ES2316492T3 - Vacuna contra la salmonella. - Google Patents
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Abstract
Vacuna para combatir la infección por Salmonella que comprende una cepa de Salmonella atenuada viva que comprende una primera mutación atenuante, comprendiendo adicionalmente dicha cepa de Salmonella atenuada una mutación que impide a la cepa preparar una proteína RecA funcional, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha cepa pertenece a cualquiera de las cepas en el grupo que consiste en S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261.
Description
Vacuna contra la Salmonella.
La presente invención se refiere a una cepa de
Salmonella atenuada que comprende una primera mutación
atenuante, a su uso en vacunas, a vacunas basadas en esta cepa y a
métodos para la preparación de tales vacunas. Las bacterias del
género Salmonella son muy conocidas por su patogenicidad
tanto en el hombre como en animales. Sólo en los Estados Unidos, el
número de seres humanos que padecen infecciones por
Salmonella cada año excede los dos millones de casos. En la
mayoría de los casos, la infección está causada por alimentos
contaminados. Las fuentes de infección bien conocidas son huevos
(tanto de patos como de pollos), productos que contienen huevos y
carne de aves de corral y cerdo no cocida suficientemente.
Especialmente en bebés, niños pequeños, personas mayores y
pacientes con insuficiencias inmunes, la capacidad de enfrentarse a
tales infecciones es baja. En estos grupos, el índice de mortalidad
anual debido a infecciones por Salmonella es elevado.
Durante las últimas décadas, la cría de animales a gran escala más
eficaz ha conducido a un aumento enorme en la densidad de animales.
Como resultado, se observa un aumento en el número de infecciones
animales y posteriormente en las infecciones humanas causadas por
alimentos infectados. Está claro que los animales son la principal
fuente de infección por Salmonella. Esta fuente es muy
difícil de controlar. En primer lugar, las infecciones por
Salmonella en la mayoría de los casos no causan enfermedades
graves en animales adultos sanos; estos animales pueden ser
portadores de la bacteria durante un período prolongado. Durante
ese tiempo, esparcen la bacteria en los excrementos. Esto hace que
sea prácticamente imposible evitar la infección en los animales
jóvenes más vulnerables. En segundo lugar, muchas especies de
Salmonella colonizan varias especies hospedadoras
diferentes. Algunas de las especies de Salmonella causan
infecciones primarias en hospedadores específicos, mientras que
otras especies de Salmonella no están limitadas en absoluto.
Como especies de infección principales, S. typhi y
paratyphi están frecuentemente asociadas con la infección en
el hombre. S. dublin está relacionada con vacas, S.
abortus-equi causa abortos en caballos. S.
abortus-ovi causa abortos en ovejas. S.
choleraesuis es la causa de diarrea mortal en cerdos jóvenes.
S. typhimurium y S. enteritidis causan salmonelosis en
seres humanos, aves de corral, cerdos, vacas y roedores, S.
arizonae causa la enfermedad en pavos, mientras que S.
gallinarum causa salmonelosis sólo en aves de corral.
Está claro que existe la necesidad de vacunas
buenas, seguras y eficaces para combatir las diversas especies de
Salmonella. Actualmente, están disponibles en el mercado
varias vacunas de Salmonella atenuadas vivas. Muchas de las
cepas que son adecuadas para uso en una vacuna viva están atenuadas
hasta un nivel que las hace prácticamente no virulentas. Dos
ejemplos llamativos de tales cepas no virulentas son la cepa de
Salmonella gallinarum 9R y la cepa de Salmonella
typhimurium SL3261.
La cepa de Salmonella gallinarum 9R se
describió hace 44 años por Smith (J. Hyg. Camb., 54:
419-432 (1956)). Se sabe que esta cepa altamente
atenuada tiene al menos una mutación en un gen implicado en la
síntesis de los O-polisacáridos de las células,
conduciendo a una mutación Lisa\rightarrowRugosa. La cepa 9R se ha
usado como una cepa Rugosa de referencia desde entonces (véase, por
ejemplo, Cameron, C. M. et al., Onderstepoort J. Vet. Res.
