ES2316492T3 - Vacuna contra la salmonella. - Google Patents

Vacuna contra la salmonella. Download PDF

Info

Publication number
ES2316492T3
ES2316492T3 ES01996389T ES01996389T ES2316492T3 ES 2316492 T3 ES2316492 T3 ES 2316492T3 ES 01996389 T ES01996389 T ES 01996389T ES 01996389 T ES01996389 T ES 01996389T ES 2316492 T3 ES2316492 T3 ES 2316492T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
salmonella
strain
reca
vaccine
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01996389T
Other languages
English (en)
Inventor
Petrus Johannes Maria Nuijten
Maarten Hendrik Witvliet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intervet International BV
Original Assignee
Intervet International BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intervet International BV filed Critical Intervet International BV
Application granted granted Critical
Publication of ES2316492T3 publication Critical patent/ES2316492T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Vacuna para combatir la infección por Salmonella que comprende una cepa de Salmonella atenuada viva que comprende una primera mutación atenuante, comprendiendo adicionalmente dicha cepa de Salmonella atenuada una mutación que impide a la cepa preparar una proteína RecA funcional, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha cepa pertenece a cualquiera de las cepas en el grupo que consiste en S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261.

Description

Vacuna contra la Salmonella.
La presente invención se refiere a una cepa de Salmonella atenuada que comprende una primera mutación atenuante, a su uso en vacunas, a vacunas basadas en esta cepa y a métodos para la preparación de tales vacunas. Las bacterias del género Salmonella son muy conocidas por su patogenicidad tanto en el hombre como en animales. Sólo en los Estados Unidos, el número de seres humanos que padecen infecciones por Salmonella cada año excede los dos millones de casos. En la mayoría de los casos, la infección está causada por alimentos contaminados. Las fuentes de infección bien conocidas son huevos (tanto de patos como de pollos), productos que contienen huevos y carne de aves de corral y cerdo no cocida suficientemente. Especialmente en bebés, niños pequeños, personas mayores y pacientes con insuficiencias inmunes, la capacidad de enfrentarse a tales infecciones es baja. En estos grupos, el índice de mortalidad anual debido a infecciones por Salmonella es elevado. Durante las últimas décadas, la cría de animales a gran escala más eficaz ha conducido a un aumento enorme en la densidad de animales. Como resultado, se observa un aumento en el número de infecciones animales y posteriormente en las infecciones humanas causadas por alimentos infectados. Está claro que los animales son la principal fuente de infección por Salmonella. Esta fuente es muy difícil de controlar. En primer lugar, las infecciones por Salmonella en la mayoría de los casos no causan enfermedades graves en animales adultos sanos; estos animales pueden ser portadores de la bacteria durante un período prolongado. Durante ese tiempo, esparcen la bacteria en los excrementos. Esto hace que sea prácticamente imposible evitar la infección en los animales jóvenes más vulnerables. En segundo lugar, muchas especies de Salmonella colonizan varias especies hospedadoras diferentes. Algunas de las especies de Salmonella causan infecciones primarias en hospedadores específicos, mientras que otras especies de Salmonella no están limitadas en absoluto. Como especies de infección principales, S. typhi y paratyphi están frecuentemente asociadas con la infección en el hombre. S. dublin está relacionada con vacas, S. abortus-equi causa abortos en caballos. S. abortus-ovi causa abortos en ovejas. S. choleraesuis es la causa de diarrea mortal en cerdos jóvenes. S. typhimurium y S. enteritidis causan salmonelosis en seres humanos, aves de corral, cerdos, vacas y roedores, S. arizonae causa la enfermedad en pavos, mientras que S. gallinarum causa salmonelosis sólo en aves de corral.
Está claro que existe la necesidad de vacunas buenas, seguras y eficaces para combatir las diversas especies de Salmonella. Actualmente, están disponibles en el mercado varias vacunas de Salmonella atenuadas vivas. Muchas de las cepas que son adecuadas para uso en una vacuna viva están atenuadas hasta un nivel que las hace prácticamente no virulentas. Dos ejemplos llamativos de tales cepas no virulentas son la cepa de Salmonella gallinarum 9R y la cepa de Salmonella typhimurium SL3261.
