KR101123390B1 - 약독화된 살모넬라 생백신 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살모넬라의 염색체 DNA로부터 ruvB 유전자를 제거하거나 ruvB 유전자를 파쇄시킴으로써 얻어지는 약독화된 살모넬라 생백신 및 그 제조방법에 관한 것으로, 백신 예방 접종으로 인한 숙주의 피해가 없으며, 병원성 살모넬라 균주에 대해 완전한 숙주 보호능을 발휘한다.

ruvB, 백신, 살모넬라, 생백신, 약독화

Description

약독화된 살모넬라 생백신 및 이의 제조방법{Live-attenuated Salmonella vaccine and method for production of it}

본 발명은 살모넬라의 염색체 DNA로부터 ruvB 유전자를 제거하거나 ruvB 유전자를 파쇄시킴으로써 얻어지는 약독화된 살모넬라 생백신 및 그 제조방법에 관한 것이다.

살모넬라(Salmonella)는 그람 음성의 통성 혐기성 세균으로, 간균 형태를 나타내는 균인데, 주로 음식물의 섭취를 통해 인간이나 동물의 숙주 내로 들어오며, 살모넬로시스(Salmonellosis)를 유발한다.

살모넬로시스는 살모넬라균 속(屬)의 세균에 의하여 일어나는 질병으로, 포유동물, 조류, 파충류, 각종 애완동물 및 가축 등에 감염하여 위염, 설사 및 패혈증 등의 질병을 일으킨다. 또한, 사람에게도 감염하여 위염, 장티푸스 등의 심각한 질병을 일으키기도 한다.

살모넬라 감염은 전 세계적으로 의학 및 수의학 분야의 해결해야 할 문제로 남아 있으며, 식품 산업에 있어서도 식품 위생과 직결되어 심각한 문제로 받아들여지고 있다.

살모넬라 감염은 주로 살모넬라균이 함유된 유제품, 계란 및 육류 등 가축 유래의 식품이나 가축들의 분뇨에 의해 오염된 물을 통하여 발생하며, 식품을 통하여 살모넬라 감염이 이루어지면 48시간 이내에 위염이 발생한다. 살모넬라 감염은 위생시설이 현대화되어 있는 선진국에서도 일 년에 약 1,400,000건이 발생하고 있는 것으로 추정된다.

이와 같이 심각한 문제를 야기하는 살모넬라 감염의 조절, 치료 및 예방은 살모넬로시스로 인한 인간 또는 가축의 치사 문제를 해결할 수 있을 것이며, 가축 산업의 경제적 손실을 피할 수 있도록 해줄 것이다.

살모넬라로 인한 문제의 해결을 위해 여러 가지 연구가 시도되었는데, 그 중 하나로 사균 백신(killed vaccines)이다. 그런데 사균 백신의 경우, 인간이나 동물을 살모넬라 감염으로부터 어느 정도 보호해 주기는 하지만 그 결과가 일정하지 않은 단점이 있다.

또 다른 방법으로 비활성화 백신(inactivated vaccines)이 있는데, 이는 일반적으로 살모넬로시스로부터의 보호 능력이 적은 것으로 알려져 있다.

한편, 생균을 이용한 백신의 경우 앞서 언급한 방법들에 비해 여러 가지 장점이 있다. 먼저, 생균 백신은 항체반응의 유도뿐만 아니라 세포 매개 면역(cell-mediated immunity)의 유도를 가져옴으로써 보다 강화된 보호 능력을 가질 수 있게 하며, 경구를 통해 쉽게 백신 접종이 가능하기 때문에 주사 바늘의 오염 등의 문제 로부터 벗어날 수 있다.

또한, 여러 번의 접종이 필요한 기존 백신에 비해 생균 백신은 한 번의 접종만으로도 상당한 숙주 보호 능력을 가지며, 생균을 이용하기 때문에 백신의 생산 비용이 매우 절감된다.

