時間インキュベートした。次いで４００μｌの２％過塩素酸リチウム／アセトンを加え、１５分間−２０℃でインキュベートし、そして５分間遠心分離した。ペレットをアセトンで２回洗い、次いで２０μｌの水に溶解した。
【０１８２】
過剰のＲＮＡタグを除くために、０．３ Ｍ ＮａＣｌの存在下にＣＴＡＢ沈殿を使用した。ＣＴＡＢは強いカチオン界面活性剤であり、核酸と結合して不溶性複合体を形成する。複合体形成は塩濃度に影響される：塩濃度が１ Ｍ以上であれば複合体は形成されない；０．２ Ｍ以下であれば、全ての核酸は複合体中に含まれる；そして０．３ Ｍから０．４ Ｍの間であれば、小さな１本鎖核酸の複合体への取り込みは非常に効率が悪い（Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５， ２９１９−２９３２； Ｂｅｒｔｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６， １０５４−１０５８）。１０μｌの１．２ Ｍ ＮａＣｌ（最終濃度０．４ Ｍ）及び３μｌの１０％ＣＴＡＢ（最終濃度１％）を加え、反応混合物を１５分間室温でインキュベートし、次いで５分間遠心分離した。ペレットを１０μｌのＮａＣｌに懸濁し、２０μｌの水及び３μｌ １０％ＣＴＡＢを加えそして反応混合物を１５分間室温でインキュベートし、次いで５分間遠心分離した。ペレットを３０μｌの１．２ Ｍ ＮａＣｌ、８０μｌの９６％エタノールを加え、そして反応混合物を終夜−２０℃でインキュベートした。次いで５分間遠心分離し、７０％エタノールで洗った。次いでタグ付きＲＮＡのペレットを２４μｌの水に溶解した。
【０１８３】
最後に、３’−特異的プライマーを逆転写することにより第一鎖ｃＤＮＡの３’−末端に５’−タグの組み込みが生じる。逆転写には、１２μｌのタグ付きＲＮＡ、１μｌの特異的３’−末端プライマー、２５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．３）， ３７５ ｍＭ ＫＣｌ， １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む５ｘ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）用緩衝液の４μｌを混合し、３０秒間９５℃に加熱し、次いで氷上で冷却した。次いでこの反応混合物に０．５μｌのＤＴＴ（最終濃度１ ｍＭ）、２μｌの１０ ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎｅ、０．５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩを加えて１時間４２℃でインキュベートした。次いで１μｌの４０ ｍＭ ＭｎＣｌ２を加えて、反応混合物を１５分間４２℃でインキュベートした。反応混合物中にＭｎＣｌ２が存在することにより逆転写の際にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭがキャップ構造をより効率よく乗り越えることを可能にする：３ ｍＭ ＭｇＣｌ２及び ２ ｍＭ ＭｎＣｌ２を使用した場合には、逆転写酵素は異常に高いキャップ依存転位酵素活性を現すことが示され、そして典型的にこの酵素は５’−キャップｍＲＮＡ鋳型の存在下に優先的に３または４個のシトシン残基を追加した（Ｃｈｅｎｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＲＴ−ＰＣＲ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐａｕｌ Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｌａｒｒｉｃｋ， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ； Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ， １９９９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７， ３３１）。
【０１８４】
ＰＣＲ反応には、２セットのプライマーを各被検ＲＮＡ−３’−特異的／５’−特異的プライマー及び３’−特異的／タグ−特異的プライマーに使用した（図１５）。
【０１８５】
既知タグ配列を持つＲＮＡを特異的にウイルスＲＮＡのキャップ構造に化学的に結合する方法を使用し得るか否かを調べるために、キャップがあることが既知である（Ｄｕｎｉｇａｎ ａｎｄ Ｚａｉｔｌｉｎ， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５， ７７７９−７７８６）タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）Ｕ１株のゲノムＲＮＡを対照として使用した。特異的プライマー、Ｕ１−Ｓｐｎ及びＲＮＡ−タグに対応するプライマー７７９をＰＣＲ反応に使用した場合に、それぞれのＰＣＲバンドが検出された（表２、図１６）。
Figure 2004536573
【０１８６】
対照として、ＴＭＶ（Ｕ１）の完全ｃＤＮＡクローンのキャップの無いＲＮＡ−転写物を使用して、キャップ構造は予想通り認められなかった（表２、図１６）。
【０１８７】
次いでｃｒＴＭＶのゲノムＲＮＡの５’−末端におけるキャップ構造の存在を調べた。この実験に、特異的ＰＣＲプライマーＫ５，２ＰＭ及びＲＮＡ−タグに対応するプライマー７７９が選ばれた（表１、図１６）。興味あることに、プライマー７７９及び２ＰＭによって認められたＰＣＲバンドは予想より高かった（図１６）。これはｃｒＴＭＶのゲノムＲＮＡの５’−末端における強い二次構造の存在を反映するものであろう（Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５０， ５−８）。この二次構造は関連ＴＭＶの５’−末端部分には存在しない（Ｇｏｅｌｅｔ ａｔ ａｌ．， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９， ５８１８−５８２２）。ＴＭＶの完全ｃＤＮＡクローンのキャップの無い転写物を用いた対照実験では、予想通り、相当するＰＣＲバンドは認められなかった。
【０１８８】
ＴＭＶ（Ｕ１）ＭＰ遺伝子をコードするサブゲノムＲＮＡに対して、５’−末端のキャップ構造が無いことを提案した。我々はそれぞれのｓｇＲＮＡを特異的プライマー２２１１，ＵＭ５０−５４及びＲＮＡ−タグに対応するプライマー７７９を用いて試験した。キャップ構造は認められなかった（表２、図１６）。
【０１８９】
このトバモウイルスのサブゲノムＲＮＡの５’−末端にはキャップ構造が存在しないことを示す同じ結果がｃｒＴＭＶそれぞれのサブゲノムＲＮＡ（表２、図１６）について得られた。
【０１９０】
ＭＰ遺伝子発現ができないＴＭＶ Ｕ１由来ベクターＫＫ６にＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲを挿入することにより有効なキャップ非依存ＭＰ遺伝子発現を生じる。
ＫＫ６ベクター（Ｌｅｈｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４， １４５−１５７）は２個のＣＰサブゲノムプロモーター（ｓｇＰｒ）を含んでいる。第一のＣＰ ｓｇＰｒ−１は適当な場所、ＣＰ遺伝子の上流にあるが、第二のＣＰ ｓｇＰｒ−２はＭＰ遺伝子の上流に存在する。ＭＰ遺伝子は固有のＭＰ ｓｇＰｒでなくＣＰ ｓｇＰｒ−２によって発現することが示されている。この挿入の結果として、ＫＫ６は効率の良い細胞間移動の能力を失う。分析の結果ではＩ２ ｓｇＲＮＡは５’−非翻訳リーダー中にＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ配列を含んでいない。ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲを失ったＫＫ６ Ｉ２ ｓｇＲＮＡはＭＰ遺伝子を効率よく発現することはできないといわれていた。このことを確かめるために、ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲをＫＫ６のＣＰ ｓｇＰｒ−２及びＭＰ遺伝子の間に挿入し、我々は後代中において安定なＫＫ６− ＩＲＥＳＭＰ，７５を得ることができた（図１７）。ＫＫ６− ＩＲＥＳＭＰ，７５はｃｒＴＭＶ ＩＲＥＳＭＰ，７５を含むＩ２ ｓｇＲＮＡの合成を生じることが示された（図１８）。
【０１９１】
ＫＫ６− ＩＲＥＳＭＰ，７５ Ｉ２ ｓｇＲＮＡの開始はＫＫ６と比較して変わらないことが認められ、このことはＩＲＥＳＭＰ，７５がＭＰ ｓｇＰｒとして働いていないことを意味する。
【０１９２】
この挿入は細胞間移動を劇的に改善する。ＫＫ６はＳａｍｓｕｎ植物全体に感染するが、最初の症状は野生型ＴＭＶ（ＴＭＶ３０４）（約７日）に比較してゆっくり（１５−１７日）生じる。ＫＫ６感染植物の上部葉の症状は異なっている：野生型ＴＭＶによって生じるモザイク症状に対して黄色斑点。
【０１９３】
ＫＫ６ウイルスの後継者は野生型ＴＭＶ ＵＩにより誘導される病気よりも遅く発症する多くの病気をＮ． ｇｌｕｔｉｎｏｓａに生じる。ＫＫ６により誘発される局所症状の平均的大きさは、ＴＭＶ ＵＩ（１．１ｍｍ）により誘発されるものに比較して、約０．１ ｍｍである。
【０１９４】
ＫＫ６− ＩＲＥＳＭＰ，７５を接種した植物はＫＫ６感染Ｓａｍｓｕｎ植物に似ているが：（ｉ）最初の全体的症状はより速やかに（約１０日）発生しそして（ｉｉ）黄色斑点及びモザイクを含めて非常に明るい。ＫＫ６とは逆にＮ． ｇｌｕｔｉｎｏｓａにおけるＫ８６により誘発された局所症状の平均的大きさは０．６−０．７ ｍｍに増加した。ＭＰ蓄積の時間経過を調べたところ、ＫＫ６− ＩＲＥＳＭＰ７５ ＭＰは接種葉においてＫＫ６ ＭＰよりも早期に検出されることが認められた（図１９）。これらの結果から、ＫＫ６ ＭＰ遺伝子の上流にＩＲＥＳＭＰ７５ ＣＲを挿入することにより細胞間及び長距離輸送に関してＫＫ６が失った移動性を部分的に回復すると結論することができる。
【０１９５】
ＴＭＶ ｃＤＮＡベクターのキャップ非依存ＭＰ遺伝子発現及びトバモウイルスの生命循環におけるＩＲＥＳの本質的役割のその他の証拠を得るために、一連の追加のＫＫ６由来ベクターを構築した（図１７）。ＫＫ６− ＩＲＥＳＭＰ１２５は天然ヘアピン構造を有し、これはＩ２ ｓｇＲＮＡのＷＴ ｃｒＴＭＶ ５’リーダー（図１３）及びＩＲＥＳＭＰ７５ の存在下にインビトロにおけるＭＰ遺伝子の翻訳を抑制することができる。ＫＫ６−Ｈ−ＰＬは天然ヘアピン構造及び７２−ｎｔ人工的ポリリンカー配列を含んでいる。ＫＫ６−ＰＬはポリリンカー領域のみを含んでいる。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． Ｓａｍｓｕｎ植物（全体宿主）における試験結果を表３に示す。
【０１９６】
図２０はＫＫ６由来ベクターに感染したタバコ葉におけるＣＰ蓄積を試験したウエスタンブロットの結果を示す。ＩＲＥＳＭＰ７５ ＣＲを機能の無いＰＬ−配列で置換するとベクターの増幅は劇的に阻害された。
Figure 2004536573
【０１９７】
例５
サブゲノムプロモーター作用の無い人工的、非天然ＩＲＥＳ配列の創製により真核細胞中において目的の遺伝子のキャップ非依存発現を生じる。
この例の目的は、真核細胞中において目的遺伝子のキャップ非依存発現を生じる、サブゲノムプロモーター作用の無い人工的、非天然ＩＲＥＳ配列を創製する方法を示すことである。
【０１９８】
ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲの１８−ｎｔ部分に基づく人工的、非天然ＩＲＥＳ配列の構築
ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ核酸配列の分析により、多量体構造をとりそして配列（−７２）ＧＵＵＵＧＣＵＵＵＵＵＧ（−６１）の変形である４個のヌクレオチド配列を含みそしてＡ． ｔｈａｌｉａｎａ １８Ｓ ｒＲＮＡに高度な相補性を有している（図２１）。人工的、非天然ＩＲＥＳを設計するために、１８−ｎｔ配列ＣＧＵＵＵＧＣＵＵＵＵＵＧＵＡＧＵＡを選択した。
【０１９９】
４個のオリゴを合成した：
ＭＰ１（＋）：
５’−ＣＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＣＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＧ−３’
ＭＰ１（−）：
５’−ＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＧ−３’
ＭＰ２（＋）：
５’−ＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＣＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧ−ＧＣ−３’
ＭＰ２（−）：
