ES2724729T3

ES2724729T3 - Cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum y composición farmacéutica usando las mismas

Info

Publication number: ES2724729T3
Application number: ES12785922T
Authority: ES
Inventors: Hyang Choi; Soo An Shin; Si Yong Yang; Young Wook Cho
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2032-05-17
Also published as: CL2013003285A1; WO2012157989A2; EP2710116A4; KR20120128583A; US8524243B2; BR112013029677A2; US20120294892A1; US20130202643A1; EP2710116B1; CN104053768B; KR101500805B1; CL2017000232A1; PE20141452A1; CN107083351B; WO2012157989A3; CN104053768A; US20130022574A1; US9192658B2; EP2710116A2; US8481052B2

Abstract

Cepas modificadas de Salmonella Gallinarum, que comprenden la eliminación de al menos un clúster de genes completo seleccionado de los siguientes puntos (i) a (iv): (i) Isla de patogenicidad de Salmonella 2 (SPI-2), (ii) Isla de patogenicidad de Salmonella 1 (SPI-1) y SPI-2, (iii) spvRABCD, y (iv) SPI-1, SPI-2, spvRABCD, y faeHI.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum y composición farmacéutica usando las mismas [Campo técnico]

La presente invención proporciona cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum y diversos usos de las mismas.

[Técnica antecedente]

Actualmente, más de 2.000 cepas de Salmonella se clasifican generalmente en serotipos específicos del huésped y serotipos no específicos del huésped patógenos tanto para animales como para seres humanos. Son representativos entre los patógenos adaptados a las aves Salmonella Gallinarum (SG) y Salmonella Pullorum (SP), que se sabe que causan tifosis aviar y pullorosis, respectivamente. Estas enfermedades aviares causadas por Salmonella se producen con poca frecuencia en los países avanzados, pero han causado un daño económico tremendo a la avicultura en los países en desarrollo.

Serológicamente, las cepas de Salmonella Gallinarum tienen las mismas estructuras de antígeno somático (antígeno O) y se clasifican como no móviles porque no tienen flagelos. Después de entrar en un animal huésped a través de pienso contaminado o un entorno contaminado, la Salmonella atraviesa el tracto gastrointestinal e invade las células epiteliales intestinales mediante la interacción con un micropliegue (M) de las células de Peyer y penetra en la membrana intestinal. La Salmonella se transporta por las células M a los macrófagos en las membranas intestinales adyacentes, y después la infección por Salmonella se convierte en una enfermedad sistémica.

El sistema de secreción de tipo III (TTSS) es un apéndice de proteínas que se encuentra en bacterias gramnegativas, que consiste en una estructura de complejo de proteínas de tipo aguja a través de la cual las proteínas efectoras de virulencia pasan del citoplasma bacteriano directamente al citoplasma huésped (Mota LJ et al., Ann Med. (2005);37(4):234-249). El sistema de secreción de tipo III es esencial para la administración de la patogenicidad de Salmonella (Schlumberger MC et al., Curr Opin Microbiol. (2006);9(1):46-54). La Salmonella de tipo silvestre aprovecha el TTSS cuando se adhiere e invade las células huésped, y después sobrevive durante la fagocitosis de los macrófagos y circula por todo el cuerpo a través del torrente sanguíneo, causando una infección sistémica. Por lo tanto, la infección por Salmonella no puede continuar sin el funcionamiento normal del TTSS. La isla de patogenicidad de Salmonella 1 (en lo sucesivo en el presente documento denominada "SPM") es una región discreta del cromosoma de Salmonella que codifica el sistema de secreción de tipo III y las proteínas efectoras virulentas que son necesarias para la invasión de las células epiteliales intestinales en la fase temprana de la infección (Kimbrough TG et al., Microbes Infect, (2002);4(1):75-82). La isla de patogenicidad de Salmonella 2 (en lo sucesivo en el presente documento, "SPI-2") es también una región discreta del cromosoma de Salmonella que codifica el sistema de secreción de tipo III y las proteínas efectoras que participan en la supervivencia y la proliferación durante la fagocitosis por macrófagos en órganos inmunes intestinales u órganos inmunes tales como el bazo y el hígado después de la translocación a través de las células epiteliales (Waterman SR et al., Cell Microbiol, (2003);5(8):501~511, Abrahams GL, Cell Microbiol, (2006);8(5):728-737). Los genes en la SPI-1 y la SPI-2 y sus funciones se resumen en la Tabla 1, a continuación.

______________________ _______________ [Tabla 1]

Además de estos sistemas de secreción de tipo III, el gen fimbrial (faeHI) (Edwards RA et al., PNAS (2000); 97(3):1258-1262) y el factor virulento (operón spvRABCD) presente en plásmidos virulentos de Salmonella están implicados en la virulencia de la Salmonella (Gulig PA et al., Mol Microbiol (1993);7(6):825-830).

Las enfermedades aviares causadas por Salmonella son difíciles de controlar porque se transmiten de diversas maneras, incluida la transmisión por huevos, y el pienso o la infección ambiental, y muestran altas tasas de reaparición incluso después del tratamiento posterior a la infección con antibióticos. Por lo tanto, es importante prevenir la aparición de la enfermedad mediante el uso de una vacuna, así como la desinfección de las granjas de cría y el pienso. En la industria avícola, se ha puesto mucho esfuerzo en el uso de vacunas vivas (cepas atenuadas de Salmonella Gallinarum - SG9S, SG9R) y vacunas muertas (vacunas en gel, vacunas a base de aceite, etc.) para prevenir la aparición de la tifosis aviar. Sin embargo, los efectos de la vacuna varían de acuerdo con la concentración de la vacuna utilizada, la afección de las aves vacunadas y el entorno de los gallineros. Se informa que la eficacia de estas vacunas es significativamente menor que la de las vacunas para otras enfermedades. El tratamiento con antibióticos, aunque reduce las lesiones resultantes, convierte las aves infectadas en portadores crónicos (véase: Incidence and Prevention of Hen Salmonellosis, the National Veterinary Research & Quarantine Service, Corea).

Por lo tanto, se están demandando nuevos enfoques de control de la Salmonella que sean mejores que las vacunas o antibióticos convencionales. Muchos científicos han prestado atención recientemente a los bacteriófagos, que infectan y lisan las bacterias específicamente y son seguros para los humanos, como una potente alternativa a los antibióticos. Hay muchos informes sobre el uso de bacteriófagos en la prevención o terapia de las enfermedades por Salmonella (Atterbury RJ et al., Appl Environ Microbiol, (2007);73(14):4543-4549) y como desinfectantes o detergentes para prevenir la putrefacción de alimentos (documentos PCT 1998-08944, PCT 1995-31562, EP 1990 202169, PCT 1990-03122), y sobre técnicas de visualización de fagos para el diagnóstico (Ripp S et al., J Appl Microbiol, (2006);100(3):488-499). Las vacunas de Salmonella preparadas eliminando o modificando uno o dos genes dentro del clúster del gen SPI-2 se han divulgado recientemente (documentos US 6923957, US7211264, US7887816).