La cepa de Salmonella gallinarum 9R se describió hace 44 años por Smith (J. Hyg. Camb., 54: 419-432 (1956)). Se sabe que esta cepa altamente atenuada tiene al menos una mutación en un gen implicado en la síntesis de los O-polisacáridos de las células, conduciendo a una mutación Lisa\rightarrowRugosa. La cepa 9R se ha usado como una cepa Rugosa de referencia desde entonces (véase, por ejemplo, Cameron, C. M. et al., Onderstepoort J. Vet. Res. 39(3), 139-146 (1972)). Esta cepa se puede administrar a pollos incluso en una dosis de 10^{9} bacterias sin causar la muerte de ningún pollo, mientras que una dosis que comprende 10^{3} bacterias de tipo silvestre mata a todos los animales. La cepa de Salmonella typhimurium SL3261 se ha descrito hace 19 años por Hoiseth, S. y Stocker, B. A. D. (Nature 291: 238-239 (1981)) y está disponible con el número de Depósito SGSC 439, Salmonella Genetic Stock Centre, University of Calgary, Alberta, Canadá T2N 1N4.
Se sabe que esta cepa tiene una mutación altamente atenuante en la ruta de síntesis aromática. Esta cepa se puede administrar en una dosis de incluso 10^{6} bacterias a ratones susceptibles sin causar la muerte de ningún animal, mientras que la DL_{50} de la cepa parental para estos ratones es menor de 20 bacterias.
Tales cepas de Salmonella se han apreciado desde hace mucho tiempo por su carácter altamente atenuado. Éstas están tan gravemente atenuadas que se describen en la bibliografía como no virulentas. Por lo tanto, han sido las cepas de elección para vacunas de Salmonella atenuadas vivas.
En principio, existe una relación clara entre el nivel de virulencia y el nivel de inmunidad inducida. En general, las cepas con la mayor virulencia inducen los mayores niveles de inmunidad: los animales que sobreviven a infecciones con cepas de Salmonella de tipo silvestre con frecuencia crean una inmunidad de efecto prolongado. Por otra parte, las cepas que no inducen ninguna patogénesis, las cepas no virulentas, son las más deseables para uso en vacunas, pero tales cepas con frecuencia no son capaces de inducir un nivel de inmunidad suficientemente elevado. Las cepas no virulentas de Salmonella anteriormente descritas apenas son capaces de activar el sistema inmune hasta un nivel suficiente.
Sin embargo, una desventaja pertinente de todas las vacunas atenuadas vivas es que, en principio, pueden volver a un nivel de virulencia de tipo silvestre mediante la recombinación del gen mutado con ADN de bacterias que son portadoras de genes no mutados tales como, por ejemplo, cepas de campo de tipo silvestre. Tal suceso de recombinación puede tener lugar de diversos modos, por ejemplo, mediante transfección, transducción o transformación. Los genes que se sabe que tienen un papel en estos procesos de recombinación se denominan genes rec. Uno de los genes rec de importancia clave es el gen recA. Este gen codifica una enzima RecA que está implicada en varias etapas del proceso de recombinación. El gen recA y muchos otros genes rec se han descrito, entre otros, por Lloyd, R. G. y Low, K. B. ("Escherichia coli and Salmonella", sec. ed., ASM Press, ISBN 1-55581-0-845, párr. 119 págs. 2236-2255), por West, S. C. (Annu. Rev. Biochem. 61: 603-640 (1992) y por Kowalczykowski, S. C. et al. (Microbiol. Rev. 58:
401-465 (1994)).
Por lo tanto, parece tentador a primera vista, cuando se contempla una vacuna atenuada viva segura, suprimir uno de los genes rec. Tal supresión afecta gravemente a la capacidad del ADN bacteriano de recombinarse. Sin embargo, también se sabe que la supresión de los genes rec causa atenuación grave de las cepas bacterianas de las que se ha suprimido. La supresión de, por ejemplo, los genes recA o recBC en Salmonella hace sensibles a los mutantes al estallido oxidativo de los macrófagos, que conduce, entre otras cosas, a una supresión significativa del crecimiento in vivo. Esto se ha demostrado para Salmonella, por ejemplo, por Buchmeier, N. A. et al., (Mol. Microbiol, 7: 933-936 (1993)) y es igualmente convincente para otros géneros bacterianos tan poco relacionados con Salmonella como, por ejemplo, Vibrio cholerae (Ketley et al., Infect. and Immun. 58: 1481-1484 (1990)).
