ES2278344T3

ES2278344T3 - Mutantes acapsulares de delecion de un gen hyae de i p /i. multocida.

Info

Publication number: ES2278344T3
Application number: ES04777430T
Authority: ES
Inventors: Robert E. Briggs; Fred M. Tatum
Original assignee: Biotechnology Research and Development Corp; US Department of Agriculture USDA
Current assignee: Biotechnology Research and Development Corp; US Department of Agriculture USDA
Priority date: 2003-07-02
Filing date: 2004-07-02
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2024-07-02
Also published as: ZA200509533B; US20050106185A1; CA2530779C; AU2004254619A1; KR101119216B1; NZ543771A; PL1638598T3; EP1638598A2; JP2011024587A; WO2005003330A2; KR20060020657A; JP5001647B2; JP5649881B2; HK1088561A1; JP2007524398A; CA2530779A1; DE602004003582D1; DK1638598T3; EP1638598B1; US7351416B2

Abstract

Una bacteria Pasteurella multocida (P. multocida) aislada de serogrupo A que comprende una deleción de todo o parte de un gen hyaE, atenuando la deleción a la bacteria.

Description

Mutantes acapsulares de deleción de un gen hyaE de I P/I: multocida.

Campo de la invención

La invención se refiere a mutantes sin cápsula de Pasteurella multocida y vacunas que comprenden los mutantes.

Antecedentes de la invención

Pasteurella multocida (P. multocida) se asocia con una diversidad de enfermedades, que incluyen meningoencefalitis del ternero y del añojo, linfadenitis del cordero, septicemia del caballo y del burro, pasteurelosis septicémica bovina (septicemia hemorrágica bubónica), pasteurelosis del cerdo, pasteurelosis septicémica porcina neumónica y cólera de las aves de corral.

Existe una necesidad en la técnica de vacunas eficaces que puedan usarse para proporcionar inmunidad protectora frente a enfermedades causadas por P. multocida.

Resumen de la invención

Una realización de la invención es una bacteria de Pasteurella multocida (P. multocida) aislada del serogrupo A que comprende una deleción de todo o parte de un gen hyaE. La deleción atenúa la bacteria.

Otra realización de la invención es una vacuna para inducir inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje. La vacuna comprende la bacteria P. multocida de serogrupo A que comprende una deleción de todo o parte de un gen hyaE y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La mutación por deleción atenúa a la bacteria.

Aún otra realización de la invención son piensos adecuados para mamíferos (incluyendo ganado, ungulados y animales de compañía) o aves (preferiblemente aves de corral), que comprende una bacteria P. multocida de serogrupo A que comprende una deleción de todo o parte de un gen hyaE. La mutación por deleción atenúa la bacteria.

Incluso otra realización de la invención es el uso de una bacteria P. multocida de serogrupo A que comprende una deleción de todo o parte de un gen hyaE, que atenúa la bacteria, en la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje. La bacteria es para la administración a un animal tal como un mamífero (incluyendo ganado, ungulados y animales de compañía) o un ave (incluyendo aves de corral). Así, la bacteria confiere al animal inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje.

De este modo, la invención proporciona herramientas y procedimientos para inducir inmunidad protectora frente a enfermedades causadas por P. multocida.

Breve descripción de la figura

Fig. 1. Ilustración de la construcción de mutantes por deleción de hyaE. Fig. 1A; esquema que muestra la deleción planificada. Fig. 1B, plásmido que contiene la inserción hyaE delecionada.

Descripción detallada de la invención

Pueden administrarse a mamíferos (incluyendo ganado, ungulados y animales de compañía) y aves (incluyendo aves de corral) mutantes sin cápsula por deleción de hyaE de P. multocida de serogrupo A para proporcionar inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje, por ejemplo, para prevenir o reducir la gravedad de enfermedades tales como septicemia hemorrágica o neumonía en el ganado, ungulados o animales de compañía y para prevenir o reducir la gravedad del cólera aviar en aves, especialmente en aves de corral, respectivamente. Las expresiones "mutante o mutantes sin cápsula", "bacteria o bacterias sin cápsula" y "bacteria o bacterias mutantes" se usan de forma indistinta en esta descripción.