５’−ＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧ−ＣＣ−３’
【０２００】
プライマーＭＰ１（＋）及びＭＰ１（−）は相互にアニール処理し、ｄｓＤＮＡフラグメントＡを生成した：
ＣＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＣＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＴＴＣＧＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＧＣＣＣ
ＨｉｎｄＩＩＩ ＰｓｔＩ
【０２０１】
プライマーＭＰ２（＋）及びＭＰ２（−）は相互にアニールし、ｄｓＤＮＡフラグメントＢを生成した：
ＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＣＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＡＣＧＴＣＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＡＡＧＣＣＣＧ
ＰｓｔＩ ＥｃｏＲＩ
【０２０２】
両フラグメントをＰｓｔＩで消化し、そして相互に結合した。次いで結合生成物Ａ＋Ｂをアガロース電気泳動を使用して抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し次いでＳｋｕｌａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３， １３９−１５４）により記述されているｈＧＦＰ−ＧＵＳベクターにＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩクローニング部位を使用して結合した（図２２）。
【０２０３】
結果
図２２に示した転写物をウサギ網状赤血球分解物（ＲＲＬ）中でＳｋｕｌａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３， １３９−１５４）により記述されているように翻訳し、そして合成生成物をゲル電気泳動により分析した。図２２に示した結果は、ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲの１８−ｎｔ部分に基づく人工的、非天然配列は３’−近位局在ＧＵＳ遺伝子発現を生じることを示している。これは、二つの特徴、つまり１８Ｓ ｒＲＮＡに対する相補性及び多量体構造がＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲの機能及び有効性に必須であることを意味している。
【０２０４】
１８−ｎｔ部分の４量体はＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲの活性レベルには達しないが、人工的、非天然ＩＲＥＳ配列の活性を１８Ｓ ｒＲＮＡに相補的な１２−ｎｔ部分ＧＣＵＵＧＣＵＵＵＧＡＧを使用して改良する方法がある。
【０２０５】
ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲの１９−ｎｔ部分を使用する人工的、非天然ＩＲＥＳの構築
ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲの活性に必須な構造配列の分析により（図２３−２６）、ポリプリン（ＰＰ）部分がＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲの機能に決定的であることが示された。ＰＰ地区の重要な配列として、１９−ｎｔ配列：５’−ＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧ中の９−ｎｔ直列反復（直列反復（ＤＲ）と呼ばれる）を人工的ＩＲＥＳの構築に使用した。ＤＲの４量体を得るために以下のプライマーを使用した：
ＣＰ１（＋）：
５’−ＣＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴ−ＧＣＡＧＧＣＧＧＧ−３’
ＣＰ１（−）：
５’−ＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＡＡＧＣＴ−ＴＧＣＧＣＧ−３’
ＣＰ２（＋）：
５’−ＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡ−ＴＴＣＧＧＧＣ−３’
ＣＰ２（−）
５’−ＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣ−ＣＧＣＣ−３’
【０２０６】
上記の実験方法に従って、次のＩＲＥＳ配列をシストロン間スペーサーとして使用した：
５’−ＣＧＣＧＣＡＡＧＣＵＵＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＵ−ＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＵＵＣＡＵＧ−３’
【０２０７】
結果
図２２に示した転写物をウサギ網状赤血球分解物（ＲＲＬ）中でＳｋｕｌａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３， １３９−１５４）により記述されているように翻訳し、そして合成生成物をゲル電気泳動により分析した。図２２に示した結果はＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲの反復１９−ｎｔ部分に基づく人工的、非天然配列は３’−近位に局在するＧＵＳ遺伝子の効率の良い発現を生じることを示している。
【０２０８】
例６
キャップ非依存様式により感染細胞中においてレプリカーゼ遺伝子を発現するＴＭＶ ｃＤＮＡ転写ベクターの構築
この例の主要な目的はキャップ非依存様式によりレプリカーゼ遺伝子を発現させる修飾５’ＵＴＲを有する２個の新規ＴＭＶ Ｕ１由来ウイルスを得ることである：
１）ＴＭＶのオメガ−リーダーを完全にＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲで置換する
ＧＵＵＣＧＵＵＵＣＧＵＵＵＵＵＧＵＡＧＵＡＵＡＡＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵＧＵＣＡＧＡＵＡＡＧＡＧＡＵＵＧＧＵＵＡＧＡＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＵＵＵＧＡＣＣＡＵＧＧ
２）ＴＭＶ ５’ＵＴＲの最初の８ヌクレオチドはウイルス複製に必須であると考えられているので（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７７， ２３５３−２３５７）、ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲを最初の８ヌクレオチドを完全に残したＴＭＶに挿入した：
ＧＵＡＵＵＵＵＵＧＵＡＧＵＡＵＡＡＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵＧＵＣＡＧＡＵＡＡＧＡＧＡＵＵＧＧＵＵＡＧＡＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＵＵＵＧＡＣＣＡＵＧＧ
【０２０９】
次のプライマーを使用した：
ａ）ＳＰ６−ＩＲＥＳ−１（最初の変異体の場合）
ＸｂａＩ ＳＰ６プロモーター ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＣＧＴＴＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡ
ｂ）ＳＰ６−ＩＲＥＳ−２（二番目の変異体の場合）
ＸｂａＩ ＳＰ６プロモーター ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣ
ｃ）ＩＲＥＳ−ＮｃｏＩ（３’末端にＮｃｏＩ部位を持つＩＲＥＳを得るための逆プライマー）
ＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＡＡＡＣ
ｄ）ＴＭＶ−ＮｃｏＩ（ＮｃｏＩ部位から開始する、ＴＭＶポリメラーゼを得るための直列プライマー）
ＮｃｏＩ
ＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＡＣ
ｅ）ＴＭＶ−Ｘｈｏ（ＡＵＧからＳｐｈＩ部位までのレプリカーゼの５’−部分を得るための逆プライマー）
ＸｈｏＩ
ＡＴＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＣＡＧＧＴＴＧＧＧＣ
【０２１０】
クローニング方法：
ＰＣＲフラグメントＡは鋳型としてオリゴＳＰ６−ＩＲＥＳ１及びＩＲＥＳ−ＮｃｏＩ及びｃｒＴＭＶクローンを使用して得た。ＰＣＲフラグメントＢはオリゴＴＭＶ−ＮｃｏＩ及びＴＭＶ−ＸｈｏＩ及びＴＭＶ−３０４Ｌクローンを使用して得た。フラグメントＡ及びＢを同時にｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベクター中にＸｂａＩ及びＸｈｏＩ部位を使用してクローニングした（フラグメントはＮｃｏＩ部位を介して共に結合された）。同じ方法をＳＰ６−ＩＲＥＳ２オリゴを使用して第二のウイルス変異体を得るために応用した。
次の段階において、ウイルスゲノムを復元するために全ＴＭＶ ｃＤＮＡを得られたベクター中にＳｐｈＩ及びＫｐｎＩ部位を使用してクローニングした（図２７）。
【０２１１】
例７
アクチン２転写プロモーターに基づくトバモウイルスベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ及びＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳの構築
この例の主要な目的は新規ｃｒＴＭＶ由来ベクターの構築方法を示すことであり、これによる植物細胞中のウイルスゲノム発現は有効なアクチン２転写プロモーターの調節下に生じる。植物中における遺伝子発現にベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳを使用することができる。
【０２１２】
ｐＵＣ１９中へＡｃｔ２のクローニング
Ａｃｔ２転写プロモーター（約１０００ ｂｐ）をＫｐｎＩ及びＰｓｔにより消化してプラスミドｐＡＣＲＳ０２９から切り出し、ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで消化したｐＵＣ１９中にクローニングした。
【０２１３】
プラスミドＴ７／ｃｒＴＭＶ（図１０参照）のｃｒＴＭＶゲノム開始の上流にＰｓｔＩ部位の創製
直列プライマー ＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（ＰｓｔＩ部位は下線付き）及び逆プライマー ＡＴＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＣＡＣＣＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＡ（ＰｖｕＩ部位は下線付き）を使用するＰＣＲにより得られたｃｒＴＭＶゲノムの５’−末端部分の３３４−ｎｔ ｃＤＮＡフラグメントをＰｖｕＩ及びＰｓｔＩで消化し、そしてｃｒＴＭＶゲノムの部分（ＰｖｕＩ−ＳｐｅＩフラグメント）と共にｐＵＣ１９Ａｃｔ２中に挿入した。
【０２１４】
最終構築と共にゲノムの残部のクローニング
構築を含むＡｃｔ２をＫｐｎＩ／ＳｐｅＩで消化した後プラスミドＴ７／ｃｒｔＭＶ中に挿入した。
【０２１５】
追加の配列の無いｃｒＴＭＶ ５’−末端のＡｃｔ２転写開始への融合
この段階はＡｃｔ２及びｃｒＴＭＶに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して部位指向性突然変異誘起により行ない、最終構築Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶを得た（図２８）。
【０２１６】
ベクターＡｃｔ／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ（図２８）を得るために、Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ（図２８）のＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ ｃＤＮＡフラグメントを、ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲの調節を受けるＧＵＳ遺伝子を含むＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ構築（図１１）のＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントにより置換した。
