KR100602460B1 - 백신용 약독화 생박테리아 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약제로서 사용하기 위한 약독화 생박테리아에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 박테리아를 주성분으로 하여, 미생물 병인유발의 예방에 유용한 백신에 관한 것이다. 또, 본 발명은 이종 유전자를 보유하는 약독화 재조합 생박테리아와 이를 주성분으로 하는 백신에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 이러한 백신과 박테리아의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
도 1은 항원 투여 후 나타나는 1일당 돼지의 평균 1일 체중 증가량(US 파운드). 이 중량에 0.4536을 곱하면 킬로그램 중량이 얻어진다.
도 2는 각종 조직(MLN = 장간막 림프절)에서 살모넬라 콜레라수스(Samonella choleraesuis)가 재분리될 수 있는 돼지의 비율.
도 3은 항원 투여 후 설사 스코어의 평균 비율.
도 4는 예방접종 후 평균 1일 살모넬라 배출 스코어.
도 5는 항원 투여 후 평균 1일 박테리아 배출 스코어.
도 6은 항원 투여 후 나타나는 돼지의 평균 1일 체중 증가량(US 파운드).
본 발명은 약제로서 사용하기 위한 약독화 생박테리아, 이 박테리아를 주성분으로 하여, 미생물 병인유발의 예방에 유용한 백신, 이종 유전자를 보유하는 약독화 생박테리아 및 이러한 백신과 박테리아의 제조 방법에 관한 것이다.
온혈 동물이 미생물의 병인유발을 극복하는 방법은 복잡한 공정이다. 미생물 병인유발에 대한 면역은 온혈 동물이 병인유발을 피하거나 또는 온혈 동물이 병원 성 상태를 약하게 발현하게 하는 1가지 방법이다. 소정의 병원균에 대한 불완전한 면역성은 병원균에 노출된 개체에 이병 상태 및 치사 상태를 초래한다. 일반적으로, 살아있지만 약독화된 미생물을 주성분으로 한 백신(약독화 생백신)은 매우 효과적인 면역 반응을 유도한다는 점에 대해서는 공통된 의견이다. 이와 같은 백신은 동물 숙주가 일단 예방접종을 받은 후에 숙주내로 미생물 병원균이 도입되면 조기 면역, 세포 매개 면역 또는 체액 면역의 회복을 가속화시켜 임상적으로 유의적인 감염률을 나타내기 전에 유기체의 추가 증식을 제어할 수 있다. 일반적으로 사멸 병원균(사백신)을 주성분으로 하는 백신은 이와 같은 유형의 반응을 유도할 수 없는 것으로 인정되고 있다. 하지만, 생병원균을 포함하는 백신은 약독화 정도에 따라 예방접종시 예방접종된 숙주가 예방하고자 한 질병에 걸릴 수 있는 위험이 있다. 따라서, 생 미생물의 면역화 속성은 있지만 예방접종시 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 없는 백신이 요구된다.
일반적으로 박테리아를 약독화하는 방법은 1 이상의 독성 인자를 제거하는 것이다. 하지만, 대부분의 경우 독성 인자는 면역성을 유도하는 역할을 하기도 한다. 이러한 경우에, 독성 인자를 결실시키면 박테리아의 면역원성 손상을 피할 수 없게 된다. 이는 물론 원하지 않던 상황으로, 생 백신은 야생형 균주의 항원성 보체를 보유하고 있는 것이 바람직하다. 더욱이, 생 백신은 허용될 수 없는 병리적 상태를 피하기에 충분한 무독성이어야 하지만, 한편으로는 숙주 중에 충분한 면역성을 유발할 수 있어야 한다. 마지막으로, 약독화 생백신 균주는 실질상 독성의 야생형 균주로 복귀될 가능성이 없어야 좋다.
이에 대하여, 현재 많은 박테리아 속에서 주요 탄수화물 대사에 큰 역할을 하는 것으로 알려진 단백질을 암호하는 유전자를 결실시킬 수 있고, 그 결과 생체내 이 박테리아의 생존능에 영향을 미침이 없이 생체내 약독화능을 유발할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 유전자가 결실된 박테리아가 약독화 특성을 나타낸다는 것은 예기치 않은 발견이었다. 더욱이, 암호된 단백질이 면역성 유도에는 어떤 역할도 하지 않기 때문에 상기 유전자 결실된 박테리아의 항원성 주입량은 야생형의 주입량과 같다. 따라서, 이와 같은 박테리아가 약제 제조 분야, 보다 구체적으로 약독화 생 백신의 제조 분야에 유리하게 사용될 수 있다는 것은 예기치 않은 발견이었다.
본 발명에 따라 결실될 수 있고, 그 결과 얻어지는 결실 돌연변이체의 생체내 약독화능을 유도하는 유전자는 종래 fruR 유전자라고 불리던 유전자로서, 현재는 cra 유전자라고 불린다. 이러한 유전자가 결실된 돌연변이체는 시험관내에서 증식할 수 있지만, Cra 활성의 결실에 의한 결손이 증식 배지 중에서 보충되어야 하는 것으로 알려져 있다. 이는, Cra 결손 돌연변이체가 증식할 수 있는 영양소가 증식 배지 중에 제공되어야 한다는 것을 의미한다.
일반적으로 말하면, 병원성 박테리아는 이용할 수 있는 영양소에 대한 대사에 적응한다는 면에서 자립성이다. cra 유전자는 많은 대사 주경로(하기 참조) 중에서 상기와 같은 적응 역할을 한다. 그러나, cra 유전자가 결실된 돌연변이체는 탄소원으로 글루코스와 기타 다양한 당 중에서 우수하게 증식할 수 있다. 따라서, 이와 같은 당을 숙주 동물 중에서 이용할 수 있다면 cra 유전자가 생체내 조건하에서 작용성인지를 예측할 수 없을 것이다. 따라서, Cra 음성 돌연변이체가 숙주 내에서 약독화 특성을 나타낼 것으로 예측되지 않았다. 즉, 이러한 이유 때문에 전술한 바와 같은 돌연변이체가 당 기술 분야에 공지된 것일지라도 유능한 약독화 생 백신의 후보로 제안된 적은 없다.
본 발명의 일 양태는 cra 유전자를 돌연변이시킨 결과로서 작용성 Cra 단백질을 더 이상 발현할 수 없는 백신용 약독화 생박테리아에 관한 것이다.