그런데, 상기의 여러 장점을 가진 생균 백신은 시장에서는 실제로 거의 이용되지 않고 있는데, 이는 약독화된 변이균주(attenuated mutant strain)를 통한 백신이 항상 좋은 결과를 가져오지는 못하기 때문이다. 일 예로 가금류의 경우 aro- 또는 cAMP 변이균주를 통해 백신의 예방 접종이 되었는데, 예방 접종에도 불구하고 일부 가금류가 여전히 죽는 문제 또는 예방 접종으로 인한 감염으로 가금류가 죽는 문제 등 이 발생하였다.

한편, cya와 crp를 제거한 Megan VacI 균주(US Patents 5,389,368; US5,855,879; US5,855,880)는 조류의 백신으로 사용되었는데, 병원성 살모넬라균의 감염으로부터 죽는 조류의 수를 줄여주기는 하였지만, 이 역시도 충분한 보호를 제공하지는 못하였다(http : //www.meganhealth. com/meganvac . html).

따라서, 이러한 문제들을 해결하고 보다 향상된 기능을 가지는 생균 백신의 개발이 필요하다.

이에 본 발명은 기존의 문제를 해결하면서도 강한 숙주 보호능력을 가지는 살모넬라 생백신을 개발하여 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ruvB 유전자를 포함하고 있는 살모넬라(Salmonella) 속 균주의 염색체 DNA로부터 ruvB 유전자만을 제거하거나 ruvB 유전자만을 파쇄시키는 것을 특징으로 하는 살모넬라 생백신의 제조방법을 제공한다. 본 발명에서 ruvB 유전자 제거는 상동적 재조합을 비록한 공지의 여러 유전공학적 방법을 통해 달성 가능한데, 이 방법들은 현재 널리 알려져 있기 때문에 이에 관한 상세한 설명은 생략하기로 한다.

한편, ruvB 유전자 파쇄는 ruvB 유전자를 균주로부터 제거하지 않은 채, 그 일부 서열을 제거하거나 치환하는 등의 방법을 통해 해당 유전자 또는 그것이 발현하는 단백질의 기능을 불활성화시키는 것을 의미한다. 유전자 파쇄는 공지의 여러 유전공학적 방법을 통해 달성 가능한데, 이 방법들 또한 현재 널리 알려져 있기 때문에 이에 관한 상세한 설명도 생략하기로 한다.

상기 본 발명의 살모넬라 생백신 제조방법에 있어서, ruvB 유전자의 파쇄는 유전자를 파쇄할 수 있는 다양한 방법 중 바람직하게 ruvB 유전자 내의 일부 염기 서열을 제거하거나, ruvB 유전자 내의 일부 염기서열을 치환함으로써 달성될 수 있 다. ruvB 유전자 내의 일부 염기서열을 제거하거나, ruvB 유전자 내의 일부 염기서열을 치환하는 것은 현재 활용되는 유전공학적 기술을 통해 쉽게 달성가능 하므로, 이에 관한 구체적인 설명 역시 생략하기로 한다.

한편, 본 발명은 ruvB 유전자를 포함하고 있는 살모넬라 속 균주의 염색체 DNA에서 ruvB 유전자가 제거되거나, ruvB 유전자가 파쇄된 살모넬라 속 변이균주를 제공한다.

상기 본 발명의 ruvB 유전자가 파쇄된 살모넬라 속 변이균주에 있어서, ruvB 유전자의 파쇄는 바람직하게 ruvB 유전자 내의 일부 염기서열을 제거하거나, ruvB 유전자 내의 일부 염기서열을 치환하는 것을 통해 달성될 수 있다.

일반적으로 사용되는 병원성 세균의 백신은 소단위(subunit) 백신이거나 사균 백신을 많이 사용하고 있으나, 이들은 제조가 번거로울 뿐만 아니라 보관에도 많은 문제점이 있다.

그런데, 살모넬라의 병원성 유발에 관여하는 유전자들 중 일부를 분자 미생물학적 기법으로 살모넬라의 염색체에서 제거하거나 파쇄하면, 약독화된 살모넬라 생백신을 제조할 수 있고, 본 발명에서는 살모넬라가 가지고 있는 유전자 중 ruvB 유전자를 제거하거나 파쇄시킴으로써 약독화된 살모넬라 생백신을 제조한 것이다.

