JP2001039890A - ワクチンに使用するための生きた弱毒細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】医薬に使用するための生きた弱毒細菌、微生物
による疾病の予防に有用な前記細菌を使用したワクチ
ン、ヘテロ遺伝子をもつ生きた弱毒細菌、及び前記ワク
チンと細菌の製造方法の提供。 【解決手段】病原細菌感染又はその病原作用に対する動
物の防御用弱毒生ワクチンであって、ｃｒａ遺伝子にお
ける突然変異の結果として機能的Ｃｒａタンパク質を発
現することができない生きた弱毒細菌と、医薬的に許容
可能なキャリヤーを含む前記弱毒生ワクチン、及びその
製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬に使用するため
の生きた弱毒細菌、微生物による疾病の予防に有用な前
記細菌を使用したワクチン、ヘテロ遺伝子をもつ生きた
弱毒細菌、及び前記ワクチンと細菌の製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来技術及び発明が解決しようとする課題】温血動物
が微生物による疾病を克服する手段は複雑なプロセスで
ある。微生物による疾病に対する免疫は、温血動物が発
病を避けるか又は症状を軽減する手段の１つである。所
与病原体に対する免疫が不完全である結果、病原体に暴
露される集団に罹病又は死亡が生じる。生きた弱毒微生
物を使用したワクチン（弱毒生ワクチン）は非常に有効
な型の免疫応答を誘導することが一般に認められてい
る。このようなワクチンは、一度動物宿主に接種する
と、病原微生物の宿主侵入により早期の細胞性又は体液
性免疫の促進誘発を誘導し、感染が臨床的に重大な程度
に達する前に微生物の増殖を抑制できるという利点があ
る。殺した病原体を使用したワクチン（死菌ワクチン）
ではこの種の応答が得られないことが一般に認められて
いる。しかし、生きた病原体を含むワクチンは弱毒程度
によっては、接種した宿主が接種後に防御の対象となる
疾病に罹患する危険がある。従って、生きた微生物の免
疫特性をもちながら、ワクチン接種後に望ましくない副
作用を生じることのないワクチンを入手できることが望
ましい。

【０００３】細菌を弱毒化するための一般的なアプロー
チは１種以上のビルレンス因子の除去である。しかし、
殆どの場合、ビルレンス因子も免疫誘導に加担してい
る。このような場合、ビルレンス因子を除去すると、細
菌の免疫能を損なうことは避けられない。これは当然望
ましくない状況である。生ワクチンは野生型株の抗原補
体を維持していることが好ましい。

【０００４】更に、生ワクチンは許容できない疾病作用
を避けるために十分に非病原性であると共に、宿主に十
分なレベルの免疫を誘導することが必要である。最後
に、弱毒生ワクチン株はビルレント野生型株に戻る可能
性が実質的にないことが好ましい。

【０００５】多くの細菌属で主要炭水化物代謝に関与す
ることが知られているタンパク質をコードする遺伝子を
欠失させると、このような細菌のｉｎ ｖｉｖｏ生存可
能性を損なわずにｉｎ ｖｉｖｏ弱毒性を誘導できるこ
とが今般意外にも判明した。この遺伝子を欠失する細菌
は意外にも弱毒性を示す。更に、この遺伝子によりコー
ドされるタンパク質は免疫誘導に加担しないので、この
遺伝子を欠失する細菌の抗原量は野生型と同一である。
従って、このような細菌は意外にも医薬製造分野、より
特定的には弱毒生ワクチンの製造に有利に使用できる。

【０００６】本発明により欠失させることができ、欠失
突然変異体のｉｎ ｖｉｖｏ弱毒性を誘導する遺伝子
は、以前はｆｒｕＲ遺伝子として知られていたが、現在
ではｃｒａ遺伝子と呼ばれる遺伝子である。この遺伝子
を欠失する突然変異体は、Ｃｒａ活性の不足に起因する
欠乏を増殖培地に補償しないとｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖で
きないことが判明した。従って、増殖培地にはＣｒａ欠
失突然変異体の増殖を可能にする栄養が存在していなけ
ればならない。

【０００７】一般に、病原細菌は利用可能な栄養にその
代謝を適応させるという意味で自立性である。ｃｒａ遺
伝子は多くの主要代謝経路（下記参照）でこのような適
応機能を果たす。しかし、ｃｒａ遺伝子を欠失させた突
然変異体は炭素源としてのグルコース及び他の多くの糖
類の存在下で完全に十分に増殖することができる。宿主
動物ではこのような糖類を利用できるので、ｃｒａ遺伝
子がｉｎ ｖｉｖｏ条件下で機能的であるとは予想され
なかった。従って、Ｃｒａ⁻突然変異体が宿主で弱毒性
を示すとは予想されなかった。そのため、このような突
然変異体は当技術分野で知られていたが、弱毒生ワクチ
ンの候補として示唆されていなかった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の１態様は、ワク
チンで使用するための、ｃｒａ遺伝子における突然変異
の結果として機能的Ｃｒａタンパク質を発現することが
できない生きた弱毒細菌に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】（以前はＦｒｕＲ（フルクトース
リプレッサータンパク質）として知られており、現在で
はＣｒａ（異化リプレッサー／アクチベータータンパク
質）として知られる）遺伝子産物は炭水化物代謝の多く
の主要経路における調節タンパク質である。

【００１０】ｃｒａ遺伝子産物Ｃｒａは主要炭素代謝を
調節する。より詳細には、Ｃｒａは生合成及び酸化酵素
（例えばＴＣＡ回路、グリオキサル酸回路、糖新生経路
及び電子輸送における主要酵素）をコードする遺伝子の
プロモーターの上流に結合することによりこれらの遺伝
子の転写を正に調節し、解糖酵素（例えばＥｍｂｄｅｎ
−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ及びＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏ
ｆｆ経路における主要酵素）をコードする遺伝子の転写
を負に調節する。