Por tanto, cuando la supresión de un gen rec pueda ser una ventaja para cepas virulentas, ciertamente se asumirá que será una desventaja para las cepas no virulentas, tales como la cepa de Salmonella gallinarum 9R y la cepa de Salmonella typhimurium SL3261. Podría esperarse que estas cepas, conocidas por ya estar afectadas altamente, no desencadenen ninguna respuesta inmunológica después de retirar los genes rec. Esto podría explicar por qué no se realizaron intentos para suprimir los genes Rec de tales cepas ya atenuadas altamente, no virulentas, tales como S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261, a pesar de su larga historia.
Se señala que los mutantes dobles recA de Salmonella como tales se conocen por Johnson (J. Bact. Mar. 1992, págs. 1911-1915). En particular se menciona un mutante his-22 recA TR4871 en la Tabla 1.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar vacunas de Salmonella atenuadas vivas que sean tanto seguras como eficaces. Sorprendentemente, ahora se ha observado que la supresión del factor de virulencia RecA no afecta adicionalmente a la capacidad de las cepas de Salmonella ya atenuadas de activar adecuadamente el sistema inmune en comparación con sus homólogas RecA positivas.
Por lo tanto, una realización de la invención proporciona cepas de Salmonella atenuadas que ya comprenden una primera mutación atenuante y que tienen como un elemento característico que comprenden adicionalmente una mutación que impide a estas cepas preparar una proteína RecA funcional.
Se entiende que las cepas atenuadas que ya comprenden una primera mutación atenuante son cepas que tienen un carácter atenuado suficientemente para usarse como una base para vacunas atenuadas vivas debido a una atenuación ya existente. La naturaleza de esa primera atenuación no es pertinente. Puede ser cualquier mutación atenuante o la combinación de dos o más mutaciones que tienen un carácter atenuado suficientemente para hacer a la bacteria útil como base para una vacuna atenuada viva. Solamente como un ejemplo puede ser, por ejemplo, una mutación Rugosa, una mutación en la ruta de síntesis de histidina o purina o una mutación en la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos. Las mutaciones en el gen cra y las mutaciones crp/cya, conocidas en la técnica, también son mutaciones adecuadas. También son muy adecuadas como base para la producción de una bacteria RecA negativa de acuerdo con la presente invención cepas de Salmonella de vacunas conocidas.
Se entiende que las cepas que no son capaces de preparar RecA funcional son cepas que o no preparan enzima RecA en absoluto, o la preparan a un nivel que es insuficiente esencialmente para conducir a sucesos de recombinación dirigidos por RecA. Esta incapacidad para preparar RecA puede ser el resultado, entre otras cosas, de una mutación o de supresión de una parte o todo el gen recA, el promotor de recA o un gen implicado en la síntesis de recA.
Las cepas de Salmonella de acuerdo con la invención pertenecen a las especies Salmonella gallinarum o Salmonella typhimurium.
En una forma más preferida de esta realización, la cepa de Salmonella gallinarum es Salmonella gallinarum 9R.
Una forma incluso más preferida de esta realización se refiere a la cepa de Salmonella gallinarum 9R-RecA^{-} de la que se deposita una muestra en el Centraalbureau loor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, Países Bajos, con el número de depósito CBS 108964.
En otra forma más preferida de esta realización, la cepa de Salmonella typhimurium es Salmonella typhimurium SL3261.
Un modo posible de preparar el gen recA o cualquiera de los otros genes conocidos implicados en la biosíntesis de RecA no funcional es por medio de métodos clásicos tales como el tratamiento de bacterias de tipo silvestre con agentes mutagénicos tales como análogos de bases, tratamiento con luz ultravioleta o tratamiento con temperatura (Anderson, P. 1995. Mutagenesis, págs. 31-58 en Methods in Cell Biology 48. H. F. Epstein y D. C. Shakes (Eds)). Otros métodos para preparar mutantes RecA negativos de diversas bacterias de las que el tipo silvestre es RecA positivo, se han descrito entre otros por Liu, S. L. et al. (Infect. Immun. 1988 Aug; 56(8): 1967-73), Haas, R. et al., (Mol. Microbiol. 1993 May; 8(4): 763-60) y Graf, J. et al. (J. Bacteriol. 1994 Nov; 176(22): 6986-91).