본 발명에서 제조된 생백신은 가축 등에 경구투여되었을 경우, 체내에서 항원으로 작용하여 면역반응을 유도하며, 병원성의 살모넬라 감염 시, 생백신에 의해 유도된 면역체계를 이용하여 방어하게 된다.

한편, 생백신은 동결건조와 같은 방법으로 손쉽게 보관할 수 있고, 배양에 의하여 균체를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 모든 면에서 경제적이다.

또한, 생백신은 외부 항원 운반 체계의 도입에 기인하여 살모넬라 이외의 다른 병원성 균주들에 대한 면역도 유도할 가능성이 있다.

한편, 본 발명은 본 발명의 ruvB 유전자가 제거되거나, ruvB 유전자가 파쇄되어 약독화된 살모넬라 속 변이균주에 약제학적으로 허용가능한 담체를 첨가하여 제조되는 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물은 일 예로 가축에 경구투여하기 위한 친액성 형태인 캡슐 형태로 제공되는 것이 유용하며, 이러한 캡슐은 예를 들면, Eudragate S eudaragete L 셀룰로오즈 아세테이트, 셀룰로오즈 프탈레이트 또는 히드록시 프로필메틸 셀룰로오즈를 포함하는 포장용 피복일 수 있다. 상기 캡슐류는 그 자체로 사용하거나 투여하기 전에 친액성 물질을 재조성하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물을 동결건조하여 보관하다가 백신 투여가 필요한 시기에 적당량의 물에 희석한 후 경구투여할 수도 있다. 살모넬라는 위산에 대한 내성이 있기 때문에 다른 조치가 필요하지 않다.

한편, 본 발명 백신 조성물의 투여량은 약독화된 살모넬라 변이균주의 균체수를 기준으로, 가축 10kg 당 10³~10⁹으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 살모넬라균(Salmonella)에 대한 새로운 백신 균주인 ruvB 변이균주를 개발하였는데, 이 균주는 기존에 연구된 백신의 단점 중 하나이던 백신 예방접종으로 인한 숙주의 피해가 없었으며, 치사량의 병원성 살모넬라 균주의 감염으로부터 숙주를 완전히 보호해 주는 효과를 발휘한다.

또한, 쥐에 있어서, 일반적으로 알려진 치사량의 100배 정도의 병원성 균주를 감염시키더라도 백신이 투여된 경우, 전혀 죽지 않음을 확인할 수 있었는데, 이는 본 발명 백신의 숙주 보호 능력이 매우 탁월함을 의미한다.

이와 같은 효과가 있는 본 발명의 약독화된 살모넬라 생백신은 사료 및 식품을 포함하는 여러 가지 분야에서 응용이 가능하며, 인간과 동물 모두에 적용가능하다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1: ruvB 유전자가 제거된 변이균주의 제작 및 ruvB 변이균주의 J774A .1 대식세포 내에서의 생존 및 증식 능력에 대한 실험

(1) ruvB 유전자가 제거된 변이균주의 제작

본 발명자들은 ruvB 유전자가 대식세포(macrophage cell) 내에서 생존 및 증 식에 중요한 역할을 담당하는 살모넬라 파소제니시티 아일랜드-2(Salmonella pathogenicity island -2, SPI-2) 유전자들의 발현 조절에 관여한다는 것을 발견하고, ruvB 변이균주를 제작하였다.

변이균주 제작을 위해 다첸코(Datsenko)와 와너(Wanner)에 의해 알려진 람다-레드 재조합(Lambda-Red recombination) 방법이 사용되었다(Datsenko, K. A., and B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 97:6640-6645).

ruvB 유전자 위치에 상동성 재조합(homologous recombination)을 통해 가나마이신 저항성 카세트(kanamycin resistant cassette)를 삽입하기 위해, pKD13에 있는 가나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)를 포함하는 부분의 DNA를 PCR을 통해 증폭하였다.