【００１１】炭水化物代謝におけるその重要な地位が故
に、ｃｒａ遺伝子とその遺伝子産物Ｃｒａは細菌界に広
く存在している。Ｃｒａタンパク質は高度に保存された
タンパク質である。例えば大腸菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｅｎｔｅｒｉｃａ種（例えば血清型Ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ及びＤｕｂｌｉ
ｎ）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えばＡ．ｐ
ｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ種（例えばＨ．ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕ
ｍ）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ
ｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種（例えばＰ．ｐｉｓｃｉ
ｄａ及びＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ種（例えばＳ．ｅｑｕｉ及びＳ．ｓｕｉｓ）
及びＹｅｒｓｉｎｉａ種（例えばＹ．ｐｅｓｔｉｓ）に
認められる。

【００１２】ＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａにおける遺伝子自体とその完全ヌクレオチド配列
は１９９１年にＪａｈｒｅｉｓ，Ｋ．ら（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２６：３３２−３３６（１９９
１））により明らかにされている。Ｊａｈｒｅｉｓは、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、血清型Ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及び大腸菌におけるＣｒａタンパク
質が４つの位置でしか相違せず、そのうちの２個も保存
的交換であることを示した。これは、特に大腸菌とサル
モネラにおいて進化中にさほど分岐していない細菌炭水
化物代謝における非常に多くの普遍経路に加担するタン
パク質に予想されたことに当然一致する。Ｃｒａタンパ
ク質の結合メカニズムはＲａｍｓｅｉｅｒ，Ｔ．Ｍ．ら
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：２８−４４（１９９
３））により少なくとも部分的に明らかにされている。
Ｃｒａタンパク質（異化リプレッサー／アクチベーター
タンパク質）の役割と機能は文献に広く記載されてお
り、例えば最近ではＳａｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．とＲａｍｓｅ
ｉｅｒ，Ｔ．Ｍ．（Ｊｏｕｒｎ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７８：３４１１−３４１７（１９９６））による短い
論文に記載されている。

【００１３】このような突然変異は機能的Ｃｒａタンパ
ク質を発現させないものであれば、挿入、欠失、置換又
はその組み合わせのいずれでもよい。機能的Ｃｒａタン
パク質とは野生型タンパク質の調節特性をもつタンパク
質を意味する。従って、その機能の少なくとも１つを欠
損するＣｒａタンパク質は非機能的Ｃｒａタンパク質で
あるとみなされる。

【００１４】本発明により使用される生きた弱毒細菌は
数種の方法で得ることができる。このような細菌を得る
方法の１例はｃｒａ遺伝子をもつ野生型細菌を塩基類似
体等の突然変異誘発物質で処理したり、紫外線処理又は
温度処理するなどの旧来の方法である。

【００１５】機能的Ｃｒａタンパク質を産生しない株は
容易に確認できる。これらの株は炭素源としてのグルコ
ース及び他の糖類の存在下でのみ最少培地で増殖する
（この点がｃｙａ及びｃｒｐ突然変異体から区別され
る）が、単独炭素源としての糖新生基質の存在下では増
殖することができない（Ｃｈｉｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１６９：８９７−８９９（１９８７））。従っ
て、これらの株は非常に容易にｉｎ ｖｉｔｒｏ選択す
ることができる。

【００１６】旧来の突然変異技術により生じる突然変異
の種類は不明である。点突然変異ではないかと思われる
が、点突然変異は、可能性は低いとしても野生型に戻る
ことがある。この小さな危険を避けるためには、トラン
スポゾン突然変異誘発が良好な代案であると思われる。
トランスポゾン突然変異誘発も当技術分野で周知の突然
変異誘発技術である。これは染色体中の局在部位で実施
される突然変異である。トランスポゾン挿入は特定遺伝
子を標的にすることができない。しかし、ｃｒａ突然変
異体はＣｒａ活性欠失の栄養補償なしにはｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ増殖しないので、ｃｒａ突然変異体を確認すること
は非常に容易である。従って、ランダムにトランスポゾ
ン突然変異した細菌のプールから容易に選択することが
できる。予め決められた部位にランダムでなく計画的に
突然変異を導入することが可能な手段は組換えＤＮＡ技
術により得られる。このような突然変異は、突然変異遺
伝子が機能的Ｃｒａをコードしない限り、挿入、欠失、
１個のヌクレオチドを別のヌクレオチドで置換又はその
組み合わせのいずれでもよい。このような突然変異は例
えば多数の核酸の欠失により実施することができる。核
酸１０個程度の非常に小さい欠失でもＣｒａを非機能的
にすることができる。たった１個の核酸の欠失でも、こ
のような突然変異の結果として他の核酸が適正な読み枠
から外れる場合にはＣｒａを非機能的にすることができ
る。３で割り切れない数の核酸の欠失又は挿入によりこ
のようなフレームシフトが生じる。もっと長い配列（例
えば核酸１００個）を欠失させるとより好ましい。完全
ｃｒａ遺伝子を欠失させると更に好ましい。当然のこと
ながら、機能的Ｃｒａをコードしない株を得るために非
常に適しているのは、特にオープンリーディングフレー
ムに停止コドンを導入する突然変異や、オープンリーデ
ィングフレームにフレームシフトを生じる突然変異であ
る。

【００１７】Ｃｒａ⁻突然変異体を構築するための全技
術は周知標準技術である。これらの技術は、ｃｒａ遺伝
子のクローニング、部位特異的突然変異誘発による遺伝
子配列の改変、制限酵素消化後の再連結又はＰＣＲアプ
ローチに続き、野生型ｃｒａ遺伝子を突然変異遺伝子で
置換する（対立遺伝子交換又は対立遺伝子置換）。プラ
スミドにおけるｃｒａ遺伝子のクローニング、遺伝子の
制限酵素消化後のエンドヌクレアーゼ処理、再連結及び
宿主株における相同組換え等の標準組換えＤＮＡ技術は
全て当技術分野で公知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ
／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０
９−６）に記載されている。部位特異的突然変異は例え
ばＣｌｏｎｔｅｃｈから市販されているＴｒａｎｓｆｏ
ｒｍｅｒ（登録商標）キットを使用してｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ部位特異的突然変異誘発により実施することができ
る。ＰＣＲ技術はＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｄｒｅ
ｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９
−４４７−３及びＩＳＢＮ ０−８７９６９−４４７−
５に詳細に記載されている。