현재 Cra(이화 생성물 억제인자/활성인자 단백질)로 불리는 유전자 생성물[종래에는 FruR(프럭토스 억제인자 단백질)로 불렸음]은 탄수화물 대사의 많은 주경로에 관여하는 조절 단백질이다.
cra 유전자 생성물인 Cra는 주요 탄소 대사를 조절한다. 보다 구체적으로, Cra는 생합성 효소 및 산화 효소(예, TCA 사이클, 글리옥살레이트 션트, 당신합성 경로 및 전자 수송 중의 주 효소)를 암호하는 유전자의 프로모터 상류에 결합하여 그 유전자의 전사를 상승(양성적으로) 조절하고, 해당과정의 효소(예, 엠브덴 메이어호프 경로 및 엔트너 도우도로프 경로 중의 주 효소)를 암호하는 유전자의 전사를 억제(음성적으로) 조절한다. 이 유전자의 탄수화물 대사 중의 주요 위치 때문에, cra 유전자와 이 유전자의 생성물인 Cra는 박테리아계 중에 널리 분포되어 있다. Cra 단백질은 보전성이 큰 단백질로서, 예컨대 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 종[예, 혈청형 티피뮤리엄(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis) 및 두블린(Dublin)], 악티노바실러스(Actinobacillus) 종[예, A. 플루로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)], 헤모필러스(Haemophilus) 종[예, H. 파라갈리나럼(H.paragallinarum)], 아에로모나스 살모니시데(Aeromonas salmonicidae), 파스퇴렐라(Pasteurella) 종[예, P.피시다(P.piscida) 및 P.뮬토시다(P.multocida)], 스트렙토코커스(Streptococcus) 종[예, S.에쿠이(S.equi) 및 S.수스(S.suis)] 및 예르시니아(Yersinia) 종[예, Y.페스티스(Y.pestis)]에서 발견된다.
살모넬라와 에스케리치아에 존재하는 상기 유전자 자체와 이의 완전한 뉴클레오티드 서열에 대해서는 문헌[Jahreis, K. et al., Mol.Gen.Genet. 226:332-336(1991)]을 통해 1991년에 이미 밝혀진 바 있다. 이 문헌에서 자레이스는 살모넬라 엔테리카, 혈청형 티피뮤리엄 및 에스케리치아 콜리 중의 Cra 단백질이 4개 위치에서만 상이하고, 이중 2개 위치에서는 단지 보전적 교환의 차이만을 보인다고 밝히고 있다. 이러한 양태는 박테리아 탄수화물 대사에 관여하는 매우 많은 보편적 경로 중에서 큰 역할을 하는 단백질에서 예상되는 것과 일치하는데, 특히 진화상 거리가 그다지 멀지 않은 E.콜리와 살모넬라에서 찾아볼 수 있다. Cra 단백질의 결합 기작에 대해서는 문헌[Ramseier, T.M. et al., J.Mol.Biol. 234:28-44(1993)]을 통해 최소한 일부분 해명되어 있다. Cra 단백질(이화 생성물 억제인자/활성인자 단백질)의 역할과 기능은 문헌[예컨대, Saier,M.H. and Ramseier,T.M.(Journ.Bacteriol. 178:3411-3417(1996)의 최근 소논문]에 정규적으로 게재되었다.
이와 같은 돌연변이는 작용성 Cra 단백질의 발현을 손상시키는 돌연변이라면 삽입, 결실, 치환 또는 이의 복합일 수 있다. 작용성 Cra 단백질이란 야생형 단백질의 조절 특성이 있는 단백질을 의미하는 것이다. 따라서, 그 작용 중 1 이상이 결손형인 Cra 단백질이라면 비작용성 Cra 단백질로 간주되어야 한다.
본 발명에 따라 사용되는 약독화 생박테리아는 여러 가지 방법으로 얻을 수 있다. 이러한 박테리아를 얻을 수 있는 1가지 방법으로는 cra 유전자를 가진 야생형 박테리아를 염기 유사체와 같은 돌연변이제로 처리하거나, 자외선으로 처리하거나 또는 온도 처리하는 등의 고전적 방법이 있다. 작용성 Cra 단백질을 생산하지 못하는 균주는 쉽게 선별할 수 있다. 이 균주는 탄소원으로서 글루코스와 기타 당의 존재하에 최소 배지에서 유일하게 증식하지만(cya 및 crp 돌연변이체와는 다름), 유일한 탄소원으로서 당신합성 기질을 사용한 경우에는 증식할 수 없다[Chin et al., J.Bacteriol.169:897-899(1987)]. 따라서, 시험관내에서 용이하게 선별할 수 있다. 하지만, 고전적 돌연변이 기법에 의해 유발되는 돌연변이의 양태는 알 수 없다. 이 돌연변이는 일어날 가능성이 희박할지라도 사실상 야생형으로 복귀될 수 있는 점 돌연변이일 수 있다. 이러한 작은 위험도 피하기 위해서는 트랜스포존 돌연변이유발법을 대안으로 사용하는 것이 좋을 것이다. 트랜스포존 돌연변이유발법에 의한 돌연변이유발은 당기술 분야에 잘 알려진 돌연변이유발 기법이다. 이것은 염색체 중의 국한된 부위에서만 일어나는 돌연변이이다. 트랜스포존 삽입은 특정 유전자만을 표적으로 하여 일어날 수는 없다. 하지만, cra 돌연변이체는 Cra 활성의 결실로 인해 영양소 보충없이는 시험관내에서 증식하지 못하기 때문에 선별하기가 매우 쉽다. 따라서, 이 돌연변이체는 무작위적으로 트랜스포존에 의해 변이된 박테리아 풀 (pool) 중에서 용이하게 선별할 수 있다. 소정 부위에 무작위 보다는 의도적으로 돌연변이를 도입할 수 있는 가능성은 재조합 DNA 기법에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 돌연변이는 변이된 유전자가 작용성 Cra를 암호하지만 않는다면 삽입, 결실, 한 뉴클레오티드에서 다른 뉴클레오티드로의 치환 또는 이의 복합 방식으로 일어날 수 있다. 이와 같은 돌연변이는 다수 핵산의 결실에 의해서도 얻어질 수 있다. 10개 핵산의 스트레치와 같은 극소수의 결실 역시 Cra를 비작용성으로 만들 수 있다. 심지어, 단일 핵산의 결실시에도 비작용성 Cra를 유도할 수 있는데, 이는 이러한 돌연변이의 결과로 다른 핵산의 리딩 프레임이 부정확하게 되기 때문이다. 3개씩 분할할 수 없는 다수 핵산의 삽입체의 각 결실은 이와 같은 프레임 이동을 일으킨다. 보다 바람직하게는, 100개의 핵산과 같은 긴 스트레치가 제거되는 것이다. 보다 더 바람직하게는, 전체 cra 유전자가 결실되는 것이다. 특히, 오픈 리딩 프레임 중에 종결 코돈을 도입시키는 돌연변이 또는 오픈 리딩 프레임 중에 프레임 이동을 유발하는 돌연변이는 작용성 Cra를 더 이상 암호하지 못하는 균주를 얻는데 매우 적합하다는 것은 자명한 것이다.
