CN104531855A - 一种细菌ⅰ型整合子的荧光定量pcr检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂，是将PCR技术与荧光检测相结合，构建并筛选出上述扩增效率高和特异性好的一对引物和一条探针，克服了常规PCR费时、易污染、准确性较差以及扩增后需电泳检测等缺点，可对细菌中的Ⅰ型整合子进行快速、准确、安全的定性检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点，可减少DNA或PCR产物污染的风险；常规PCR的检测时间一般6小时以上，本发明无需扩增后的电泳分析，样品检测时间在3小时之内，可判断出阳性、阴性和可疑结果，Ct值为40.0可确定为阳性和阴性的临界值，可同时进行大量样品检测，具有高通量性。

Description

一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂

技术领域

 本发明涉及整合子的PCR检测，具体涉及一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂。

背景技术

整合子是一种能识别并俘获移动性基因盒，具有位点特异的基因重组系统。抗生素的应用压力不断增强，导致越来越多的耐药基因盒出现，携带重组基因盒的整合子能够随机插入到接合性质粒或转座子中，导致了更大范围的耐药性水平传播。整合子的传播借助于转化、转导及接合，不仅发生于细菌之间，还可以跨越菌属的界限，在真菌和细菌间进行，同时有证据表明细菌整合子在细菌中也呈逐年递增的趋势。因此，开展实验室快速检测整合子，类似于细菌药敏报告产ESBL一样，是随着细菌耐药机制研究不断深入提出的新方法，通过避免细菌所携带的未表达耐药基因相应抗生素的使用，来减缓细菌更多耐药性的产生。目前对细菌Ⅰ型整合子的检测方法主要包括基因杂交方法、酶切分析，基因测序，聚合酶链式反应（PCR）技术等。如授权公告号为CN101948909的发明专利，就公开了检测细菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子的PCR方法，Ⅰ型整合子的PCR检测具有较好的敏感性和特异性，但需要进行DNA电泳等PCR后处理，检测时间较长，同时接触有毒试剂溴化乙锭，安全性较差，易发生交叉污染而造成假阳性结果，检测结果准确性较差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂，该检测试剂具有特异性高、敏感性强、检测快速、安全和结果准确的优点。

本发明系选择细菌Ⅰ型整合子的整合酶基因的保守片段为靶目标，应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物和探针。

本发明所述的一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为200 bp，引物和探针序列为：

引物：intgerno1 -F：5′- CGTAGAAGAACAGCAAGG -3′

intgerno1 -R：5′- ACGCTACTTGCATTACAG -3′

探针：5′- FAM—ACCGAACAGGCTTATGTCCACT—TAMRA -3′

其中探针5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有不发荧光的淬灭基团TAMRA。

与现有技术相比本发明的一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂，是将PCR技术与荧光检测相结合，构建并筛选出上述扩增效率高和特异性好的一对引物和一条探针，克服了常规PCR费时、易污染、准确性较差以及扩增后需电泳检测等缺点，可对细菌中的Ⅰ型整合子进行快速、准确、安全的定性检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点，可减少DNA或PCR产物污染的风险；常规PCR的检测时间一般6小时以上，本发明无需扩增后的电泳分析，样品检测时间在3小时之内，可判断出阳性、阴性和可疑结果，Ct值为40.0可确定为阳性和阴性的临界值，可同时进行大量样品检测，具有高通量性。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1、设计引物和探针

本发明选择细菌Ⅰ型整合子的整合酶基因的保守片段为靶目标，通过GenBank中报道的Ⅰ型整合子的整合酶基因序列进行同源性分析比较，选定基因的保守片段（200 bp），该保守片段的扩增目标核苷酸序列为：cgtagaagaa cagcaaggcc gccaatgcct gacgatgcgt ggagaccgaa accttgcgct  cgttcgccag ccaggacaga aatgcctcga cttcgctgct gcccaaggtt gccgggtgac gcacaccgtg gaaacggatg aaggcacgaa  cccagtggac ataagcctgt tcggttcgta aactgtaatg caagtagcgt，

再应用primer Express 3.0软件，设计引物和探针。引物和探针的合成采用β－乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针，合成同时进行两端荧光标记，探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，3′端标记的是不发荧光的淬灭基团TAMRA。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估，得到本发明扩增效率和特异性好的一对引物和一条探针，引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值（ΔRn）。

实施例2、细菌Ⅰ型整合子荧光定量PCR标准化试剂盒

标准化试剂盒组份（20 μL反应×50次）：

Buffer AE	11 mL
		溶液I（PCR缓冲液，含引物和探针）	200μL
溶液II（Taq DNA聚合酶，5U/μL）	30μL
		溶液III（DEPC处理水）	1.25 μL
溶液IV（阳性对照，含细菌Ⅰ型整合子DNA）	260μL
		溶液V（阴性对照，不细菌Ⅰ型整合子DNA）	260 μL

上述标准化试剂是按照优化的反应条件配制：选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量PCR反应的最低Ct值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用不同DNA模板浓度的标准阳性样品，对设计的引物与探针，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。

