JP2007504155A

JP2007504155A - 弱毒細菌生ワクチン

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Publication number: JP2007504155A
Application number: JP2006524882A
Authority: JP
Inventors: コーエン，ポール・エス
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-26
Publication date: 2007-03-01
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Abstract

本発明は医薬用弱毒生菌に関する。本発明は微生物病の予防に有用なこれらの弱毒生菌に基づくワクチンにも関する。更に、本発明はワクチンの製造における弱毒生菌の使用にも関する。更に、本発明は前記ワクチンの製造方法に関する。

Description

本発明は医薬用弱毒生菌、微生物病の予防に有用な前記細菌に基づくワクチン、前記ワクチンの製造における前記弱毒生菌の使用、及び前記ワクチンの製造方法に関する。

微生物病に対する免疫は温血動物の発病を回避するか又は病状を弱める１つの手段である。所与病原体に対する不完全な免疫は病原体に暴露された集団に罹病と死亡をもたらす。生きた弱毒微生物に基づくワクチン（弱毒生ワクチン）は非常に有効な型の免疫応答を誘導することが一般に認められている。このようなワクチンは動物宿主に接種すると、微生物病原体の宿主侵入により初期細胞性又は体液性免疫応答誘導が促進され、感染の程度が臨床的に有意になる前に微生物の増殖をくい止めることができるという利点がある。死滅病原体に基づくワクチン（死菌ワクチン）はこの型の応答を達成できないことが一般に認められている。しかし、死菌ワクチンと異なり、生きた病原体を含むワクチンは弱毒化レベルによってはワクチン接種した宿主が接種の結果として防御対象疾病に感染する危険がある。

近縁群であるエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属とサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属に属する細菌に対するワクチンは上記一般原則に従う。これらの細菌群の多くのメンバーは消化管及び膀胱に感染するという事実により病原性である。これらの細菌の病原作用は消化管及び膀胱の粘膜層に定着する能力に密接な関係がある。定着現象の結果として病原体は消化管及び／又は膀胱に持続的に存在し、病原体は粘膜層に非常に密接に接触し、その結果、更に他の組織に侵入することができる。即ち、同時に逆説的に言えば、免疫系が所定レベルの免疫応答を発生するように誘因されるのは、これらの細菌が消化管及び膀胱に定着し、同時に疾病を誘発するためである。この免疫応答の発生は定着細胞の病原作用を抑制するためには明らかに遅過ぎる。

従って、生きた微生物の免疫属性をもちながら、ワクチン接種の結果として望ましくない副作用を生じることのないワクチンが得られるならば望ましい。

しかし、弱毒生ワクチンには以下の矛盾がある。細菌を弱毒化するためのアプローチの１つは１種以上の毒性因子の除去である。しかし、殆どの場合に毒性因子は免疫を誘導する役割もある。これらの場合には、毒性因子を欠失させると細菌の免疫原性の低下を避けられない。生ワクチンは非毒性でありながら野生型株の抗原性補体を保持することが好ましい。

本発明の目的は上記欠点のいくつかを解消した弱毒生ワクチンを提供することである。

エシェリキア及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属群の細菌は数種の毒性因子を有する。エシェリキア属とサルモネラ属の両者で定着に関わるものを含めて多数の毒性因子の合成に関与する単一遺伝子の１例はＬｅｕＸをコードする遺伝子である。この遺伝子は特定ｔＲＮＡとしてｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをコードする。配列番号１はサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｌｅｕＸ遺伝子の配列を示す。

ＬｅｕＸと定着及び線毛合成におけるその役割は例えばＮｅｗｍａｎら（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ１２２：２８１−２８７（１９９４））、Ｎｅｗｍａｎら（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ１７：３０１−３１１（１９９４））及びＣｏｌｌｉｇｈａｎ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄＷｏｏｄｗａｒｄＭ．Ｊ．（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８０：２３５−２４５（２００１））により記載されている。

ＲｉｔｔｅｒらはＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１７：１０９−１２１（１９９５）において毒性におけるＬｅｕＸ遺伝子産物の種々の役割を詳細に分析している。同著者らはＬｅｕＸの存在がいずれも運動性と定着に関与する１型線毛と鞭毛の合成の刺激に極めて重要であると共に、鉄取込みに関与する蛋白質の合成、腸内バクトリンの合成及びインビトロ毒性にも極めて重要であることを示した。