【００１８】ｃｒａ遺伝子はＣｒａタンパク質をコード
する遺伝子だけでなく、プロモーター等の直接配列も含
む。更に、Ｃｒａ ｍＲＮＡの適正な翻訳に必須の部位
（例えばリボソーム結合部位）も含む。

【００１９】従って、コーディング領域の突然変異だけ
でなく、適正な転写及び翻訳に必須な配列の突然変異も
本発明の範囲に含むものとする。

【００２０】好ましい態様において、本発明はワクチン
で使用するためのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐａｓｔｅｕｒ
ｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＹｅｒｓｉ
ｎｉａ属の生きた弱毒細菌に関する。

【００２１】本発明のより好ましい形態において、本発
明の生きた弱毒細菌はＳ．ｅｎｔｅｒｉａ血清型Ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｏｌ
ｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｔｙｐｈｉ、Ｇａｌ
ｌｉｎａｒｕｍ、Ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉ、Ａｂｏｒｔｕ
ｓｅｑｕｉ、Ｐｕｌｌｏｒｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＹ．
ｐｅｓｔｉｓから構成される群から選択される。これら
の細菌属はヒト及び種々の動物に病原性の多数の種を含
む。

【００２２】更に好ましい形態において、本発明の生き
た弱毒細菌はＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ又は
Ｙ．ｐｅｓｔｉｓである。

【００２３】更に好ましい形態において、本態様はｃｒ
ａ遺伝子における突然変異を組換えＤＮＡ技術により実
施した本発明の生きた弱毒細菌に関する。

【００２４】ｃｒａ遺伝子のフラグメントもしくは完全
遺伝子の欠失又はヘテロＤＮＡフラグメントの挿入又は
その両者を含む明確且つ計画的になされた突然変異は、
旧来通りに誘導した突然変異に比較して野生型状態に戻
らないという利点がある。

【００２５】従って、より好ましい形態において、本発
明のこの態様はｃｒａ遺伝子が挿入及び／又は欠失を含
む生きた弱毒細菌に関する。

【００２６】今日ではペットと家畜の両者に多量のワク
チンが投与されているので、単にワクチン接種費用の低
減のためだけでも数種のワクチンの併用投与が望ましい
ことは明白である。従って、他の病原微生物又はウイル
スから選択される抗原をコードするヘテロ遺伝子の組換
えキャリヤーとして生きた弱毒細菌を使用することは非
常に有利である。このような組換えキャリヤーを投与す
ると、２種以上の疾病に対する免疫が同時に誘導される
という利点がある。Ｃｒａタンパク質をコードする遺伝
子をヘテロ遺伝子の挿入部位として使用することができ
るので、ワクチンで使用するための本発明の生きた弱毒
細菌はヘテロ遺伝子の非常に適切なキャリヤーとなる。
ｃｒａ遺伝子を挿入部位として使用すると、ｃｒａ遺伝
子が不活化されると同時に、新たに導入したヘテロ遺伝
子を（ホモ細菌遺伝子と同時に）発現させることができ
るという利点がある。このような組換えキャリヤーの構
築は対立遺伝子交換等の標準的な分子生物学技術を使用
して常法により実施することができる。従って、本発明
の別の態様は機能的Ｃｒａタンパク質を産生せず、ヘテ
ロ遺伝子を挿入した好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
及びＹｅｒｓｉｎｉａ属の生きた弱毒組換え細菌に関す
る。このようなヘテロ遺伝子は上述のように例えば他の
病原微生物又はウイルスから選択される抗原をコードす
る遺伝子とすることができる。このような遺伝子は病原
性ヘルペスウイルス（例えばヘルペスウイルスの構造タ
ンパク質をコードする遺伝子）、レトロウイルス（例え
ばｇｐ１６０エンベロープタンパク質）、アデノウイル
ス等から誘導することができる。ヘテロ遺伝子は病原細
菌からも得られる。例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ毒素、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ毒素、外膜タンパク質等の細菌毒素を
コードする遺伝子が非常に適切な細菌ヘテロ遺伝子であ
る。あるいは、インターロイキン又はインターフェロン
等の免疫系の開始に関与するタンパク質をコードする遺
伝子や、免疫調節に関与する別の遺伝子を挿入してもよ
い。

【００２７】ヘテロ遺伝子をｃｒａ遺伝子に挿入する
と、ヘテロ遺伝子の挿入部位を見つけだす必要がないと
同時にｃｒａ遺伝子を欠損させるので有利である。

【００２８】従って、この態様の好ましい形態では、ヘ
テロ遺伝子をｃｒａ遺伝子に挿入する。ヘテロ遺伝子は
ｃｒａ遺伝子のどこかに挿入でき、部分的又は完全に欠
失しているｃｒａ遺伝子の部位に挿入してもよい。

【００２９】ワクチンで使用するための本発明の細菌は
予想外のｉｎ ｖｉｖｏにおける弱毒性であるが免疫原
性を有するという特性により、弱毒生ワクチンの主成分
として非常に適切である。従って、本発明の更に別の態
様は野生型形態がｃｒａ遺伝子を含む細菌による感染に
対して動物及びヒトを防御するための弱毒生ワクチンに
関する。

【００３０】このようなワクチンは免疫原として有効な
量のワクチンで使用するための本発明の生きた弱毒細菌
又は本発明の生きた組換えキャリヤー細菌と、医薬的に
許容可能なキャリヤーを含む。

【００３１】ワクチンはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐａｓｔ
ｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＹｅ
ｒｓｉｎｉａの群から選択される本発明の生きた弱毒細
菌を含むことが好ましい。

【００３２】免疫原として有効とは、ワクチン接種時の
生きた弱毒細菌の投与量が細菌のビルレント形態に対す
る有効な免疫応答を宿主に誘導するために十分であるこ
とを意味する。