实施例3、检测方法

1、细菌DNA提取：取1 mL培养好的细菌，10 000 r/min 离心1min弃去上清，用567 μL TE溶解菌体，30 μL 10% SDS和3 μL 20mg/ml蛋白酶K（革兰氏阳性菌，可加溶菌酶）37℃温育1h，加入100 μL 5mol/LNaCl，80 μL CTAB/NaCl，65℃温育10 min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5 min，保留上清。加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000 r/min离心5 min，收集DNA沉淀，用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。用50 μL TE溶解DNA，-20℃保存。2、细菌质粒提取：取1 mL培养好的细菌，10 000 r/min 离心1min弃去上清，重悬于100 μL溶液Ｉ（50 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)）中（革兰氏阳性菌，可加溶菌酶），加200 μL新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH、1％SDS）盖紧盖子，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟，加150 μL用冰预冷的溶液Ⅲ（5mol/L乙酸钾60ml、冰乙酸 11.5ml、水 28.5ml）盖紧管口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放5分钟，12000r/min离心5 min，区上清，加0.6体积的异丙醇混匀，10000 r/min离心5 min，收集DNA沉淀，用70%乙醇离心洗涤质粒沉淀。用100 μL TE溶解资料，-20℃保存。3、20 μL反应体系：11.2 μL溶液I、0.5 μL溶液II、4.3 μL溶液III、5 μL样品或溶液IV或溶液V；检测管做3管平行试验，阳性对照和阴性对照各设2管。4、反应条件：在罗氏型荧光定量PCR仪（Ligntcycler 2.0）中，按下列反应参数进行：94℃预变性10 sec；94℃变性10 sec，60℃延伸30 sec，扩增40个循环。5、结果分析和判定：阈值线设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。阴性对照无Ct值，并且无典型扩增曲线；阳性对照的Ct值应小于35.0，并出现典型的扩增曲线；样品中若有荧光信号，Ct值应小于等于35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在Ⅰ型整合子，若Ct值在35.0~40.0的样本建议重做。重做结果无Ct值或无典型扩增曲线判为阴性，否则判为阳性。

实施例4、细菌Ⅰ型整合子荧光定量PCR的特异性和敏感性试验

依实施例3的检测方法，对Ⅰ型整合子阳性大肠杆菌、Ⅰ型整合子阳质粒、Ⅱ型整合子阳性阴沟肠杆菌、Ⅲ型整合子阳性铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌进行特异性比较检测。结果只有Ⅰ型整合子阳性大肠杆菌和Ⅰ型整合子阳质粒出现了扩增曲线。 提取阳性质粒，用分光光度计测定其OD值来计算模板DNA的拷贝数，再对其进行十倍比稀释，进行敏感性试验，检测限量可以到100拷贝数左右。

实施例5、细菌Ⅰ型整合子荧光定量PCR的稳定性和重复性试验

依实施例3的检测方法，在评估荧光定量PCR检测细菌Ⅰ型整合子方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用阳性样品和阴性样品，在同样反应条件下，反复进行荧光定量PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。

实施例6、对样品的检测

依实施例3的检测方法，对食物中分离的细菌或临床分离的细菌：Ⅰ型整合子阳性大肠杆菌进行荧光定量PCR检测，结果表明，Ⅰ型整合子阳性大肠杆菌具有典型的扩增曲线，Ct值小于35.0，阴性对照及阴性样品均无典型扩增曲线，也无Ct值。三个平行试验的结果稳定一致。证明荧光定量PCR检测细菌Ⅰ型整合子的特异性强、敏感度高和重复性好。

<110>宁波检验检疫科学技术研究院

 

<120>一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

 

<210> 1

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>检测细菌Ⅰ型整合子特异性荧光探针序列

<400> 1

 CGTAGAAGAA CAGCAAGG   18

 

<210>2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>检测细菌Ⅰ型整合子的特异性引物序列

<400>2

 ACGCTACTTG CATTACAG   18

 

<210>3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>检测细菌Ⅰ型整合子的特异性引物序列

<400>3

 ACCGAACAGG CTTATGTCCA CT  22

 

<210>4

<211> 200

<212> DNA

<213> 细菌Ⅰ型整合子的整合酶基因

<400>4

cgtagaagaa cagcaaggcc gccaatgcct gacgatgcgt ggagaccgaa       50

accttgcgct  cgttcgccag ccaggacaga aatgcctcga cttcgctgct        100

gcccaaggtt gccgggtgac gcacaccgtg gaaacggatg aaggcacgaa       150

cccagtggac ataagcctgt tcggttcgta aactgtaatg caagtagcgt           200

 

Claims (1)

1.一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为200 bp，其特征是引物和探针的核苷酸序列分别为：

引物：intgerno1 -F： CGTAGAAGAACAGCAAGG 

intgerno1 -R： ACGCTACTTGCATTACAG

探针： FAM—ACCGAACAGGCTTATGTCCACT—TAMRA

其中荧光报告基团FAM标记于探针5′端，不发荧光的淬灭基团TAMRA标记于探针3′端。