39(3), 139-146 (1972)). Esta cepa se puede
administrar a pollos incluso en una dosis de 10^{9} bacterias sin
causar la muerte de ningún pollo, mientras que una dosis que
comprende 10^{3} bacterias de tipo silvestre mata a todos los
animales. La cepa de Salmonella typhimurium SL3261 se ha
descrito hace 19 años por Hoiseth, S. y Stocker, B. A. D. (Nature
291: 238-239 (1981)) y está disponible con el número
de Depósito SGSC 439, Salmonella Genetic Stock Centre,
University of Calgary, Alberta, Canadá T2N 1N4.
Se sabe que esta cepa tiene una mutación
altamente atenuante en la ruta de síntesis aromática. Esta cepa se
puede administrar en una dosis de incluso 10^{6} bacterias a
ratones susceptibles sin causar la muerte de ningún animal,
mientras que la DL_{50} de la cepa parental para estos ratones es
menor de 20 bacterias.
Tales cepas de Salmonella se han
apreciado desde hace mucho tiempo por su carácter altamente
atenuado. Éstas están tan gravemente atenuadas que se describen en
la bibliografía como no virulentas. Por lo tanto, han sido las
cepas de elección para vacunas de Salmonella atenuadas
vivas.
En principio, existe una relación clara entre el
nivel de virulencia y el nivel de inmunidad inducida. En general,
las cepas con la mayor virulencia inducen los mayores niveles de
inmunidad: los animales que sobreviven a infecciones con cepas de
Salmonella de tipo silvestre con frecuencia crean una
inmunidad de efecto prolongado. Por otra parte, las cepas que no
inducen ninguna patogénesis, las cepas no virulentas, son las más
deseables para uso en vacunas, pero tales cepas con frecuencia no
son capaces de inducir un nivel de inmunidad suficientemente
elevado. Las cepas no virulentas de Salmonella anteriormente
descritas apenas son capaces de activar el sistema inmune hasta un
nivel suficiente.
Sin embargo, una desventaja pertinente de todas
las vacunas atenuadas vivas es que, en principio, pueden volver a
un nivel de virulencia de tipo silvestre mediante la recombinación
del gen mutado con ADN de bacterias que son portadoras de genes no
mutados tales como, por ejemplo, cepas de campo de tipo silvestre.
Tal suceso de recombinación puede tener lugar de diversos modos,
por ejemplo, mediante transfección, transducción o transformación.
Los genes que se sabe que tienen un papel en estos procesos de
recombinación se denominan genes rec. Uno de los genes rec
de importancia clave es el gen recA. Este gen codifica una
enzima RecA que está implicada en varias etapas del proceso de
recombinación. El gen recA y muchos otros genes rec se
han descrito, entre otros, por Lloyd, R. G. y Low, K. B.
("Escherichia coli and Salmonella", sec. ed., ASM
Press, ISBN
1-55581-0-845, párr.
119 págs. 2236-2255), por West, S. C. (Annu. Rev.
Biochem. 61: 603-640 (1992) y por Kowalczykowski,
S. C. et al. (Microbiol. Rev. 58:
401-465 (1994)).
401-465 (1994)).
Por lo tanto, parece tentador a primera vista,
cuando se contempla una vacuna atenuada viva segura, suprimir uno
de los genes rec. Tal supresión afecta gravemente a la
capacidad del ADN bacteriano de recombinarse. Sin embargo, también
se sabe que la supresión de los genes rec causa atenuación grave de
las cepas bacterianas de las que se ha suprimido. La supresión de,
por ejemplo, los genes recA o recBC en
Salmonella hace sensibles a los mutantes al estallido
oxidativo de los macrófagos, que conduce, entre otras cosas, a una
supresión significativa del crecimiento in vivo. Esto se ha
demostrado para Salmonella, por ejemplo, por Buchmeier, N.
A. et al., (Mol. Microbiol, 7: 933-936
(1993)) y es igualmente convincente para otros géneros bacterianos
tan poco relacionados con Salmonella como, por ejemplo,
Vibrio cholerae (Ketley et al., Infect. and Immun.
58: 1481-1484 (1990)).