La disertación de Mi Ah Kim con el título "Development of oral vaccine candidate using attenuated Salmonella Gallinarum (22 de febrero de 2010, Chonbuk National University, Disertación, páginas 69pp) divulga una cepa de Salmonella Gallinarum en la que el gen prgK-H se ha eliminado y una cepa de Salmomello Gallinarum adicional en la que se ha eliminado el gen sprP.

D.H.Shah (Microbiology, vol. 151, n.° 12, del 1 de diciembre de 2005) ha identificado genes de virulencia de Salmonella Gallinarum en un modelo de infección de pollo utilizando un sistema de mutagénesis etiquetada con firma basada en PCR.

I. Rychlik et al. (FEMS Microbiology letters, vol. 159, n.° 2, 15 de febrero de 1998) han identificado genes homólogos a los genes faeH y fael en el plásmido de virulencia de Salmonella Gallinarum.

Además, S. Barth y R. Bauerfeind (Berl. Münch. Tierarztl. Wschr, vol. 118, 1 de enero de 2005) divulgan una cepa de Salmonella typhimurium a partir de la cual se han identificado características y funciones de proteínas Spv específicas.

Para uso industrial, los bacteriófagos se producen separando las progenies de fagos de las células huésped que se lisan durante la proliferación de bacteriófagos que se han inoculado en las células huésped cultivadas de forma masiva. Sin embargo, en cuanto a los bacteriófagos específicos para bacterias patógenas, sus lisados pueden contener células huésped patógenas que no se eliminan, y/o materiales virulentos como tales proteínas patógenas del huésped. Esta probabilidad actúa como un gran factor de riesgo para la seguridad de los bacteriófagos producidos sobre la base de células huésped patógenas.

Muchas bacterias tienen fagos lisógenos en sus cromosomas; sin embargo, la mayoría de los fagos son crípticos y no pueden producir progenie debido a la acumulación de muchas mutaciones como remanentes ancestrales. Los fagos lisógenos, aunque inactivos, pueden ayudar a la capacidad de supervivencia de la Salmonella en la infección del huésped porque contienen los genes necesarios para el crecimiento lítico y lisógeno y algunos de los genes codifican factores patógenos. Sin embargo, es probable que estos genes experimenten una recombinación homóloga con el genoma viral de otros fagos similares que infectan de nuevo a los animales, produciendo de este modo fagos modificados genéticamente. En cuanto a la típica Salmonella typhimurium, tiene profagos fels-1, fels-2, gifsy-1 y gifsy-2 y dos fagos crípticos. En contraste, podría usarse Salmonella Gallinarum como un huésped productor de fagos, ya que Salmonella Gallinarum no tiene profagos ni fagos crípticos, y después los fagos producidos no se modifican genéticamente por recombinación (Edwards RA et al, Trends Microbiol, (2002); 10(2):94-99).

Con el fin de minimizar los restos tóxicos durante la producción de progenie y la oportunidad de mutación del fago, los presentes inventores diseñaron el concepto de que los grupos de genes de virulencia de Salmonella Gallinarum podrían inactivarse para producir bacteriófagos. No hay casos precedentes en los que bacterias avirulentas, que se hayan convertido a partir de bacterias virulentas mediante la inactivación de un clúster de genes de virulencia, se hayan utilizado como una célula huésped de bacteriófago.

Además de la producción de bacteriófagos, la Salmonella privada de virulencia mediante la inactivación de grupos de genes de virulencia se usa por sí misma para desarrollar vacunas vivas atenuadas para controlar la Salmonella o aplicarse a la bioindustria, lo que garantiza un valor añadido significativo.

En la presente invención, se utilizan cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum obtenidas al eliminar al menos uno del principal clúster de genes completo de virulencia de Salmonella seleccionado del siguiente punto (i) a (iv): (i) isla de patogenicidad de Salmonella 2 (SPI-2), (ii) isla de patogenicidad de Salmonella 1 (SPI-1) y SPI-2, (iii) spvRABCD, y (iv) SPI-1, SPI-2, spvRABCD, y faeHI, como una célula huésped productora de bacteriófagos y se aplican en diversos usos.

[Divulgación]

Con el objetivo de resolver los problemas con la modificación recombinante de los fagos de la progenie y los remanentes bacterianos tóxicos en el transcurso de la producción de bacteriófagos sobre la base de los hechos descritos anteriormente, los presentes inventores desarrollaron cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum de acuerdo con Reivindicación 1 a utilizar como una célula huésped para la producción de bacteriófagos. Además, los presentes inventores confirmaron principalmente la reducción de la virulencia al medir la eficiencia de la invasión de Salmonella Gallinarum en las células epiteliales aviares, y se reconfirmaron al medir la mortalidad de las gallinas infectadas con cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum. Por otro lado, los presentes inventores aprueban el uso de huéspedes productores de bacteriófagos, el uso de las composiciones farmacéuticas y aditivos para pienso para la prevención o el tratamiento de la salmonelosis aviar a través de la comparación de la productividad de los bacteriófagos entre las cepas de tipo silvestre y las avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar el uso de la cepa avirulenta modificada de Salmonella Gallinarum de acuerdo con la reivindicación 1 en la producción de bacteriófagos específicos de Salmonella, o un método para producir fagos utilizando la cepa o las cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum de acuerdo con la reivindicación 1. Las cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum de acuerdo con la presente invención se pueden usar para la producción en masa de bacteriófagos líticos específicos de Salmonella libres de toxicidad remanente y se aplican al desarrollo de un nuevo concepto de sustitutos de antibióticos que tienen un alto valor de utilidad y garantizan un valor añadido significativo.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona además una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 9 y 10, una vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 y un aditivo para pienso de acuerdo con la reivindicación 12.

El clúster del gen SPI-1 codifica proteínas del sistema de secreción de tipo III que permanecen en las superficies celulares, actuando como un antígeno, mientras que el clúster del gen SPI-2 codifica proteínas que participan en la supervivencia en los fagosomas después del paso a través de las células epiteliales. Por lo tanto, la inactivación del clúster del gen SPI-2 en solitario, con el clúster del gen SPI-1 intacto, deja el antígeno necesario para la producción de un anticuerpo que induce una respuesta inmune, pero no permite que la Salmonella sobreviva durante la fagocitosis, por lo tanto, no da como resultado una enfermedad sistémica. Por lo tanto, la cepa de Salmonella Gallinarum inactivada por un clúster del gen SPI-2 podría usarse como una vacuna viva.