\newpage
Los mutantes recA negativos se pueden seleccionar fácilmente debido a su sensibilidad mucho mayor a la radiación UV. Un modo clásico de detectar las bacterias mutantes entre las no mutadas es mediante réplica en placa. Esta técnica comienza con una placa de agar cubierta con colonias bacterianas que se han sometido a tratamiento mutagénico. Se prepara una réplica de esta placa en una segunda placa de agar. Después, esta placa se somete a dosis elevadas de radiación UV. Las colonias que no crecen más después del tratamiento de radiación son colonias que tienen una mutación en un gen rec. Después, se pueden seleccionar y cultivar sus réplicas de colonias vivas en la placa original para, por ejemplo, propósitos de vacunas.
Habitualmente se desconoce la naturaleza exacta de la mutación causada mediante técnicas de mutación clásicas. Esta puede ser, por ejemplo, una mutación puntual que puede, aunque no es probable que suceda, volver eventualmente al tipo silvestre. Por lo tanto, la mutagénesis con transposones es una buena alternativa. La mutación mediante mutagénesis con transposón también es una técnica de mutagénesis bien conocida en la técnica. Ésta es una mutación que se consigue en un sitio localizado en el cromosoma. La tecnología de ADN recombinante ofrece la posibilidad de introducir una mutación en un sitio predeterminado, deliberadamente en lugar de aleatoriamente. Tal mutación puede ser una inserción, una supresión, un reemplazo de un nucleótido por otro o una combinación de los mismos, con la única condición de que el gen mutado ya no codifica RecA funcional. Tal mutación se puede realizar, por ejemplo, mediante supresión de varios pares de bases. Incluso supresiones muy pequeñas tales como tramos de 10 pares de bases pueden hacer que el gen recA codifique un RecA no funcional. Incluso la supresión de un único par de bases puede conducir a RecA no funcional, ya que como resultado de tal mutación, los otros pares de bases ya no están en la fase de lectura correcta. Cada supresión o inserción de un número de pares de bases que no sea múltiplo de 3 causa tal desplazamiento de fase. Más preferiblemente, se retira un tramo más largo, por ejemplo, 100 pares de bases. Aún más preferiblemente, se suprime todo el gen recA.
Todas las técnicas de ADN recombinante para la construcción de mutantes recA negativos son técnicas convencionales bien conocidas. Estas se refieren a la clonación del gen recA, modificación de la secuencia de genes mediante mutagénesis dirigida, digestión con enzimas de restricción seguida de re-ligamiento o estrategias de PCR, y al reemplazo posterior del gen recA de tipo silvestre por el gen mutante (intercambio alélico o reemplazo alélico). En la técnica se conocen técnicas de ADN recombinante convencionales tales como clonación del gen recA en un plásmido, digestión del gen con una enzima de restricción, seguido de tratamiento con endonucleasa, re-ligamiento y recombinación homóloga en la cepa hospedadora, y se han descrito, entre otros, en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). Las mutaciones dirigidas se pueden realizar, por ejemplo, por medio de mutagénesis dirigida in vitro usando el kit Transformer® vendido por Clontech. Las técnicas de PCR se describen ampliamente en (Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1995)).
Dada la gran cantidad de vacunas suministradas hoy en día tanto a mascotas como a animales de granja, está claro que sería deseable la administración combinada de varias vacunas, aunque sólo sea por motivos de reducir los costes de vacunación. Por lo tanto, es muy atractivo usar bacterias atenuadas vivas como un vehículo recombinante de genes heterólogos, que codifiquen antígenos seleccionados de otros microorganismos patógenos o virus. La administración de tal vehículo recombinante tiene la ventaja de que se induce la inmunidad contra dos o más enfermedades al mismo tiempo. Las bacterias atenuadas vivas para uso en una vacuna de acuerdo con la presente invención proporcionan vehículos muy adecuados para genes heterólogos. En principio, tales genes heterólogos se pueden insertar en el genoma bacteriano en cualquier sitio no esencial.