【００３３】免疫原として有効な量の上記生きた弱毒細
菌に加え、本発明のワクチンは医薬的に許容可能なキャ
リヤーも含む。このようなキャリヤーは単に水でもよい
し、例えば細菌を培養した培養液でもよい。別の利用可
能なキャリヤーは例えば生理的塩濃度の溶液である。

【００３４】有用な投与量は年齢、体重及びワクチン接
種する動物、投与方法並びにワクチン接種の対象となる
病原体の種類によって異なる。

【００３５】ワクチンは免疫応答を誘導するために十分
な任意用量の細菌を含むことができる。例えば、細菌１
０^３〜１０^１０個が非常に適切な用量である。

【００３６】場合により、アジュバント活性をもつ１種
以上の化合物をワクチンに加えてもよい。アジュバント
は免疫系の非特異的刺激剤である。アジュバントはワク
チンに対する宿主の免疫応答を高める。当技術分野で公
知のアジュバントの例はフロイント完全及び不完全アジ
ュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、
ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例
えばヨーロッパ特許第ＥＰ１０９９４２号参照）、サポ
ニン、鉱油、植物油及びカルボポールである。

【００３７】粘膜投与に特に適したアジュバントは例え
ば大腸菌熱変性性毒素（ＬＴ）又はコレラ毒素（ＣＴ）
である。

【００３８】他の利用可能なアジュバントは例えば水酸
化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニ
ウム、オイルエマルション（例えばＢａｙｏｌ Ｆ（登
録商標）又はＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標））、サポ
ニン又はビタミンＥ可溶分である。

【００３９】従って、好ましい形態において、本発明の
ワクチンはアジュバントを含む。

【００４０】本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリ
ヤー又は希釈剤の他の例としては安定剤が挙げられ、例
えばＳＰＧＡ、炭水化物（例えばソルビトール、マンニ
トール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラ
ン）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）、
タンパク含有物質（例えばウシ血清又は脱脂乳）及び緩
衝液（例えばリン酸緩衝液）である。

【００４１】特にこのような安定剤をワクチンに加える
と、ワクチンは非常に凍結乾燥し易くなる。従って、よ
り好ましい形態では、ワクチンは凍結乾燥形態である。

【００４２】動物又はヒトに投与するには、本発明のワ
クチンは特に鼻腔内、皮内、皮下、経口、エアゾール又
は筋肉内の経路で投与することができる。家禽に投与す
るには、羽板及び点眼投与が非常に適切である。

【００４３】更に別の態様は、野生型細菌感染又は感染
の病原作用に対する動物及びヒトの防御用ワクチンの製
造のための、本発明のワクチン用細菌又は組換え細菌の
使用に関する。

【００４４】本発明の更に別の態様は、本発明のワクチ
ンの製造方法に関する。このような方法は、本発明の生
きた弱毒細菌又は本発明の生きた組換えキャリヤー細菌
と医薬的に許容可能なキャリヤーを混合することを特徴
とする。

【００４５】

【実施例】実施例１ Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１ Ｆａｄ⁻に
おける突然変異遺伝子の同定、クローニング及び配列決
定 突然変異体Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１
Ｆａｄ⁻のトランスポゾン突然変異遺伝子を同定、クロ
ーニング及び配列決定した。

【００４６】前記ＳＲ−１１ Ｆａｄ⁻を非病原性にす
る突然変異遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１に示
す。

【００４７】配列番号２は配列番号１のヌクレオチド配
列によりコードされるタンパク質分子のアミノ酸配列を
示す。

【００４８】Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１
Ｆａｄ⁻はｃｒａ遺伝子における突然変異体であるこ
とが分かった。トランスポゾン挿入点はｃｒａ翻訳停止
コドンの３’末端から約４５塩基対の範囲内に位置する
ことが判明した。

【００４９】１．９ｋｂのＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
ＳＲ−１１ ＤＮＡフラグメントと、１．１ｋｂの
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１ ＤＮＡフラ
グメントに挟まれた１．５ｋｂのＴｎ １０ｄ Ｃａｍ
インサートを含む４．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメントを
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＰｓｔＩ
部位に挿入した。得られたプラスミドｐＪＨＡ７をエレ
クトロポレーションにより大腸菌ＨＢ１０１に導入し
た。Ｔｎ １０ｄ Ｃａｍインサートの両側の領域をサ
ンガージデオキシ熱サイクリング法により配列決定し
た。Ｔｎ １０ｄ Ｃａｍインサートのすぐ両側のヌク
レオチド配列はＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｃｒａ（ｆ
ｒｕＲ）遺伝子に１００％相同であることが判明し、挿
入点はｃｒａ翻訳停止コドンの３’末端から４５ヌクレ
オチドであることが判明した。これは、Ｓ．ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１ Ｆａｄ⁻がｃｒａ突然変異
体であることを示唆している。

【００５０】ＳＲ−１１と異なり、ＳＲ−１１ Ｆａｄ
⁻はクエン酸、オレイン酸、ピルビン酸、酢酸、コハク
酸及びフマル酸を含むＭ９最少寒天プレートで増殖する
ことができなかった。

【００５１】Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１
野生型ｃｒａ（ｆｒｕＲ）をＰＣＲにより増幅し、ｐＢ
Ｒ３２２のアンピシリン耐性遺伝子のＰｓｔＩ部位に挿
入した。得られたプラスミドｐＪＨＡ８は炭素源として
上記化合物の各々を利用してそれらの野生型親と同様に
増殖するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１Ｆａ
ｄ⁻の能力を回復した。これらの実験は、Ｓ．ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１⁻がｃｒａ（ｆｒｕＲ）突
然変異体であることを裏付けている。