PCR을 위해 두 개의 정방향 역방향 프라이머가 사용되었는데, 정방향 프라이머인 ruvB-F의 시퀀스는 5'-TGA TTC GCG ACG CGT TAC GCG CCG CGT TAT GAG GTA AAG GTG TAG GCT GGA GCT GCT TCG-3'이었고, 역방향 프라이머인 ruvB-R는 5'-CAA AAT CGC CCA GGT CTG ATG AGC GCA GCG ACT TCA GGC GAT TCC GGG GAT CCG TCG ACC-3'이었다.

상기 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA를 pKD46을 가지는 살모넬라(Salmonella)에 삽입하여 최종적으로 ruvB 유전자가 제거되고, 가나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)를 가지는 살모넬라 변이균주를 제작하였다.

(2) 상기에서 제작된 ruvB 변이균주의 J774A .1 대식세포 내에서의 생존 및 증식 능력에 대한 실험

상기에서 제작된 ruvB가 제거된 변이균주의 대식세포 내에서의 생존 및 증식 정도를 조사하였다.

실험을 위해 사용된 J774A.1 대식세포는 10% FBS(fatal bovine serum), 페니실린(50 U/ml), 그리고 스트렙토마이신(50 U/ml)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)에서 배양되었다.

살모넬라 감염을 위한 대식세포의 모노레이어(monolayer)는 24-웰 조직배양 플레이트(24-well tissue culture plate)에서 준비되었다. 각각의 웰은 2×10⁵개의 J774A.1 대식세포가 DMEM 배지에 접종되었으며, 세포는 5%의 CO₂ 존재 하에 37℃에서 배양되었다.

배양 후, 살모넬라 감염 1시간 전에 각각의 웰은 PBS로 세 번 씻어준 후 항생제가 없는 DMEM으로 바꾸어 주었다. 이후 정상균주와 ruvB 변이균주를 10:1의 MOI(multiplicity of infection)로 대식세포의 모노레이어 위에 첨가하였다. 이때, 살모넬라는 정상균주와 ruvB 변이균주를 1:1로 섞은 박테리아 혼합액(bacteria culture mix)으로 준비하였다.

한 시간 동안 정상균주와 ruvB 변이균주의 박테리아 혼합액이 J774A.1 대식세포 내로 침투할 수 있도록 한 후, 각각의 웰을 PBS로 세 번 씻어주고, 100μg/ml의 젠타마이신이 들어 있는 DMEM으로 바꾼 후, 다시 1시간 동안 배양하여 J774A.1 대식세포 밖에 있는 살모넬라들을 제거하였다.

이 후, 일부는 10μg/ml의 젠타마이신이 들어 있는 DMEM으로 바꾸어 계속 배양하고, 나머지는 PBS로 세 번 씻은 후 1%의 트리톤 X-100을 이용하여 J774A.1 대식세포를 파괴하여 그 안에 있는 살모넬라를 밖으로 유출시켰다.

이 후, 적절한 연속적인 희석을 하고, LB와 가나마이신이 있는 LB 아가 플레이트에 도말한 후, 이를 배양하여 대식세포 내에 있던 정상균주와 ruvB 변이균주의 수를 계수하였다.

10μg/ml의 젠타마이신이 들어있는 DMEM에서 계속 배양된 대식세포는 18시간까지 배양한 후, 위와 같은 방법을 통해 처리하고, 그 안에 있는 정상균주와 ruvB 변이균주의 수를 계수하였다.

정상균주(WT) 와 ruvB 변이균주의 배양액을 1:1로 섞은 혼합액을 대식세포에 감염시킨 18시간 후에 대식세포 내에 존재하는 살모넬라의 수를 정량하여 정상균주와 ruvB 변이균주의 수를 비교한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 ruvB 변이균주의 수가 정상균주에 비해 약 1000배 정도 감소된 것을 확인할 수 있었다. 도 1의 CI index는 정상균주의 수를 1로 두고, 이를 기준으로 하여 이에 대한 ruvB 변이균주의 수를 상대적으로 나타낸 것이다.