Por lo tanto, una forma todavía incluso más preferida de esta realización se refiere a bacterias de acuerdo con la invención en las que se inserta un gen heterólogo. Tal gen heterólogo puede ser, como se ha mencionado anteriormente, por ejemplo, un gen que codifica un antígeno seleccionado de otros microorganismos patógenos o virus. Tales genes se pueden obtener, por ejemplo, a partir de herpesvirus patógenos (por ejemplo, los genes que codifican las proteínas estructurales de herpesvirus), Retrovirus (por ejemplo, la proteína de la envuelta gp160), adenovirus y similares. También se puede obtener un gen heterólogo a partir de bacterias patógenas. Como ejemplo, los genes que codifican toxinas bacterianas tales como toxinas de Actinobacillus pleuropneumoniae, toxinas de Clostridium, proteínas de la membrana externa y similares son genes heterólogos bacterianos muy adecuados. Adicionalmente, los genes heterólogos de diversos parásitos tales como, por ejemplo, Eimeria son candidatos muy atractivos para clonación en un vector de Salmonella atenuado vivo de acuerdo con la invención. Otra posibilidad es insertar un gen que codifique una proteína implicada en activar al sistema inmune, tal como una interleucina, Factor de Necrosis Tumoral o un interferón, u otro gen implicado en la regulación inmune. En la forma más preferida de esta realización, el gen heterólogo codifica un antígeno de un microorganismo o virus que se selecciona del grupo que consiste en virus de la Bronquitis Infecciosa, virus de la Enfermedad de Newcastle, Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (Gumboro), agente de Anemia del Pollo, Reovirus Aviar, Mycoplasma gallisepticum, virus de la Rinotraqueitis del Pavo, Haemophilus paragallinarum (Coryza), Poxvirus del Pollo, virus de la Encefalomielitis Aviar, especies de Eimeria, Pasteurella multocida, Mycoplasma synoviae, especies de Salmonella, Ornithobacterium rhinotracheale y E. coli.
El uso del gen recA como un sitio de inserción tiene la ventaja de que no hay necesidad de encontrar un nuevo sitio de inserción para el gen heterólogo y al mismo tiempo el gen recA se inactiva y se puede expresar el gen heterólogo recientemente introducido (de acuerdo con los genes bacterianos homólogos). La construcción de tales vehículos recombinantes se puede realizar rutinariamente, usando técnicas de biología molecular convencionales tales como intercambio alélico.
Por tanto, en una forma preferida de esta realización, el gen heterólogo se inserta en el gen recA. El gen heterólogo se puede insertar en cualquier lugar en el gen recA o se puede insertar en el sitio del gen recA siempre que este gen se haya suprimido parcialmente o completamente.
La invención se refiere a vacunas para combatir la infección por Salmonella que comprenden una cepa atenuada de Salmonella como se ha descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser tan sencillo como el agua, pero también puede comprender, por ejemplo, el líquido de cultivo en el que se cultivaron las bacterias. Otro vehículo adecuado es, por ejemplo, una solución de concentración de sal fisiológica.
La dosis útil que se tiene que administrar variará dependiendo de la edad, peso y animal vacunado, el modo y vía de administración y el tipo de patógeno contra el que se busca la vacunación. La vacuna puede comprender cualquier dosis de bacterias, suficiente para inducir una respuesta inmune. Son dosis muy adecuadas, por ejemplo, dosis que varían entre 10^{3} y 10^{10} bacterias. Son incluso más preferidas las dosis entre 10^{6} y 10^{9} bacterias.
Opcionalmente, se pueden añadir a la vacuna uno o más compuestos que tengan actividad adyuvante. Los adyuvantes son estimulantes no específicos del sistema inmune. Estos mejoran la respuesta inmune del hospedador a la vacuna. Los ejemplos de adyuvantes conocidos en la técnica son adyuvante Completo e Incompleto de Freund, vitamina B, polímeros de bloque no iónicos, muramildipéptidos, ISCOM (complejos estimulantes inmunes, véase, por ejemplo, la Patente Europea EP 109942), Saponinas, aceite mineral, aceite vegetal y adyuvantes de Carbopol; son especialmente adecuados para aplicación en la mucosa, por ejemplo, la toxina termolábil (LT) de E. coli o la toxina de Cholera (CT). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio u óxido de aluminio, emulsiones de aceite (por ejemplo, de Bayol F^{(R)} o Marcol 52^{(R)}), saponinas o solubilizado de vitamina E. Por lo tanto, en una forma preferida, las vacunas de acuerdo con la presente invención comprenden un adyuvante.