【００５２】ＳＲ−１１ Ｆａｄ⁻はバクテリオファー
ジＰ２２ＨＴ１０５ｉｎｔによりＬＴ−２のミニトラン
スポゾン突然変異体からクロラムフェニコール耐性をＳ
Ｒ−１１に形質導入することにより構築した。従って、
可能性は低いが、ＳＲ−Ｆａｄ⁻の非病原性は欠損ｃｒ
ａ遺伝子に起因するのでなく、形質導入後に一部のＳＲ
−１１ ＤＮＡが損失、例えば病原性島が損失したため
であるとも考えられた。そこで、以下に記載するよう
に、ＳＲ−Ｆａｄ⁻に存在すると同一の突然変異をｃｒ
ａ遺伝子に含む以外はＳＲ−１１と同一の株（以下、Ｓ
Ｒ−１１ Ｃｒａ ^ｍｏｄＡＸ−２と呼ぶ）を対立遺伝子
交換により構築した。

【００５３】アンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリ
ン耐性遺伝子（ｔｅｔＡＲ）の両者を含む自殺ベクター
であるｐＬＤ５５のＰｓｔＩ部位にＳＲ−１１ Ｆａｄ
⁻突然変異ｃｒａ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺
伝子を含むｃｒａ）を含む４．３ｋｂのＰｓｔＩ ＳＲ
−１１ Ｆａｄ⁻ＤＮＡフラグメントを挿入した。これ
をｐＭＪＮ１０と命名した。ｐＭＪＮ１０をエレクトロ
ポレーションにより大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒに導入し
た。大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒ（ｐＭＪＮ１０）をＳＲ
−１１と交配後、数種のアンピシリン、テトラサイクリ
ン及びクロラムフェニコールＳＲ−１１接合体がオレイ
ン酸、クエン酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸及びフマ
ル酸を単独炭素源として利用できるか否かを試験した。
相同配列を使用する単一交差によりｐＭＪＮ１０を染色
体に組み込んだ場合、即ち突然変異及び野生型ｃｒａ対
立遺伝子の両者が染色体に存在する場合には、全接合体
は予想通りこれらの化合物を利用することができた。こ
れらの「組込体」のうちの５個について遊離プラスミド
としてｐＭＪＮ１０が存在するか否かを試験した処、存
在するものは皆無であり、プラスミドがＳＲ−１１染色
体に挿入されたことが更に示唆された。５個の組込体の
各々をクロラムフェニコール添加ルリア寒天プレートで
画線培養した。この場合には、２回目の交差を行った細
胞は、染色体に残っているｃｒａ対立遺伝子がクロラム
フェニコール耐性遺伝子を含む突然変異対立遺伝子であ
る場合にしか生存しない。次に、画線培養した組込体の
試料をテトラサイクリン感受性選択寒天（ＴＳＳ寒天）
で画線培養した。ＴＳＳ寒天はフマル酸を含んでおり、
テトラサイクリン感受性細胞即ち自殺プラスミドを失っ
た細胞は染色体中にプラスミドを維持しているテトラサ
イクリン耐性細胞に比較して非常に大きいコロニーとし
て増殖する。クロラムフェニコール耐性、アンピシリン
及びテトラサイクリン感受性、並びにオレイン酸、酢
酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸及びフマル酸を単
独炭素源として利用する能力について合計３４個の大き
いコロニーを試験した。３４個の単離株のうち、６個は
クロラムフェニコール耐性、アンピシリン及びテトラサ
イクリン感受性であり、上記化合物を単独炭素源として
利用することができなかった。単離株のうちの１個（Ｓ
Ｒ−１１ Ｃｒａ^ｍｏｄＡＸ−２（ＡＸは対立遺伝子交
換を意味する）と呼ぶ）をｐＢＲ３２２又はｐＪＨＡ８
（ｐＪＨＡ８は野生型ｃｒａ遺伝子を含む）で形質転換
し、両者株がグルコース、グリセロール、オレイン酸、
酢酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸及びフマル酸を
単独炭素源として利用する能力を試験した。ＳＲ−１１
Ｃｒａ^ｍｏｄＡＸ−２（ｐＢＲ３２２）と異なり、Ｓ
Ｒ−１１ Ｃｒａ ^ｍｏｄＡＸ−２（ｐＪＨＡ８）は上記
化合物を単独炭素源として利用することができ、ＳＲ−
１１ Ｃｒａ^ｍｏｄＡＸ−２がｃｒａ突然変異体である
ことが示唆された。どちらの株も予想通り、グルコース
とグリセロールを単独炭素源として利用することができ
た。

【００５４】機能的ｃｒａ（ｆｒｕＲ）遺伝子がＳ．ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＲ−１１をビルレントにする
か否かを調べるために、以下の実験を実施した。

【００５５】ＢＡＬＢ／ｃマウス４頭にＳＲ−１１
（２．１×１０^８ｃｆｕ／頭）、５頭にＳＲ−１１ Ｃ
ｒａ^ｍｏｄＡＸ−２（２．８×１０^８ｃｆｕ／頭）を経
口感染させた。感染後８日までに全４頭のＳＲ−１１感
染マウスは死亡したが、ＳＲ−１１ Ｃｒａ^ｍｏｄＡＸ
−２を感染させた全５頭は健康であった（表１）。ＳＲ
−１１ Ｃｒａ^ｍｏｄＡＸ−２は、ｃｒａにＳＲ−１１
Ｃｒａ^ｍｏｄと同一の突然変異が存在する以外はＳＲ
−１１と同一であるので、ＬＴ−２株からの形質導入に
よるＳＲ−１１ Ｃｒａ^ｍｏｄの構築中にそのビルレン
ス低下の原因となるようなｃｒａに無関係の異常が発生
したとは考えられない。