【０２１７】
例８
環状１本鎖トバモウイルスベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ（図３０）の構築
この例の主要な目的は植物における外来遺伝子の発現に環状１本鎖ＤＮＡベクターを使用し得ることを示すことにある。
【０２１８】
ＫＳ／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ（図３０）を構築するために、ベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／Ｉ ＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳの９．２ ｋｂ ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ ｃＤＮＡフラグメントをＫｐｎＩ−ＳａｌＩで消化し、ファージｆ１複製起点を含むプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入した。ベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳの一本鎖ＤＮＡはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に従って調製した。
【０２１９】
例９
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのオレオシンイントロンを含むトバモウイルスベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ−Ｉｎｔ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳの構築
この例の主要な目的は、転写操作の後に除去されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのオレオシン遺伝子イントロンを含むベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳを創製することである（図３１）。
【０２２０】
クローニン方法は以下の段階を含む：
１． Ａ． ｔｈａｌｉａｎａオレオシン遺伝子イントロンのクローニング。
Ａ． ｔｈａｌｉａｎａオレオシン遺伝子イントロンはＡ． ｔｈａｌｉａｎａゲノムＤＮＡ及び特異的プライマー：Ａ． ｔｈ．／Ｉｎｔ（直列）ＡＴＧＣＴＧＣＡＧｇｔｔｔｔａｇｔｔＣＡＧＴＡＡＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣ（ＰｓｔＩ部位は下線付き、小文字はｃｒＴＭＶ ５’末端配列を表す）及びＡ． ｔｈ．／Ｉｎｔ（逆）ＡＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣＣＧＴＴＧＣＧＴＡＣＣＴＡ（ＳｔｕＩは下線付き）を使用するＰＣＲにより得た。
【０２２１】
２． Ａ． ｔｈａｌｉａｎａオレオシン遺伝子イントロンのｃｒＴＭＶ ｃＤＮＡの３３４−ｎｔ ５’−末端フラグメントへの挿入。
Ａ． ｔｈａｌｉａｎａオレオシン遺伝子イントロンを含むｃＤＮＡをＰｓｔＩ／ＳｔｕＩで消化しそしてｃｒＴＭＶゲノムの１０−３３４位置に対応するプライマーを使用するＰＣＲにより得たＤＮＡフラグメントと結合した：ａｔｇＡＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＴＴＡ（ＳｔｕＩ部位は下線付き）及びＡＴＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＣＡＣＣＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＡ（ＰｖｕＩ部位は下線付き）。
次の段階は例７に記述した通り。
【０２２２】
例１０
ビシストロン性転写ベクター、３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳ（図３２）及び３５Ｓ／ＧＵＳ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＣＰ（図３３）を含むＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲを遺伝子導入したタバコプロトプラストにおけるＧＵＳ遺伝子の発現に対するキャップ依存翻訳開始抑制薬としてのラパマイシンの影響
この例の目的は、目的の遺伝子のＩＲＥＳ仲介キャップ非依存翻訳の効率を増加させるためにキャップ依存翻訳の抑制薬が原理的に使用できることを示すことにある。
【０２２３】
キャップ依存翻訳開始の抑制薬としてラパマイシンを選択した。最近、４Ｅ−ＢＰ１（ｅｌＦ−４Ｅ結合タンパク１）またはＰＨＡＳ−１と命名された、キャップ仲介翻訳の新規リプレッサーが検討されている（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６， ６５３−６５６； Ｐａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７１， ７６２−７６７）。４Ｅ−ＢＰ１は熱及び酸に安定なタンパクであり、その活性はリン酸化により調節されている（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６， ６５３−６５６； Ｐａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７１， ７６２−７６７）。４ＥＢＰ１とｅｌＦ−４Ｅの相互作用は、インビトロ及びインビボのいずれにおいても、キャップ依存翻訳の特異的抑制を生じる（Ｐａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７１， ７６２−７６７）。ラパマイシンは脱リン酸化及び続く４Ｅ−ＢＰ１の活性化を誘導することが示されている（Ｂｅｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９６， ＥＭＢＯ Ｊ． １５， ６５８−６６４）。
【０２２４】
ＩＲＥＳ−及びＧＵＳ遺伝子−含有ベクター３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳ（図３２）、３５Ｓ／ＧＵＳ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＣＰ（図３３）構築及びタバコプロトプラストへ３５Ｓ由来ｃＤＮＡの遺伝子導入はＳｋｕｌａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３， １３９−１５４）によって記述されている。ラパマイシン処理及び３’−及び５’−近位局在ＧＵＳ遺伝を持つビシストロン性ｃＤＮＡを遺伝子導入したタバコプロトプラストにおいてＧＵＳ遺伝子発現を比較したところ、ＧＵＳ遺伝子のＩＲＥＳ仲介キャップ非依存翻訳を増加する可能性を示している。
【０２２５】
例１１
ビシストロン性転写ベクター、３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳ（図３２）及び３５Ｓ／ＣＰ−ＶＰｇ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳを含むＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲを遺伝子導入したタバコプロトプラストにおけるＧＵＳ遺伝子の発現に対するキャップ依存翻訳開始抑制薬としてのポチウイルスＶＰｇの影響
この例はキャップ依存翻訳を抑制するために遺伝子産物が原理的に使用できることを示す（図３４）。最近、カブモザイクポチウイルス（ＴｕＭＶ）のゲノム（ＶＰｇ）に結合したウイルスタンパクとＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの真核翻訳抑制因子ｅｌＦ（ｉｓｏ）４Ｅの相互作用が報告された（Ｗｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３４， ８４−９２）。ＶＰｇの相互作用は３５アミノ酸の範囲にマップされそしてこの領域内のアスパラギン酸残基の置換は相互作用を完全に消失する。ｍ７ＧＴＰ、ＧＴＰではない、類似のキャップ構造はＶＰｇ−ｅｌＦ（ｉｓｏ）４Ｅ複合体形成を抑制し、ＶＰｇ及び細胞性ｍＲＮＡはｅｌＦ（ｉｓｏ）４Ｅ結合を競合していることを示している（Ｌｅｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４， ７７３０−７７３７）。
【０２２６】
ＶＰｇのｅｌＦ（ｉｓｏ）４Ｅに結合する能力をキャップ依存翻訳の抑制に使用することができる。我々はＣＰがポチウイルスポテトウイルスＡのＶＰｇと融合しているベクター３５Ｓ／ＣＰ−ＶＰｇ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳ（図３４）を使用することを提案する。３５Ｓ／ＣＰ−ＶＰｇ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳまたは３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳを導入されたプロトプラストにおけるＧＵＳ遺伝子の発現を比較すると、ＩＲＥＳに仲介されそしてキャップ非依存ＧＵＳ遺伝子発現を増加させることができるであろう。
【０２２７】
例１２
ＩＲＥＳ配列またはＴＭＶベクターに使用するサブゲノムプロモーターのインビボ遺伝子選択
この実験は、サブゲノムプロモーターまたはウイルスベクター中の目的の遺伝子のキャップ非依存発現を生じるＩＲＥＳ配列のインビボ遺伝子選択または対数濃縮によるリガンドの系統的発生（ＳＥＬＥＸ）を使用できることを示す。この方法は多数のランダム配列の並列選択並びに配列発生を使用するものである（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４６， ８１８−８２２； Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ５０５−５１０； Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ， １９９８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６， ２４２６−２４３２）。
【０２２８】
このプロジェクトは以下を包含する：
下記配列を含むｃｒＴＭＶ由来欠陥干渉性（ＤＩ）転写物のインビトロ合成（５’ から３’方向）；（ｉ）Ｔ７転写プロモーター、（ｉｉ）ウイルスゲノム相補性（マイナス鎖）合成に必要な配列を持つｃｒＴＭＶゲノムの５’−末端部分、（ｉｉｉ）ウイルスレプリカーゼのＮ−末端部分、（ｉｖ）７５−ｎｔランダム化塩基を含む配列、（ｖ）ネオマイシンリン酸転移酵素ＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）遺伝子、（ｖｉ）集合のｃｒＴＭＶ起点（Ｏａ）、及び（ｖｉｉ）マイナス鎖ゲノムプロモーター配列を持つｃｒＴＭＶゲノムの３’−末端部分（図３５）。
【０２２９】
ｃｒＴＭＶゲノムＲＮＡと共に転写物によりタバコプロトプラストを共遺伝子導入（図１０）。プロトプラストは成長し、カナマイシンを含む培地中で再生する。カナマイシン存在下にプロトプラストの生存及び再生を生じるＩＲＥＳまたはサブゲノムプロモーターを選択及び単離。
【０２３０】
付属文書Ｂ
遺伝子導入植物を作製するための方法及びベクター
発明の分野
本発明は遺伝子導入植物並びにそれによって得られる植物細胞を作製するための方法及びベクターに関するものである。
【０２３１】
発明の背景