Cra 음성 돌연변이체를 작제할 수 있는 기법은 모두 공지되어 있는 표준 기법이다. 이 기법은 Cra 유전자의 클로닝, 부위 특이적 돌연변이유발에 의한 유전자 서열의 변형, 제한 효소 분해 후 재결찰 또는 PCR 시도 및 야생형 cra 유전자의 돌연변이 유전자로의 후속 치환(대립유전자 교환 또는 대립유전자 치환)에 관한 것이다. cra 유전자를 플라스미드에 클로닝하고, 이 유전자를 제한 효소로 절단한 후, 엔도뉴클레아제로 처리하고, 숙주 균주 중에서 재결찰 및 동종 재조합하는 것과 같은 표준 재조합 DNA 기법은 모두 당 기술 분야에 공지된 것으로, 예컨대 Maniatis/Sambrook(Sambrook,J. et al., Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6)을 참조할 수 있다. 부위 특이적 돌연변이는, 예를 들어 클론테크에서 시판하는 Transformer(등록상표명) 키트를 사용하여 시험관내 부위 특이적 돌연변이유발법으로 제조할 수 있다. PCR 기법에 대해서는 문헌[Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual, ISBN 0-87969-447-3 및 ISBN 0-87969-447-5]에 상세하게 설명되어 있다.
cra 유전자는 Cra 단백질을 암호하는 암호 서열 뿐 아니라, 프로모터와 같은 조절 서열도 포함한다. 또한, 이 유전자는 리보솜 결합 부위와 같이 Cra mRNA의 정확한 해독에 필수적인 부위를 포함한다. 따라서, 암호 영역 중의 돌연변이 뿐만 아니라 정확한 전사와 해독에 필수적인 서열 중의 돌연변이 역시 본 발명의 범위에 속하는 것이다.
바람직한 양태로서, 본 발명은 백신에 사용할 수 있는 에스케리치아, 살모넬라, 악티노바실러스, 헤모필러스, 아에로모나스, 파스퇴렐라, 스트렙토코커스 및 예르시니아 속의 약독화 생 박테리아에 관한 것이다.
본 발명의 보다 바람직한 형태로, 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아는 S.엔테리카 혈청형 티피뮤리엄, 엔테리티디스, 콜레라수스, 두블린, 티피, 갈리나룸, 아보투소비, 아보투스-에퀴, 풀로럼, E.콜리 또는 Y.페스티스로 구성된 군 중에서 선택되는 것이다. 이러한 박테리아 속은 인간 및 다양한 여러 동물에 대하여 병원 성인 다수의 종을 포함한다.
이의 보다 바람직한 형태로서, 본 발명에 따른 약독화 생박테리아로는 S.엔테리카, E.콜리 또는 Y.페스티스가 있다.
보다 더 바람직한 형태로, 이 양태는 Cra 유전자 중의 돌연변이가 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아에 관한 것이다.
cra 유전자 단편이나 심지어 그 전체 유전자의 결실 또는 이종 DNA 단편의 삽입 또는 이 양자를 비롯한 의도적으로 만든 일정 돌연변이는 고전적 유도 돌연변이에 비하여 야생형으로 복귀하지 않는다는 잇점이 있다. 따라서, 보다 바람직한 형태로, 이러한 형태의 본 발명은 cra 유전자가 삽입 및/또는 결실을 포함하는 약독화 생 박테리아에 관한 것이다.
오늘날, 애완동물 및 가축에게 다량의 백신을 투여해야 한다면, 예방접종 비용의 경감 측면에서라도 여러 종류의 백신을 혼합 투여하는 것은 분명히 바람직한 일이다. 따라서, 약독화 생 박테리아를, 다른 병원성 미생물이나 바이러스 중에서 선택되는 항원을 암호하는 이종 유전자의 재조합 운반체로서 사용하는 것은 매우 바람직하다. 이러한 재조합 운반체의 투여는 2 이상의 질환에 대하여 동시에 면역성을 유도한다는 이점이 있다. 본 발명에 따라 백신에 사용할 수 있는 약독화 생 박테리아는, Cra 단백질을 암호하는 유전자가 이종 유전자에 대한 삽입 부위로서 사용될 수 있기 때문에 이종 유전자에 매우 적합한 담체를 제공한다. 삽입 부위로서 cra 유전자의 용도는 cra 유전자를 불활성화하는 동시에 새로 도입된 이종 유전자를 발현(동종 박테리아 유전자와 함께)시킬 수 있다는 이점이 있다. 이러한 재조합 운반체의 작제는 대립유전자 교환과 같은 표준 분자 생물학 기법에 의해 일정하게 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 작용성 Cra 단백질을 생산하지 않고 이종 유전자가 삽입된, 바람직하게는 에스케리치아, 살모넬라, 악티노바실러스, 헤모필러스, 아에로모나스, 파스퇴렐라, 스트렙토코커스 및 예르시니아 속의 약독화된 재조합 생 박테리아에 관한 것이다. 이러한 이종 유전자로는 전술한 바와 같이, 다른 병원성 미생물 또는 바이러스 중에서 선택되는 항원을 암호하는 유전자일 수 있다. 이 유전자는 예컨대 병원성 헤르페스바이러스(예, 헤르페스바이러스의 구조 단백질을 암호하는 유전자), 레트로바이러스(예, gp160 엔벨로프 단백질), 아데노바이러스 등에서 유래될 수 있다. 또한, 이종 유전자는 병원성 박테리아에서도 얻을 수 있다. 일 예로서, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 독소, 클로스트리디움 독소, 외막 단백질 등과 같은 박테리아 독소를 암호하는 유전자는 매우 적합한 박테리아 이종 유전자이다. 또 다른 방법은 면역계를 자극하는데 관여하는 단백질, 예컨대 인터루킨이나 인터페론을 암호하는 유전자 또는 면역 조절에 관여하는 기타 다른 유전자를 삽입하는 것이다.
cra 유전자 중에 이종 유전자를 삽입하는 방법은, 이종 유전자의 삽입 부위를 찾을 필요가 없으면서 cra 유전자가 무력화되기 때문에 유리한 방법이다. 따라서, 이 양태의 바람직한 형태는 이종 유전자가 cra 유전자 중에 삽입되는 것이다. 이 이종 유전자는 cra 유전자 중의 임의 위치에 삽입되거나 또는 cra 유전자가 부분 결실되거나 완전 결실되면서 cra 유전자 부위에 삽입될 수 있다.
이와 같이 예상치 못한 생체내에서의 약독화되었지만 면역원성인 특성으로 인해, 본 발명에 따른 백신용 박테리아는 약독화 생백신의 주성분으로 매우 적합하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 야생형 형태가 cra 유전자를 포함하는 박테리아로의 감염에 대하여 동물과 인간을 예방하기 위한 약독화 생백신에 관한 것이다. 이러한 백신은 본 발명에 기재된 백신용 약독화 생박테리아 또는 본 발명에 기재된 재조합 생 담체 박테리아의 면역학적 유효량과 약학적 허용성 담체를 포함한다.