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum de acuerdo con la reivindicación 1 con una reducción notable de la patogenicidad.

Como se usa en el presente documento, el término "clústeres de genes de virulencia de Salmonella" se refiere a los cuatro clústeres de genes implicados en la virulencia de Salmonella Gallinarum, incluida el operón de la isla de patogenicidad de Salmonella 1 (en lo sucesivo en el presente documento denominado "SPI-1") que codifica las proteínas estructurales y las proteínas efectoras tóxicas del sistema de secreción de tipo III, el operón de la isla de patogenicidad de Salmonella 2 (en lo sucesivo en el presente documento denominado "SPI-2") que codifica las proteínas estructurales y las proteínas efectoras tóxicas del sistema de secreción de tipo III, el operón spvRABCD que codifica proteínas patógicamente activas en plásmidos virulentos específicos de Salmonella aviar, y el operón faeHI que codifica las fimbrias. Mientras funcione de forma funcional en Salmonella Gallinarum, se puede usar cualquier clúster de genes.

El término "clúster de genes", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de genes adyacentes en un cromosoma o un plásmido que son comúnmente responsables de los mismos productos. Los genes en un clúster están bajo la regulación de genes reguladores comunes.

La inactivación de genes en bacterias se puede lograr usando diversos métodos. Por ejemplo, mediante modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica, o también mediante la técnica de ARN antisentido conocida en la técnica sin excesiva experimentación. Las estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión a ribosomas, el codón de inicio y los terminadores, pero sin limitación (Jensen y Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58:191195 (1998), Carrier y Keasling, Biotechnology Progress 15:5864 (1999), Franch y Gerdes, Current Opinion in Microbiology 3:159164 (2000), Knippers ("Molecular Genetics", 6a edición, 1995) o los de Winnacker ("Genes y Clones", 1990), cuyo contenido de cada uno se incorpora en el presente documento por referencia).

Además, se puede usar un mecanismo de interferencia de ARN (ARN de interferencia: ARNi) que induce la degradación del ARNm del gen diana a través de la introducción de ARN bicatenario (ARNds) que consiste en la cadena de sentido que comprende el ARNm del gen diana y las secuencias homólogas del mismo, y la cadena antisentido que comprende la secuencia complementaria. Además, el método que utiliza transposón, que se puede mover a otra ubicación dentro del genoma de una sola célula, se puede usar para inactivar el gen a través de la mutación mediada por transposón para bloquear la función del gen diana. Las mutaciones que conducen a un cambio o reducción en las propiedades catalíticas de proteínas enzimáticas de clústeres de genes se conocen de la técnica anterior (Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:86118617 (1997)), Yano et al., (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95:5511 5515 (1998)), y Wente y Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266:2083320839 (1991)). Pueden encontrarse descripciones resumidas en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, por ejemplo, los de Hagemann ("General Genetics", 1986).

Preferiblemente, la inactivación del clúster de genes se realiza utilizando un método seleccionado de los siguientes: modificación de uno o más nucleótidos en el gen, eliminación de uno o más genes, inserción de un gen exógeno en los genes, eliminación de todos de los clústeres de genes, inserción de secuencias supresoras en el promotor del clúster de genes, mutación del promotor, inserción de una expresión que suprime la secuencia de regulación del clúster de genes, introducción del ARNi para uno o más nucleótidos en el grupo de genes, mutaciones mediadas por transposón, y una combinación de los mismos.

Los métodos descritos anteriormente pueden entenderse comúnmente por los expertos en la técnica y llevarse a cabo como se describe (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición (Cold SpringHarbor Press 2001)).

Por ejemplo, se pueden modificar uno o más nucleótidos de un sitio activo dentro de un gen para disminuir la actividad de la proteína expresada. Alternativamente, un gen resistente a los antibióticos u otro gen o genes pueden insertarse en el gen de interés para evitar la expresión de proteínas intactas. El método más preferible es eliminar la secuencia completa de un grupo de genes del genoma (Russell CB et al., J. Bacteriol. (1989); 171:2609-2613, Hamilton CM et al., J. Bacteriol. (1989); 171:4617-4622, Link AJ et al., J. Bacteriol. (1997); 179:6228-6237). En la presente invención, se elimina la secuencia completa del clúster de genes de interés para asegurar eficazmente la inactivación de los genes. Para esto, se puede emplear el método de deleción en un solo paso que utiliza lamda Red recombinasa, conocido como un método para eliminar clústeres de genes, desarrollado por (Datsenko KA et al., PNAS, (2000); 97(12):6640-6645).

Con respecto a la información de los genes de virulencia a eliminar, se obtuvieron secuencias de nucleótidos de SPI-1 y SPI-2 en referencia a las secuencias de genes de virulencia dentro del cromosoma de Salmonella Gallinarum (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum str.287/91, NC 011274), divulgado por el NCBI. Para la secuencia del operón faeHI, se hizo referencia a la secuencia del gen del plásmido de virulencia de Salmonella Gallinarum (genes de la subunidad fimbrial menor del plásmido de virulencia de Salmonella Gallinarum, AF005899). Para el operón spvRABCD, se consultó la secuencia del mismo gen de Salmonella Typhimurium LT2, que es altamente homóloga con Salmonella Gallinarum, porque su secuencia no se divulga en el NCBI. La secuenciación del operón spvRABCD de Salmonella Gallinarum también se realizó con referencia a la secuencia del gen correspondiente de Salmonella Typhimurium.

Los ejemplos de los clústeres de genes de virulencia de Salmonella incluyen el clúster del gen SPI-1 (SEQ ID NO: 1), el clúster del gen SPI-2 (SEQ ID NO: 2), el operón spvRABCD (SEQ ID NO: 3), y el operón faeHI (SEQ ID NO: 4) de Salmonella Gallinarum 287/91.

Para preparar las cepas que se habían convertido en avirulentas, se eliminaron al menos un clúster de genes de virulencia.

La presente invención incluye una cepa de Salmonella Gallinarum en la que solo se elimina el clúster completo del gen SPI-2 (SG3-d2), una cepa de Salmonella Gallinarum en la que se eliminan integralmente los clústeres de genes tanto SPI-1 como SPI-2 (SG3-d1d2), y una cepa de Salmonella Gallinarum en la que los cuatro clústeres de genes de virulencia (SPI-1, SPI-2, spvRABCD y faeHI) se eliminan integralmente (SG3-d4). SG3-d2 se deposita con el N.° de acceso KCCM11009P, SG3-d1d2 con el N.° de acceso KCCM11010P, y SG3-d4 con el N.° de acceso KCCM11011P.