Mutantes sin cápsula por deleción de hyaE de P. multocida de serogrupo A

Los mutantes sin cápsula por deleción de hyaE de P. multocida de serogrupo A (por ejemplo, serotipo A:1, A:3, A:4) pueden generarse mediante mutagénesis del gen hyaE en el locus biosintético de la cápsula. Los genes del locus biosintético de la cápsula en el serogrupo A son bien conocidos y se han secuenciado por completo. Chung y col., FEMS Microbiol. Lett. 166(2), 289-96,1998. El locus del serotipo A:1 contiene cuatro fases de lectura abierta (ORF) en la región 1 (hexA, hexB, hexC y hexD), cinco ORF en la región 2 (hyaA, hyaB, hyaC, hyaD e hyaE) y dos ORF en la región 3 (phyA y phyB).

En ciertas realizaciones, la bacteria mutante no comprende ningún gen de resistencia a antibióticos o ADN extraño lo cual mejora su atractivo medioambiental y ecológico. En el ejemplo 1 se describe un procedimiento para generar mutantes por deleción, pero puede usarse cualquier otro procedimiento conocido en la técnica para generar mutaciones por deleción. También se describen en el Ejemplo 1 ensayos sencillos para confirmar que los mutantes tienen un fenotipo sin cápsula.

La bacteria P. multocida con cualquier deleción de todo o parte del gen hyaE está dentro del alcance de la invención siempre que la deleción atenúe la bacteria. En una realización, la mutación por deleción da lugar a la deleción de los aminoácidos 239-359 de la proteína hyaE (es decir, no está presente ninguno de los aminoácidos 239-359 en la proteína hyaE codificada). En otras realizaciones, la fase de lectura abierta mutada de hyaE comprende la ID SEC Nº 7 o ID SEC Nº 8.

Una bacteria mutante está atenuada si, tras la exposición a la bacteria mutante, se necesita un aumento de la dosis de P. multocida de tipo salvaje para matar a la mitad de la especie diana susceptible (es decir, aumenta la DL_{50}) y/o hay una reducción de las lesiones patológicas (por ejemplo, neumonía) tras la exposición de la especie diana a la bacteria mutante, en comparación con la exposición a una bacteria de tipo salvaje, y/o hay una reducción en la colonización comensal de las superficies mucosas donde reside P. multocida tras la exposición de la especie diana a la bacteria mutante, cuando se compara con la exposición a una bacteria de tipo salvaje.

La atenuación puede valorarse por diversos medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para una enfermedad septicémica (tal como la cólera aviar), puede exponerse a las especies susceptibles a organismos de tipo salvaje por las vías intranasal, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, y puede compararse la dosis requerida para causar enfermedad entre los organismos de tipo salvaje y mutante. Para la enfermedad neumónica, pueden exponerse a animales susceptibles a organismos de tipo salvaje por las vías intranasal, intratraqueal o intrapulmonar y comparar el grado y la gravedad de los síntomas clínicos y de las lesiones patológicas entre los animales expuestos al mutante y al tipo salvaje. Para la colonización mucosa, los animales pueden exponerse a organismos de tipo salvaje mediante la vía oral, intranasal o intraamigdalina y pueden compararse las cantidades de organismos recuperados de las muestras de moco nasal o del lavado de la amígdala a intervalos tras la exposición.

Preparaciones de vacuna

Las vacunas que comprenden bacterias mutantes pueden administrarse solas o como componentes de una vacuna polivalente, es decir, en combinación con otras vacunas. En una formulación de vacuna, la bacteria mutante puede estar viva o muerta, la bacteria viva o muerta puede estar liofilizada y, opcionalmente, reconstituirse como se conoce en la técnica. Las vacunas pueden suministrarse convenientemente en kits, que también pueden comprender el etiquetado y las instrucciones apropiadas para la administración de una vacuna a un animal (por ejemplo, ganado, un ungulado o un animal de compañía) o a un ave (por ejemplo, un ave de corral).