바람직하게는, 백신은 에스케리치아, 살모넬라, 악티노바실러스, 헤모필러스, 아에로모나스, 파스퇴렐라, 스트렙토코커스 및 예르시니아로 구성된 군 중에서 선택되는 본 발명에 따른 약독화 생박테리아를 포함한다. 면역학적 유효량이란 예방접종에 투여된 약독화 생 박테리아의 양이 박테리아의 독성 형태에 대하여 유효한 면역 반응을 숙주내에 유도하기에 충분한 양을 의미한다.
전술한 약독화 생 박테리아의 면역학적 유효량외에도, 본 발명에 기재된 백신은 약학적 허용성 담체를 더 포함한다. 이 담체는 단순히 물이거나, 박테리아가 배양된 배양액을 포함할 수도 있다. 다른 적합한 담체는, 예컨대 생리적 염농도의 용액이다.
투여되어야 하는 유효 투여량은 예방접종되는 동물, 연령 및 체중, 투여 방식 및 예방접종하고자 하는 병원균의 종류에 따라 다양하다.
백신은 면역 반응을 자극하기에 충분한 임의 투여량의 박테리아를 포함할 수 있다. 예컨대, 103 내지 1010 박테리아 범위의 투여량이 매우 적합한 양이다.
경우에 따라, 면역증강제(adjuvant) 활성이 있는 1 이상의 화합물을 백신에 첨가할 수도 있다. 면역증강제는 면역계의 비특이적 자극인자이다. 면역증강제는 백신에 대한 숙주의 면역반응을 증강시킨다. 당해 기술 분야에 알려진 면역증강제의 예로는 프로인트 완전 및 불완전 면역증강제, 비타민 E, 비이온 블록 중합체, 뮤라밀디펩티드, ISCOM(면역 자극 복합체, 예컨대 EP109942 참조), 사포닌, 광유, 식물유 및 Carbopol이 있다. 특히, 점막 투여에 적합한 면역증강제는, 예컨대 E.콜리 열불안정성 독소(LT) 또는 콜레라 독소(CT)이다. 다른 적합한 면역증강제는 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, 오일 유제[예, Bayol F(등록상표명) 또는 Marcol 52(등록상표명)], 사포닌 또는 비타민 E 가용화물이다.
따라서, 바람직한 형태로 본 발명에 따른 백신은 면역증강제를 포함하는 것이다.
본 발명에 유용한 약학적 허용성 담체 또는 희석제의 다른 예로는 SPGA와 같은 안정화제, 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 전분, 슈크로스, 글루코스, 덱스트란), 알부민이나 카제인과 같은 단백질, 소혈청 또는 탈지유 같은 제제를 포함하는 단백질 및 완충액(예, 인산염 완충액)을 포함한다. 특히, 이와 같은 안정화제를 백신에 첨가하는 경우, 이 백신은 동결 건조하기에 매우 적합하다. 따라서, 보다 바람직한 형태로, 백신은 동결건조된 형태이다.
동물이나 인간에 대한 투여용으로서, 본 발명에 따른 백신은 특히 비내 투여, 피내 투여, 경피 투여, 경구 투여, 에어로졸 투여 또는 근육내 투여될 수 있다. 가금류에 대한 투여용의 경우, 날개압(wing web) 투여 및 점안 투여가 매우 적합하다.
또 다른 양태는 야생형 박테리아 감염 또는 감염의 병원성 효과에 대하여 동 물 및 인간을 예방하기 위한 백신 제조에 사용되는, 본 발명에 기재된 재조합 박테리아 또는 백신용 박테리아의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태는 본 발명에 기재된 백신의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아 또는 본 발명에 따른 재조합 생 담체 박테리아와 약학적 허용성 담체를 혼합하는 것을 포함한다.
실시예
실시예 1
S.티피뮤리엄 SR-11 Fad
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내 변이된 유전자의 동정, 클로닝 및 서열분석
돌연변이 S.티피뮤리엄 SR-11 Fad-의 트란스포손 변이된 유전자를 동정하여, 클로닝하고, 서열분석하였다. 이와 같은 SR-11 Fad- 무독성을 제공하는 변이 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에 기재하였다. 서열 번호 2는 서열 번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열이 암호하는 단백질 분자의 아미노산 서열을 기재한 것이다. S.티피뮤리엄 SR-11 Fad-는 cra 유전자 내에 돌연변이를 갖는 것으로 확인되었다. 트랜스포존의 삽입점은 cra 해독 종결 코돈의 3' 말단으로부터 약 45개 염기쌍의 범위내에 위치하는 것으로 밝혀졌다.
한쪽 말단에 1.9 kb S.티피뮤리엄 SR-11 DNA 단편과 다른쪽 말단에 1.1 kb S.티피뮤리엄 SR-11 DNA 단편이 인접해 있는 1.5 kb Tn 10d Cam 삽입체를 포함하는 4.5 kb PstI 단편을 pBluescript II SK(+)의 PstI 부위에 삽입하였다. 얻어지는 플 라스미드 pJHA7은 전기침투에 의해 이.콜리 HB101에 주입하였다. Tn 10d Cam 삽입체가 인접해 있는 영역의 서열 분석은 생거 디데옥시 열순환법으로 실시하였다. Tn 10d Cam 삽입체의 각 측면에 직접 접해있는 뉴클레오티드 서열은 S.티피뮤리엄 cra(fruR) 유전자와 100% 상동성인 것으로 나타났고, 삽입 지점은 cra 해독 종결 코돈의 3' 말단에서부터 45개 뉴클레오티드 위치인 것으로 나타났다. 이것은 S.티피뮤리엄 SR-11 Fad-가 cra 돌연변이체임을 암시하는 것이다. SR-11과 반대로, SR-11 Fad-는 구연산염, 올레산염, 피루브산염, 아세트산염, 숙신산염 및 푸마르산염을 포함하는 M9 최소 한천 평판 상에서 증식하지 못하였다.
S.티피뮤리엄 SR-11 야생형 cra(fruR)는 PCR로 증폭하여 pBR322의 암피실린 내성 유전자 중의 PstI 부위에 삽입하였다. 얻어지는 플라스미드, pJHA8은 탄소원으로 전술한 화합물을 각각 이용하는 야생형 친주만큼 S.티피뮤리엄 SR-11 Fad-의 증식능을 복귀시켰다. 이 실험은 S.티피뮤리엄 SR-11-가 cra(fruR) 돌연변이체라는 것을 입증한다.
SR-11 Fad-는 LT-2의 미니트란스포손 돌연변이체 유래의 클로람페니콜 내성인 박테리오파지 P22 HT105 int
-를 SR-11로 형질도입시켜 작제하였다. 가능성은 없지만, SR-Fad-의 무독성은 결손형 cra 유전자 때문이라기 보다는 형질도입시 일부 SR-11 DNA의 상실, 예컨대 병원성 섬의 상실때문일 수도 있다. 따라서, 이하 설명 되는 바와 같이 SR Fad- 중에 존재하는 cra 유전자내의 동일한 돌연변이를 포함하는 것을 제외하고는 SR-11과 동일한 균주(이하, SR-11 Cramod AX-2)는 대립유전자 교환으로 작제하였다.