Por tanto, cuando la supresión de un gen rec
pueda ser una ventaja para cepas virulentas, ciertamente se asumirá
que será una desventaja para las cepas no virulentas, tales como la
cepa de Salmonella gallinarum 9R y la cepa de Salmonella
typhimurium SL3261. Podría esperarse que estas cepas, conocidas
por ya estar afectadas altamente, no desencadenen ninguna respuesta
inmunológica después de retirar los genes rec. Esto podría explicar
por qué no se realizaron intentos para suprimir los genes Rec de
tales cepas ya atenuadas altamente, no virulentas, tales como S.
gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261, a pesar de su
larga historia.
Se señala que los mutantes dobles recA de
Salmonella como tales se conocen por Johnson (J. Bact. Mar.
1992, págs. 1911-1915). En particular se menciona un
mutante his-22 recA TR4871 en la Tabla 1.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar vacunas de Salmonella atenuadas vivas que sean
tanto seguras como eficaces. Sorprendentemente, ahora se ha
observado que la supresión del factor de virulencia RecA no afecta
adicionalmente a la capacidad de las cepas de Salmonella ya
atenuadas de activar adecuadamente el sistema inmune en comparación
con sus homólogas RecA positivas.
Por lo tanto, una realización de la invención
proporciona cepas de Salmonella atenuadas que ya comprenden
una primera mutación atenuante y que tienen como un elemento
característico que comprenden adicionalmente una mutación que
impide a estas cepas preparar una proteína RecA funcional.
Se entiende que las cepas atenuadas que ya
comprenden una primera mutación atenuante son cepas que tienen un
carácter atenuado suficientemente para usarse como una base para
vacunas atenuadas vivas debido a una atenuación ya existente. La
naturaleza de esa primera atenuación no es pertinente. Puede ser
cualquier mutación atenuante o la combinación de dos o más
mutaciones que tienen un carácter atenuado suficientemente para
hacer a la bacteria útil como base para una vacuna atenuada viva.
Solamente como un ejemplo puede ser, por ejemplo, una mutación
Rugosa, una mutación en la ruta de síntesis de histidina o purina o
una mutación en la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos.
Las mutaciones en el gen cra y las mutaciones crp/cya,
conocidas en la técnica, también son mutaciones adecuadas. También
son muy adecuadas como base para la producción de una bacteria RecA
negativa de acuerdo con la presente invención cepas de
Salmonella de vacunas conocidas.
Se entiende que las cepas que no son capaces de
preparar RecA funcional son cepas que o no preparan enzima RecA en
absoluto, o la preparan a un nivel que es insuficiente esencialmente
para conducir a sucesos de recombinación dirigidos por RecA. Esta
incapacidad para preparar RecA puede ser el resultado, entre otras
cosas, de una mutación o de supresión de una parte o todo el gen
recA, el promotor de recA o un gen implicado en la
síntesis de recA.
Las cepas de Salmonella de acuerdo con la
invención pertenecen a las especies Salmonella gallinarum o
Salmonella typhimurium.
En una forma más preferida de esta realización,
la cepa de Salmonella gallinarum es Salmonella
gallinarum 9R.
Una forma incluso más preferida de esta
realización se refiere a la cepa de Salmonella gallinarum
9R-RecA^{-} de la que se deposita una muestra en
el Centraalbureau loor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK
Baarn, Países Bajos, con el número de depósito CBS 108964.
En otra forma más preferida de esta realización,
la cepa de Salmonella typhimurium es Salmonella
typhimurium SL3261.
Un modo posible de preparar el gen recA o
cualquiera de los otros genes conocidos implicados en la biosíntesis
de RecA no funcional es por medio de métodos clásicos tales como el
tratamiento de bacterias de tipo silvestre con agentes mutagénicos
tales como análogos de bases, tratamiento con luz ultravioleta o
tratamiento con temperatura (Anderson, P. 1995. Mutagenesis, págs.
31-58 en Methods in Cell Biology 48. H. F. Epstein y
D. C. Shakes (Eds)). Otros métodos para preparar mutantes RecA
negativos de diversas bacterias de las que el tipo silvestre es
RecA positivo, se han descrito entre otros por Liu, S. L. et
al. (Infect. Immun. 1988 Aug; 56(8):
1967-73), Haas, R. et al., (Mol. Microbiol.
1993 May; 8(4): 763-60) y Graf, J. et
al. (J. Bacteriol. 1994 Nov; 176(22):
6986-91).