導入遺伝子の望ましいそして安定した遺伝パターンを達成するには植物バイオテクノロジー上一つの大きな問題が残されている。標準的方法はベクター中に完全に独立した転写単位の部分として導入遺伝子を導入することであり、この場合導入遺伝子は植物特異的異種または同種プロモーター及び転写終結配列の転写調節の下にある（例えば、ＵＳ ０５，５９１，６０５； ＵＳ ０５，９７７，４４１； ＷＯ ００５３７６２Ａ２； ＵＳ ０５，３５２，６０５など参照）。しかし、ゲノムＤＮＡ中に組込んだ後に、植物ゲノムＤＮＡ中に外来ＤＮＡをランダムに挿入するために、その転写ベクターからの遺伝子発現は多くの異なる宿主因子による影響を受けるようになる。これらの因子は導入遺伝子発現を不安定化し、予想し難くし、そしてしばしば後継者における導入遺伝子不活性化を生じる（Ｍａｔｚｋｅ ＆ Ｍａｔｚｋｅ， ２０００， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ４３， ４０１−４１５； Ｓ．Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ９， ２２７−２３２； Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １６， ６５１−６５９）。植物における導入遺伝子不活化の例は詳細に文書化されており、転写時（ＴＧＳ）及び転写後遺伝子不活化（ＰＴＧＳ）の段階がある。最近の知見は、ＴＧＳにおけるメチル化及びクロマチン構造及びＰＴＧＳにおけるＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼの必要性の間に密接な関係があることを明らかにしている（Ｍｅｙｅｒ， Ｐ．， ２０００， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４３， ２２１−２３４； Ｄｉｎｇ， Ｓ．Ｗ．， ２０００， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １１， １５２−１５６； Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０００， ４３， ３２３−３４６）。例えば、ＴＧＳにおいて、導入遺伝子のプロモーターは往々にして安定した導入遺伝子発現には好ましくないクロマチン構造を持つ多数の組み込み部位にメチル化を行なう。結果として、既存方法を実施するには、これらが目的とする安定した発現パターンを持つことを確認するために多数の遺伝子導入植物を作製し数世代に亘って分析を行なう必要がある。さらに、数世代に亘って安定した導入遺伝子発現パターンを表す植物であってもストレスまたは病原体攻撃のような自然発生条件によりその後不活化することがある。転写単位を挟むスカフォールド付着領域（Ａｌｌｅｎ， Ｇ．Ｃ．， １９９６， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８， ８９９−９１３； Ｃｌａｐｈａｍ， Ｄ．， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ．， ４６， ６５５−６６２； Ａｌｌｅｎ， Ｇ．Ｃ．， １９９３， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ５， ６０３−６１３）の使用のような、発現調節の改良を目的とした既存方法は所謂「位置効果変異」の影響を減少することにより導入遺伝子の独立性及び安定性を増加させる可能性がある（Ｍａｔｚｋｅ ＆ Ｍａｔｚｋｅ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．， １，１４２−１４８； Ｓ．Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ９， ２２７−２３２； ＷＯ ９８４４ １３９ Ａ１； ＷＯ ００６７５７ Ａ１； ＥＰ １００５ ５６０ Ａ１； ＡＵ ００，０１８，３３１ Ａ１）。しかし、それらは導入遺伝子の必要な発現パターンを持つ植物を設計するのに存在する問題の部分的解決を提供するに過ぎない。
【０２３２】
遺伝子不活化はウイルスに感染した植物による植物防御機構として生じることがある（Ｒａｔｃｌｉｆｆ ｅｔ ａｌａ．， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６， １５５８−１５６０； Ａｌ−Ｋａｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７９， ２１１３−２１１５）。遺伝子導入をしていない植物においては、そのような不活化は病原体に向けられるが、遺伝子導入植物においては、特に導入遺伝子が病原体と類似性を持つ場合には、導入遺伝子を不活化することがある。特に転写ベクターの設計にウイルス起源の多数の配列が使用する場合に、これが問題となる。代表的な例はＡｌ−Ｋａｆｆ及び共同研究者による最近の発表がある（Ａｌ−Ｋａｆｆ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １８， ９９５−９９９）、彼らは遺伝子導入植物のＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）感染はＣａＭＶ由来３５Ｓプロモーターの調節下にあるＢＡＲ遺伝子を不活化することを示した。
【０２３３】
この数年間に、シス調節配列のセットは著しく増加し、そして現在導入遺伝子の精巧な空間的及び時間的調節の道具になっている。これらは種々のプロモーター及び転写ターミネーターのようないくつかの転写配列並びに遺伝子発現の翻訳調節配列／エンハンサーである。一般的に、翻訳エンハンサーは、細胞性トランス作動性因子と共同して、ｍＲＮＡの翻訳を促進するシス作動性配列として定義することができる。真核細胞における翻訳は一般的にキャップされたｍＲＮＡの５’末端からリボゾーム走査により開始される。しかし、翻訳の開始はキャップ構造に依存しない機構によっても生じることがある。この場合に、リボソームは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列により翻訳開始コドンに導かれる。最初ピコルナウイルスにおいて発見された（Ｊａｃｋｓｏｎ ＆ Ｋａｍｉｎｓｋｉ， １９９５， ＲＮＡ， １， ９８５−１０００）この配列は他のウイルスにおいても同定され、そして細胞性真核ｍＲＮＡであった。ＩＲＥＳはシス作動性配列であり、他の細胞性トランス作動性因子と共にｍＲＮＡの内部開始コドンにおいてリボソーム複合体の集合を促進する。このＩＲＥＳ配列の特徴は、動物または昆虫細胞におけるポリシストロン性転写単位から２以上のタンパクを発現させるベクターにおいて利用されてきた。現在では、それらは動物系のビシストロン性発現ベクターに広く使用されており、その中で第一遺伝子はキャップ依存様式で翻訳され、そして第二遺伝子はＩＲＥＳ配列の調節下に翻訳される（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ＆ Ｓｍｉｔｈ， １９９５， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， ４， １７９−１８４； Ｍａｒｔｉｎｅｓ−Ｓａｌａｓ， １９９９， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １９， ４５８−４６４）。通常ＩＲＥＳの調節下における遺伝子の発現は著しく変動し、第一遺伝子のキャップ依存発現に比較して６−１００％の範囲内である（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， １， ３７６−３８２）。これらの知見はＩＲＥＳの使用に関して重要な意味がある、例えば、ビシストロン性ベクターにおける第一遺伝子としていずれの遺伝子を使用すべきか決める場合に。発現ベクター中にＩＲＥＳが存在することにより、正常な条件の下のみならず、キャップ依存翻訳が抑制されているような条件の下においても、選択的翻訳を生じる。これは通常ストレス条件下（ウイルス感染、熱ショック、成長抑制、など）に、正常ではトランス作動性因子が存在しないために、起こる（Ｊｏｈａｎｎｅｓ ＆ Ｓａｒｎｏｗ， １９９８， ＲＮＡ， ４， １５００−１５１３； Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ ＆ Ｇｉｎｇｒａｓ， １９９８， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０， ２６８−２７５）。
【０２３４】
翻訳に基づくベクターは最近動物細胞系を使用している研究者の注目を引いている。マウスのｃｒｅ組換え酵素の組織特異的発現をするためのＩＲＥＳ−Ｃｒｅ組換え酵素カセットの使用に関係する一報告がある（Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ．， ８５， ３５−４７）。この研究では、新規ＩＲＥＳ−Ｃｒｅカセットを、発生の早期に発現するタンパクチロシンキナーゼのＥｐｈ受容体をコードするＥｐｈＡ２遺伝子のエクソン配列中に導入した。宿主ＤＮＡの転写調節に依存する動物細胞における導入遺伝子の組織特異的発現のために翻訳ベクターを使用することを最初に示したものであるので、この研究は特に関心がある。その他の重要なＩＲＥＳの応用例は挿入突然変異誘起のためのベクターに使用したものである。そのベクターにおいて、レポーターまたは選択マーカー遺伝子はＩＲＥＳ配列の調節下にあり、そしてそれを転写活性遺伝子の転写領域内に挿入した時にのみ発現することができる（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９２， ６０８−６１１； Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４５， ７３７−７５０）。しかし、動物系においてＩＲＥＳの応用に関して進歩があったが、これらの系のＩＲＥＳ配列は植物細胞中では機能しない。さらに、植物細胞における部位指定または相同組換えは極めて稀であり、実用性がないので、植物細胞での類似の方法は考えられない。
【０２３５】
植物特異的ＩＲＥＳ配列に関するデータは極めて少ない。しかし、最近植物においても活性があるＩＲＥＳがいくつかトバモウイルスｃｒＴＭＶ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ植物に感染するＴＭＶウイルス）の中に発見され（Ｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２３２， ３２−４３； Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２６３， １３９−１５４； ＷＯ ９８／５４３４２）、そして他の植物ウイルスにおけるＩＲＥＳ翻訳調節が示されている（Ｈｅｆｆｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ７８， ３０５１−３０５９； Ｎｉｅｐｅｌ ＆ Ｇａｌｌｉｅ， １９９９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７３， ９０８０−９０８８）。ＩＲＥＳ技術は遺伝子導入植物及び既存のベクターの便利な代替品となる植物ウイルスベクター中に使用できる大きな可能性を有している。今日まで、安定した核形質転換用植物ＩＲＥＳ配列の唯一の既知応用例はビシストロン性構築中の目的遺伝子の発現のためにＩＲＥＳを使用することに関連している（ＷＯ ９８／５４３４２）。問題の構築は、５’から３’方向に、転写プロモーター、該転写プロモーターに結合した第一遺伝子、第一遺伝子の３’に位置するＩＲＥＳ配列及びＩＲＥＳ配列の３’に位置する第二遺伝子を含む、つまり、転写調節配列の完全な組合せを含んでいる。
【０２３６】
驚くべきことに、我々は、自身の転写調節エレメントを除去しそして植物宿主の転写活性ゲノムへＤＮＡの挿入に完全に依存する翻訳ベクターが目的の遺伝子を発現する多くの形質転換体を回収できるようにすることを発見した。さらに驚くべきことに、その形質転換体は、コムギのようなそのゲノム中に非常に低い比率の転写活性ＤＮＡを持つ宿主植物においても容易に検出することができる。この発明は、宿主植物の転写機構により完全に調節される、したがって導入遺伝子不活化を生じることが知られている外来遺伝子ＤＮＡの量を減少する、導入遺伝子発現の設計を可能にする方法の基礎である。これはまた新規な方法、キャップ依存対キャップ非依存翻訳の比率を調節すること、による導入遺伝子発現の調節を可能にする。
【０２３７】
発明の詳細な説明
本発明の主な目的は植物ゲノム中に組込まれた導入遺伝物質の安定した発現のために遺伝子導入植物を作製する方法またはベクターを提供することである。
【０２３８】
この目的は、翻訳開始の機能を形成するように植物細胞質性リボソームと結合するための配列及び、その下流に、該導入遺伝子コード配列を転写物中に含むベクターを核ゲノム中に導入することにより宿主核プロモーターの転写調節下に目的の導入遺伝子コード配列を発現することができる遺伝子導入植物または植物細胞を作製し、次いで該導入遺伝子コード配列を発現する植物細胞または植物を選択する方法により達成される。目的の遺伝子は、これに限定はしないが、ＩＲＥＳのような、翻訳シグナルの調節下にあり、それに作動的に結合したプロモーターを持たない。そのベクターは宿主ゲノムの転写活性ＤＮＡへの導入遺伝子の挿入に依存している。
【０２３９】
さらに、宿主細胞中におけるプロセッシングの後にさらに、その転写物中に翻訳を開始する機能を形成する形で植物細胞質性リボソームと結合するための配列及び、その下流に、コード配列を含む植物細胞を形質転換するための新規ベクター、該ベクターは該コード配列の転写のためのプロモーター機能を持たない、が提供される。
【０２４０】
望ましい態様はサブクレーム中に明示する。
【０２４１】