이상의 결과로부터 ruvB 변이균주의 병원성은 정상균주에 비해 매우 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 경구투여와 복강 투여를 통한 쥐에서의 병원성 실험

상기 실시예 1에서 확인한 병원성 감소가 쥐의 생체 모델에서도 나타나는지를 확인하기 위해 6주령의 쥐를 이용하여 정상균주와 ruvB 변이균주를 각각 독립적으로 감염시킨 후, 각각의 균주에 감염된 쥐들의 생존 정도를 살펴보았다. 다만, 하기의 실시예 2 내지 5에서 사용된 ruvB 변이균주는 균주 내에 pCP20을 삽입함으로써 추가적으로 가나마이신 저항성 카세트까지 제거된 변이균주이다.

한편, 본 실시예에서 사용된 쥐는 서울대학교 실험동물자원관리원의 시설을 통해 오리엔트바이오(Orient bio)에서 구매되었으며, 실험동물자원관리원의 시설에서 사육되었다.

정상균주와 ruvB 변이균주의 병원성 여부를 알아보기 위한 실험을 위해 5마리의 쥐를 한 그룹으로 하여 각각 정상균주와 ruvB 변이균주, 그리고 대조군으로 PBS를 주입하였다.

본 실험에서는 경구투여와 복강투여가 사용되었는데, 두 경우 모두 치사량으로 알려진 양의 살모넬라 균주를 투여하였다. 경구투여의 경우 10⁷CFU/100μl, 복강투여의 경우 10³CFU/μl로 각각 희석하여 쥐 한 마리 당 100μl의 양을 투여하였다. 경구 투여의 경우, 박테리아 감염 전과 후에 각각 4시간 동안 물과 사료를 제거함으로써 교차 오염을 방지하였다. 이와 같이 감염된 쥐에 대해 생존 여부를 12시간마다 모니터링하였다.

실험 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이 정상균주가 감염된 쥐의 경우, 경구투여와 복강투여 모두에서 모두 7~10일 정도 이내에 모든 쥐가 죽었지만, ruvB 변이균 주가 감염된 쥐들은 대조군과 같은 양상을 보이며, 단 한 마리도 죽지 않는 것을 확인하였다. 이는 ruvB 변이균주의 병원성이 매우 약화되어 쥐에서 병원성이 발현되지 않음을 의미한다.

이와 같은 실험 결과로부터, 본 발명의 ruvB 변이균주는 생체 내(in vivo)와 시험관 내(in vitro) 모두에서 병원성이 정상균주에 비해 매우 감소함을 알 수 있었고, 이러한 병원성의 극명한 감소는 이 변이균주의 백신 균주로서의 가능성을 보여준다고 확신할 수 있었으며, 하기에서는 백신 균주로서의 개발 가능성에 대한 실험을 추가적으로 진행하였다.

실시예 3: ruvB 변이균주의 백신 접종 실험

쥐에서 ruvB 변이균주가 백신 균주로서의 역할을 할 수 있는지를 알아보기 위하여, 쥐의 경구와 복강을 통해 각각 10⁷ CFU와 10³ CFU의 ruvB 변이균주를 예방 접종하고, 첫 번째 접종 2주 뒤에 다시 한 번 같은 양의 ruvB 변이균주를 재접종하였다.

두 번째 접종 3주 이후, 병원성 균주인 정상균주를 예방접종된 방법에 따라 같은 양(치사량)으로 쥐에 감염시키고 감염된 쥐들의 생존 여부를 살펴보았다. 이때, 대조군으로는 예방접종 시에 ruvB 변이균주가 아닌 PBS만을 투여한 쥐가 사용되었으며, 이들도 역시 같은 방법으로 정상균주를 감염시켰다.

실험 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이 PBS만 투여된 대조군의 쥐들의 경우 병원 성 균주인 살모넬라 정상균주에 감염되었을 때, 이전 실험에서와 비슷하게 대략 8~10일 사이에 사망함이 관찰되었다. 하지만 ruvB 변이균주 백신이 접종된 경우 경구투여와 복강투여 모두의 방법에서 예방 접종된 쥐들은 죽지 않고 병원성 살모넬라의 감염을 극복하는 것을 확인할 수 있었다.