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Los mutantes recA negativos se pueden
seleccionar fácilmente debido a su sensibilidad mucho mayor a la
radiación UV. Un modo clásico de detectar las bacterias mutantes
entre las no mutadas es mediante réplica en placa. Esta técnica
comienza con una placa de agar cubierta con colonias bacterianas que
se han sometido a tratamiento mutagénico. Se prepara una réplica de
esta placa en una segunda placa de agar. Después, esta placa se
somete a dosis elevadas de radiación UV. Las colonias que no crecen
más después del tratamiento de radiación son colonias que tienen
una mutación en un gen rec. Después, se pueden seleccionar y
cultivar sus réplicas de colonias vivas en la placa original para,
por ejemplo, propósitos de vacunas.
Habitualmente se desconoce la naturaleza exacta
de la mutación causada mediante técnicas de mutación clásicas. Esta
puede ser, por ejemplo, una mutación puntual que puede, aunque no es
probable que suceda, volver eventualmente al tipo silvestre. Por lo
tanto, la mutagénesis con transposones es una buena alternativa. La
mutación mediante mutagénesis con transposón también es una técnica
de mutagénesis bien conocida en la técnica. Ésta es una mutación
que se consigue en un sitio localizado en el cromosoma. La
tecnología de ADN recombinante ofrece la posibilidad de introducir
una mutación en un sitio predeterminado, deliberadamente en lugar de
aleatoriamente. Tal mutación puede ser una inserción, una
supresión, un reemplazo de un nucleótido por otro o una combinación
de los mismos, con la única condición de que el gen mutado ya no
codifica RecA funcional. Tal mutación se puede realizar, por
ejemplo, mediante supresión de varios pares de bases. Incluso
supresiones muy pequeñas tales como tramos de 10 pares de bases
pueden hacer que el gen recA codifique un RecA no funcional.
Incluso la supresión de un único par de bases puede conducir a RecA
no funcional, ya que como resultado de tal mutación, los otros
pares de bases ya no están en la fase de lectura correcta. Cada
supresión o inserción de un número de pares de bases que no sea
múltiplo de 3 causa tal desplazamiento de fase. Más preferiblemente,
se retira un tramo más largo, por ejemplo, 100 pares de bases. Aún
más preferiblemente, se suprime todo el gen recA.
Todas las técnicas de ADN recombinante para la
construcción de mutantes recA negativos son técnicas
convencionales bien conocidas. Estas se refieren a la clonación del
gen recA, modificación de la secuencia de genes mediante
mutagénesis dirigida, digestión con enzimas de restricción seguida
de re-ligamiento o estrategias de
PCR, y al reemplazo posterior del gen recA de tipo silvestre
por el gen mutante (intercambio alélico o reemplazo alélico). En la
técnica se conocen técnicas de ADN recombinante convencionales tales
como clonación del gen recA en un plásmido, digestión del
gen con una enzima de restricción, seguido de tratamiento con
endonucleasa, re-ligamiento y recombinación
homóloga en la cepa hospedadora, y se han descrito, entre otros, en
Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a
laboratory manual. ISBN
0-87969-309-6). Las
mutaciones dirigidas se pueden realizar, por ejemplo, por medio de
mutagénesis dirigida in vitro usando el kit Transformer®
vendido por Clontech. Las técnicas de PCR se describen ampliamente
en (Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual.
ISBN 0-87969-447-5
(1995)).
Dada la gran cantidad de vacunas suministradas
hoy en día tanto a mascotas como a animales de granja, está claro
que sería deseable la administración combinada de varias vacunas,
aunque sólo sea por motivos de reducir los costes de vacunación.
Por lo tanto, es muy atractivo usar bacterias atenuadas vivas como
un vehículo recombinante de genes heterólogos, que codifiquen
antígenos seleccionados de otros microorganismos patógenos o virus.
La administración de tal vehículo recombinante tiene la ventaja de
que se induce la inmunidad contra dos o más enfermedades al mismo
tiempo. Las bacterias atenuadas vivas para uso en una vacuna de
acuerdo con la presente invención proporcionan vehículos muy
adecuados para genes heterólogos. En principio, tales genes
heterólogos se pueden insertar en el genoma bacteriano en cualquier
sitio no esencial.