【００５６】ｃｒａ遺伝子にクロラムフェニコール耐性
カセットを挿入した結果、下流遺伝子に極性作用を生じ
たので、ＳＲ−１１ Ｆａｄ⁻の弱毒は欠損ｃｒａ遺伝
子に起因しないとも考えられる。そこで、ＳＲ−１１
Ｃｒａ^ｍｏｄ（ｐＪＨＡ８）がビルレンスを回復したか
否かを調べるために、野生型ｃｒａ遺伝子のみを含むｐ
ＪＨＡ８でＳＲ−１１ Ｃｒａ^ｍｏｄを相補した。対照
として、ｐＪＨＡ８の構築に使用したベクターであるｐ
ＢＲ３２２でＳＲ−１１ Ｃｒａ^ｍｏｄを相補した。Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウス４頭にＳＲ−１１ Ｃｒａ^ｍｏｄ（ｐ
ＢＲ３２２）３．１×１０^８ｃｆｕ／頭、４頭にＳＲ−
１１ Ｆａｄ⁻（ｐＪＨＡ８）４．３×１０^８ｃｆｕ／
頭を経口感染させた。感染後９日までに、ＳＲ−１１
Ｃｒａ^{ｍ ｏｄ}（ｐＪＨＡ８）を感染させた４頭のうち３
頭が死亡したが、ＳＲ−１１ Ｃｒａ^ｍｏｄ（ｐＢＲ３
２２）を感染させた４頭は健康であった（表１）。死亡
した全マウスの肝臓と脾臓は臓器当たり１０^８ｃｆｕを
上回るＳＲ−１１ Ｆａｄ ⁻（ｐＪＨＡ８）を含んでい
た。この結果、クロラムフェニコールカセットによるｃ
ｒａ遺伝子の不活化が非病原性を誘導する下流作用を生
じるという可能性はなくなり、ＳＲ−１１ビルレンスに
は機能的ｃｒａ遺伝子が必要であることが明らかであ
る。

【００５７】

【表１】

【００５８】種々の細菌属におけるｃｒａ遺伝子の検出 ４種のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株と、Ｓ．ｅｎｔｅ
ｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．ｄｕ
ｂｌｉｎ及びＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ株各１種に
ついて、サザンハイブリダイゼーションによりｃｒａ遺
伝子を試験した。いずれの場合もＳＲ−１１と同一寸法
の４．３ｋｂ ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメントにｃｒａ
遺伝子が存在していた。６種の異なる病原性大腸菌株を
試験した処、全株にｃｒａ遺伝子が検出されたが、６種
の株で３種の異なる寸法のＰｓｔＩフラグメントに存在
していた。更に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉ
ｃｉｄａｅ株と、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＹｅｒｓｉｎｉａ細菌属株も
試験した処、全株にｃｒａ遺伝子が検出された。

【００５９】上記細菌におけるｃｒａ遺伝子の存在は次
のように検出した。これらの株のゲノムＤＮＡをＰｓｔ
Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０単位で３７℃で一晩消化し
た。ゲル電気泳動（０．７％アガロース、１×ＴＡＥ）
を使用して各種寸法のＰｓｔＩＤＮＡフラグメントを分
離した。分離したＤＮＡをＳ＆Ｓ Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔ
ｔｅｒシステム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃ
ｈｕｅｌｌ）によりアルカリ条件下で３時間かけて正荷
電ナイロンにトランスファーした。膜を３０分間９０℃
で焼付け、ＤＮＡを膜に結合した。次に、Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｃｒａ遺伝子の７
００塩基対フラグメントをＤＩＧ標識し、膜をプローブ
するために使用した。５×ＳＳＣ、０．１％Ｎ−ラウロ
イルサルコシン、０．０２％ＳＤＳ、１．５％ブロッキ
ング剤を含むハイブリダイゼーション緩衝液（ＣＳＰＤ
によるＤＩＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ
Ｋｉｔ ＩＩ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）中６２℃で２〜４時間（回転びんハイブリダイゼー
ションオーブンで）膜をプレハイブリダイズした。標識
プローブを変性させ、新鮮なハイブリダイゼーション緩
衝液に加え、ブロットを６２℃で１６〜２０時間インキ
ュベートした。ブロットを６２〜６５℃で５分間２×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。次に、ブロット
を６０℃で１５分間０．１％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣで
２回洗浄した。推奨条件を次のように変更してブロット
を展開した。ブロッキング溶液では２％ブロッキング剤
を使用し（通常は１％使用）、ブロットを１時間ブロッ
クし（通常ブロッキング時間は３０分間）、ＤＩＧ標識
プローブの検出に低濃度抗体を使用した（通常は７０％
濃度を使用）。これらの変更は低バックグラウンドシグ
ナルについて製造業者により推奨されている。

【００６０】実施例２ Ｃｒａ⁻Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ株ＳＲ１１ Ｃｒａ ^ｍｏｄによるニワトリのワクチン
接種 ワクチン接種効果。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株の増殖条件
は実施例１に記載したと同様に行った。第１の実験では
ブロイラー２０羽２群（３日齢）にＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｔ．ＳＲ１１ Ｃｒａ^ｍｏｄ６×１０^７ＣＦＵをＰ
ＢＳに加えて経口接種した。一方の群は１１日後に同一
株８．３×１０^７ＣＦＵをブースター投与した。１８日
後に、両群をビルレント野生型株細菌１．９×１０^９個
で皮下、筋肉内及び経口攻撃した。結果を表２に示す。

【００６１】

【表２】

【００６２】併用ワクチン接種安全性及び効果実験。第
２の実験では、ワクチンの効果とワクチンの安全性の両
方を調べた。ワクチンの安全性は成長抑制に基づいて測
定した。ブロイラー１５羽１群にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔ．ＳＲ１１ Ｃｒａ^{ｍｏ ｄ}２．７×１０^８ＣＦＵを
培地に加えて経口接種した。ブロイラー１５羽の別の群
には同一株１．３×１０^８ＣＦＵをＰＢＳ中に加えて経
口接種した。１８日後に両群をビルレント野生型株細菌
６．５×１０^８個で皮下、筋肉内及び経口攻撃した。結
果を表３に示す。

【００６３】

【表３】

【００６４】結果：２つの試験から明らかなように、高
用量で攻撃したにも拘わらず、Ｃｒａ⁻Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株では非常に高レベル
の防御が得られる。更に、ワクチン接種の結果として有
意成長抑制は認められない。従って、Ｃｒａ⁻Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株は野生型細菌
感染に対する家禽の防御用弱毒生ワクチンで使用するの
に非常に適切であると結論することができる。