植物の安定した形質転換をするためのベクターの構築は多数の著者により記述されている（総説として、Ｈａｎｓｅｎ ＆ Ｗｒｉｇｈｔ， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４， ２２６−２３１； Ｇｅｌｖｉｎ， Ｓ．Ｂ．， １９９８， Ｃｕｒｒ， Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ９， ２２７−２３２参照）。これらの構築全ての基本的原理は同じである−５’から３’方向に、植物特異的プロモーター、目的の遺伝子の構造部分及び転写ターミネーターを含む完全な機能の転写単位が植物細胞に導入されそして目的の遺伝子の発現を行なうためにゲノム中に安定的に組込まれなければならない。
【０２４２】
我々は植物の安定な核形質転換体を得る別の方法を開発した。我々の発明は宿主植物転写機構が形質転換植物細胞中において目的の導入遺伝子からｍＲＮＡの生成を促進し得るという驚くべき発見によるものである。提案する方法は該ベクター中のプロモーターに作動的に結合していない目的の遺伝子を持つベクターを使用する。と言うより、それらは翻訳配列のみの調節下にある目的の遺伝子のコード領域を含んでいる。該翻訳配列は、望ましくは転写後に、植物細胞質リボソームと結合しそしてその下流にあるコード配列を翻訳することを可能にするための配列である。望ましくは、該翻訳配列は植物中のリボソーム侵入部位機能を持ち、より望ましくは植物特異的ＩＲＥＳ配列、特に植物ウイルス起源、植物起源、非植物起源のＩＲＥＳ配列または人工的に設計したＩＲＥＳ配列である。
【０２４３】
そのベクターＤＮＡは、固有の植物遺伝子の転写領域中に組込まれた後、キメラｍＲＮＡを生じ、そして次いで植物細胞質リボソームに結合するための該配列からの翻訳開始により目的のタンパクに翻訳される（図３６）。我々の知る限りでは、安定な植物核転写物を作るためのこの方法に関する先行技術はない。大部分の植物ゲノムにおいて転写活性ＤＮＡの比率は低いことを考慮すると、本発明中に記述されている翻訳ベクターを使用する形質転換実験において目的の遺伝子を発現する多数の形質転換体を生じたことは、非常に驚きであった。
【０２４４】
我々の発明は信頼性のある導入遺伝子発現の差し迫った問題に対処するものである。我々の発明方法を使用する宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込みは、宿主固有の遺伝子の転写調節配列の全てまたは殆どを含む転写機構に依存しており、それにより通常異種遺伝子ＤＮＡ配列により生じる導入遺伝子不活化を減少する。
【０２４５】
導入遺伝子輸送のためのベクターは種々の方法で作ることができる。最も簡単なものは翻訳シグナルを持つ目的遺伝子のコード領域またはその部分のみから構成される（基本的翻訳ベクター）。望ましいベクターでは、翻訳停止シグナルは植物細胞質リボソームを結合するための該配列の上流に供給される。停止シグナルは例えば少なくとも一つの停止コドン及び／またはＲＮＡヘアピン２次構造などであろう。この停止シグナルは上流の翻訳を無効にする。さらに進化したものは目的の（遺伝子の）コード領域がこれに続いている植物特異的ＩＲＥＳ配列を含むであろう。翻訳ベクターの進化したものは部位特異的組換え酵素を含み（総説として、Ｃｏｒｍａｎ ＆ Ｂｕｌｌｏｃｋ， ２０００， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １１， ４５５−４６０参照）、既存導入遺伝子の置換または宿主ＤＮＡの転写領域中への目的の追加遺伝子の組み込みのいずれも可能にする。バクテリオファージ及びイーストの部位特異的組換え酵素／インテグラーゼはインビトロ及び植物におけるＤＮＡ操作に広く使用されている。本発明における使用のための組換え酵素−組換え部位の例は以下である：ｃｒｅ組換え酵素−ＬｏｘＰ組換え部位、ＦＬＰ組換え酵素−ＦＲＴ組換え部位、Ｒ組換え酵素−ＲＳ組換え部位、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ−ａｔｔＰ／ａｔｔＢ組換え部位など。
【０２４６】
翻訳ベクターへのスプライシング部位の導入はプロセッシングを受けた転写物中への導入遺伝子組み込みの確率を増加することがある。
【０２４７】
このベクターはさらに植物細胞質リボソームを結合するための該配列及び該コード配列の間にターゲティングシグナルペプチドをコードする配列を含む。そのシグナルペプチドの望ましい例はプラスチドトランシットペプチド、ミトコンドリアトランシットペプチド、核ターゲティングシグナルペプチド、空胞ターゲティングペプチド、及び分泌シグナルペプチドを含む。
【０２４８】
翻訳ベクターを植物細胞中に輸送するために、微小弾丸発射法、電気穿孔法またはプロトプラストのＰＥＧ処理による植物細胞へ該ベクターを直接導入することを含めて種々の方法を使用することができる。アグロバクテリウム仲介植物形質転換も翻訳ベクター輸送の効果的な方法を提供する。正しいＴ−ＤＮＡ境界の近くに結合したプロモーターの無いレポーターＡＰＨ（３’）ＩＩ遺伝子によるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及びＮｉｃｏｔｉａｎａにおけるＴ−ＤＮＡ挿入突然変異誘起は、全挿入の少なくとも３０％に転写及び翻訳遺伝子融合を誘導することを示した（Ｋｏｎｃｚ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８６， ８４６７−８４７１）。
【０２４９】
翻訳ベクターは転移性配列中にもクローニングすることができ、適当な転写領域の探索を促進しそして導入遺伝子発現の構成的または組織／器官特異的パターンのいずれも生じる。転移性配列は不活化に基づく遺伝子タグの目的で良く使用されている（Ｐｅｒｅｉｒａ ＆ Ａａｒｔｓ， １９９８， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ８２， ３２９−３３８； Ｌｏｎｇ ＆ Ｃｏｕｐｌａｎｄ， ８２， ３１５−３２８； Ｍａｒｔｉｎ ＧＢ．， １９９８， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ９， ２２０−２２６）。トランスポゾンタグシステムの種々の改良型が開発された。最も簡単なものでは、トランスポゾンは非自律転移配列を作製するために、多分、欠失またはフレームシフト以外の修飾のない挿入突然変異誘起のために使用される。さらに精巧なものでは、追加の遺伝子がトランスポゾン配列に挿入される、例えば、再挿入マーカー、レポーター遺伝子、プラスミド−レスキューベクター（Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １３， ４０７−４２０； Ｔｉｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １１， １８４１−１８５２）。所謂エンハンサートラップ及び遺伝子トラップシステムがある（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ９， １７９７−８１０； Ｆｅｄｏｒｏｖ ＆ Ｓｍｉｔｈ， １９９３， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ３， ２７３−８９）。そのようなシステムにおける転移性配列はプロモーターの無いレポーター遺伝子または最小プロモーターの調節下にあるレポーター遺伝子を備えている。最初の場合には、レポーター遺伝子は、宿主プロモーターの直後に宿主ＤＮＡの転写領域に挿入するかまたは宿主遺伝子のコード領域に挿入しそして宿主遺伝子転写物と「インフレーム」融合をすることにより、発現することができる。
【０２５０】
「インフレーム」融合の成功の確率はレポーター遺伝子の前に３個の読み枠全てに対するスプライシングドナー及びアクセプターのセットを置くことにより有意に増加することができる（Ｎｕｓｓａｕｍｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．， ２４９， ９１−１０１）。第二の場合には、レポーター遺伝子の転写は活性宿主プロモーターに近い挿入に続く最小プロモーターにより活性化されるであろう（Ｋｌｉｍｙｕｋ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．， ２４９， ３５７−６５）。そのようなトランスポゾンタグの方法の成功により、目的の遺伝子の前にＩＲＥＳ配列を持つ翻訳ベクターに対して類似の方法を使用することは支持されている。
【０２５１】
上記の方法は全て導入遺伝子を、挿入を生じた固有遺伝子の発現調節の下に置くシステムの設計を目的としている。これは特定の業務及び場合には好都合である。多くの場合に、導入遺伝子の発現パターンの修飾は望ましいものであろう。そのような目的のために、翻訳ベクターは導入遺伝子の発現パターンを変更することができるエンハンサーのような転写活性配列を備えることができる。エンハンサー配列は数千塩基対離れた位置にあるプロモーターの強さに影響することができる（Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｊ．， ２０００， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １０， Ｒ２４１−Ｒ２４４）。そのような方法の実現可能性は、Ｔ−ＤＮＡ局在３５Ｓエンハンサーが固有遺伝子の発現パターンを変えた、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける活性化タグの実験において（Ｗｅｉｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １２２， １００３−１０１３）、また上記のエンハンサートラップトランスポゾンタグにおいて実証された。後者の例では、固有遺伝子エンハンサーがレポーター導入遺伝子の発現パターンを決定する。この方法は、例えば、植物形質転換の初期段階において、あるいは形質転換の後に導入遺伝子の発現パターンの変更が必要になった時に有用であろう。応用の必要に応じた配列特異的組換えシステム（挿入、置換または除去）によりエンハンサー配列を容易に操作することができる。
【０２５２】
我々の方法は植物細胞中で機能する種々のＩＲＥＳ配列に基づく構築のセットを望むように作ることであった。この構築はＩＲＥＳに続いて植物選択マーカー遺伝子及び転写／翻訳終結シグナルを含んでいる。これらの構築はＩＲＥＳ配列の前の５’末端から直線化した後植物細胞形質転換に直接使用するかまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介ＤＮＡ転移用のＴ−ＤＮＡ中にクローニングすることができる。対照として使用した別の構築のセットはプロモーターの無い遺伝子（陰性対照）または単子葉または双子葉細胞中で機能する構成的プロモーターの調節下にある選択遺伝子（陽性対照）を含んでいた。ＤＮＡは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって運ばれるＴｉ−プラスミド（ＵＳ ５，５９１，６１６； ＵＳ ４，９４０，８３８； ＵＳ ５，４６４，７６３）、粒子または微小弾丸発射（ＵＳ ０５１００７９２； ＥＰ ００４４４８８２Ｂ１； ＥＰ ００４３４６１６Ｂ１）のような適当な技術を使用して植物細胞中に遺伝子導入した。原理的には、その他の植物形質転換法を使用することができるであろう、例えば、限定はしないが、マイクロインジェクション（ＷＯ ０９２０９６９６； ＷＯ ０９４００５８３Ａ１； ＥＰ １７５９６６Ｂ１）、電気穿孔（ＥＰ ００５６４５９５Ｂ１； ＥＰ ００２９０３９５Ｂ１； ＷＯ ０８７０６６１４Ａ１）。
【０２５３】
形質転換方法は形質転換する植物の種類による。我々の例示は、単子葉（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）及び双子葉（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ， Ｏｒｉｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｕｓ）植物種の代表例における形質転換効率のデータを含んでおり、これにより異なる植物遺伝子起源の及び種ゲノム内の転写領域の密度が異なる植物種に対する我々の方法の実現性を立証している。ベクター中の導入遺伝子コード配列は目的の遺伝子の部分に過ぎないであろうから、その遺伝子は部位特異的または相同組換えの結果として機能的長さに再構成される。目的の配列の翻訳はキャップ非依存的であることが望ましい。宿主はキャップ依存翻訳を抑制（または増強）するかまたはキャップ非依存翻訳を増強（または抑制）するように修飾されるであろう。これは外来性薬物による処理またはその発現が望ましい効果を示す配列をベクター中または該植物中に含ませることにより達成することができる。
【０２５４】
例
例１
ＩＲＥＳ含有ベクターの構築