Por lo tanto, una forma todavía incluso más
preferida de esta realización se refiere a bacterias de acuerdo con
la invención en las que se inserta un gen heterólogo. Tal gen
heterólogo puede ser, como se ha mencionado anteriormente, por
ejemplo, un gen que codifica un antígeno seleccionado de otros
microorganismos patógenos o virus. Tales genes se pueden obtener,
por ejemplo, a partir de herpesvirus patógenos (por ejemplo, los
genes que codifican las proteínas estructurales de herpesvirus),
Retrovirus (por ejemplo, la proteína de la envuelta gp160),
adenovirus y similares. También se puede obtener un gen heterólogo a
partir de bacterias patógenas. Como ejemplo, los genes que
codifican toxinas bacterianas tales como toxinas de
Actinobacillus pleuropneumoniae, toxinas de
Clostridium, proteínas de la membrana externa y similares son
genes heterólogos bacterianos muy adecuados. Adicionalmente, los
genes heterólogos de diversos parásitos tales como, por ejemplo,
Eimeria son candidatos muy atractivos para clonación en un
vector de Salmonella atenuado vivo de acuerdo con la
invención. Otra posibilidad es insertar un gen que codifique una
proteína implicada en activar al sistema inmune, tal como una
interleucina, Factor de Necrosis Tumoral o un interferón, u otro gen
implicado en la regulación inmune. En la forma más preferida de
esta realización, el gen heterólogo codifica un antígeno de un
microorganismo o virus que se selecciona del grupo que consiste en
virus de la Bronquitis Infecciosa, virus de la Enfermedad de
Newcastle, Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (Gumboro), agente de
Anemia del Pollo, Reovirus Aviar, Mycoplasma gallisepticum,
virus de la Rinotraqueitis del Pavo, Haemophilus
paragallinarum (Coryza), Poxvirus del Pollo, virus de la
Encefalomielitis Aviar, especies de Eimeria, Pasteurella
multocida, Mycoplasma synoviae, especies de
Salmonella, Ornithobacterium rhinotracheale y E.
coli.
El uso del gen recA como un sitio de
inserción tiene la ventaja de que no hay necesidad de encontrar un
nuevo sitio de inserción para el gen heterólogo y al mismo tiempo el
gen recA se inactiva y se puede expresar el gen heterólogo
recientemente introducido (de acuerdo con los genes bacterianos
homólogos). La construcción de tales vehículos recombinantes se
puede realizar rutinariamente, usando técnicas de biología molecular
convencionales tales como intercambio alélico.
Por tanto, en una forma preferida de esta
realización, el gen heterólogo se inserta en el gen recA. El
gen heterólogo se puede insertar en cualquier lugar en el gen
recA o se puede insertar en el sitio del gen recA
siempre que este gen se haya suprimido parcialmente o
completamente.
La invención se refiere a vacunas para combatir
la infección por Salmonella que comprenden una cepa atenuada
de Salmonella como se ha descrito anteriormente y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente
aceptable puede ser tan sencillo como el agua, pero también puede
comprender, por ejemplo, el líquido de cultivo en el que se
cultivaron las bacterias. Otro vehículo adecuado es, por ejemplo,
una solución de concentración de sal fisiológica.
La dosis útil que se tiene que administrar
variará dependiendo de la edad, peso y animal vacunado, el modo y
vía de administración y el tipo de patógeno contra el que se busca
la vacunación. La vacuna puede comprender cualquier dosis de
bacterias, suficiente para inducir una respuesta inmune. Son dosis
muy adecuadas, por ejemplo, dosis que varían entre 10^{3} y
10^{10} bacterias. Son incluso más preferidas las dosis entre
10^{6} y 10^{9} bacterias.