これらの特徴はいずれも毒性に大きく寄与することが知られている。従って、これらの特徴は同時に免疫応答の最重要ターゲットでもある。線毛と鞭毛に対する免疫応答は定着と運動性を妨害し、腸内バクトリンと鉄取込みに関与する蛋白質に対する免疫応答は毒性作用を妨害し、細菌が必須養分である鉄を獲得できないようにする。

従って、ワクチンの観点では、ワクチン中に存在すべき主要な選択毒性因子はＬｅｕＸの存在下に発現される毒性因子であると思われる。従って、選択ワクチンは（好ましくは）１型線毛、鞭毛、腸内バクトリン及び鉄取込みに関与する蛋白質を含むサブユニットワクチンであると思われる。このようなワクチンは第１に安全であり、第２にこれらの４種の毒性因子に対する免疫を誘導し、そうすることによって感染に対する防御を提供する可能性が高い。

ＬｅｕＸ遺伝子を欠失させた生きた弱毒株は上記毒性因子を生成しない。このようなＬｅｕＸ陰性欠失変異体をワクチンで使用したならば、これらの最重要毒性因子即ち１型線毛、鞭毛、腸内バクトリン及び鉄取込みに関与する蛋白質に対する防御を誘導しないと思われる。

従って、ＬｅｕＸは弱毒生ワクチン株における欠失の非常に魅力的な候補であると考えられる。

更に、ＬｅｕＸ陰性欠失変異体の場合のように（１型線毛及び鞭毛の不足により）定着能をもたない細菌は宿主細胞と緊密に接触しないと予想されるので、迅速に除去されると想定される。従って、このような細菌はＬｅｕＸ遺伝子産物の不在下でも存在している毒性因子に対して実質的免疫を誘導しないと予想される。

しかし、驚くべきことに、エシェリキア属及びサルモネラ属群に由来する機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをもたない細菌株は宿主動物で毒性野生型細菌に対して防御免疫応答を非常に良好に誘導できることが今回判明した。これらの株は上記主要毒性因子に対して免疫を誘導しないので、これは実際に全く予想外である。

従って、本発明の第１の態様は機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをもたないワクチン用弱毒生菌に関する。

ＤｏｂｒｉｎｄｔＵ．ら，（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ１６２：１３５−１４１（１９９８））は例えばマウス膀胱粘膜における尿路病原性大腸菌の生存を司るのは実際にＬｅｕＸによりコードされるｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕであり、病原性の島の存在自体ではないことを確認している。これらの病原性の島は例えばヘモリジン、線毛性付着因子等をコードする領域である。

細菌病原性におけるその重要な位置により、ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子とその遺伝子産物ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕは細菌界で広く存在している。ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕは高度に保存されている。例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ）種（例えばチフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、エンテリチジス（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ガリナルム（ｇａｌｉｎａｒｕｍ）及びデュブリン（ｄｕｂｌｉｎ）血清型）及びエルシニア種（例えばペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ））で検出することができる。

サルモネラ属とエシェリキア属における前記遺伝子自体とその完全ヌクレオチド配列は例えばＴｈｏｒｂｊａｒｎａｒｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６１：２１９−２２２（１９８５））、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７７：６２７−６４４（１９８４））、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｓ．ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗ５４：１９８−２１０（１９９０））、Ｋｏｍｉｎｅ，Ｙ．ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１２：５７９−５９８（１９９０））及びＢｌｕｍ，Ｇ．ら（Ｉｎｆｅｃｔ．＆Ｉｍｍｕｎ．６２：６０６−６１４（１９９４））により記載されている。

機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕは野生型ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕの特徴をもつｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ、即ちロイシンをコードするコドンがＵＵＧである場合に合成中にアミノ酸ロイシンを蛋白質鎖に付加することができるｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕであるとみなされる。従って、少なくともこの機能を欠損するｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕが非機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕとみなされる。

本発明の弱毒生菌は機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕの合成を阻止する変異をＬｅｕＸ遺伝子に導入することにより獲得することもできる。

従って、本発明の１好適態様はｌｅｕｘ遺伝子の変異の結果として機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをもたないワクチン用弱毒生菌に関する。

このような変異は変異が機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕを発現できなくするという条件で挿入、欠失、置換又はその組み合わせとすることができる。

本発明の用途における弱毒生菌は数種の方法で獲得することができる。このような細菌を獲得する１つの可能な方法はｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子をもつ野生型細菌を塩基類似体等の突然変異誘発物質で処理する方法、紫外線処理又は温度処理等の古典的方法である。