SR-11 Fad- 돌연변이체의 cra 유전자(cra 중의 클로람페니콜 내성 유전자)를 포함하는 4.3 kb PstI SR-11 Fad- DNA 단편을, 암피실린 내성 유전자와 테트라사이클린 내성 유전자(tetAR)를 모두 포함하는 자살 벡터인 pLD55의 PstI 부위에 삽입하였다. 이것을 pMJN10이라 불렀다. pMJN10을 전기침투에 의해 E.콜리 S17-1 λpir중으로 주입하였다. E.콜리 S17-1 λpir(pMJN10)을 SR-11과 교배한 후, 얻어지는 여러 암피실린, 테트라사이클린 및 클로람페니콜 SR-11 트란스접합체를 가지고 유일한 탄소원으로서 올레산염, 구연산염, 아세트산염, 피루브산염, 숙신산염 및 푸마르산염의 이용능에 대하여 시험하였다. 모든 접합체는 상동성 서열을 사용한 단일 크로스오버에 의해 pMJN10이 염색체내로 통합된 경우 예상되는 바와 같이, 즉 돌연변이 cra 대립유전자와 야생형 cra 대립유전자가 모두 염색체 중에 존재하는 것과 같은 성질을 나타내었다. 이와 같은 5가지 "통합체"를 가지고 pMJN10이 유리 플라스미드로서 존재하는지에 대하여 시험한 결과, 플라스미드로서 보유하는 통합체는 없었으며, 이는 이 플라스미드가 SR-11 염색체 중에 삽입되었음을 암시하는 것이다. 5가지 통합체를 각각 클로람페니콜을 포함하는 루리아 아가 평판 상에 스트리킹하였다. 이 경우, 2차 크로스오버가 일어난 세포는 염색체 중에 남아있는 cra 대립유전자가 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 돌연변이 대립유전자인 경우에만 생존한다. 그 다음, 스트리킹한 통합체의 샘플을 테트라사이클린 감수성 선택 한천(TSS 아가)상에 스트리킹한다. TSS 한천은 푸마르산과 테트라사이클린 감수성 세포를 포함하고, 즉 자살 플라스미드를 상실한 세포는 염색체 중에 플라스미드를 그대로 보유하고 있는 테트라사이클린 내성 세포에 비해 콜로니가 매우 크게 증식한다. 대형 콜로니를 총 34개 취하여 클로람페니콜에 대한 내성, 암피실린 및 테트라사이클린에 대한 감수성 및 유일한 탄소원으로서 올레산염, 아세트산염, 피루브산염, 구연산염, 숙신산염 및 푸마르산염의 이용능에 대하여 시험하였다. 34개의 분리물 중에서 6개는 클로람페니콜 내성, 암피실린과 테트라사이클린 감수성이고, 유일한 탄소원으로서 전술한 화합물을 이용할 수 없는 것으로 나타났다. SR-11 Cramod AX-2(AX는 대립유전자 교환을 의미함)로 표시한 상기 분리물 중 하나를 pBR322 또는 pJHA8(pJHA8은 야생형 cra 유전자를 포함함)로 형질전환시키고, 이 두 균주를 유일한 탄소원으로서 글루코스, 글리세롤, 올레산염, 아세트산염, 피루브산염, 구연산염, 숙신산염 및 푸마르산염의 이용능에 대하여 시험하였다. SR-11 Cramod AX-2(pBR322)와는 반대로, SR-11 Cramod AX-2(pJHA8)는 유일한 탄소원으로서 전술한 화합물을 이용할 수 있었고, 이는 SR-11 Cramod AX-2가 cra 돌연변이체라는 것을 암시한다. 예상한 바와 같이 두 균주는 유일한 탄소원으로서 글루코스와 글리세롤을 이용할 수 있었다. 작용성 cra(fruR) 유전자가 S.티피뮤리엄 SR-11에 독성을 부여하는지를 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.
BALB/c 마우스 4마리는 SR-11(2.1 x 108 cfu/마우스)을 경구적으로 감염시키고, 5마리는 SR-11 Cramod AX-2(2.8 x 108 cfu/마우스)로 감염시켰다. 감염 8일 후, 4마리의 SR-11 감염된 마우스는 모두 사멸하였고, 이에 반해 SR-11 Cramod AX-2로 감염된 5마리 마우스는 모두 건강하고 활동적인 상태를 유지하였다(표 1). SR-11 Cramod AX-2는 SR-11 Cramod 중에 존재하는 것과 동일한 cra 중의 돌연변이를 제외하고는 SR-11과 동일하기 때문에, LT-2 균주로부터의 형질도입에 의한 SR-11 Cramod의 작제 동안 독성의 상실을 유발할 수 있는 cra와 무관한 비정상적 변이가 발발할 가능성은 배제된다.
또한, cra 유전자 중에 클로람페니콜 내성 카세트를 삽입하면 하류 유전자 에 대한 극성 효과가 나타나는 바, SR-11 Fad-의 약독화의 원인이 결손형 cra 유전자 때문이 아닐 수 있다는 가능성은 여전히 존재하였다. 따라서, SR-11 Cramod를 pJHA8(단지 야생형 cra 유전자만을 포함함)로 보충하여 SR-11 Cramod (pJHA8)이 다시 독성을 나타내는 정도를 측정하였다. 대조군으로, SR-11 Cramod를 pJHA8 작제에 사용된 벡터인 pBR322로 보충하였다. BALB/c 마우스 4마리는 SR-11 Cramod(pBR322) 3.1 x 108 cfu/마우스로 경구적으로 감염시키고, 다른 4마리는 SR-11 Fad- 4.3 x 108
cfu/마우스로 감염시켰다. 감염 9일 후, SR-11 Cramod(pJHA8)로 감염시킨 4마리 마우스 중 3마리는 사망한 반면, SR-11 Cramod(pBR322)로 감염된 4마리 마우스는 모두 건강하고 활동적으로 남아있었다(표 1). 사망한 모든 마우스의 간과 비장에서는 SR-11 Fad-(pJHA8) 수가 기관당 108 cfu 이상 나타났다. 이와 같은 결과는 클로람페니콜 카세트로의 cra 유전자의 불활성화가 무독성을 초래하는 하류 효과의 원인일 가능성을 배제하는 것으로, 작용성 cra 유전자가 SR-11 독성의 필수 인자임을 입증하는 것이다.