Opcionalmente, se pueden añadir a la vacuna uno
o más compuestos que tengan actividad adyuvante. Los adyuvantes son
estimulantes no específicos del sistema inmune. Estos mejoran la
respuesta inmune del hospedador a la vacuna. Los ejemplos de
adyuvantes conocidos en la técnica son adyuvante Completo e
Incompleto de Freund, vitamina B, polímeros de bloque no iónicos,
muramildipéptidos, ISCOM (complejos estimulantes inmunes, véase,
por ejemplo, la Patente Europea EP 109942), Saponinas, aceite
mineral, aceite vegetal y adyuvantes de Carbopol; son especialmente
adecuados para aplicación en la mucosa, por ejemplo, la toxina
termolábil (LT) de E. coli o la toxina de Cholera
(CT). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo, hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio u óxido de aluminio, emulsiones de
aceite (por ejemplo, de Bayol F^{(R)} o Marcol 52^{(R)}),
saponinas o solubilizado de vitamina E. Por lo tanto, en una forma
preferida, las vacunas de acuerdo con la presente invención
comprenden un adyuvante.
Otros ejemplos de vehículos o diluyentes
farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención
incluyen estabilizadores tales como SPAG, carbohidratos (por
ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano),
proteínas tales como albúmina o caseína, agentes que contienen
proteína tales como suero bovino o leche desnatada y tampones (por
ejemplo, tampón fosfato). La vacuna es muy adecuada para
liofilización o secado por pulverización especialmente cuando se
añaden tales estabilizantes a la vacuna. Por lo tanto, en una forma
más preferida, la vacuna está en una forma liofilizada o secada por
pulverización.
Para administración a animales o seres humanos,
la vacuna de acuerdo con la presente invención se puede suministrar,
entre otras maneras, por vía intranasal, mediante pulverización,
por vía intradérmica, subcutánea, oral, mediante aerosol o por vía
intramuscular. Los métodos preferidos por motivos de conveniencia
son administración mediante pulverización, administración
intranasal y administración oral. Para aplicación a aves de corral,
son adecuadas adicionalmente las administraciones en la membrana
del ala y en gotas oftálmicas.
Otra realización más de la invención se refiere
a cepas de Salmonella atenuadas de acuerdo con la invención
para uso en una vacuna.
Una realización adicional de la invención se
refiere a cepas de Salmonella atenuadas de acuerdo con la
invención para uso en la fabricación de una vacuna para combatir la
infección por Salmonella.
La invención también se refiere a métodos para
la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención. Tales
métodos comprenden la mezcla de bacterias de Salmonella
atenuadas de acuerdo con la invención o material antigénico de las
mismas y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonaron y secuenciaron el locus completo de
recA y las regiones flanqueantes, de aproximadamente 4 kb, de S.
gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261. (Los métodos
usados para la clonación fueron métodos convencionales como los
descritos por Maniatis/Sambrook (anteriormente incorporados como
referencia), los genes RecA se detectaron como se ha descrito por
Lloyd, West y Kowalczykowski (anteriormente incorporados como
referencia), y los métodos de secuenciación son métodos
convencionales bien conocidos en la técnica). Basándose en esta
secuencia, se amplificaron las dos regiones flanqueantes del gen
recA mediante PCR; 1 kb cadena arriba de recA y 1 kb cadena abajo
de recA. Estos dos fragmentos de PCR se conectaron entre sí mediante
PCR de extensión por superposición de tal modo que la orientación
de los fragmentos fue correcta. Este fragmento de PCR, que
representa el locus recA con una supresión de la mayoría del gen
recA, se clonó en un vector suicida de Salmonella pLD55
(resistente a ampicilina y tetraciclina) en Escherichia coli
S 17.1 lambda-pir. Esta cepa se usó para
intercambio alélico para preparar una cepa mutante de recA limpia,
sin marcador, de S. gallinarum 9R y S. typhimurium
SL3261, como se describe más adelante. Por medio de conjugación, la
construcción con supresión de recA en pLD55 se transfirió desde
E. coli a S. gallinarum 9R y S. typhimurium
SL3261. Ya que este plásmido no se replica en Salmonella, las
colonias de S. gallinarum 9R y S. typhimurium SL3261
resistentes a ampicilina tenían la construcción de supresión
integrada en su cromosoma mediante recombinación homóloga en el
locus recA. Esto se comprobó mediante PCR usando diferentes
conjuntos de cebadores. En una segunda etapa de recombinación
intracromosómica espontánea entre regiones de ADN de recA, se
escinden el pLD55 y el ADN flanqueante, lo cual conduce a colonias
sensibles a ampicilina y tetraciclina y al mismo tiempo a la
formación de i) un locus recA de tipo silvestre o ii) un locus recA
mutado que contiene la supresión como se ha descrito anteriormente.