Las vacunas que comprenden mutantes sin cápsula también pueden comprender vehículos farmacéutica y veterinariamente aceptables. Estos vehículos son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitaciones, macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas víricas inactivas. También pueden usarse en la vacuna sales farmacéutica y veterinariamente aceptables, por ejemplo, sales minerales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos o sulfatos, así como las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos. Las vacunas también pueden contener líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol, así como sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes o agentes para tamponamiento del pH. También pueden usarse liposomas como vehículos para la bacteria mutante. Véase la patente de EE.UU. 5.422.120, o los documentos WO 95/13796, WO 91/14445 o EP 524.968 B1.

Si se desea, puede añadirse un adyuvante a la vacuna. Los adyuvantes útiles incluyen, sin limitaciones, tensioactivos (por ejemplo, hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de di-metildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-n'-N-bis(2-hidroxietil-propano di-amino), metoxihexadecilglicerol y polioles pluronic); polianiones (por ejemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol), péptidos (por ejemplo, muramil dipéptido, dimetilglicina, tuftsina), emulsiones oleosas, alumbre y mezclas de los mismos.

Tratamiento de mamíferos, especialmente ganado, ungulados y animales de compañía

Los "mamíferos" incluyen a monotremas (por ejemplo, el ornitorrinco), marsupiales (por ejemplo, el canguro) y placentarios, que incluyen ganado (animales domésticos que se crían para la alimentación, leche o fibra, como cerdos, ovejas, terneras y caballos) y animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos). "Ungulados" incluye, pero sin limitaciones, terneras (animales bovinos), búfalo de agua, visón, oveja, cerdo, ciervo, elefantes y yaks. Cada uno de estos incluye tanto formas adultas como en desarrollo (por ejemplo, terneros, lechones, corderos, etc.). Las bacterias de la invención puede administrarse a adultos o a mamíferos en desarrollo, preferiblemente a ganado, ungulados o animales de compañía.

Un procedimiento conveniente de suministro de una bacteria de la invención a mamíferos (tal como ganado, ungulados o animales de compañía) es la administración por vía oral (por ejemplo, en el pienso o en el agua de beber o como cebo). Es especialmente conveniente añadir la bacteria sobre el pienso o mezclarla con él. Típicamente, los animales grandes (por ejemplo, ganado ungulado como las terneras) reciben dosis de aproximadamente 10^{6}, 5 X 10^{6}, 10^{7}, 5 x 10^{7}, 10^{8}, 5 x 10^{8}, 10^{9}, 5 x 10^{9} ó 10^{10} ufc; aproximadamente 10^{8}, 5 x 10^{8}, 10^{9}, 5 x 10^{9} ufc si se añade sobre el pienso. Pueden administrarse dosis de aproximadamente 10^{6} a aproximadamente 10^{8}, de aproximadamente 2 x 10^{6} a aproximadamente 3 x 10^{8}, de aproximadamente 2,4 x 10^{6} a aproximadamente 2,6 x 10^{8}, de aproximadamente 10^{4} a aproximadamente 10^{6} ufc o de aproximadamente 10^{4} a aproximadamente 10^{9} ufc. La dosis pueden ajustarse para ganado/ungulados más pequeños, tales como ovejas (por ejemplo, aproximadamente 10^{4}, 5 x 10^{4}, 10^{5}, 5 x10^{5}, 10^{6}, 5 x 10^{6},10^{7}, 5 x 10^{7}, 10^{8}, 5 x 10^{8} ufc. Pautas de dosificación análogas pueden deducirse fácilmente para los animales de compañía.

Aunque se prefiere la vía oral por la facilidad de administración, también pueden usarse otras vías de vacunación. Estas incluyen sin limitaciones, vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, intrabroquial, etc. La bacteria de la invención puede implantarse en el oído. La bacteria también puede administrarse mediante un pulverizador, mediante inoculación ocular o escarificación.