Se han publicado estudios sobre la eliminación independiente de genes individuales de los clústeres de genes (Hapfelmeier S et al., J Immunol, (2005); 174(3):1675-1685, Brumme S et al., Vet Microbiol, (2007); 124(3-4):274-285, Desin TS et al., Infect Immun, Jul (2009);2866-2875), pero las cepas avirulentas de Salmonella se desarrollaron mediante la inactivación integral de dos o más clústeres de genes completos que no se habían divulgado antes del estudio de los presentes inventores. La cepa de Salmonella Gallinarum se denominó Salmonella Gallinarum SG2293-d2 cuando solamente se eliminó la totalidad del clúster del gen SPI-2, y SG2293-d1d2 cuando tanto SPI-1 como SPI-2 se eliminaron integralmente. Además, se denominó SG2293-d4 tras la eliminación de la totalidad de SPI-1, SPI-2, spvRABCD, y faeHI. Los términos "SG2293-d2" y "SG3-d2", "SG2293-dld2" y "SG3-dld2", y "SG2293-d4" y "SG3-d4" pueden usarse indistintamente en el presente documento.

Para determinar la avirulencia de las mismas, se sometieron a ensayo analizando las cepas preparadas mediante la eliminación de clústeres completos de genes de virulencia de acuerdo con la presente invención para determinar la eficacia de la invasión en las células epiteliales aviares y el brote de la enfermedad y la mortalidad (%) tras la infección en aves de corral. Preferiblemente, se permitió que las cepas de Salmonella Gallinarum en las que se habían eliminado los clústeres de genes de virulencia invadieran las células epiteliales aviares, de manera que pudiera medirse la eficacia de la invasión. Además, las cepas se inyectaron en capas de huevo marrón para medir la mortalidad.

De acuerdo con otro aspecto de la misma, la presente invención proporciona una cepa avirulenta modificada de Salmonella de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en la producción de bacteriófagos líticos específicos de Salmonella y un método para producir fagos usando los mismos.

Se usó OCJ1 (documento US 20100135962), un fago específico de Salmonella, para examinar la productividad del bacteriófago de las cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum. El fago muestra una actividad bactericida específica contra Salmonella Gallinarum y Salmonella pullorum, pertenece al grupo de morfotipos de la familia Siphoviridae B1, que se caracteriza por la cápside isométrica y la cola no contráctil larga, y tiene un tamaño de genoma total de 61 kb y proteínas estructurales mayores con un tamaño de 38 kDa y 49 kDa.

El método para producir un bacteriófago de acuerdo con la presente invención comprende cultivar las cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum de acuerdo con la reivindicación 1 en un medio, inocular un bacteriófago en el medio, y recuperar el bacteriófago. A este respecto, el fago puede producirse brevemente usando una placa o de forma masiva utilizando caldo. En el caso de la producción utilizando una placa, un bacteriófago se inocula en una relación adecuada en bacterias cuando las bacterias entran en una fase logarítmica, se mezclan con agar superior, y se vierten en una placa. Cuando aparecen las placas de fago, las fracciones de agar superior se recogen y se centrifugan, seguido de filtrado del sobrenadante para proporcionar una reserva de fagos. Para la producción en masa como caldo, se prepara una mezcla de fagos y bacterias de la misma manera que en la producción de placas, y se incuba durante 5 horas en caldo fresco, en lugar de en agar superior.

De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la tifosis aviar, que comprende la cepa avirulenta de Salmonella de acuerdo con la reivindicación 1 como principio activo. De acuerdo con la invención, se proporciona además una vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 para la prevención o el tratamiento de la tifosis aviar, formulada con la cepa avirulenta de Salmonella.

La composición o vacuna puede comprender opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento, se refiere a un vehículo o diluyente que no deteriora la actividad biológica ni la propiedad del principio activo y que no irrita al sujeto. Las preparaciones destinadas a la administración oral pueden estar en forma de comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos, gránulos, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes, elixires, etc. En lo que respecta a las formas orales tales como comprimidos y cápsulas, el principio activo puede formularse en combinación con un aglutinante tal como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, amilopectina, conjugado tal como celulosa o gelatina, un excipiente tal como fosfato dicálcico, un disgregante tal como almidón de maíz o almidón de batata, o un lubricante tal como estearato de magnesio, estearato de calcio, estearilfumarato de sodio o cera de polietilenglicol. En cuanto a las cápsulas, pueden comprender además un vehículo líquido tal como aceite graso.

La composición de la presente invención se puede formular en preparaciones para administración no oral, tales como inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas o inyecciones intradérmicas. Para esto, la composición de la presente invención se puede mezclar con un estabilizador o tampón en agua para preparar una solución o una suspensión que después se formula en dosis unitarias tales como ampollas o viales.

Como se usa en el presente documento, el término "vacuna" se refiere a una preparación biológica que mejora la inmunidad a una enfermedad particular al inducir la formación de un anticuerpo tras la inyección en el cuerpo, una preparación que contiene un antígeno, por ejemplo, formas muertas o atenuadas de un microorganismo causante de enfermedad. Las vacunas pueden prepararse a partir de patógenos muertos. También existen vacunas vivas, pero con virulencia atenuada de las mismas. Las cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum de la presente invención tienen las mismas proteínas antigénicas que las del tipo silvestre, pero tienen una virulencia mucho menor en comparación con el tipo silvestre, por lo que pueden usarse como vacunas profilácticas vivas de la tifosis aviar. De acuerdo con la presente invención, se proporciona adicionalmente un aditivo para pienso que comprende la cepa avirulenta modificada de Salmonella Gallinarum de acuerdo con la reivindicación 1. Cuando se aplica a aves de corral, el aditivo para pienso de la presente invención sirve como una vacuna viva que previene la tifosis aviar. El pienso de la presente invención se puede preparar mezclando el pienso con la cepa avirulenta modificada de Salmonella Gallinarum tal como está o en forma de un aditivo para pienso. En el pienso, la cepa avirulenta modificada de Salmonella Gallinarum puede estar en estado líquido o seco. El estado seco se puede lograr mediante diversos métodos de secado incluyendo, pero sin limitación, el secado neumático, el secado espontáneo, el secado por pulverización y la liofilización. Además de la cepa avirulenta modificada de Salmonella Gallinarum de la presente invención, el pienso de la presente invención puede comprender además un aditivo típico útil para mejorar la conservación del pienso.