Varias de las colonias sensibles a ampicilina y tetraciclina se
analizaron en relación con su locus recA por medio de PCR: el locus
recA de tipo silvestre dio un fragmento de 1,4 kb y el locus recA
suprimido un fragmento de 0,4 kb. Dos de las 16 colonias mostraron
el locus recA suprimido para Salmonella gallinarum y se
confirmó que eran mutantes recA mediante análisis de secuencia del
fragmento de PCR de recA y por su mayor sensibilidad a la radiación
UV.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia contra la cepa parental de S.
enteritidis 9R y el mutante de recA 9R CBS 108964 se ensayó en
un experimento de exposición en gallinas ponedoras. Se usaron tres
grupos de 15 gallinas no vacunadas previamente. Un grupo se vacunó
por vía intramuscular con la cepa 9R (1,3 x 10^{7} UFC/dosis), un
grupo se vacunó con el mutante de recA (8,4 x 10^{6} UFC/dosis) y
el tercer grupo se usó como control. Todas las gallinas se
infectaron por exposición con una cepa de S. enteritidis PT4
resistente a ácido nalidíxico a las 10 semanas de edad (1,0 x
10^{8} UFC) por vía oral. Dos semanas después de la exposición,
todas las gallinas se sometieron a necropsia y se cultivaron bazos,
torundas de las cloacas y contenidos del ciego para la cepa de
exposición. Se realizó inoculación directa en placas de Agar Verde
Brillante que contenían ácido nalidíxico (BGA) y siembra en placas
después del enriquecimiento con agua de peptona tamponada que
contenía ácido nalidíxico. Se confirmó la identidad de aislados de
S. enteritidis mediante aglutinación con antisuero específico
para flagelo.
Se obtuvieron ponedoras comerciales, de 6
semanas de edad de una población libre de Salmonella.
Como se muestra en la tabla 1, las velocidades
de colonización de S. enteritidis de bazo y cloaca fueron
altamente reducidas tanto en el grupo de 9R como en el de 9RrecA
cuando se compararon con controles no vacunados. Por lo tanto, se
puede concluir que la eficacia de las vacunas basadas tanto en 9R
como en 9RrecA es totalmente comparable.
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Claims (6)
1. Vacuna para combatir la infección por
Salmonella que comprende una cepa de Salmonella
atenuada viva que comprende una primera mutación atenuante,
comprendiendo adicionalmente dicha cepa de Salmonella
atenuada una mutación que impide a la cepa preparar una proteína
RecA funcional, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la
que dicha cepa pertenece a cualquiera de las cepas en el grupo que
consiste en S. gallinarum 9R y S. typhimurium
SL3261.
2. Vacuna de acuerdo con la Reivindicación 1,
que se caracteriza porque la cepa comprende adicionalmente
al menos un gen heterólogo que codifica un antígeno de un virus o
microorganismo patógeno para aves de corral.
3. Vacuna de acuerdo con la Reivindicación 2,
que se caracteriza porque el virus o microorganismo se
selecciona del grupo que consiste en virus de la Bronquitis
Infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, Enfermedad
Infecciosa de la Bolsa (Gumboro), agente de Anemia del pollo,
Reovirus Aviar, Mycoplasma gallisepticum, virus de la
Rinotraqueítis del Pavo, Haemophilus paragallinarum (Coryza),
Poxvirus del Pollo, virus de la Encefalomielitis Aviar, especies de
Eimeria, Pasteurella multocida, Mycoplasma
synoviae, especies de Salmonella, Ornithobacterium
rhinotracheale y E. coli.
4. Método para la preparación de una vacuna para
combatir la infección por Salmonella, que se
caracteriza porque dicho método comprende la mezcla de una
cepa de Salmonella mutada en RecA como se define en la
reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Cepa de Salmonella atenuada viva
mutada en RecA como se define en la reivindicación 1 para uso en una
vacuna para combatir la infección por Salmonella.
6. Uso de una cepa de Salmonella atenuada
viva mutada en RecA como se define en la reivindicación 1 en la
fabricación de una vacuna para combatir la infección por
Salmonella.
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