一連のＩＲＥＳ仲介発現ベクターは標準的分子生物学技術を使用して構築した（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ベクターｐＩＣ１３０１（図３７）はプラスミドｐＩＣ５０１（ｐ３５Ｓ−ＧＦＰ− ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＢＡＲ−３５ＳターミネーターのｐＵＣ１２０）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、大きなゲル精製フラグメントを再結合することにより作製した。ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲはアブラナ（ＣＲ）−感染トバモウイルスの移動タンパク（ＭＰ）のサブゲノムＲＮＡの５’−非翻訳リーダー配列の３’末端７５塩基を示す。
【０２５５】
ベクターｐＩＣ１５２１（図３８）は３段階のクローニングにより作製した。第一段階においてｐＩＣ１３１１は、ｐＩＣ０３２の小ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩフラグメントを持つｐＩＣ０３１の大ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩフラグメント及びｐＩＣ０１８の小ＢｓｐＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントの結合により構築した。得られた３５Ｓプロモーターの調節下にあるＢＡＲ遺伝子を含む構築ｐＩＣ１３１１（図示せず）を形質転換実験における比較対照として使用した。プラスミドｐＩＣ１３１１をＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントで処理して平滑末端とした。大制限フラグメントをゲル精製し、再結合してｐＩＣ１４５１（プロモーターの無いＢＡＲ−３５ターミネーター；図３９参照）を生成した。ｐＩＣ０３３の小ＳａｃＩ−ＮｃｏＩフラグメントを持つｐＩＣ１４５１の大Ｓａｃ１−Ｐｓｔ１フラグメント及びｐＩＣ０１８の小ＢｓｐＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントの結合によりｐＩＣ１５２１（図３８）を生成した。この構築はＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ（ＣＰはコートタンパクを意味する）配列の前に「ヘアピン」を含む。「ヘアピン」構造はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋ポリリンカーのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ及びＣＩａＩ−ＫｐｎＩフラグメントにより形成された逆方向直列反復の存在により形成される。
【０２５６】
ベクターは全て形質転換実験に使用するためにＳａｃＩ（ｐＩＣ１５２１；ｐＩＣ１４５１）またはＨｉｎｄＩＩＩ（ｐＩＣ１３１１；ｐＩＣ１３０１）制限酵素の消化により直線化し、そして消化されないベクターから分離するためにゲル精製を行なった。
【０２５７】
例２
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＰＥＧ介在プロトプラスト形質転換
プロトプラストの単離
Ｂｒａｓｓｉｃａプロトプラストの単離は以前に記述されているプロトコールに基づいている（Ｇｌｉｍｅｌｉｕｓ Ｋ．， １９８４， Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ．， ６１， ３８−４４； Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＆ Ｇｌｉｍｅｌｉｕｓ， １９８６， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４３， １５５−１６２及びＳｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ７５， ９６−１０４）。
【０２５８】
滅菌した種子（補遺参照）を０．３％ Ｇｅｌｒｉｔｅを含む１／２ＭＳ培地を入れた９０ ｍｍペトリ皿中において発芽させた。種子を相互に若干離して数列にして置いた。ペトリ皿をシールし、４５°の角度に傾け、そして６日間２８℃で暗所に置いた。胚軸を鋭利なかみそり刃で１−３ ｍｍの長さに細切した。試料の分解を避けるために刃をしばしば交換した。細胞の原形質分離をするために胚軸の細片をＴＶＬ溶液（補遺参照）中に入れた。試料を室温で１−３時間処理した。この前処理は完全なプロトプラストの収量を著しく改善する。前原形質分離溶液を８−１０ ｍｌの酵素溶液（補遺参照）に置換した。酵素溶液は試料全体を被わなければならないが、過剰に使用してはならない。試料を少なくとも１５時間暗所において２０−２５℃でインキュベートした。ペトリ皿をロータリーシェーカー上に置き非常に穏やかに振とうした。
【０２５９】
プロトプラスト及び細胞破片の混合物を７０ ｍｍメッシュサイズのフィルターを通して濾過した。ペトリ皿を５−１０ ｍｌのＷ５溶液で洗い（Ｍｅｎｃｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ５９， １９１−１９５）（補遺も参照）、これは濾過せずに残りの懸濁と合併した。プロトプラスト懸濁を４０ ｍｌ滅菌Ｆａｌｃｏｎ試験管に移し、７分間１２０ ｇで遠心分離することによりプロトプラストをペレットとした。上清を除去し、プロトプラストのペッレトを０．５ Ｍスクロースに再懸濁した。懸濁を滅菌した１０ ｍｌ遠心分離試験管に入れ（試験管当たり８ ｍｌ）、そして２ ｍｌのＷ５溶液を加えた。１０分間１９０ ｇで遠心分離した後完全なプロトプラストをパスツールピペットで中間層から採取した。それを新しい遠心分離試験管に移し、１０ ｍＭ ＣａＣｌ２を含む０．５ Ｍマンニトールに再懸濁し、そして５分間１２０ ｇでペレットにした。
【０２６０】
ＰＥＧ処理
プロトプラストを形質転換緩衝液（補遺参照）に再懸濁した。プロトプラスト濃度を計数チャンバーで測定し、そして１−１．５ｘ１０６プロトプラスト／ｍｌに調節した。この懸濁の１００μｌを傾斜した６−ｃｍペトリ皿の低い隅に置き、そして数分間放置してプロトプラストを落ち着かせた。次いでプロトプラストを５０−１００μｌのＤＮＡ溶液（Ｑｉａｇｅｎで精製し、１ ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解）と穏やかに混合した。次いで２００μｌのＰＥＧ溶液（補遺参照）を滴下してプロトプラスト／ＤＮＡ混合物に加えた。１５−３０分後形質転換緩衝液（またはＷ５溶液）を少量ずつ加え（滴下し）、皿を殆ど充たした（〜６ ｍｌ）。懸濁を１−５時間静置した。次いでプロトプラストを遠心分離試験管に移し、Ｗ５溶液に再懸濁し、５−７分間１２０ｇでペレットにした。
【０２６１】
プロトプラスト培養及び形質転換体の選別
プロトプラストを８ｐＭ培地（Ｋａｏ ＆ Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ， １９７５， Ｐｌａｎｔａ， １２６， １０５−１１０； 補遺も参照）に移し、０．５または１．５ ｍｌの培地を入れた２．５ ｃｍまたは５．０ ｃｍペトリ皿中２５℃で弱い照明下にインキュベートした。プロトプラスト密度は２．５×１０４プロトプラスト／ｍｌであった。最初のプロトプラスト分裂の直後にホルモンを含まない８ｐＭ培地３倍量を加えた。細胞を１日１６時間強い光でインキュベートした。
【０２６２】
１０−１４日後０．１ Ｍスクロース、０．１３％アガロース、５−１５ ｍｇ／ＬのＰＰＴ及び８ｐＭ培地よりも４倍少ない濃度のホルモンを含むＫ３培地（Ｎａｇｙ ＆ Ｍａｌｉｇａ， １９７６， Ｚ． Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．， ７８， ４５３−４５５）に細胞を移した。新鮮な培地への移行を促進するために、細胞を滅菌した濾紙上に置き薄い層になるように広げた。細胞を１日１６時間強い光の中に置いた。細胞コロニーが直径約０．５ ｃｍに達した後分別培地Ｋ３を入れたペトリ皿に細胞コロニーを移した。
【０２６３】
例３
微小弾丸発射によるＴｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍの形質転換
植物細胞培養
Ｔ． ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ Ｌ．の細胞系の懸濁を回転振とう機上の２５０ ｍｌフラスコ中ＭＳ２（ＭＳ塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ， １９６２ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ．， １５， ４７３−４９７）， ０．５ ｍｇ／Ｌチアミン ＨＣｌ， １００ ｍｇ／Ｌイノシット， ３０ ｇ／Ｌスクロース， ２００ ｍｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ２ ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ）培地で２５℃、１６０ ｒｐｍで増殖させ毎週継代した。継代培養４日後細胞を０．５ Ｍスクロースを含むｇｅｌｒｉｔｅ−固形化（４ ｇ／Ｌ）ＭＳ２上の５０ ｍｍ滅菌円盤濾紙上に展開した。
【０２６４】
微小弾丸発射法
微小弾丸発射はＢｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して行なった。９００−１１００ ｐｓｉ， マクロキャリア発射点から停止膜までの距離１５ ｍｍそして停止膜から標的組織までの距離６０ ｍｍで細胞を射撃した。破裂ディスクとマクロキャリアの発射点の間の距離は１２ ｍｍであった。浸透圧前処理の４時間後に細胞を射撃した。
【０２６５】
本来のＢｉｏ−Ｒａｄのプロトコール（Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｉｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，ｅｄ． Ｒ． Ｗｕ， ２１７， ４８３−５０９）によるＤＮＡ−金コーティングは次のように行なった：５０％グリセロール（６０ ｍｇ／ｍｌ）中の２５μｌの金粉（０．６，１．０ ｍｍ）を５μｌのプラスミドＤＮＡ（０．２μｇ／μｌ）、２５μｌのＣａＣｌ２（２．５ Ｍ）及び１０μｌの０．１ Ｍスペルミジンと混合した。混合物を２分間渦巻き状に攪拌し、次いで室温３０分インキュベートし、遠心分離（２０００ｒｐｍ，１分間）、７０％及び９９．５％エタノールで洗った。ペレットを３０μｌの９９．５％エタノール（６μｌ／ショット）に再懸濁した。
【０２６６】
新規のＤＮＡ−金コーティング法（ＰＥＧ／Ｍｇ）は次のように行なった：２５μｌの金懸濁（５０％グリセロール中６０ ｍｇ／ｍｌ）を５μｌのプラスミドＤＮＡとエッペンドルフ試験管中で混合しそして続いて３０μｌの１．０ Ｍ ＭｇＣｌ２中４０％ ＰＥＧを添加した。混合物を２分間渦巻き状に攪拌し、次いで攪拌せずに室温３０分間インキュベートした。遠心分離（２０００ｒｐｍ，１分間）の後ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで２回、１ｍｌの９９．５％エタノールで１回洗い、そして最終的に３０μｌの９９．５％エタノールに分散した。ＤＮＡ−金のエタノール懸濁の一部（６μｌ）をマクロキャリアディスクにつけ、５−１０分間乾燥した。
【０２６７】
プラスミドＤＮＡ標品
プラスミドはＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株に遺伝子導入し、マキシ標品をＬＢ培地で増殖し、そしてＤＮＡをＱｉａｇｅｎキットを使用して精製した。
【０２６８】
選別
安定した形質転換実験のために、処理細胞を付けた濾紙を滅菌選別試薬（１５０ ｍｇ／ＬヒグロマイシンＢ、Ｄｕｃｈｅｆａ）；１０ ｍｇ／Ｌ ｂｉａｌａｐｈｏｓ（Ｄｕｃｈｅｆａ）を含む固形ＭＳ２培地上に移した。プレートを暗所２６℃でインキュベートした。
【０２６９】
例４
微小弾丸発射によるＯｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓの形質転換
懸濁培養の調製
Ｏ． ｖｉｏｌａｃｅｕｓの植物をＭＳ培地、０．３％Ｇｅｌｒｉｔｅ（または、１／２ＭＳ， ２％スクロース及び０．８％寒天）上インビトロ、２４℃、１６／８明暗照明時間で３−４週間育成した。４−６枚の葉（大きさによる）を細片に切り、３０ ｍｌのカルス誘導培地（ＣＩＭ）（補遺参照）を入れたマゼンタボックスに移した。試料を４−５週間薄明かり（または暗所）で２４℃に保ち、激しく攪拌した。この間に新鮮ＣＩＭ培地を加えてマゼンタボックス中の植物組織を液で覆われるように維持した。マゼンタボックスの壁の中に刺さった細胞はボックスを激しく反転及び揺することにより培地中に放出した。
【０２７０】
微小弾丸発射法のための植物試料の調製