Tratamiento de aves

Las "aves" incluyen aves salvajes (por ejemplo, gallo de pelea) y domesticados (por ejemplo, aves de corral o mascotas) e incluyen tanto formas adultas como en desarrollo (por ejemplo, polluelos, pollos, pavos, etc.). Las "aves de corral" incluyen todas las aves mantenidas, recogidas o domesticadas para carne o huevos, incluyendo pollo, pavo, avestruz, gallina, paloma, gallo, faisán, codorniz, pato, ganso y emú.

La bacteria de la invención puede administrarse a un ave mediante cualquier técnica conocida o convencional, incluyendo inyección en mucosa o intramuscular. En un criadero, la bacteria puede administrarse usando técnicas tales como vacunación en huevo, vacunación por pulverización o vacunación por vía subcutánea. En la granja, la bacteria puede administrarse usando técnicas, tales como escarificación, vacunación por pulverización, vacunación por colirio, vacunación en el agua, vacunación en la comida, vacunación en la membrana del ala, vacunación subcutánea y vacunación por vía intramuscular.

Las dosis eficaces dependen del tamaño del ave. El intervalo de dosis puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 10^{2}, 5 x 10^{2}, 10^{3}, 5 x 10^{3}, 10^{4}, 5 x 10^{4}, 10^{5}, 5 x 10^{5}, 10^{6}, 5 x 10^{6}, 10^{7}, 5 x 10^{7}, 10^{8}, 5 x 10^{8}, 10^{9} a 5 x 10^{9} ufc.

La descripción anterior describe en general la presente invención. Puede obtenerse un entendimiento más completo en referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Generación de mutantes sin cápsula por deleción de hyaE de P. multocida

Los mutantes de las cepas 1056 (aviar, serotipo A:3) y 1062 (bovina, serotipo A:3) de P. multocida se generaron mediante la deleción de la región codificadora de sus genes hyaE, que bloqueaban la síntesis de los bloques de N-acetil-D-glucosamina componentes de la cápsula. Las regiones codificadoras de los genes hyaE de 1059 y 1062 (ID SEC Nº 5 y 6, respectivamente) se obtuvieron mediante amplificación por PCR, usando el cebador sentido 5'-ATGAAAAAGGT
TAATATCATTGG-3' (ID SEC Nº 1) y el cebador complementario 5'-TTAACCTTGCTTGAATCGTTTACC-3' (ID SEC Nº 2). Todos los cebadores se sintetizaron con un sintetizador de oligonucleótidos (Applied Biosystems, Inc.) por Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA. Las reacciones de PCR se realizaron usando el kit de PCR GeneAmp LX (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) en un termociclador GenAmp modelo 9600 de Perkin Elmer. Las con-
diciones de reacción fueron 30 ciclos, con 30 segundos a 95ºC, 45 segundos a 48ºC y 60 segundos a 72ºC por ciclo.

Los dos fragmentos de hyaE generados por PCR se iniciaban en sus codones Met de inicio y terminaban en sus codones de parada. Los fragmentos de PCR se ligaron en pCR2.1 (Invitrogen Inc., LaJolla, CA) y se electroporaron en la cepa de E. coli, DH11S (Life Technologies, Rockville, MD), que generaron los plásmidos pCR2.1hyaE1059 y pCR2.1hyaE1062. Las dos construcciones plasmídicas se aislaron por el procedimiento de SDS alcalino, a continuación se purificaron por centrifugación en CsCl usando procedimientos convencionales. Las dos cadenas de ambos genes hyaE se secuenciaron usando el kit Dye Terminator Chemistry de PE Applied Biosystems. Las muestras se aplicaron en un Secuenciador de ADN ABI Prism 377 en las Instalaciones de Ácidos Nucleicos, Universidad del Estado de Iowa, Ames, IA.