Otros ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención incluyen estabilizadores tales como SPAG, carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, agentes que contienen proteína tales como suero bovino o leche desnatada y tampones (por ejemplo, tampón fosfato). La vacuna es muy adecuada para liofilización o secado por pulverización especialmente cuando se añaden tales estabilizantes a la vacuna. Por lo tanto, en una forma más preferida, la vacuna está en una forma liofilizada o secada por pulverización.
Para administración a animales o seres humanos, la vacuna de acuerdo con la presente invención se puede suministrar, entre otras maneras, por vía intranasal, mediante pulverización, por vía intradérmica, subcutánea, oral, mediante aerosol o por vía intramuscular. Los métodos preferidos por motivos de conveniencia son administración mediante pulverización, administración intranasal y administración oral. Para aplicación a aves de corral, son adecuadas adicionalmente las administraciones en la membrana del ala y en gotas oftálmicas.
Otra realización más de la invención se refiere a cepas de Salmonella atenuadas de acuerdo con la invención para uso en una vacuna.
Una realización adicional de la invención se refiere a cepas de Salmonella atenuadas de acuerdo con la invención para uso en la fabricación de una vacuna para combatir la infección por Salmonella.
La invención también se refiere a métodos para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención. Tales métodos comprenden la mezcla de bacterias de Salmonella atenuadas de acuerdo con la invención o material antigénico de las mismas y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Construcción de un mutante recA de S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261
Se clonaron y secuenciaron el locus completo de recA y las regiones flanqueantes, de aproximadamente 4 kb, de S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261. (Los métodos usados para la clonación fueron métodos convencionales como los descritos por Maniatis/Sambrook (anteriormente incorporados como referencia), los genes RecA se detectaron como se ha descrito por Lloyd, West y Kowalczykowski (anteriormente incorporados como referencia), y los métodos de secuenciación son métodos convencionales bien conocidos en la técnica). Basándose en esta secuencia, se amplificaron las dos regiones flanqueantes del gen recA mediante PCR; 1 kb cadena arriba de recA y 1 kb cadena abajo de recA. Estos dos fragmentos de PCR se conectaron entre sí mediante PCR de extensión por superposición de tal modo que la orientación de los fragmentos fue correcta. Este fragmento de PCR, que representa el locus recA con una supresión de la mayoría del gen recA, se clonó en un vector suicida de Salmonella pLD55 (resistente a ampicilina y tetraciclina) en Escherichia coli S 17.1 lambda-pir. Esta cepa se usó para intercambio alélico para preparar una cepa mutante de recA limpia, sin marcador, de S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261, como se describe más adelante. Por medio de conjugación, la construcción con supresión de recA en pLD55 se transfirió desde E. coli a S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261. Ya que este plásmido no se replica en Salmonella, las colonias de S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261 resistentes a ampicilina tenían la construcción de supresión integrada en su cromosoma mediante recombinación homóloga en el locus recA. Esto se comprobó mediante PCR usando diferentes conjuntos de cebadores. En una segunda etapa de recombinación intracromosómica espontánea entre regiones de ADN de recA, se escinden el pLD55 y el ADN flanqueante, lo cual conduce a colonias sensibles a ampicilina y tetraciclina y al mismo tiempo a la formación de i) un locus recA de tipo silvestre o ii) un locus recA mutado que contiene la supresión como se ha descrito anteriormente. Varias de las colonias sensibles a ampicilina y tetraciclina se analizaron en relación con su locus recA por medio de PCR: el locus recA de tipo silvestre dio un fragmento de 1,4 kb y el locus recA suprimido un fragmento de 0,4 kb. Dos de las 16 colonias mostraron el locus recA suprimido para Salmonella gallinarum y se confirmó que eran mutantes recA mediante análisis de secuencia del fragmento de PCR de recA y por su mayor sensibilidad a la radiación UV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Ensayo de vacunación
La eficacia contra la cepa parental de S. enteritidis 9R y el mutante de recA 9R CBS 108964 se ensayó en un experimento de exposición en gallinas ponedoras. Se usaron tres grupos de 15 gallinas no vacunadas previamente. Un grupo se vacunó por vía intramuscular con la cepa 9R (1,3 x 10^{7} UFC/dosis), un grupo se vacunó con el mutante de recA (8,4 x 10^{6} UFC/dosis) y el tercer grupo se usó como control. Todas las gallinas se infectaron por exposición con una cepa de S. enteritidis PT4 resistente a ácido nalidíxico a las 10 semanas de edad (1,0 x 10^{8} UFC) por vía oral. Dos semanas después de la exposición, todas las gallinas se sometieron a necropsia y se cultivaron bazos, torundas de las cloacas y contenidos del ciego para la cepa de exposición. Se realizó inoculación directa en placas de Agar Verde Brillante que contenían ácido nalidíxico (BGA) y siembra en placas después del enriquecimiento con agua de peptona tamponada que contenía ácido nalidíxico. Se confirmó la identidad de aislados de S. enteritidis mediante aglutinación con antisuero específico para flagelo.