| S.티피뮤리엄 균주 | 감염 수a | 생존 수 |
| SR-11 | 4 | 0 |
| SR-11 Cramod AX-2 | 5 | 5 |
| SR-11 Cramod(pBR322) | 4 | 4 |
| SR-11 Cramod(pJHA8) | 4 | 1 |
| a마우스를 균주에 따라 2.0 x 108 cfu/마우스 내지 5.0 x 108 cfu/마우스의 수로 경구 감염시켰다. 사망한 모든 마우스는 감염 9일 이내에 사망하였다. 생존한 모든 마우스는 완전하게 회복하였다. | ||
각종 박테리아 속 중에 존재하는
cra
유전자의 검출
S.엔테리티디스, S.갈리나럼, S.두블린 및 S.콜레라수스 각각 한 균주와 4가지 S.티피뮤리엄 균주를 가지고 서던 하이브리드화로 cra 유전자에 대하여 시험하였다. cra 유전자는 모두 SR-11과 같은 크기인 4.3 kb PstI DNA 단편 상에서 발견되었다. 또한, 6가지 다른 병원성 E.콜리 균주도 시험한 결과, 모두 cra 유전자를 갖고 있었지만, 이 유전자는 6가지 균주 중에서 3개의 다른 크기의 PstI 단편중에 존재하였다. 또한, 아에로모나스 살모니시데 균주와 박테리아 악티노바실러스, 헤 모필러스, 파스퇴렐라, 스트렙토코커스 및 예르시니아 속의 균주도 시험한 결과 모두 cra 유전자의 존재를 나타내었다.
전술한 박테리아내 cra 유전자의 존재는 다음과 같이 입증되었다. 이러한 균주의 게놈 DNA는 PstI(프로메가) 20 유니트로 37 ℃에서 하룻밤 동안 분해하였다. 다양한 크기의 PstI DNA 단편을 분리하기 위하여 겔 전기영동(0.7% 아가로스, 1x TAE)을 사용하였다. 분리한 DNA를 S&S Turboblotter 시스템(Schleicher and Schuell)을 사용하여 알칼리 조건하에 양하전 나일론으로 3 시간 동안 전이시켰다. 막에 DNA를 결합시키기 위하여 막을 90 ℃에서 3 시간 동안 소성하였다. 이어서, 살모넬라 티피뮤리엄의 cra 유전자인 700 염기쌍 단편을 DIG 표지하고 막의 탐침에 사용하였다. 이 막을 5 x SSC, 0.1% N-라우로일사르코신, 0.02% SDS, 1.5% 차단 시약(CSPD를 보유한 DIG Detection Starter Kit II, 뵈링거 맨하임)을 포함하는 하이브리드화 완충액 중에서 62 ℃하에 2 내지 4 시간 동안 예비하이브리드화(회전 병 하이브리드화 오븐 중에서)하였다. 표지된 프로브를 변성시키고 새로운 하이브리드화 완충액에 첨가한 뒤, 블롯을 62 ℃에서 16 내지 20 시간 동안 항온처리하였다. 블롯을 2 x SSC, 0.1 % SDS로 62 내지 65 ℃에서 5 분 동안 2회 세척하였다. 그 다음, 블롯을 0.1% SDS, 0.5 x SSC로 60 ℃에서 15 분 동안 2 회 세척하였다. 이 블롯을 다음과 같은 변화된 조건하에 추천된 바대로 발색시켰다. 차단 용액 중에 2% 차단 시약을 사용하고(보통 1%가 사용됨), 블롯을 1 시간 동안 차단시켰으며(30분이 정상적인 차단 시간임), DIG 표지된 프로브의 검출에 저농도의 항체(일반적으로 사용되는 농도의 70%)를 사용하였다. 이와 같은 변형은 기준 시그널을 줄일 수 있 는 방안으로 제조자에 의해 추천된 것이다.
실시예 2
Cra 음성 살모넬라 티피뮤리엄 균주 SR11 Cra
mod
를 이용한 병아리의 예방접종
예방접종 효능
살모넬라 균주의 증식 조건은 실시예 2에 기재된 바와 대등하게 사용하였다. 제1 실험으로, 20마리 영계(3일령) 두 군에게 PBS 중의 6 x 107 CFU 살모넬라 t. SR11 Cramod를 경구적으로 예방접종하였다. 1군은 11일 후 동일 균주 8.3 x 107 CFU를 추가 접종하였다. 18일 후, 두 군에게 독성 야생형 균주 1.9 x 109 박테리아를 경피, 근육내 그리고 경구적으로 항원투여하였다. 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.
| SR11 Cramod | SR11 Cramod | 대조군 | |
| 예방접종후 1일 | 6.0 x 107 | 6.0 x 107 | -- |
| 예방접종후 11일 | -- | 8.3 x 107 | -- |
| 항원투여후 18일 | 1.9 x 109 | 1.9 x 109 | 1.9 x 109 |
| 치사율(%) | 15 | 10 | 100 |
복합 예방접종의 안정성 및 효능 실험
제2 실험으로, 백신의 효능과 백신의 안정성을 측정하였다. 백신의 안정성은 증식 지연 실험을 기초로 하여 측정하였다. 15마리 영계 1군에게 배양 배지 중의 2.7 x 108 CFU 살모넬라 t. SR11 Cramod를 경구적으로 예방접종하였다. 또 다른 15 마리 영계 군에게 PBS 중의 동일 균주 1.3 x 108 CFU를 경구적으로 예방접종하였다. 18일 후, 양 군에게 독성 야생형 균주 6.5 x 108 박테리아를 경피, 근육내 및 경구적으로 항원투여하였다.
그 결과를 표 3에 제시하였다.
| SR11 Cramod(i) | SR11 Cramod(ii) | 대조군 | |
| 예방접종 투여후 1일 | 2.7 x 108 | 1.3 x 108 | -- |
| 7일째 체중 | 178 | ND | 185 |
| 18일째 체중 | 733 | 722 | 749 |
| 항원투여량 투여후 18일 | 6.5 x 108 | 6.5 x 108 | 6.5 x 108 |
| 치사율(%) | 0 | 13 | 100 |
| i = 배양액, ii = PBS | |||
결과 : 양 실험을 통해, Cra 음성 살모넬라 티피뮤리엄 균주는 높은 항원투여량의 제공에도 불구하고 매우 높은 예방률을 제공한다는 것이 입증되었다. 또한, 예방접종의 결과로서 유의적인 증식 지연은 관찰되지 않았다. 따라서, Cra 음성 살모넬라 티피뮤리엄 균주는 야생형 박테리아 감염에 대한 가금 예방에 매우 적합한 약독화 생백신이라는 결론을 얻었다.
실시예 3
개요
cra 양성 양친 균주 34682 및 35276과 비교하여 살모넬라 콜레라수스 Cra 음성 무력화(KO) 균주 34682와 35276의 안정성을 측정하기 위하여 돼지 항원투여 연 구를 실시하였다. 상기 무력화 돌연변이체는 CramodAX-2의 작제에 대하여 전술한 것과 동일한 방법과 플라스미드를 사용하여 제조하였다.
1. 돼지 안정성 시험
A. 동물 및 사육
살모넬라에 대한 예방접종을 전혀 받은 바 없는 5 내지 6 주령의 돼지 20 마리를 살모넬라에 대한 병력이 없는 농장에서 구입하였다. 이 돼지를 5 마리씩 4 군으로 나누었다. 연구 동안, 돼지들은 분리된 4개의 방에서 사육하였다.