El pienso que comprende la cepa avirulenta modificada de Salmonella Gallinarum de la presente invención puede ser materia vegetal tal como un cereal, nuez, un subproducto del procesamiento de alimentos, mijo, fibra, subproducto farmacéutico, un aceite vegetal, almidón, harinas de semillas oleaginosas y restos de cereales, o materia animal tales como proteínas, minerales, grasas, aceites minerales, proteínas unicelulares, plancton de animales y restos de alimentos, etc.

Los ejemplos del aditivo para pienso que comprende la cepa avirulenta modificada de Salmonella Gallinarum de la presente invención incluyen, pero sin limitación, diversos agentes para prevenir el deterioro de la calidad y mejorar la utilidad, tales como aglutinantes, emulsionantes, conservantes, aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes saporíferos, compuestos nitrogenados no proteicos, silicatos, tampones, colorantes, extractos, oligosacáridos, etc. Además, un agente de mezcla puede estar dentro del alcance del aditivo para pienso.

La composición de la presente invención se puede administrar a animales en forma de una preparación farmacéutica para animales, o mezclando con pienso o agua. Preferiblemente, se mezcla en forma de un aditivo para pienso con el pienso antes de la administración.

Siempre que permita que la composición de la presente invención alcance tejidos o células de interés, puede tomarse cualquier vía de administración, tal como vía no oral, intraarterial, intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral o intranasal.

Será evidente para los expertos en la materia que la dosis diaria total adecuada puede ser determinada por un médico tratante dentro del alcance del criterio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente en particular puede variar dependiendo de una diversidad de factores, incluyendo el tipo y grado de reacción deseada, la composición específica, incluido el uso de cualquier otro agente de acuerdo con el uso previsto, la edad del paciente, el peso, salud general, género y dieta, el tiempo de administración, la vía de administración, y la tasa de excreción de la composición; la duración del tratamiento, otros fármacos utilizados en combinación o a la vez con la composición específica; y factores similares ya conocidos en las técnicas médicas. Típicamente, la composición puede administrarse a una dosis diaria de 104 a 108 UFC una vez o a modo de dosificación dividida.

[Efectos ventajosos]

Las cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum de acuerdo con la presente invención, preparadas mediante la eliminación de un clúster o clústeres de genes de virulencia completos, son útiles como células huésped para producir de manera eficaz bacteriófagos líticos específicos de Salmonella a escala industrial con la ventaja de ahorrar coste. Las cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum simplifican el proceso de purificación utilizado para eliminar la toxicidad después de la producción de bacteriófagos, lo que reduce considerablemente el coste de producción y resuelve el problema de seguridad de los productos. Además, las cepas modificadas pueden usarse como vacunas vivas, que garantizan mayores efectos inmunológicos y seguridad que las vacunas convencionales.

[Descripción de los dibujos]

Los anteriores y otros objetos, características y otras ventajas de la presente invención se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra los genes de virulencia de Salmonella aviar (isla de patogenicidad de Salmonella 1, isla de patogenicidad de Salmonella 2, spvRABCD y faeHI) y los sitios correspondientes a los cebadores para inactivar los genes de virulencia; y

La Figura 2 es un gráfico que muestra la eficacia de la invasión in vitro en células epiteliales aviares de las cepas de Salmonella Gallinarum inactivadas por el gen de virulencia (SG3-d1, SG3-d2, SG3-dld2 y SG3-d4), junto con controles de tipo silvestre de Salmonella Gallinarum SG2293), vacuna viva de Salmonella Gallinarum (SG9R) y E. coli no patógena (MG1655). La eficiencia de invasión se expresa como un porcentaje del recuento de microorganismos dentro de las células dividido con el recuento de microorganismos dentro de un medio de cultivo. Los microorganismos se usaron a una concentración de 8,0 x 107 ufc por pocillo.

[Mejor modo]

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son solo para fines ilustrativos, y la invención no pretende limitarse por estos ejemplos.

[Modo de la invención]

EJEMPLO 1: Cribado de genes diana a inactivar mediante la comparación de genes de virulencia de Salmonella Gallinarum

La primera etapa de la preparación de cepas avirulentas de Salmonella aviar fue el cribado de los genes de virulencia diana a inactivar. La isla de patogenicidad de Salmonella 1 (SPI-1), y la isla de patogenicidad de Salmonella 2 (SPI-2), que son ambos clústeres de genes del sistema de secreción tipo tres esenciales para la administración de la patogenicidad de Salmonella, y spvRABCD y faeHI, ambos de los cuales son genes en plásmidos de virulencia, se determinaron como genes diana, y en la base de datos del NCBI se buscaron las secuencias de nucleótidos de los genes diana (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum str. 287/91, NC 011274). Como la secuencia de nucleótidos de spvRABCD de Salmonella Gallinarum aún no se había divulgado, los cebadores se sintetizaron con referencia a la secuencia de nucleótidos del mismo nombre gen de Salmonella typhimurium (plásmido de Salmonella typhimurium LT2 pSLT, NC 003277), que tiene una alta homología de nucleótidos con Salmonella Gallinarum. En cuanto al operón faeHI, la información de su secuencia de nucleótidos se obtuvo a partir de los genes de la subunidad fimbrial menor del plásmido de virulencia de Salmonella Gallinarum (AF005899).

EJEMPLO 2: Preparación de cepas modificadas avirulentas mediante la inactivación de los genes de virulencia de Salmonella Gallinarum y por la integración de los sitios inactivados

2-1. Inactivación de los genes de virulencia de Salmonella Gallinarum

Para eliminar los genes de virulencia relacionados con el TTSS de Salmonella Gallinarum de tipo silvestre (SGSC N.° 2293) como se determinó en el Ejemplo 1, se empleó el método de deleción en un solo paso usando lamda Red recombinasa, desarrollado por Datsenko KA et al., (Datsenko KA et al, PNAS, (2000);97(12):6640-6645).

Se usó un gen resistente a cloranfenicol de pKD3 como marcador de antibiótico para identificar la inserción en un sitio diana de un cromosoma. Usando un par de los cebadores SPI-1-P1 (SEQ ID N^o: 5) y SPI-1-P2 (SEQ ID NO: 6) de la Tabla 2, que corresponden a 50 pb de la región flanqueante 5 de avrA y 50 pb de la región flanqueante 3 del gen invH, en los que SPI-1 que comprende de avrA a invH es el objetivo para la eliminación, y una parte del gen resistente a cloranfenicol de pKD3, se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo en el presente documento denominada "PCR") [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories], con pKD3 como plantilla. El producto de PCR obtenido era un fragmento de gen de aproximadamente 1100 pb de longitud.