Los genes hyaE estructurales de cada cepa tenían una longitud de 1.869 pb. Debido a la variación de secuencia, encontrada principalmente en el extremo 3' de la región codificadora, se construyeron plásmidos sencillos de sustitución de hyaE para cada cepa para obtener las dos cepas mutantes de P. multocida. Las deleciones precisas en cada gen hyaE contenidas en los plásmidos pCR2.1hyaE1059 y pCR2.1hyaE1062 se consiguieron mediante PCR usando los cebadores para la deleción 5'-AAAGATATCTTGGTTTACTTCAATAATTTC-3' (ID SEC Nº 3) y 5'-AAAGA
TATCACTGCATCTGTTCAATCAACGAGC-3' (ID SEC Nº 4). Los cebadores para la deleción hibridan con el gen clonado a una distancia de aproximadamente 300 pares de bases pero hacia el exterior, hacia el vector plasmídico, en lugar de hacia el interior. La reacción de PCR amplifica el vector de clonación completo y los dos extremos de la inserción génica, pero no la "deleción" de aproximadamente 300 pares de bases. El producto amplificado es lineal, con los dos fragmentos del gen hyaE en los extremos y el vector plasmídico en el centro. Los cebadores contiene sitios EcoRV (GATATC) en sus extremos 5'. Por tanto, los extremos del producto lineal amplificado contienen sitios EcoRV. Véase las Figura 1A y 1B.

Los fragmentos de PCR resultantes se sometieron a digestión de restricción con EcoRV para eliminar secuencias específicas de sus extremos. A continuación, cada fragmento se ligó para generar deleciones en fase que escindían los nucleótidos del 715 a 1.082. Se insertó un enlazador SmaI de ocho pares de bases (5'-CCCCGGGG-3') en el sitio de deleción de EcoRV de P. multocida 1062 para asegurarse de que la mutación daría lugar a un fenotipo sin cápsula. No se insertó este ADN en el sitio de deleción de la inserción hyaE de P. multocida 1059.

Las secuencias de nucleótidos de los fragmentos hyaE mutados de 1059 y 1062 se muestran en las ID SEC Nº 7 y 8, respectivamente. Tanto en 1059 como en 1062 se había delecionado los aminoácidos 239 al 359 de la proteína hyaE. Además, en ambas cadenas se cambió el aminoácido de la anterior posición 360 de leucina a isoleucina. La cepa 1062 recibía 8 aminoácidos adicionales en el sitio de deleción justo antes del extremo 3' de la anterior posición 360 (Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly; ID SEC Nº 9).

Los fragmentos de hyaE mutados se subclonaron en sitios EcoRI en el sitio de clonación múltiple del plásmido pBCSK (Stratagene, Inc.), seguido de la inserción del elemento de resistencia a kanamicina Tn903 en los sitios BamHI adyacentes para producir pBCSK\DeltahyaEkan^{r}1059 y pBCSK\DeltahyaEkan^{r}1062, respectivamente. Las construcciones de los plásmidos de sustitución se completaron mediante el ligamiento de los fragmentos \DeltahyaEkan^{r} generados con BssH2 de 1059 y 1062 con el origen de replicación termosensible de pBB 192 escindido del sitio BssH2 de pBCSK (Stratagene, Inc.). Véase la patente de EE.UU. 5.840.556. Debido a que el origen ColE1 está inactivo en P. multocida, sólo los productos de ligamiento que generaban los plásmidos p192ori\DeltahyaEkan^{r}1059 o p192ori\DeltahyaEkan^{r}1062 eran capaces de replicarse en los huéspedes.

Los plásmidos de sustitución se introdujeron en las cepas de P. multocida apropiadas mediante electroporación. Las células se cultivaron en medio de cultivo Columbia, preparándose a continuación para la electroporación mediante las siguientes etapas. El cultivo se sedimentó por centrifugación a 5.000 x g durante 15 minutos y se lavó una vez con 100 ml de sacarosa 272 mM a 0ºC. El sedimento celular se resuspendió (1:3 bacterias envasadas: Sacarosa 272 mM) en hielo. Las bacterias competentes (100 \mul) se mezclaron en una cubeta de electroporación de 0,1 cm (Bio-Rad) con 200 ng de ADN plasmídico que se había metilado o desmetilado in vitro usando HhaI. Inmediatamente después de añadir el ADN, las células se electroporaron (Gene pulser, Bio-Rad) a 18.000 V/cm, 80 ohm y 25 mFd, que daban lugar a tiempos constantes que oscilaban entre 11 y 15 mseg.