B. 항원투여
항원투여는 각 군의 5마리 돼지가 5 내지 6 주령 되었을 때 처치하였다. 이 돼지에 대한 항원투여는 비내(0.5 ㎖/비공) 및 경구적으로(배양물 1.0 ㎖ + 박테리아 희석액 4.0 ㎖) 실시하였다. 항원투여용 배양물의 농도는 약 9.0 x 108 cfu/㎖로 만들었다. 항원투여후, 체중 감소, 설사 및 직장 온도의 증가를 비롯한 전형적인 살모넬라 감염의 임상적 증후에 대하여 매일 관찰하였다.
C. 도살
항원투여 7일 후 돼지를 안락사시켰다. 돼지를 부검하여, 폐, 간, 비장, 장간막 림프절(MLN) 및 회장을 분리 배양하여 S.콜레라수스의 증식을 조사하였다.
D. 체중 증가
평균 1일 체중 증가(ADG)는 최종 체중에서 초기 체중을 감하고 항원투여일부터 도살일까지의 일수로 나누어 계산하였다. 군 ADG는 각 돼지 ADG의 평균값이다.
2. 마우스 안전 시험
여러 S. 콜레라수스 균주, 즉 cra 양성의 양친 균주 34682와 35276 및 cra 음성의 무력화(KO) 균주 34682와 35276의 LD50을 측정하기 위하여 마우스 연구를 실시하였다.
A. 동물
16 내지 20 g의 CF-1 Sasco 마우스 200마리를 각각 10마리씩 20 군으로 나누어 마우스 안전 시험을 실시하였다. 이 연구에서 마우스는 같은 실이지만 다른 통 중에서 사육하였다.
B. 항원투여
각각 마우스 10 마리를 포함하는 5개의 하위군에 대하여 각 균주를 시험하였다. 이 하위군에게 각 균주의 5가지 희석액(10-3 내지 10-7)을 0.25 ㎖씩 복강내(IP)로 항원투여하였다. 상기 4가지 균주 각각의 동결 종균을 10-3 내지 10-7으로 희석하였다. 이 희석액을 각각 마우스 10 마리에게 0.25 ㎖씩 복강내 주사하였다.
결과
I. 돼지 안전 시험
A. 체중 증가
돼지의 체중 증가에 대해서는 도 1에 도시하였다. 이 데이터는 KO 균주가 항원투여된 돼지와 양친 균주가 항원투여된 돼지 간에 차이를 분명하게 제시하고 있다. 또한, 이 데이터는 동물의 전반적인 건강 상태의 차이를 반영하고 있다. 양친 균주를 항원투여받은 돼지 양 군은 항원투여 시기부터 사망시까지 체중이 감소하였고, KO 균주를 항원투여받은 돼지는 1일 당 약 0.75 ㎏의 체중이 증가하였다.
II. 마우스 안전 시험
A. 사망
이 마우스 연구 결과는 하기 표 4에 제시하였다. 우측 컬럼은 각 균주의 LD50(CFU)를 나타낸 것이다. 무력화 균주는 상당한 약독성을 분명하게 보여준다.
| 균주 | LD50 cfu |
| 35276 양친주 | <7.7 cfu |
| 35276 무력화주 | 1.5E+04 cfu |
| 34682 양친주 | 12.5 cfu |
| 34682 무력화주 | >9.0E+0.4 cfu |
결론
돼지 안전 시험으로부터 Cra 무력화(KO) 균주가 항원 투여후 양친주에 비해 체중이 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 이를 통해, Cra KO 돌연변이체의 약독화 특성을 알 수 있었다. 돼지 안전 시험외에, 마우스 안전 시험에서도 Cra KO 균주가 약독화된 것으로 나타났다. 즉, KO 돌연변이체의 LD50은 양친주의 LD50 보다 상당히 높았다.
실시예 4
개요
본 실시예의 목적은 KO-34682 Cra 돌연변이체와 이의 양친주의 안전성을 비교 평가하고, 이종 독성 살모넬라 균주 35276 항원투여에 대한 살모넬라 균주 KO- 34682의 효능을 측정하는 것이다. 또한, KO-34682 Cra 돌연변이체의 효능을 예방접종되지 않은 대조군과 비교하였다.
동물 및 사육
살모넬라에 대한 예방접종을 받은 적이 없는 3주령의 돼지 20 마리를 살모넬라에 대한 병력이 없는 농장에서 구입하였다. 이 돼지를 5마리씩 4군으로 나누고 4개의 분리실에서 사육하였다.
백신 및 예방접종
3주령의 돼지에게 살모넬라 콜레라수스 균주 KO-34682, 34682 양친주 약 1 x 109 CFU/㎖를 경구 예방접종하거나 또는 예방접종하지 않은 채 방치하였다.
항원투여
예방접종 21일 후, 돼지에게 독성의 살모넬라 콜레라수스 균주 35276을 비내(0.5 ㎖/비공) 및 경구(1.0 ㎖ 배양물 + 4.0 ㎖ 박테리아 희석물)적으로 항원투여하였다. 35276 항원투여 균주는 항원투여에 앞서 날리딕산(Nal) 내성주로 만들어, Nal을 포함하는 평판에서 항원투여 균주와 백신 균주를 구별할 수 있도록 하였다. 항원투여후, 돼지의 살모넬라 감염의 임상적 징후, 예컨대 체중 감소, 설사 및 직장 온도의 상승 등을 매일 관찰하였다. 살모넬라 배출의 기간은 매일 분변을 배양하여 측정하였다.
항원투여 9일 후, 돼지를 안락사시켰다. 이 돼지를 부검하여, 폐, 간, 비장, 장간막 림프절(MLN) 및 회장을 분리하고, 날리딕산 80 ㎍/㎖을 함유하는 헥토엔 장(HE) 한천 평판 상에서 배양하여 살모넬라 콜레라수스를 증식시켰다.
설사 스코어
설사 스코어는 항원투여후 나타나는 각 설사 일을 각 돼지 마다 1점으로 하여 계산하였다. 시험 마지막에 연구 중에 얻은 총 득점수를 항원투여 후부터 사망시까지의 일수로 나누었다. 이 수를 100으로 곱하여 관찰된 설사일의 비율을 측정하였다.
살모넬라 배출
예방접종 후와 그 다음 항원투여 후의 살모넬라 콜레라수스 배출 기간을 측정하기 위하여 돼지의 분변을 매일 채취하였다. 음성 결과가 나타난 지 2일 후, 분변의 채취를 중지하였다. 분리용 HE 평판상에서 분변의 역가를 측정하였다. 샘플을 다양하게 희석한 후 관찰되는 증식에 대해 다음과 같이 포인트를 지정하였다.
| 10-1 | 1 pt |
| 10-2 | 2 pt |
| 10-3 | 3 pt |
| 10-4 | 4 pt |
| 10-5 | 5 pt |
체중 증가
평균 1일 체중 증가(ADG)는 최종 중량에서 초기 중량를 감하고, 항원투여 후부터 사망시까지의 일수로 나누어 계산하였다. 군ADG는 각 돼지 ADG의 평균값이다.