백신이 접종되어 죽지 않은 쥐들에 대해, 추가적으로 약 1달간 생존 여부를 살펴보았는데, 살모넬라 감염으로 말미암은 질병 등의 특이한 변화는 관찰되지 않았다.

이상의 실험으로부터, ruvB 변이균주의 백신은 숙주인 쥐를 병원성 살모넬라의 감염으로부터 완전히 보호해 줄 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 백신의 예방 접종 횟수에 따른 숙주의 병원균에 대한 보호 능력 실험

상기 실시예 3에서 ruvB 변이균주의 백신으로서의 역할을 이중 면역 시스템(double-immunization system)을 통해 살펴보았는데, 본 실시예에서는 단일 투여 면역(single-dose immunization)을 통해 백신을 공급하였을 경우에도, 상기 실시예 3에서 확인한 백신능이 발휘되는지 여부를 확인하였다.

실험의 순서는 앞서 실시예 3의 방법과 유사하게 진행하였고, 일부 쥐들은 두 번째의 백신 예방접종을 생략한 채 병원성 살모넬라에 의해 감염시킨 후 생존기간을 살펴보았다. 즉, 한 번의 백신 접종을 한 쥐 그룹과 두 번의 백신 접종을 한 쥐 그룹으로 나누어 각각의 경우에 병원성 균주에 대한 숙주 보호 능력 정도를 살펴본 것이다.

한 번의 접종을 한 쥐의 경우, 백신 접종 후 5주 후에 병원성 균주로 감염시켰고, 두 번의 접종을 한 쥐의 경우는 앞에서와 같이 두 번째 예방접종 후 3주 후에 병원성 균주로 감염시켰다.

실험 결과, 도 4에서 보듯이 한 번 예방접종을 한 쥐 그룹과 두 번의 예방접종을 한 쥐 그룹 모두에서 병원성 균주의 감염에 대한 숙주 보호가 완전하게 이루어진다는 것을 알 수 있었다.

한편, 본 실험에서도 예방 접종을 받지 않은 쥐 그룹은 일주일 안에 모두 사망하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 많은 병원성 균의 감염에 대한 백신의 숙주 보호능력 실험

상기 실시예 3~4에 기재된 실험들로부터 ruvB 변이균주의 백신 기능이 탁월함을 확인할 수 있었으며, 마지막으로 상기에서 투여한 양보다도 더 많은 양의 병원성 살모넬라균을 감염시켰을 경우에도 ruvB 변이균주가 숙주를 완전히 보호할 수 있는지 여부를 확인해 보았다.

상기 실시예들에서 수행된 실험들에 비해 10~100배의 병원성 균주를 예방접종을 한 그룹과 그렇지 않은 그룹에 각각 감염시킨 후, 생존 정도를 각각 살펴보았다.

실험 결과, 도 5에서 보듯이 100배가량 많은 양의 병원성 균주가 감염되어도 충분히 숙주를 보호해 주는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 ruvB 변이균주의 J774A.1 대식세포(macrophage cell) 내에서의 생존 및 증식 능력에 대한 실험 결과를 보여준다.

도 2는 쥐에서 경구투여와 복강 투여를 통한 ruvB 변이균주의 병원성 실험 결과를 보여준다.

도 3은 ruvB 변이균주의 백신 접종 결과를 보여준다.

도 4는 ruvB 변이균주 백신의 예방 접종 횟수에 따른 숙주의 병원균에 대한 보호능력을 보여준다.

도 5는 여러 병원성 균의 감염에 대한 ruvB 변이균주 백신의 숙주 보호능력을 보여준다.

Claims (5)

1. ruvB 유전자를 포함하고 있는 살모넬라(Salmonella) 속 균주의 염색체 DNA로부터 ruvB 유전자만을 제거하거나 ruvB 유전자만을 파쇄시키는 것을 특징으로 하는 살모넬라 생백신의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,

   ruvB 유전자의 파쇄는,

   ruvB 유전자 내의 일부 염기서열을 제거하거나, ruvB 유전자 내의 일부 염기서열을 치환하는 것을 통해 달성되는 것을 특징으로 하는 살모넬라 생백신의 제조방법
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제

Images