本発明の株は少なくとも上記４種の毒性因子の欠失に基づいて容易に選択することができる。

しかし、古典的突然変異技術により誘導される変異の種類は不明である。ＬｅｕＸ遺伝子の点突然変異の場合もあり、その場合には確率は低いが、野生型に復帰する可能性がある。

この小さな危険を回避するためには、トランスポゾン突然変異誘発が良好な代替方法であると思われる。トランスポゾン突然変異誘発による変異誘発も当分野で周知の変異誘発技術である。これは染色体中の局在部位で行われる変異である。トランスポゾン挿入は特定遺伝子を標的とすることができない。しかし、ＬｅｕＸ変異体は少なくとも上記４種の毒性因子を欠失しているので容易に選別することができる。

ランダムではなく故意に既定部位に変異を導入する著しくエレガントな方法が組換えＤＮＡ技術により提供される。このような変異は変異した遺伝子が機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをコードしなくなるという条件で挿入、欠失、ヌクレオチド置換又はその組み合わせとすることができる。このような変異は例えば多数の塩基対の欠失により実施することができる。１０塩基対等の非常に小さな欠失であってもｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕを非機能的にすることができる。１塩基対の欠失であっても非機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕが得られる。より長い配列（例えば５０塩基対以上）を除去することがより好ましい。完全なｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子を欠失させることが更に好ましい。

ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ陰性変異体を構築するための全技術は周知標準技術である。これらの技術はｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子をクローニングし、遺伝子配列を部位特異的変異誘発により改変し、制限酵素消化後に再連結又はＰＣＲアプローチを適用した後に野生型ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子を変異体遺伝子で置換する（対立遺伝子交換又は対立遺伝子置換）。ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子のプラスミドクローニング、遺伝子の制限酵素消化とその後のエンドヌクレアーゼ処理、再連結及び宿主株における相同組換え等の標準組換えＤＮＡ技術はいずれも当分野で公知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。部位特異的変異は例えばＣｌｏｎｔｅｃｈから市販されているＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（登録商標）キットを使用してｉｎｖｉｔｒｏ部位特異的変異誘発により実施することができる。ＰＣＲ技術はＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−８７９６９−４４７−３及びＩＳＢＮ０−８７９６９−４４７−５に詳細に記載されている。

ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子はｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをコードするコーディング配列以外に、プロモーター等の調節配列も含む。従って、コーディング領域の変異に加え、正確な転写に必須の配列の変異も本発明の範囲に含むものとする。

より好ましい態様では、本発明はエシェリキア属とサルモネラ属の弱毒生菌に関する。

本発明の更に好ましい形態では、本発明の弱毒生菌はＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、エンテリチジス（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、コレラエスイス（ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、デュブリン（ｄｕｂｌｉｎ）、チフィ（ｔｙｐｈｉ）、ガリナルム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、アボルツソビ（ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉ）、アボルツス−エクイ（ａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ）、プロルム（ｐｕｌｌｏｒｕｍ）、大腸菌又はペスト菌から構成される群から選択される。これらの細菌属はヒトと各種動物の両者に対して病原性の多数の種を含む。

更に好ましい形態では、本発明の弱毒生菌はＳ．エンテリカ、大腸菌又はペスト菌である。

更に好ましい形態では、本態様はｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子の変異が組換えＤＮＡ技術により実施されている本発明の弱毒生菌に関する。

ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子のフラグメントもしくは完全遺伝子の欠失又は異種ＤＮＡフラグメントの挿入又はその両者を含む明確に既定され、故意に実施される変異は古典的に誘導される変異に比較して野生型状態に復帰しないという利点がある。

従って、最も好ましい形態では、本発明の本態様はｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子が挿入及び／又は欠失を含む弱毒生菌に関する。

現在多量のワクチンが愛玩動物と家畜の両者に投与されていることを考慮すると、単にワクチン接種費用の削減という理由だけでも数種のワクチンを併用投与することが望ましいと思われる。従って、他の病原性微生物又はウイルスから選択される抗原をコードする異種遺伝子の組換えキャリヤーとして弱毒生菌を使用することは非常に魅力的である。このような組換えキャリヤーを投与すると、同時に２種以上の疾病に対して免疫を誘導するという利点がある。本発明のワクチン用弱毒生菌はｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをコードする遺伝子をこのような異種遺伝子の挿入部位として使用することができるので異種遺伝子の非常に適切なキャリヤーとなる。ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子を挿入部位として使用すると、ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子が不活化されると同時に新たに導入した異種遺伝子を（同種細菌遺伝子と呼応して）発現させることができるという利点がある。このような組換えキャリヤーの構築は対立遺伝子交換等の標準分子生物学技術を使用して日常的に実施することができる。従って、本発明の別の態様は機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕを生産せず、異種遺伝子が挿入された好ましくはエシェリキア、サルモネラ及びエルシニア属の組換えキャリヤー弱毒生菌に関する。このような異種遺伝子は上述したように例えば他の病原性微生物又はウイルスから選択される抗原をコードする遺伝子とすることができる。このような遺伝子は例えば病原性ヘルペスウイルス（例えばヘルペスウイルスの構造蛋白質をコードする遺伝子）、レトロウイルス（例えばｇｐ１６０エンベロープ蛋白質）、アデノウイルス等に由来することができる。病原性細菌から異種遺伝子を得ることもできる。１例として、細菌毒素（例えばＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ毒素）、外膜蛋白質等の防御抗原をコードする遺伝子が非常に適切な細菌異種遺伝子である。