Se añadió medio de cultivo Columbia (1 ml, 0ºC) a las células electroporadas y las suspensiones se incubaron a 25ºC durante aproximadamente 25 minutos. Las células se recuperaron a 30ºC durante 2 horas y, a continuación, se pusieron en placas de agar Columbia que contenían kanamicina a 50 \mug/ml. Las colonias eran visibles tras 24 horas de incubación a 30ºC. Las células transformadas se cultivaron a 30ºC durante toda la noche en medio de cultivo que contenía kanamicina. A continuación, las células se pusieron en placas de agar de dextrosa almidón con kanamicina a 50 \mug/ml y se cultivó a 30ºC durante 24 horas.

Las células que poseían el plásmido integrado sobrevivían a la selección con antibióticos a la temperatura no permisiva para la replicación del plásmido y éstas podrían identificarse debido a que la integración del plásmido de sustitución daba lugar a un fenotipo sin cápsula. Se conseguía fácilmente distinguir entre las colonias de P. multocida con cápsula y sin cápsula de las cepas 1059 y 1062 que crecían en las placas de agar de dextrosa almidón. Las colonias capsuladas de tipo salvaje de las dos cepas poseen ácido hialurónico, el principal componente de la cápsula, que da lugar a colonias de apariencia mucoide; cuando se observaban con estas colonias con luz transmitida oblicua, mostraban irisaciones nacaradas. Por el contrario, los mutantes de entrecruzamiento sencillo sin cápsula no son mucoides ni presentan irisaciones.

Los mutantes de entrecruzamiento sencillo se transfirieron a 5 ml de medio de cultivo Columbia sin antibiótico adicional y se incubaron a 30ºC durante toda la noche para que el plásmido se liberara del cromosoma. El cultivo se transfirió a placas de agar de dextrosa almidón sin antibiótico adicional que se incubaron a 38ºC durante 12 horas. El ensayo inicial para identificar mutantes de entrecruzamiento doble supuso una matriz de replicación en placas de células que se mostraban sin cápsula en las placas de agar de dextrosa almidón, con o sin antibiótico, y las células se cultivaron a 38ºC. Las colonias sin cápsula que no crecían en las placas con antibiótico se sometieron a análisis por PCR usando los cebadores sentido y complementario de hyaE. Los tamaños de los productos de PCR se compararon con los de los parentales de tipo salvaje usando electroforesis en gel de agarosa.

También se evaluó la presencia del gen de resistencia a kanamicina en los supuestos mutantes por deleción de hyaE de P. multocida 1059 y 1062. Los posibles mutantes que poseían deleciones "limpias" de hyaE estaban desprovistos de secuencias de resistencia a antibióticos. Se usaron un ensayo enzimático de difusión en disco (ensayo de Kirby-Bauer, Bauer y col., Am. J. Clin. Path. 45, 493-96,1966) y un ensayo de tinción con tinta china (Collins y Lyne, MICROBIOLOGICAL METHODS, Butterworths, Boston, Mass., 1976, pág. 110) para confirmar que los dos mutantes hyaE poseían un fenotipo sin cápsula.

Ejemplo 2 Vacunación de pavos con la cepa 1059 \DeltahyaE de P. multocida

La atenuación de la cepa 1059 \DeltahyaE de P. multocida se evaluó en pavos de la variedad Broad Breasted White de tres semanas de edad. Los grupos constituidos por cuatro pavos se inyectaron por vía intramuscular con diluciones seriadas 1:10 de cultivos en fase de crecimiento exponencial de cultivos de tipo salvaje o mutantes sin cápsula suspendidos en medio de cultivo tripticasa (0,1 ml). Los pavos se observaron durante 7 días después de la estimulación.

Los valores de DL_{50} (es decir, la cantidad de bacterias necesarias para matar a la mitad de los pavos) eran de <10^{3} organismos por pavo inyectado con la cepa de tipo salvaje y en exceso de 10^{7} organismos para pavos inyectados con el mutante hyaE.