결과
예방접종 후 사망
살모넬라 콜레라수스 야생형 양친주 34682를 예방접종한 돼지 2마리는 예방접종 후 사망하였다. 이 군의 다른 돼지 3 마리는 연구 종료시까지 생존하였다.
살모넬라 분리/부검 스코어
도 2는 각 기관의 S.c. 분리 결과를 도시한 것이다. KO 백신이 예방접종된 돼지 군에서는 양친군 및 예방접종 무처리군과 비교하였을 때 어떤 기관에서도 S.c.가 분리되지 않았다. 예방접종 무처리군의 경우에는 돼지 5 마리 모두의 회장 및 MLN에서 살모넬라 콜레라수스가 분리된 반면, 양친군의 경우에는 이들 기관 중 어떤 기관에서도 분리되지 않았다. 살모넬라 콜레라수스가 분리된 각 기관에 1점씩을 배당하여 각 군마다 분리 스코어를 계산하였다. 그 결과, KO 백신이 예방접종된 돼지가 양친주로 예방접종된 돼지보다 분리 스코어가 낮고, 예방접종 무처리군 보다는 유의적으로 낮은 분리 스코어를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
설사 스코어
평균 1일 설사 스코어는 도 3에 도시하였다. 이 도면은 다른 3군에 비하여 KO의 분리 스코어에 유의적인 차이가 있음을 보여준다. KO 군은 분명하게 가장 낮은 분리 스코어를 나타내었다.
살모넬라 배출
예방접종 및 항원투여 후 돼지의 살모넬라 배출에 대해서는 도 4 및 도 5에 도시하였다. 예방접종 후의 챠트는 양친주가 가장 높은 배출률을 나타낸다는 것을 보여주고 있고, 항원투여후 챠트는 예방접종 무처리군이 가장 오랫동안 살모넬라 콜레라수스를 배출시켜 가장 높은 배출률을 나타낸다는 것을 보여주고 있다.
체중 증가
돼지의 체중 증가는 도 6에 도시하였다. 이 데이터는 각 군 간의 차이를 분 명하고 보여준다. 또한, 동물간의 전반적인 건강의 차이도 보여준다. 예방접종 무처리군은 평균 0.15 ㎏/일의 체중이 감소한 반면, KO 군은 평균 0.6 ㎏/일의 체중 증가를 나타내었다.
결론
살모넬라 콜레라수스 무력화 균주 34682는 백신 균주로서 효능적이고 안전한 것으로 입증되었다. 부검시 살모넬라의 분리 시험에서, 무력화 균주의 경우에는 전혀 나타나지 않았다. 예방접종 무처리군은 가장 높은 재분리율을 나타내었다. 항원투여후 평균 1일 체중 증가와 관련하여, 무력화 균주는 가장 높은 체중 증가를 나타내었고 예방접종 무처리군은 체중 증가를 거의 나타내지 않았다.
KO-34682 살모넬라 콜레라수스 생백신 균주는 안전하고 효능적이다.
SEQUENCE LISTING
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gtg aaa ctg gat gaa atc gct cgg ctg gcc ggt gtc tcg cgc aca act 165
Val Lys Leu Asp Glu Ile Ala Arg Leu Ala Gly Val Ser Arg Thr Thr
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gca agc tac gtt ata aac ggt aaa gca aag caa tac cgc gtg agc gac 213
Ala Ser Tyr Val Ile Asn Gly Lys Ala Lys Gln Tyr Arg Val Ser Asp
20 25 30
aaa acc gta gaa aaa gtc atg gcg gta gtg cgt gag cac aat tac cat 261
Lys Thr Val Glu Lys Val Met Ala Val Val Arg Glu His Asn Tyr His
35 40 45
cct aac gct gtg gct gcc ggg ctg cgt gct gga cgc aca cgt tcc att 309
Pro Asn Ala Val Ala Ala Gly Leu Arg Ala Gly Arg Thr Arg Ser Ile
50 55 60
ggt ctg gtg atc ccg gac ctt gaa aac acg agc tac acc cgt atc gca 357
Gly Leu Val Ile Pro Asp Leu Glu Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Ile Ala
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aac tat ctt gag cgc cag gca cgc cag cgt ggc tac caa ctg ctg atc 405
Asn Tyr Leu Glu Arg Gln Ala Arg Gln Arg Gly Tyr Gln Leu Leu Ile
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gcc tgt tct gaa gat cag ccg gat aac gaa atg cgc tgc att gag cac 453
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ctt ttg caa cgc cag gtg gat gca atc att gtt tca act tcg tta ccg 501
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Val Ala Leu Asp Arg Ala Leu Asp Arg Glu His Phe Thr Ser Val Val
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Claims (9)
- cra 유전자 중의 돌연변이 결과로서 작용성 Cra 단백질을 발현할 수 없는 약독화 생박테리아와 약학적 허용 담체를 포함하는, 병원성 박테리아에 의한 감염이나 이의 병원성 효과에 대하여 동물을 보호하기 위한 약독화 생백신.
- 제1항에 있어서, 병원성 박테리아가 에스케리치아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 악티노바실러스(Actinobacillus), 헤모필러스(Haemophilus), 아에로모나스(Aeromonas), 파스퇴렐라(Pasteurella), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 예르시니아(Yersinia) 속 중 어느 하나에 속하는 것이 특징인 약독화 생백신.
- 제1항에 있어서, 약독화 생박테리아가 병원성 바이러스로부터 유래된 항원, 박테리아 독소, 또는 면역시스템을 자극하는 데 관여하는 단백질을 코딩하는, cra 유전자에 삽입되어 있는 이종 유전자를 가지는 것을 특징으로 하는 약독화 생백신.
- 제3항에 있어서, 병원성 박테리아가 에스케리치아 (Escherichia), 살모넬라 (Salmonella), 악티노바실러스 (Actinobacillus), 헤모필러스 (Haemophilus), 아에로모나스 (Aeromonas), 파스퇴렐라 (Pasteurella), 스트렙토코커스 (Streptococcus) 및 예르시니아 (Yersinia) 속 중 어느 하나에 속하는 것이 특징인 약독화 생백신.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역증강제(adjuvant)를 포함하는 것이 특징인 약독화 생백신.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 동결 건조 형태인 것이 특징인 약독화 생백신.
- 제5항에 있어서, 동결 건조 형태인 것이 특징인 약독화 생백신.
- 약독화 생박테리아와 약학적 허용 담체를 혼합하는 것을 포함하는, 제1항에 기재된 백신의 제조 방법.
- 제1항에 기재된 백신을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 병원성 박테리아에 의한 감염에 대하여 상기 동물을 면역시키는 방법.
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