A este respecto, se usó un kit de premezcla de PCR HL (BIONEER) y se llevaron a cabo 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, hibridación a 55°C durante 30 s y alargamiento a 72°C durante 1 minuto. El producto de la PCR se separó en gel de agarosa al 0,8% mediante electroforesis y se eluyó en un tamaño de banda deseado.

De acuerdo con el método de Datsenko KA et al., el fragmento del gen de 1100 pb de longitud se introdujo en Salmonella Gallinarum de tipo silvestre competente, transformada en pKD46, que después se extendió sobre placas LB que contenían cloranfenicol (30 mg/l). En cuanto al transformante resultante, su gen se examinó mediante PCR utilizando un par de cebadores SPI-1-P3 (SEQ ID NO: 7) y SPI-1-P4 (SEQ ID NO: 8), que corresponden a regiones de aproximadamente 1 kb de distancia de ambos extremos del gen diana de eliminación. El producto de PCR obtenido de este modo era de 3100 pb de longitud, lo que indicaba que el clúster del gen SPI-1 estaba inactivado. La cepa resultante se cultivó a 37°C, una condición para eliminar el vector pKD46, para seleccionar una cepa que no pudiera crecer en una placa LB que contenía ampicilina (100 mg/l).

Posteriormente, el marcador de antibiótico insertado en el clúster de genes inactivados se eliminó mediante transformación con pCP20. La eliminación del marcador de antibiótico se identificó mediante PCR utilizando los cebadores SPI-1-P3 y SPI-1-P4. El producto de PCR resultante tenía una longitud de 2000 pb, lo que también indica la inactivación.

Posteriormente, la cepa que ahora estaba libre del marcador de antibiótico se cultivó a 42°C (una condición para eliminar el pCP20) para seleccionar una cepa que no podía crecer en una placa LB que contenía ampicilina. La cepa inactivada por clúster del gen SPI-1 obtenida de este modo se denominó SG3-d1 (SG2293::ASPI-1 de Salmonella Gallinarum). La cepa SG3-d1 se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms, YuRim B/D Hongje-dong, Seodamun-gu, Seúl, Corea el 2 de julio de 2009 con el N.° de acceso KCCM11009P.

Los clústeres del gen SPI-2, spvRABCD y faeHI también se inactivaron de la misma manera que en el clúster del gen SPI-1. Las cepas inactivadas por clúster de genes resultantes se denominaron SG3-d2 (Salmonella Gallinarum SG2293::ASPI-2, acceso N.° KCCM11009P), SG3-ds (Salmonella Gallinarum SG2293::Aspv), y SG3-df (Salmonella Gallinarum SG2293::Afae), respectivamente. Los cebadores utilizados para eliminar genes y para identificar la eliminación de genes se resumen en la Tabla 2, a continuación.

T l 21

2-2. Integración de la inactivación de los genes de virulencia relacionada con el sistema de secreción de tipo III

Para inactivar integralmente los clústeres de genes en una cepa, la cepa SG3-d1 se sometió secuencialmente a la inactivación de los clústeres de los genes SPI-2, spvRABCD y faeHI, utilizando un método similar al del Ejemplo 2-1. Para comenzar, se realizó la PCR utilizando los cebadores SPI-2-P1 (SEQ ID NO: 9) y SPI-2-P2 (SEQ ID NO: 10) con el fin de inactivar el clúster del gen SPI-2, sirviendo pKD4 como plantilla, dando como resultado un fragmento del gen de 1600 pb. Este producto de PCR se introdujo en la cepa SG3-d1 en la que permaneció el vector pKD46 (Ejemplo 1-2), seguido de la propagación de las bacterias sobre una placa LB que contenía kanamicina (50 mg/l). En cuanto al transformante resultante, su gen se examinó mediante PCR utilizando un par de cebadores SPI-2-P3 (SEQ ID NO: 11) y SPI-2-P4 (SEQ ID NO: 12), que corresponden a ambas regiones flanqueantes del gen diana de eliminación. El producto de PCR obtenido de este modo era de 3600 pb de longitud, lo que indicaba que el clúster del gen SPI-2 estaba inactivado.

La cepa resultante se cultivó a 37°C, una condición para eliminar el vector pKD46, para seleccionar una cepa que no pudiera crecer en una placa LB que contenía ampicilina (100 mg/l).

Posteriormente, el marcador de antibiótico insertado en el clúster de genes inactivados se eliminó mediante transformación con pCP20. La eliminación del marcador de antibiótico se identificó por PCR usando los cebadores SPI-1-P3 y SPI-1-P4 en el caso de SPI-1 y los cebadores SPI-2-P3 y SPI-2-P4 en el caso de SPI-2. El producto de PCR resultante tenía una longitud de 2000 pb, lo que también indica que se había producido la inactivación.

Posteriormente, la cepa libre del marcador de antibiótico se cultivó a 42°C (una condición para eliminar el pCP20) para seleccionar una cepa que no podía crecer en una placa LB que contenía ampicilina. La cepa inactivada por clústeres de los genes SpI-1 y SPI-2 obtenida de este modo se denominó SG3-d1d2 (SG2293::ASPI-1ASPI-2 de Salmonella Gallinarum, N.° de acceso KCCM11010P). La cepa SG3-d1d2 se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms, YuRim B/D Hongje-dong, Seodamun-gu, Seúl, Corea el 2 de julio de 2009 con el N.° de acceso KCCM1 1010P.

En la cepa SG-dld2, los clústeres de los genes spvRABCD y faeHI se inactivaron adicionalmente. Para este fin, el clúster del gen spvRABCD (el gen resistente a kanamicina de pKD4 se usó como marcador de antibiótico) se inactivó de la misma manera que en la inactivación de SPI-1 en el Ejemplo 1-2, mientras que la inactivación del clúster del gen faeHI (el gen resistente a cloranfenicol de pKD3 se usó como marcador de antibiótico) se realizó de la misma manera que en la inactivación de SPI-2 en la cepa inactivada de SPI-1. En cuanto a los transformantes resultantes, sus genes se examinaron mediante PCR utilizando el conjunto de cebadores spv-P3 (SEQ ID NO: 15) y spv-P4 (SEQ ID NO: 16) para la eliminación de spvRABCD, y el conjunto de cebadores fae-P3 (SEQ ID NO: 19) y fae-P4 (SEQ ID NO: 20) para la eliminación de faeHI, que corresponden a las regiones de aproximadamente 1 kb de distancia de ambos extremos de los genes diana de eliminación respectivos. Los productos de la PCR obtenidos de este modo eran de 3600 pb, 3100 pb de largo respectivamente, lo que indicaba que los clústeres de los genes spvRABCD y faeHI estaban inactivados. La cepa resultante se cultivó a 37°C, una condición para eliminar el vector pKD46, para seleccionar una cepa que no pudiera crecer en una placa LB que contenía ampicilina (100 mg/l). La cepa de Salmonella Gallinarum en la que todos los cuatro clústeres de los genes SPI-1, SPI-2, spvRABCD y faeHI se inactivaron integralmente se denominó SG3-d4 (SG2293::ASPI-1 ASPI-2AspvRABCDAfaeHI de Salmonella Gallinarum) y se depositaron con el N.° de acceso KCCM11011P en el Korean Culture Center of Microorganisms, YuRim B/D Hongje-dong, Seodamun-gu, Seul, Corea el 2 de julio de 2009.