Ejemplo 3 Vacunación de terneros castrados con la cepa 1062 \DeltahyaE de P. multocida

Seis terneros castrados Holstein, de aproximadamente 227 kg (500 pounds), se expusieron al mutante 1062 \DeltahyaE de P. multocida sin cápsula. La cepa se administró por inyección subcutánea en el cuello (10^{8} ufc) o se añadió al pienso (10^{9} ufc).

No se observó reacción adversa a ninguna exposición. Las amígdalas del paladar en los vacunados por vía mucosa resultaban colonizadas para el resto del ensayo (5 semanas). La estimulación intratraqueal con la cepa parental virulenta (dosis total de 10^{10} ufc en 15 ml) provocaba días de fiebre transitoria (1-2) en los terneros control pero con pocos o ningún cambio neumónico 10 días tras la estimulación en los controles o en los vacunados.

<110> Biotechnology Research Development Corporation, Estados Unidos de América en representación del Departamento de Agricultura.

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<120> Mutantes por deleción sin cápsula de hyaE de P. multocida

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<151> 02-07-2003

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<160> 9

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<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

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ttaaccttgc ttgaatcgtt tacc

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aaagatatct tggtttactt caataatttc

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aaagatatca ctgcatctgt tcaatcaacg agc

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<213> P. multocida

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

2

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.507

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> P. multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

4

\hskip0.8cm

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.531

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> P. multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> aminoácidos insertados

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly}

Claims

1. Una bacteria Pasteurella multocida (P. multocida) aislada de serogrupo A que comprende una deleción de todo o parte de un gen hyaE, atenuando la deleción a la bacteria.

2. La bacteria de la reivindicación 1 que no comprende genes de resistencia a antibióticos.

3. La bacteria de la reivindicación 1 que no comprende ADN exógeno.

4. La bacteria de la reivindicación 1 que es de serotipo A: 3.

5. La bacteria de la reivindicación 1 que es de serotipo A: 1.

6. La bacteria de la reivindicación 1 que es de serotipo A: 4.

7. La bacteria de la reivindicación 1 en la que se delecionan los aminoácidos 239-359 de la proteína hyaE.

8. La bacteria de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 7.

9. La bacteria de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 8.

10. La bacteria de la reivindicación 1 que está viva.

11. La bacteria de la reivindicación 1 que está liofilizada.

12. La bacteria de la reivindicación 1 que está muerta.

13. Una vacuna para inducir inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje que comprende:

la bacteria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La vacuna de la reivindicación 13 que se envasa con instrucciones para administrar la vacuna a un ungulado para que confiera inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje.

15. La vacuna de la reivindicación 13 que se envasa con instrucciones para administrar la vacuna a un ave pare conferir inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje.

16. Un pienso adecuado para ungulados que comprende la bacteria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

17. El pienso de la reivindicación 16 que se envasa con instrucciones para administrar el pienso a ungulados para conferir inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje.

18. Un pienso adecuado para un ave que comprende la bacteria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

19. El pienso de la reivindicación 18 que se envasa con instrucciones para administrar el pienso a un ave para conferir inmunidad protectora frente a P. multocida de tipo salvaje.

20. Uso de la bacteria según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para conferir inmunidad protectora a un ungulado o un ave frente a P. multocida de tipo salvaje.

21. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración a un ungulado.

22. El uso de la reivindicación 21 en el que el ungulado es un animal bovino.

23. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración a un ave.

24. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración a un ave y el ave es un ave de corral.

25. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración a un ave y el ave es un ave de corral que se selecciona entre el grupo constituido por pollo, pavo, avestruz, gallina, paloma, gallo, faisán, codorniz, pato, ganso y emú.

26. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración a un ave y el ave en un pollo.

27. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración a un ave y el ave en un pavo.

28. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración por vía subcutánea.

29. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración por vía intramuscular.

30. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración por vía oral.

31. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración añadido al pienso.

32. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración por vía intranasal.

33. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración a dosis de entre aproximadamente 10^{4} y aproximadamente 10^{9} ufc.

34. El uso de la reivindicación 20 en el que el medicamento es para su administración a dosis de entre aproximadamente 10^{4} y aproximadamente 10^{6} ufc.