Animales
Se obtuvieron ponedoras comerciales, de 6 semanas de edad de una población libre de Salmonella.
Resultados
Como se muestra en la tabla 1, las velocidades de colonización de S. enteritidis de bazo y cloaca fueron altamente reducidas tanto en el grupo de 9R como en el de 9RrecA cuando se compararon con controles no vacunados. Por lo tanto, se puede concluir que la eficacia de las vacunas basadas tanto en 9R como en 9RrecA es totalmente comparable.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
1

Claims (6)

1. Vacuna para combatir la infección por Salmonella que comprende una cepa de Salmonella atenuada viva que comprende una primera mutación atenuante, comprendiendo adicionalmente dicha cepa de Salmonella atenuada una mutación que impide a la cepa preparar una proteína RecA funcional, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha cepa pertenece a cualquiera de las cepas en el grupo que consiste en S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261.
2. Vacuna de acuerdo con la Reivindicación 1, que se caracteriza porque la cepa comprende adicionalmente al menos un gen heterólogo que codifica un antígeno de un virus o microorganismo patógeno para aves de corral.
3. Vacuna de acuerdo con la Reivindicación 2, que se caracteriza porque el virus o microorganismo se selecciona del grupo que consiste en virus de la Bronquitis Infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (Gumboro), agente de Anemia del pollo, Reovirus Aviar, Mycoplasma gallisepticum, virus de la Rinotraqueítis del Pavo, Haemophilus paragallinarum (Coryza), Poxvirus del Pollo, virus de la Encefalomielitis Aviar, especies de Eimeria, Pasteurella multocida, Mycoplasma synoviae, especies de Salmonella, Ornithobacterium rhinotracheale y E. coli.
4. Método para la preparación de una vacuna para combatir la infección por Salmonella, que se caracteriza porque dicho método comprende la mezcla de una cepa de Salmonella mutada en RecA como se define en la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Cepa de Salmonella atenuada viva mutada en RecA como se define en la reivindicación 1 para uso en una vacuna para combatir la infección por Salmonella.
6. Uso de una cepa de Salmonella atenuada viva mutada en RecA como se define en la reivindicación 1 en la fabricación de una vacuna para combatir la infección por Salmonella.
ES01996389T 2000-11-16 2001-11-15 Vacuna contra la salmonella. Expired - Lifetime ES2316492T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00204022 2000-11-16
EP00204022 2000-11-16
EP00204387 2000-12-08
EP00204387 2000-12-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2316492T3 true ES2316492T3 (es) 2009-04-16

Family

ID=26072856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01996389T Expired - Lifetime ES2316492T3 (es) 2000-11-16 2001-11-15 Vacuna contra la salmonella.

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7045122B2 (es)
EP (1) EP1345621B1 (es)
JP (1) JP2004513646A (es)
AT (1) ATE413888T1 (es)
AU (1) AU2002217043A1 (es)
CA (1) CA2429120C (es)
DE (1) DE60136563D1 (es)
ES (1) ES2316492T3 (es)
HU (1) HUP0302612A3 (es)
WO (1) WO2002040046A1 (es)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7695725B2 (en) * 2003-02-06 2010-04-13 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
MXPA05008340A (es) * 2003-02-06 2006-03-13 Cerus Corp Microbios de vida libre modificados, composiciones de vacuna y metodos de uso de los mismos.