【００６５】実施例３ 序論 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ Ｃ
ｒａ⁻ノックアウト（ＫＯ）株３４６８２及び３５２７
６の安全性をｃｒａ^＋親株３４６８２及び３５２７６と
比較検討するために、ブタ攻撃試験を実施した。これら
のノックアウト突然変異株はＣｒａ^ｍｏｄＡＸ−２の構
築について上述したと同一のプラスミド及び方法を使用
して作製した。

【００６６】１．ブタ安全性試験 Ａ．動物及び飼育 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病歴のない養豚場からＳａｌｍｏ
ｎｅｌｌａワクチンを接種したことのない５〜６週齢ブ
タ２０頭を購入した。ブタを５頭ずつ４群に分けた。全
試験を通してブタは４個の隔離室で飼育した。

【００６７】Ｂ．攻撃 各群５頭に５〜６週齢で攻撃した。ブタを鼻腔内（０．
５ｍｌ／鼻孔）及び経口（１．０ｍｌ培養物＋４．０ｍ
ｌ細菌希釈剤）攻撃した。攻撃培養物は約９．０×１０
^８ＣＦＵ／ｍｌとした。攻撃後にブタの体重減少、下痢
及び直腸体温上昇等のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の典型
的臨床徴候を毎日観察した。

【００６８】Ｃ．屠殺 攻撃から７日後にブタを安楽死させた。ブタを解剖し、
肺、肝臓、脾臓、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び回腸を
培養し、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓを増殖させた。

【００６９】Ｄ．体重増加 初期体重を最終体重から引き、攻撃から屠殺までの日数
で割ることにより、１日平均増加（ＡＤＧ）を計算し
た。群ＡＤＧは個体ブタＡＤＧの平均である。

【００７０】２．マウス安全性試験 ｃｒａ^＋親株３４６８２及び３５２７６とｃｒａ⁻ノッ
クアウト（ＫＯ）株３４６８２及び３５２７６の各Ｓ．
ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ株のＬＤ_５０を調べるために
マウス試験を実施した。

【００７１】Ａ．動物 体重１６〜２０ｇのＣＦ−１ Ｓａｓｃｏマウス２００
頭を１０頭ずつ２０群に分け、マウス安全性試験を行っ
た。全試験を通してマウスは同一室内で別タブに入れて
飼育した。

【００７２】Ｂ．攻撃 各群１０頭からなる５サブ群に各株を投与した。５種の
異なる希釈率の株（１０^−３〜１０^−７）を使用してこ
れらのサブ群を０．２５ｍｌで腹腔内（ＩＰ）攻撃し
た。４種の株の各々の凍結種子を１０^−３〜１０^−７に
希釈した。これらの希釈液の各々をマウス１０頭に腹腔
内（０．２５ｍｌ）注射した。

【００７３】結果 Ｉ．ブタ安全性試験 Ａ．体重増加 ブタの体重増加を図１に示す。これらのデータはＫＯ株
で攻撃したブタと親株で攻撃したブタの間の差を明白に
示している。データは更に、動物の総合健康差も示して
いる。親株で攻撃した両群のブタは攻撃時から屠殺まで
体重が減少したが、ＫＯ株で攻撃したブタは約０．７５
ｋｇ／日増加した。

【００７４】ＩＩ．マウス安全性試験 Ａ．死亡 マウス試験の結果を下表４に示す。右欄は各株のＬＤ
_５０をＣＦＵで示す。ノックアウト株は明白に高弱毒レ
ベルを示す。

【００７５】

【表４】

【００７６】結論 ブタ安全性試験から明らかなように、Ｃｒａノックアウ
ト（ＫＯ）株は親株に比較して攻撃後に有意に高い体重
増加を生じる。これはＣｒａ ＫＯ突然変異株の弱毒性
を裏付けている。ブタ安全性試験に加え、マウス安全性
試験もＣｒａＫＯ株が弱毒株であることを示しており、
ＫＯ突然変異株のＬＤ_５０は親株よりも著しく高い。

【００７７】実施例４ 序論 本実施例の目的は、ＫＯ−３４６８２ Ｃｒａ突然変異
株の安全性を親株と比較評価し、ヘテロビルレントＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ株３５２７６攻撃に対するＳａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ株ＫＯ−３４６８２の効果を調べることであ
った。更に、ＫＯ−３４６８２ Ｃｒａ突然変異株の効
果を非ワクチン接種対照と比較した。

【００７８】動物及び飼育 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病歴のない養豚場からＳａｌｍｏ
ｎｅｌｌａワクチンを接種したことのない３週齢ブタ２
０頭を購入した。ブタを５頭ずつ４群に分け、４個の別
々の隔離室で飼育した。

【００７９】ワクチン及びワクチン接種 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ株Ｋ
Ｏ−３４６８２、３４６８２親約１×１０^９ＣＦＵ／ｍ
ｌを３週齢のブタに経口接種するか、又は接種せずにお
いた。

【００８０】攻撃 ワクチン接種から２１日後にビルレントＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ株３５２７６でブタ
を鼻腔内（０．５ｍｌ／鼻孔）及び経口（１．０ｍｌ培
養物＋４．０ｍｌ細菌希釈剤）攻撃した。３５２７６攻
撃株は攻撃前にナリジクス酸（Ｎａｌ）耐性にし、Ｎａ
ｌを加えたプレートを使用すると、攻撃株をワクチン株
から区別できるようにした。攻撃後、ブタの体重減少、
下痢及び直腸体温上昇等のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の
典型的臨床徴候を毎日観察した。糞便を毎日培養するこ
とにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ排出期間を調べた。

【００８１】攻撃から９日後にブタを安楽死させた。ブ
タを解剖し、ナリジクス酸８０μｇ／ｍｌを加えたＨｅ
ｋｔｏｅｎ ｅｎｔｅｒｉｃ（ＨＥ）寒天プレートで
肺、肝臓、脾臓、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び回腸を
培養し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉ
ｓを増殖させた。

【００８２】下痢得点 攻撃後に下痢を生じた日毎に各ブタに１点を与えること
により下痢得点を計算した。試験終了時に、試験中の得
点の合計を攻撃から屠殺までの日数で割った。この数に
１００を掛けて下痢日数の百分率とした。