細胞懸濁の分割液をペトリ皿の固形ＣＩＭ培地に支持されている滅菌濾紙状に注意して置いた。植物試料を入れたペトリ皿を５−７日間暗所に置いた。操作の４時間前に、細胞のついた濾紙を１０％スクロースを含む新鮮ＣＩＭに移した。微小弾丸発射は例３に記述したように実施した。発射の１４時間後試料を３％スクロースを含むＣＩＭ培地に移し、暗所に維持した。
【０２７１】
形質転換体の選別
発射の２−４日後に、細胞のついた濾紙を適当な選別試薬（１０−１５μｇ／ｍｌ ＰＰＴ）を添加したＣＩＭを入れたプレートに移した。７日毎に試料を新鮮選別培地に移した。プレートを暗所に維持し、約６週間後植物試料を、適当な選別試薬（１０−１５μｇ／ｍｌ ＰＰＴ）を添加した形質形成誘導培地（ＭＩＭ）（補遺参照）に移した。プレートを１６時間照明の強い光度でインキュベートした。
【０２７２】
例５
プロモーターの無いｌｏｘＰ−ＨＰＴ遺伝子によるＴｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍの形質転換
構築ｐＩＣ０５２（図４１）をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素の消化により直線化し、ゲル精製して非消化物質を分離し、そして上記のように（例３参照）、微小弾丸発射法に使用した。直線化ベクターはｐＵＣ１９ポリリンカー（５７ ｂｐ）に続いてＨＰＴ遺伝子の５’末端のｌｏｘＰ部位を含んでいる。一般的に、ＨＰＴ遺伝子の翻訳開始コドンの５’末端には約１００ ｂｐが存在する。３４プレートが形質転換され、そしてヒグロマイシン含有培地上における１．５ヶ月の選別（例３）の後、３個のヒグロマイシン耐性コロニーが回収された。組み込み部位の配列はＩＰＣＲにより再生され、３個の形質転換体の非依存性が確認された。
【０２７３】
例６
プロモーターの無いＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＡＨＡＳによるＯｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ葉の形質転換
植物アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）は核にコードされ、クロロプラスト標的タンパクであり、分枝アミノ酸の生合成の第一段階を触媒する。これはこれらのアミノ酸によりアロステリック調節を受けており、数クラスの除草剤により抑制されることがある。構築ＰＩＣ０６−ＩＲＥＳは、ｐＩＣ０６中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＡＨＡＳ（Ｓｅｒ６５３−Ａｓｎ）遺伝子（１．３ Ｋｂ ＰｓｔＩ−ＮｃｏＩフラグメント）のプロモーターをＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ配列で置換することにより作製される。この最終構築は（図４１）、イミダゾール除草剤ファミリーに対する耐性を付与する１ アミノ酸置換（Ｓｅｒ６５３Ａｓｎ）を持つＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）遺伝子の変異体を含んでいる（Ｓａｔｈａｓｉｖａｎ， Ｈａｕｇｈｎ ＆ Ｍｕｒａｉ， １９９１， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ９７， １０４４−１０５０）。プラスミドはＳａＩＩ制限酵素で処理して直線化し、そして新しく作製したＯ． ｖｉｏｌａｃｅｏｕｓ懸濁培養の微小弾丸発射に使用した。滅菌Ｏ． ｖｉｏｌａｃｅｏｕｓの葉を細かく切りそしてロータリー振とう機上のマジェンタボックス中の液体高オーキシン培地（ＨＡＭ）にいれ懸濁培養した。７−１４日後懸濁培養を滅菌濾紙で被ったグリーニング培地（ＧＭ）を入れたペトリ皿に移した（補遺参照）。３日後細胞がついた濾紙を０．４ Ｍスクロースを添加したＧＭ上に移した。４時間後細胞を例３で記述したように、ｐＩＣ０６−ＩＲＥＳの直線化したＤＮＡによる微小弾丸発射に使用した。１４時間後細胞がついた濾紙をＧＭ，３％スクロース、に移した。２日後細胞を０．７μＭ イマゼタピル（ＡＣ２６３，４９９またはＰｕｒｓｕｉｔ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）を含むＧＭに移した。細胞は７−１０日毎に継代培養した。約４−６週後に推定事象の確認をおこない、形質転換体を、１日１６時間、強い光度の下で１−２μＭイマゼタピルを含む再生培地（ＲＭ）上で選別した。
【０２７４】
例７
翻訳ベクターを使用する２−ＤＯＧ−６−Ｐの発現
この例の目的は、配列特異的組換え部位を持つ翻訳ベクターを既に含む遺伝子導入植物を操作できることを示すことにある。
【０２７５】
ベクターｐＩＣ０５２で形質転換したヒグロマイシン耐性Ｔ． ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ細胞（例５）を２種のプラスミド、ｐＩＣ−ＤＯＧ及びｐＩＣ−ＣＲＥ（図４２）による微小弾丸共発射に使用した。プラスミドｐＩＣ−ＤＯＧは２個のｌｏｘＰ部位に挟まれたプロモーターの無い２−デオキシグルコース−６−リン酸（２−ＤＯＧ−６−Ｐ）リン酸化酵素ｃＤＮＡ（特許ＷＯ ９８／４５４５６）を含む。ｐＩＣ０５２を含む形質転換体のｌｏｘＰ部位へ２−ＤＯＧ−６−ＰのＣｒｅ仲介組み込みにより固有プロモーターによる２−ＤＯＧ−６−Ｐの発現を生じる。この発現は２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）に対する耐性を付与する。耐性コロニーは例３に記述したように選別したが、選択試薬として０．０７５−０．１％の２−ＤＯＧを使用した。
【０２７６】
例８
トランスポゾンを組み込んだ翻訳ベクター
この例の目的は、宿主ゲノム中の目的とする転写部位に翻訳ベクターを指向させる直接形質転換の別の方法を示すことにある。
【０２７７】
図４３に示した構築によりＯ． ｖｉｏｌａｃｅｏｕｓ細胞を共形質転換し、そして例４に記述したように形質転換体の選別をおこなった。非自律的転移性ｄＳｐｍ配列はＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲの５’末端に先行するプロモーターの無いＢＡＲ遺伝子を含んでいる。Ｓｐｍトランスポゼースにより誘導される転移は、該宿主ゲノム中の目的発現パターン（この場合には−構成的）を持つ転写活性領域の探索を促進するので、一次形質転換体の回収数を増加する。実際、形質転換体の数はＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＢＡＲ遺伝子（ｐＩＣ１３０１、図３７）のみによるよりも３−４倍高かった。
【０２７８】
補遺
種子の滅菌
種子を１％ＰＰＭ溶液に少なくとも２時間（終夜が望ましい）浸す。種子を７０％エタノール中で１分間次いで０．０１％ＳＤＳまたはＴｗｅｅｎ ２０を含む１０％塩素溶液中ロータリー振とう機上の２５０ ｍｌ振とうフラスコ中で洗う。種子を０．５Ｌの滅菌水で洗う。
Figure 2004536573
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【図面の簡単な説明】
【図１】
１Ａは本発明の方法の説明図である。
１Ｂは感染植物細胞における相互作用の可能性のある組合せの説明図である。
【図２】
ＩＲＥＳｃｐ，１４８ ＣＲ−Ａｃトランスポゼース及びＩＲＥＳｍｐ，７５ ＣＲ−Ａｃトランスポゼースをそれぞれ含むｃｒＴＭＶ由来ベクターｐｌＣ１１１１及びｐｌＣ１１２３を示す。ｐ３５Ｓ：：Ｄｓ：：ＧＵＳ−３’ｏｃｓを含むバイナリーベクターｐＳＬＪ７４４のＴ−ＤＮＡ領域も示す。
【図３】
ＩＲＥＳｃｐ，１４８ ＣＲ−Ｃｒｅ組換え酵素及びＩＲＥＳｍｐ，７５ ＣＲ−Ｃｒｅ組換え酵素をそれぞれ含むｃｒＴＭＶ由来ベクターｐｌＣ２５４１及びｐｌＣ２５３１を示す。直列方向に二つのｌｏｘＰサイトに挟まれたＧＵＳ遺伝子を含むバイナリーベクターｐｌＣ２５６１のＴ−ＤＮＡ領域も示す。
【図４】
二つの逆転したｌｏｘＰサイトに挟まれたＧＵＳ遺伝子を含むバイナリーベクターｐｌＣ１６４１のＴ−ＤＮＡ領域と組合わせたｃｒＴＭＶ由来ベクターｐｌＣ２５４１及びｐｌＣ２５３１（図３も参照）を示す。
【図５】
Ｔ７プロモーターの調節を受けるＧＵＳ遺伝子を持つバイナリーベクターｐｌＣ２６９１のＴ−ＤＮＡ領域及びＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含むｃｒＴＭＶ由来ｐｌＣ２６３１を示す。
【図６】
ｐＳＬＪ７４４で形質転換した遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の葉のＸ−ｇｌｕｃ染色を示す。ＧＵＳ遺伝子の転写はＤｓ配列の挿入により阻止されている。
Ａ−ｐｌＣ１１２３の転写物を接種した葉。
Ｂ−ｐｌＣ１１１１の転写物を接種した葉。
Ｃ−水を接種した葉。
【図７】
ＴＭＶ由来プロベクターｐｌＣＨ４３７１及びプロベクターのｐｌＣＨ４４６１末端を示す（ＲｄＲｐ：ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ：移動タンパク；ｓＧＦＰ：合成緑色蛍光タンパク；３’ＮＴＲ：ＴＭＶの３’非翻訳領域；ｓｇｐ：サブゲノムプロモーター）。
【図８】
Ｃｒｅ組換え酵素発現カセットを提供するバイナリーベクターｐｌＣＨ１７５４のＴ−ＤＮＡを示す。
【図９】
Ｃｒｅ組換え酵素の存在下にプロベクターからウイルスベクターの形成を図示する。
補足図１から１１は例６に使用されたベクター及び構築物を示す。
【図１０】
ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ及びＳｐ６／ｃｒＴＭＶを示す。
【図１１】
ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳ，Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＵＩ−ＧＵＳ，
Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，２２８ ＣＲ−ＧＵＳ，Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ−ＧＵＳ，
Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＳＰＡＣＥＲＣＰ，１４８ ＵＩ−ＧＵＳ及びＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＰＬ−ＧＵＳを示す
【図１２】
プライマー伸長によるｃｒＴＭＶ Ｉ２ ｓｇＲＮＡの５’末端のマッピング（Ａ）及びＩ２ ｓｇＲＮＡ ５’ＮＴＲの理論的２次構造。
【図１３】
ｃｒＴＭＶ １２ ｓｇＲＮＡ ５’ＮＴＲは翻訳抑制ヘアピン構造を含んでいる。
（Ａ）−コムギ胚芽抽出物（ＷＧＥ）中におけるインビトロ翻訳に使用される人工的転写物を示す；
（Ｂ）−ＷＧＥ中で合成される翻訳産物を示す。
【図１４】
トバモウイルスはＭＰ遺伝子の上流に理論的翻訳抑制ヘアピン構造を含む。
【図１５】
キャップのあるｍＲＮＡの特異的検出方法。Ａ，Ｂ．既知配列のＲＮＡ−タグを被検ＲＮＡのキャップに特異的に結合する。Ｃ． ３’−特異的プライマーによる逆転写及びｃＤＮＡの第一鎖の合成。タグ配列はｃＤＮＡ配列に含まれる。Ｄ．タグ特異的及び３’−特異的プライマーによるＰＣＲ．それぞれのＰＣＲバンドの現われ方により被検ＲＮＡ中のキャップ構造の存在が示される。Ｅ． ５’−特異的及び３’−特異的プライマーによるＰＣＲ。ＰＣＲバンドの現われ方はＰＣＲ反応の調節に役立ちそして反応中の特定の被検ＲＮＡの存在を示す。Ｆ．得られたＰＣＲバンドの長さの相対的比較。
【図１６】
１６ａ及び１６ｂ。２％アガロースゲルにおけるウイルスＲＮＡの５’−末端におけるキャップ構造存在の検出。矢印はそれぞれのＰＣＲバンドを示す。
【図１７】
ＫＫ６−由来ＴＭＶベクターを示す。
【図１８】
ＫＫ６及びＫＫ６−ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲＩ２ｓｇＲＮＡの５’ＮＴＲのヌクレオチド配列。
【図１９】
ＫＫ６−ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ（Ｋ８６）、ＫＫ６及びＴＭＶ Ｕ１を接種した葉におけるＣＰ及びＭＰ蓄積の時間経過。
【図２０】
ＫＫ６，ＫＫ６−ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ， ＫＫ６−ＩＲＥＳＭＰ，１２５ ＣＲ，及びＫＫ６−Ｈ−ＰＬ及びＫＫ６−ＰＬに感染したタバコにおけるＣＰ蓄積。
【図２１】
ｃｒＴＭＶ ＩＲＥＳｍｐ多量体構造及び１８Ｓ ｒＲＮＡに対する相補性。
【図２２】
ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲを含むビシストロン性転写物、ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲの１８−ｎｔ部分の４量体、ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲの１９−ｎｔ部分、シストロン間スペーサーとしてのポリリンカー（ＰＬ）及びＲＲＬにおける翻訳産物を示す。