US7842289B2 (en) 2003-12-24 2010-11-30 Aduro Biotech Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof
WO2005092372A2 (en) * 2004-02-06 2005-10-06 Cerus Corporation Modified bacillus anthracis vaccine compositions and methods of use thereof
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
WO2008147847A1 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Baylor College Of Medicine Immune complex vaccination as a strategy to enhance immunity in the elderly and other immune compromised populations
KR101123390B1 (ko) * 2009-03-30 2012-03-23 서울대학교산학협력단 약독화된 살모넬라 생백신 및 이의 제조방법
WO2011019134A2 (ko) * 2009-08-11 2011-02-17 전북대학교산학협력단 살모넬라 변이균주를 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물
BRPI1000173A2 (pt) * 2010-01-04 2011-08-23 Fundacao De Amparo A Pesquisa cepa bacteriana modificada e uso da mesma
CN102586489B (zh) * 2010-04-09 2013-09-18 山东农业大学 Pcr结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中禽贫血病病毒感染
WO2012123269A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Immunogenic compositions and methods for their use
KR101856736B1 (ko) * 2016-02-29 2018-05-11 (주)비손바이오로직스 가금티푸스 및 살모넬라증 예방을 위한 내독소가 감소된 살모넬라 3가 불활화 백신 조성물
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CN109486714B (zh) * 2018-12-07 2020-08-04 扬州大学 一种鸡伤寒沙门氏菌弱毒分离株及其应用
CN110218668B (zh) * 2019-05-21 2020-04-03 扬州大学 一种惰性载体沙门氏菌及其潜在应用
CN110257276B (zh) * 2019-05-21 2020-03-24 扬州大学 一种惰性载体大肠杆菌及其潜在应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5124153A (en) * 1987-08-24 1992-06-23 University Of Tennessee Research Corp. Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products
CA2096529C (en) * 1990-11-21 2003-01-21 Roy Curtiss, Iii Recombinant avirulent salmonella antifertility vaccines
JPH07206705A (ja) * 1993-11-03 1995-08-08 American Cyanamid Co 生インオボ（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチン
US5997881A (en) 1995-11-22 1999-12-07 University Of Maryland, Baltimore Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A
GB9711964D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Medical Res Council Live attenuated vaccines
GB2434636B (en) 2004-11-10 2009-03-18 Martin Professional As Method and apparatus for project light with gel

Also Published As

Publication number Publication date
CA2429120A1 (en) 2002-05-23
CA2429120C (en) 2012-03-13
AU2002217043A1 (en) 2002-05-27
DE60136563D1 (de) 2008-12-24
HUP0302612A3 (en) 2004-10-28
HUP0302612A2 (hu) 2003-11-28
EP1345621B1 (en) 2008-11-12
WO2002040046A1 (en) 2002-05-23
JP2004513646A (ja) 2004-05-13
US7045122B2 (en) 2006-05-16
US20040052802A1 (en) 2004-03-18
ATE413888T1 (de) 2008-11-15
EP1345621A1 (en) 2003-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2316492T3 (es) Vacuna contra la salmonella.
ES2761693T3 (es) Composiciones y métodos para mejorar las respuestas inmunitarias a Eimeria
US20080069843A1 (en) Salmonella vaccine
JP2002521345A (ja) 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン
JP2009531029A (ja) 弱毒化サルモネラ生ワクチン
US8431138B2 (en) In ovo vaccination of Campylobacter in avian species
BRPI0621489A2 (pt) cepa mutante atenuada de bactéria infectante de espécies veterinárias, vacina para imunização de espécies veterinárias contra uma infecção bacteriana, método para imunizar uma espécie veterinária contra uma infecção bacteriana e uso de uma cepa mutante atenuada
KR100602460B1 (ko) 백신용 약독화 생박테리아
MXPA01007747A (es) Composiciones y metodos para el tratamiento y prevencion de la infeccion bacteriana patogena basada en el papel esencial de metilacion del adn en la virulencia bacteriana.
US20090263419A1 (en) Live attenuated bacterial vaccine
US20220395565A1 (en) Attenuated salmonella gallinarum mutant strains and uses thereof
ES2358595T3 (es) Vacunas de bacterias vivas atenuadas.
Peighambari Development of a live attenuated vaccine against Escherichia coli respiratory infection in broiler chickens
Barrow Department of Microbiology Institute for Animal Health, Houghton Laboratory Houghton, Huntingdon Cambridgeshire, PE17 2DA United Kingdom
CN1325731A (zh) 用于疫苗的活减毒细菌
KR20140053475A (ko) rfaH 결손형 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 상기 균주를 이용한 식중독 예방 백신 조성물