【００８３】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ排出 ブタの糞便を毎日採取し、ワクチン接種後と攻撃後のＳ
ａｌｍｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ排出期間
を調べた。マイナス結果の２日後に糞便採取を停止し
た。糞便はＨＥプレート上で滴定単離した。試料の各希
釈後に観察される増殖に相関して得点を与えた。得点は
次のように割り当てた。

【００８４】 １０^−１ １点 １０^−２ ２点 １０^−３ ３点 １０^−４ ４点 １０^−５ ５点

【００８５】体重増加 初期体重を最終体重から引き、攻撃から屠殺までの日数
で割ることにより、１日平均増加（ＡＤＧ）を計算し
た。群ＡＤＧは個体ブタＡＤＧの平均である。

【００８６】結果： ワクチン接種後死亡 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ野生
型親株３４６８２をワクチン接種したブタ２頭はワクチ
ン接種後に死亡した。この群の残りの３頭は試験終了時
まで生存した。

【００８７】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ単離／剖検得点 図２は各種臓器のＳ．ｃ．単離結果を示す。全臓器でＫ
Ｏワクチンを接種したブタ群は親及び非ワクチン接種群
と対照的にどの臓器からも単離されなかった。非ワクチ
ン接種群は全５頭から回腸とＭＬＮでＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓが単離されたが、親株
ではこれらのどちらの臓器でも単離されなかった。Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓが単離さ
れた各臓器に１点を割り当てることにより、各群の単離
得点を計算した。その結果、ＫＯワクチンを接種したブ
タは親株を接種したブタよりも得点が低く、非ワクチン
接種群より有意に低かった。

【００８８】下痢得点 １日平均下痢得点を図３に示す。同図は、他の３群に比
較してＫＯ得点の有意差を示している。ＫＯ群は明白に
最低得点を示した。

【００８９】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ排出 ワクチン接種後及び攻撃後のブタのＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ排出を図４及び５に示す。ワクチン接種後のグラフに
よると親の排出レベルが最高である。攻撃後のグラフで
は、非ワクチン接種群が最も長期間にわたってＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓを排出し、最高
得点を示した。

【００９０】体重増加 ブタの体重増加を図６に示す。これらのデータは各群間
の差を明白に示している。動物間の総合健康差も示して
いる。非ワクチン接種群は平均０．１５ｋｇ／日減少し
たが、ＫＯ群は平均０．６ｋｇ／日増加した。

【００９１】考察 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓノッ
クアウト株３４６８２は効果的で安全なワクチン株であ
ることが判明した。剖検時のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの単
離はノックアウト株では完全に陰性であった。非ワクチ
ン接種群は再単離が最高であった。攻撃後の１日平均体
重増加については、ノックアウト株は体重増加が最高で
あり、非ワクチン接種群は体重増加が有意に低かった。

【００９２】結論 ＫＯ−３４６８２Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒ
ａｅｓｕｉｓ生ワクチン株は安全且つ有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＵＳポンドで表した攻撃後ブタ１頭１日当たり
の１日平均体重増加。この体重に０．４５３６を掛ける
と、ｋｇで表した体重が得られる。

【図２】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕ
ｉｓを各種組織から再単離することができたブタの百分
率（ＭＬＮ＝腸間膜リンパ節）。

【図３】攻撃後下痢得点の平均百分率。

【図４】ワクチン接種後の１日平均Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ排出。

【図５】攻撃後の１日平均細菌排出

【図６】ＵＳポンドで表した攻撃後のブタ１頭１日当た
りの１日平均体重増加。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 １７１ Ａ６１Ｐ 31/04 １７１ 43/00 １０５ 43/00 １０５ // Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｌ 1/20 1/20 Ａ Ｅ 15/01 15/00 Ｅ (72)発明者 デイビツド・シー・ロー アメリカ合衆国、ロード・アイランド、ナ ラガンセツト・02882、ロビンソン・スト リート・74 (72)発明者 ペトラス・ヨハネス・マリア・ナイテン オランダ国、5831・エル・デー・ボツクス メール、デ・リンデ・10

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 病原細菌感染又はその病原作用に対する
   動物の防御用弱毒生ワクチンであって、ｃｒａ遺伝子に
   おける突然変異の結果として機能的Ｃｒａタンパク質を
   発現することができない生きた弱毒細菌と、医薬的に許
   容可能なキャリヤーを含む前記弱毒生ワクチン。
2. 【請求項２】 病原細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓ
   ａｌｍｏｎｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕ
   ｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐ
   ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及
   びＹｅｒｓｉｎｉａ属のいずれかに属することを特徴と
   する請求項１に記載の弱毒生ワクチン。
3. 【請求項３】 生きた弱毒細菌がヘテロ遺伝子をもつこ
   とを特徴とする請求項１に記載の弱毒生ワクチン。
4. 【請求項４】 病原細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓ
   ａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、
   Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐａｓ
   ｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＹ
   ｅｒｓｉｎｉａ属のいずれかに属することを特徴とする
   請求項３に記載の弱毒生ワクチン。
5. 【請求項５】 アジュバントを含むことを特徴とする請
   求項１から４のいずれか一項に記載の弱毒生ワクチン。
6. 【請求項６】 凍結乾燥形態であることを特徴とする請
   求項１から５のいずれか一項に記載の弱毒生ワクチン。
7. 【請求項７】 病原細菌感染又は感染の病原作用に対す
   る動物の防御用ワクチンの製造のための、ｃｒａ遺伝子
   における突然変異の結果として機能的Ｃｒａタンパク質
   を発現することができない生きた弱毒細菌の使用。
8. 【請求項８】 生きた弱毒細菌がヘテロ遺伝子をもつこ
   とを特徴とする請求項７に記載の使用。
9. 【請求項９】 生きた弱毒細菌を医薬的に許容可能なキ
   ャリヤーと混合することを含む請求項１に記載のワクチ
   ンの製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載のワクチンを動物に投
    与することを含む病原細菌感染に対する動物の免疫方
    法。