2-3. Secuenciación del operón spvRABCD de Salmonella Gallinarum

En ninguna parte se ha divulgado aún la información genética sobre spvRABCD de Salmonella Gallinarum (SGSC N.° 2293). Su secuencia de nucleótidos se analizó en la presente invención. Para ello, los cebadores se sintetizaron como se resume en la Tabla 3, a continuación.

T l 1

El resultado del análisis se proporciona en la SEQ ID NO: 3.

EJEMPLO 3: Ensayo de Salmonella Gallinarum inactivada por clústeres de genes de virulencia SG3-d4 para determinar la avirulencia mediante la medición de la eficiencia de la invasión en una célula epitelial aviar Salmonella Gallinarum y Salmonella pullorum, que son especies únicas de Salmonella debido a la falta de flagelos móviles, infectan específicamente a las células aviares y pueden invadir otras células animales, pero con una eficacia muy baja. En este ejemplo, se realizó un ensayo de invasión celular in vitro (Henderson SC et al, Infect Immun, (1999); 67(7):3580-3586) en la línea de células epiteliales aviares (tumor abdominal de periquito), proporcionada por el Dr. Lee, Georgia University. Se esperaba que las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum SG3-d1d2 y SG3-d4, desarrolladas por el método de eliminación génica descrito anteriormente, invadieran la célula huésped con una eficacia muy baja en función del nivel reducido de proteína relacionada con TTSS. Una revisión reciente de la investigación sobre los mecanismos de infección de los microorganismos patógenos indica que incluso cuando solo se elimina un gen específico de SPI-1, la cepa de Salmonella muestra una disminución en la eficiencia de invasión de las células epiteliales (Lostroh CP et al, Microbes Infect, (2001); 3(14-15):1281-1291).

En la presente invención, se comprobó que la eliminación de genes relacionados con TTSS conducía a una disminución de la virulencia al medir la eficacia de la invasión de las cepas modificadas de Salmonella aviar en la línea celular epitelial aviar BAT.

La eficacia de la invasión en células epiteliales aviares se midió en placas de 24 pocillos por triplicado, y se proporcionaron los valores medios de tres mediciones. La línea celular BAT se cultivó a 37°C en DMEM complementado con suero fetal bovino al 10%, glutamina 1 mM, 100 UI/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina bajo la condición de un 5 % de CO². La línea celular BAT se sembró a una densidad de 2,5 x 10⁵células/pocillo en placas de 24 pocillos y se incubó a 37 °C durante 1-2 días en una incubadora con el 5 % de CO²para formar monocapas de células. Después de la distribución de la célula y la incubación durante un día, se cambió el medio de cultivo por DMEM sin antibiótico. Para la comparación de la eficacia de la invasión, se emplearon Salmonella Gallinarum de tipo silvestre SG3 (SGSC N.°: 2293), las cepas de Salmonella Gallinarum inactivadas por los clústeres de los genes de virulencia SG3-d1, SG3-d2, SG3-dld2 y SG3-d4, y SG9R, que es una vacuna viva disponible comercialmente, sirviendo MG1655 de E. coli no patógeno como control.

Después de cultivarse principalmente en semilla, todas las bacterias de ensayo se incubaron vigorosamente durante 4-5 horas en un medio LB principal, y los cultivos se diluyeron a una DO⁶⁰⁰= 1,0. A 200 pl de las células animales incubadas en el medio sin antibiótico, se le añadieron 200 pl de cada uno de los cultivos diluidos para que las bacterias se dividieran en alícuotas a una concentración de 2,0 x 10⁸UFC/ml por pocillo. Las placas se incubaron a 37°C durante una hora en una atmósfera de CO²al 5 % para permitir que las bacterias penetraran en las células epiteliales. Posteriormente, el medio se eliminó por aspiración y las placas se lavaron con IX PBS para eliminar los microorganismos restantes. Después, las células epiteliales se incubaron a 37°C durante 2 horas en presencia de 50 pg/ml de gentamicina en una incubadora de CO²al 5 % para eliminar los microorganismos que quedaron fuera de las células. El antibiótico se eliminó por lavado con IX PBS. Para examinar los microorganismos que lograron penetrar en las células epiteliales, las células animales se lisaron durante 15-30 minutos en 500 pl de Tritón X-100 al 0,1 %. Los lisados celulares se extendieron sobre placas LB y se incubaron durante una noche a 37°C para poder contar los microorganismos que habían crecido. Para calcular la eficacia de la invasión, también se incubaron 200 pl del cultivo de microorganismos con una DO⁶⁰⁰= 1,0.

Eficiencia de la invasión (%) = Recuento de microorganismos que han invadido la célula/recuento de microorganismos en el medio de cultivo (DO⁶⁰⁰= 1,0) x 100

Se calcularon las eficiencias de invasión celular BAT de las cuatro cepas de Salmonella Gallinarum transformadas preparadas por la inactivación de clústeres de genes de virulencia. De ellas, la cepa modificada en la que solo se inactivó el clúster del gen SPI-1, responsable del mecanismo de invasión celular, disminuyó la eficiencia de la invasión en un 84 % en comparación con el tipo silvestre. Se encontró que la cepa modificada SG3-dld2 con la eliminación tanto de SPI-1 como de SPI-2 y la cepa modificada SG3-d4 con la eliminación de los cuatro clústeres de genes disminuyen la eficiencia de invasión celular en aproximadamente el 89 % y el 91 %, respectivamente, en comparación con Salmonella Gallinarum (SG3) de tipo silvestre. Las cepas modificadas de la presente invención también tenían una capacidad de invasión notablemente reducida, en comparación con la de la vacuna viva disponible comercialmente Nobilis SG9R. Estos datos demostraron que la inactivación de los clústeres de genes relacionados con TTSS disminuye la virulencia de Salmonella Gallinarum (véase la Tabla 4 y la Figura 2). i T l 41

La avirulencia de la cepa modificada de Salmonella Gallinarum SG3-d4 se confirmó por una prueba in vitro que muestra una eficiencia de invasión extremadamente baja en las células epiteliales aviares, y se reconfirmó en pruebas en animales, y los resultados se dan en el Ejemplo 4.