【図２３】
ＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ構造を示す。
【図２４】
インビトロ及びインビボにおいてＩＲＥＳＣＰ，１４８ ＣＲ配列試験に使用した構築を示す。
【図２５】
図３０に示されている転写物の翻訳後のＷＧＥにおけるＧＵＳ作用の試験。
【図２６】
図３０に示されているものと類似の３５Ｓプロモーター由来構築を導入したタバコプロトプラストにおけるＧＵＳ作用試験。
【図２７】
５’ＮＴＲにＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲを含む２種の感染性ＴＭＶベクターのクローニングの図解を示す。
【図２８】
ベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶを示す。
【図２９】
ｐＵＣ−由来ベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳを示す。
【図３０】
環状１本鎖ベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳを示す。
【図３１】
ベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ−ＧＵＳを示す。
【図３２】
構築３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳを示す。
【図３３】
構築３５Ｓ／ＧＵＳ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＣＰを示す。
【図３４】
構築３５Ｓ／ＣＰ−ＶＰｇ／ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ／ＧＵＳを示す。
【図３５】
発現ベクター中におけるウイルスサブゲノムプロモーターまたは目的とする遺伝子のキャップ非依存発現を行なうＩＲＥＳ配列を同定するためにインビボ遺伝子選択をするための構築を示す。
【図３６】
多数の可能な翻訳ベクター変異体のうちの４個からの導入遺伝子発現を示す。
Ａ−ベクターは翻訳エンハンサー及び翻訳停止コドンを含む；
Ｂ−ベクターは翻訳エンハンサーとしてＩＲＥＳをそして転写終結領域を含む；
Ｃ−ＩＲＥＳが３個の読み枠全てに対する翻訳停止コドンより先行している以外はＢにおけると同じ；
Ｄ−ベクターはイントロン／エクソン境界領域（３’Ｉ−５’Ｅ及び３’Ｅ−５’Ｉ）により挟まれエクソンの特徴を示し、そしてスプライスされたｍＲＮＡ中に取込まれることを促進する以外はＣと同じ。
【図３７】
ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ，ＢＡＲ及び３５Ｓターミネーターを含むベクターｐＩＣ１３０１を示す。
【図３８】
「ヘアピン」、ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ，ＢＡＲ及び３５Ｓターミネーターを含むベクターｐＩＣ１５２１を示す。「ヘアピン」構造は翻訳停止コドンの代替物として働き、翻訳融合生成物の形成を防ぐ。
【図３９】
プロモーターの無いＢＡＲ遺伝子及び３５Ｓターミネーターを含むベクターｐＩＣ１４５１を示す。
【図４０】
ｌｏｘＰ，ＨＰＴ及びｎｏｓターミネーターを含むベクターｐＩＣ０５２を示す。
【図４１】
ＩＲＥＳＭＰ，７５ ＣＲ，ＡＨＡＳ遺伝子を含むベクターｐＩＣ０６−ＩＲＥＳを示す、このＡＨＡＳはイミダゾリン除草剤耐性を生じるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子の突然変異株である。
【図４２】
イースト２−デオキシグルコース−６−リン酸（２−ＤＯＧ−６−Ｐ）リン酸化酵素及びコメアクチンプロモーターに調節されるｃｒｅ組換え酵素、それぞれのコード配列を含むベクターｐＩＣ−ＤＯＧ及びｐＩＣ−ＣＲＥを示す。
【図４３】
トランスポゼースを含むトランスポゾンを組込んだ翻訳ベクターｐＩＣ−ｄＳｐｍ及びベクターｐＩＣ１４９１を示す。ｐＨＢＴはコムギＣ４ＰＰＤＫ遺伝子の基本部分に融合したｐ３５Ｓエンハンサーからなるキメラプロモーターである。

Claims (31)

  1. （ａ） １またはそれ以上の第一異種ＤＮＡ配列を植物の核ゲノム中に導入し、
    （ｂ） 自身のゲノム中に１またはそれ以上の第二異種ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む少なくとも一つのウイルス遺伝子導入ベクターを植物に感染させること、により
    （ｉ） 核ゲノムの１またはそれ以上の第一異種ＤＮＡ配列及び／またはその第一異種ＤＮＡ配列の発現産物、及び
    （ｉｉ） 遺伝子導入ベクターの１またはそれ以上の第二異種ＤＮＡまたはＲＮＡ配列及び／またはその第二異種ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の発現産物、及び
    （ｉｉｉ） さらに１またはそれ以上の外部から加えた低分子量化合物、
    の間の相互作用過程（Ｉ）を開始して、該相互作用の以前には作動しない目的の生化学過程（ＩＩ）または生化学連鎖（ＩＩＩ）のスイッチを入れる上記段階を含むことを特徴とする植物中における目的の生化学過程（ＩＩ）または生化学連鎖（ＩＩＩ）を調節する方法。
  2. 相互作用過程が植物の核ゲノム中に安定的に組み込まれた第一異種ＤＮＡ配列の発現産物を必要とする請求項１に記載の方法。
  3. 該相互作用が該遺伝子導入ベクターの第二異種ＤＮＡまたはＲＮＡの発現産物を必要とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 段階（ｂ）おける植物の感染が集合ウイルス粒子または感染性ウイルス核酸によるか、または植物ゲノム中に予め組み込まれたウイルス核酸の放出による遺伝子導入過程の活性化により行われる請求項１から３のいずれか一つに記載の方法。
  5. 該集合ウイルス粒子または該感染性ウイルス核酸がＲＮＡであるかまたはＲＮＡを含む請求項４に記載の方法。
  6. 段階（ｂ）における植物の感染が該植物の細胞中への核酸配列のアグロバクテリウム仲介輸送を含む請求項１から３のいずれか一つに記載の方法。
  7. 段階（ｂ）においてさらに別のベクターが導入されそして該別のベクターの配列及び／または発現産物が該相互作用過程に必要である請求項１から６のいずれか一つに記載の方法。
  8. 段階（ｂ）における植物の感染が該植物の細胞中へ１またはそれ以上のベクターが導入されることにより行われ、そして該ベクターが該植物の細胞中において該ウイルス遺伝子導入ベクターを発生する過程を行なうように順応させられている請求項１から７のいずれか一つに記載の方法。
  9. 該相互作用過程がウイスル遺伝子導入ベクター発生過程である請求項１から８の一つに記載の方法。
  10. 相互作用過程がＤＮＡ転移を必要とする請求項１から９のいずれか一つに記載の方法。
  11. 相互作用過程がＤＮＡ組換えを必要とする請求項１から１０のいずれか一つに記載の方法。
  12. 目的の生化学過程または連鎖が該相互作用過程において構成的プロモーターに対して正方向に置かれるプロモーターの無い遺伝子をアンチセンス方向に含有する第一または第二ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の発現を含む請求項１１に記載の方法。
  13. 相互作用過程が異種ＲＮＡポリメラーゼによる異種プロモーターの認識を必要とする請求項１から９のいずれか一つに記載の方法。
  14. 該第一または該第二ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が植物ＲＮＡポリメラーゼによって認識されない異種プロモーターの調節下に発現され、そしてそれぞれ該第二及び該第一ＤＮＡ配列によりコードされている該プロモーターとそれと共に機能するＲＮＡポリメラーゼの相互作用により発現される該配列の転写のスイッチが入る請求項１３に記載の方法。
  15. 該ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼでありそして該異種プロモーターがバクテリオファージプロモーターである請求項１４に記載の方法。
  16. 相互作用過程がＤＮＡ複製、結合、ハイブリダイゼーション、転写、またはＤＮＡ制限のようなＤＮＡ反応を必要とする請求項１から１５のいずれか一つに記載の方法。
  17. 相互作用過程が複製、プロセッシング、スプライシング、逆転写、ハイブリダイゼーションまたは翻訳のようなＲＮＡ反応、またはそれらの活性化、抑制または修飾を含む請求項１から１６の一つに記載の方法。
  18. 相互作用過程がタンパク折り畳み、集合、活性化、翻訳後修飾、ターゲティング、結合、酵素作用またはシグナルトランスダクションのような酵素反応、またはその活性化、抑制または修飾を含む請求項１から１７のいずれか一つに記載の方法。
  19. （ｉ） 目的の生化学過程または連鎖が第一または第二ＤＮＡ配列の転写を抑制することができるＤＮＡ挿入によりそのプロモーターから分離されている第一及び第二ＤＮＡ配列の発現を含み、そして
    （ｉｉ） 段階（ｂ）において開始する相互作用過程がＤＮＡ挿入の除去を生じ、それによって第一または第二ＤＮＡ配列が発現される
    請求項１から１１の一つに記載の方法。
  20. ＤＮＡ挿入が
    （ｉ） 核ゲノムに挿入するためのウイルスベクター上の第二ＤＮＡ配列によってコードされている、または
    （ｉｉ） ウイルスベクターに挿入するための核ゲノム中の第一ＤＮＡ配列によってコードされている、
    トランスポゼースによって除去される非自律的転移配列である請求項１９に記載の方法。
  21. ＤＮＡ挿入が
    （ｉ） 核ゲノムに挿入するためのウイルスベクター上の第二ＤＮＡ配列によってコードされている、かまたは
    （ｉｉ） ウイルスベクターに挿入するための核ゲノム中の第一ＤＮＡ配列によってコードされている、
    部位特異的ＤＮＡ組換え酵素により認識される一方向部位に挟まれている請求項１９に記載の方法。
  22. 該プロモーターは天然の植物転写因子及び第二または第一ＤＮＡ配列によりそれぞれコードされている該異種または操作した転写因子によって認識されず、該第一または第二ＤＮＡ配列の目的の異種遺伝子に作動的に結合した異種または操作したまたはキメラプロモーターを認識することができる異種または操作した転写因子により第一または第二ＤＮＡ配列の転写のスイッチが入る請求項１から９の一つに記載の方法。
  23. 転写因子が外部から適用した低分子量化合物により誘導される請求項２２に記載の方法。
  24. 段階（ａ）の該第一異種ＤＮＡ配列が植物ウイルス起源でない請求項１から２３の一つに記載の方法。
  25. 段階：
    （ａ） １またはそれ以上の第一異種核酸配列を植物の核ゲノム中に導入し、
    （ｂ） 自身のゲノム中に１またはそれ以上の第二異種核酸配列を含む少なくとも一つのベクターを植物に感染させること、により
    （ｉ） 核ゲノムの１またはそれ以上の第一異種核酸配列及び／またはその第一異種核酸配列の発現産物、及び
    （ｉｉ） 遺伝子導入ベクターの１またはそれ以上の第二異種核酸配列及び／またはその第二異種核酸配列の発現産物、及び
    （ｉｉｉ） さらに１またはそれ以上の外部から加えた低分子量化合物、
    の間の相互作用過程（Ｉ）を開始して、該相互作用の以前には作動しない目的の生化学過程（ＩＩ）または生化学連鎖（ＩＩＩ）のスイッチを入れる上記段階を含むことを特徴とする植物における目的の生化学過程（ＩＩ）または生化学連鎖（ＩＩＩ）を調節する方法。
  26. 請求項２から２４の一つに記載した特徴をさらに追加した請求項２５に記載の方法。
  27. 請求項１から２６の一つに記載した方法の段階を含む遺伝子導入植物における製品の製造方法。
  28. 以下の方法：
    （ａ） 望む段階まで植物を育成する、次いで
    （ｂ） １以上のウイルス遺伝子導入ベクターに植物を感染させ、そしてさらに植物を１以上の低分子量化合物と接触させ、こうして該相互作用以前には作動しない製品の製造に必要な生化学過程または生化学連鎖のスイッチを入れ、そして
    （ｃ） 植物中において製品を製造すること
    をさらに含む請求項２７に記載の方法。
  29. （ｉ） 遺伝子導入植物またはその種子、及び
    （ｉｉ） ベクター、特にウイルス遺伝子導入ベクター
    を含む請求項１から２８の一つに記載の方法を実施するための部品のキット。
  30. 請求項１から２６の一つに記載の段階（ｂ）を実施するためのベクター。
  31. 請求項２７または２８に記載の方法により得たまたは得ることができる植物。
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