EJEMPLO 4: Ensayo de SG3-d4 de Salmonella Gallinarum para determinar la avirulencia mediante la medición de la mortalidad de los pollos

Se encomendó este ensayo al Research Institute of Veterinary Science, Seoul National University. Las capas de huevo marrón de una semana de edad (pollo Hy-Line) se dividieron en muchos grupos de 10 que se separaron en los respectivos gallineros antes de la infección con patógenos. No se usaron programas de vacunas en los animales experimentales después de la eclosión.

Se emplearon en el ensayo in vivo cinco cepas de Salmonella aviar que incluían la Salmonella Gallinarum de tipo silvestre SG3 (SGSC N.°: 2293), la Salmonella Gallinarum inactivada por clúster de genes virulentos SG3-d2 y SG3-d4 (identificada para disminuir en virulencia por ensayo de invasión in vitro), la vacuna viva disponible comercialmente, Nobilis SG9R, y la MG1655 de E. coli no patógena.

Después de cultivarse principalmente en semilla, las cinco cepas se incubaron vigorosamente durante 4-5 horas a una ÜÜ⁶⁰⁰= 1,0 en un medio LB principal, y la concentración de cada uno de los cultivos celulares se ajustó a 1,0 x 108 UFC/ml. Las bacterias se inyectaron por vía subcutánea a los pollos a una dosis ajustada que después se controló durante dos semanas para determinar la mortalidad. Posteriormente, se realizó una autopsia de los pollos que estaban vivos para examinar las lesiones y aislar las bacterias.

Durante las dos semanas posteriores a la infección artificial de los patógenos (1,0 x 108 UFC/ml), los pollos infectados con Salmonella Gallinarum modificada (SG3) se observaron y mostraron síndromes externos típicos tales como baja motilidad, diarrea azul y baja ingesta de pienso, y parecían estar muriendo. La mortalidad no fue alta, pero la autopsia reveló lesiones en casi todos los pollos.

En contraste, se observó que el grupo de pollos infectados con la cepa modificada de Salmonella Gallinarum (SG3-d4) se movía activamente y no moría, aunque algunos de ellos tuvieron diarrea durante las dos semanas. Además, se encontró que casi no tenían lesiones en la autopsia. Por lo tanto, se demostró de nuevo que la cepa modificada de Salmonella Gallinarum de la presente invención tenía una virulencia muy reducida. Se observó que los grupos de pollos infectados con la cepa modificada SG3-d2 en la que el gen responsable de la invasión primaria en las células huésped permanece intacto, mientras que el gen SPI-2 involucrado en la infección sistémica y la supervivencia sobre la fagocitosis está inactivado, o con la cepa modificada SG3-ds en la que el gen spv, que se sabe que participa en la patogenicidad, está inactivado, tenían una mortalidad baja o nula (%). Por lo tanto, incluso la inactivación de clústeres de genes únicos tuvo una gran influencia en la reducción de la patogenicidad (véase la Tabla 5).

T l

De acuerdo con los hallazgos de la autopsia, el hígado y el bazo estaban hinchados y debilitados, con la frecuencia significativa de lesiones hepáticas de color marrón verdoso o verde azulado, en el grupo de pollos infectados con Salmonella Gallinarum (SG3) de tipo silvestre. Al igual que la vacuna viva Nobilis SG9R disponible comercialmente o la MG1655 de E. coli no patógena, sin embargo, se descubrió que las cepas inactivadas por clústeres de genes virulentos de la presente invención (SG3-d1d2 y SG3-d4) casi no tenían lesiones, y demostraron ser inofensivas para los pollos.

EJEMPLO 5: Comparación de la productividad del bacteriófago ®CJ1 específico para las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum

En última instancia, el desarrollo de cepas avirulentas de Salmonella se debe aplicar a la producción de bacteriófagos líticos específicos de Salmonella. Se demostró que las cepas modificadas de Salmonella preparadas en el Ejemplo 2 tienen una virulencia muy atenuada en los Ejemplos 3 y 4. Finalmente, se utilizó OCJ1 (Solicitud de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Cepas modificadas de Salmonella Gallinarum, que comprenden la eliminación de al menos un clúster de genes completo seleccionado de los siguientes puntos (i) a (iv):

(i) Isla de patogenicidad de Salmonella 2 (SPI-2),

(ii) Isla de patogenicidad de Salmonella 1 (SPI-1) y SPI-2,

(iii) spvRABCD, y

(iv) SPI-1, SPI-2, spvRABCD, y faeHI.

2. Las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1, en las que un clúster de genes completo de la isla de patogenicidad de Salmonella 2 de SEQ ID NO: 2 se elimina (SG3-d2).

3. Las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 2, se depositan con el N.° de acceso KCCM1 1009P.

4. Las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1, en las que ambos grupos de genes de la isla de patogenicidad de Salmonella 1 de SEQ ID NO: 1 y la isla de patogenicidad de Salmonella 2 de SEQ ID NO: 2 se eliminan (SG3-d1d2).

5. Las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 4, se depositan con el N.° de acceso KCCM11010P.

6. Las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1, en las que todos los grupos de genes de la isla de patogenicidad de Salmonella 1 de SEQ ID NO: 1, la isla de patogenicidad de Salmonella 2 de SEQ ID NO: 2, spvRABCD de SEQ ID NO: 3, y faeHI de SEQ ID NO: 4 se han eliminado (SG3-d4).

7. Las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 6, se depositan con el N.° de acceso KCCM11011P.

8. Uso de las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de acuerdo con las reivindicaciones anteriores para producir un bacteriófago lítico específico de Salmonella.

9. Una composición farmacéutica que comprende las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1 como un ingrediente eficaz.

10. Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de tifosis aviar, que comprende las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1 como un ingrediente eficaz.

11. Una vacuna que comprende las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1 como un ingrediente eficaz.

12. Un aditivo para pienso, que comprende las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1 como un ingrediente eficaz.

13. Las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1 para su uso en un método para la prevención o tratamiento de animales.

14. Un método para producir un bacteriófago, que comprende:

cultivar las cepas modificadas de Salmonella Gallinarum de la reivindicación 1 en un medio;

inocular el bacteriófago en el medio; y

recuperar la progenie de bacteriófagos del medio.