また、サイトカイン、インターロイキン又はインターフェロン等の免疫系の誘因に関与する蛋白質をコードする遺伝子や、免疫調節に関与する別の遺伝子を挿入することも考えられる。

異種遺伝子をｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子に挿入すると、異種遺伝子に適した新規挿入部位を見出す必要がないと同時にｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子が破壊されるので有利である。

従って、本態様の１好適形態では、異種遺伝子をｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子に挿入する。異種遺伝子はｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子の所定部位に挿入することもできるし、ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子の一部又は全部を欠失させてこの遺伝子の部位に挿入することもできる。

予想外のインビトロ弱毒免疫原性により、本発明のワクチン用細菌は弱毒生ワクチンの基盤として非常に適切である。従って、本発明の更に別の態様は野生型形態がｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕ遺伝子を含む細菌によるエシェリキア、エルシニアもしくはサルモネラ感染又はその病原作用に対して動物及びヒトを防御するための前記弱毒生ワクチンに関する。

このようなワクチンは免疫原として有効な量の本発明の弱毒生菌又は本発明の組換えキャリヤー生菌と、医薬的に許容可能なキャリヤーを含む。

ワクチンはエシェリキア、サルモネラ、及びエルシニアの群から選択される本発明の弱毒生菌を含むことが好ましい。

免疫原として有効とは、ワクチン接種時の弱毒生菌の投与量が毒性形態の細菌に対して有効な免疫応答を宿主に誘導するために十分であることを意味する。

免疫原として有効な量の上記弱毒生菌に加え、本発明のワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤーも含む。このようなキャリヤーは水等の単純なものでもよいが、例えば細菌を培養した培養液も含むことができる。別の適切なキャリヤーは例えば生理的塩濃度の溶液である。

有用な投与用量は年齢、体重及びワクチン接種する動物、投与方法並びにワクチン接種の対象となる病原体の種類により異なる。

ワクチンは免疫応答を誘発するために十分な任意用量の細菌を含むことができる。例えば細菌１０^３〜１０^１０個の用量が非常に適切な用量である。

場合により、アジュバント活性をもつ１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。アジュバントは免疫系の非特異的刺激剤である。アジュバントはワクチンに対する宿主の免疫応答を強化する。当分野で公知のアジュバントのレイはフロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例えばヨーロッパ特許ＥＰ１０９９４２号参照）、サポニン、鉱油、植物油及びカルボポールである。

粘膜塗布に特に適したアジュバントは例えば大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）又はコレラ毒素（ＣＴ）である。

他の適切なアジュバントは例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、油−エマルション（例えばＢａｙｏｌＦ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥ可溶化物である。

従って、１好適形態では、本発明のワクチンはアジュバントを含む。

本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤の他の例としては、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン）、蛋白質（例えばアルブミン又はカゼイン）、蛋白質含有物質（例えばウシ血清又は脱脂乳）及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）等の安定剤が挙げられる。

特にこのような安定剤をワクチンに添加する場合には、ワクチンは凍結乾燥に非常に適している。従って、より好ましい形態では、ワクチンは凍結乾燥形態である。

更に別の態様は野生型細菌感染又は感染の病原作用に対する動物及びヒトの防御用ワクチンの製造における本発明の細菌の使用に関する。

動物又はヒトに投与する場合には、本発明のワクチンは特に鼻腔内、皮内、皮下、経口、エアゾール又は筋肉内投与することができる。家禽に投与する場合には、羽板及び点眼投与が非常に適切である。

本発明のワクチンの投与方法は既存の細菌ワクチンの接種に適用する方法と殆ど変わらないので当業者に公知である。本発明のワクチンは特に大腸菌、サルモネラ、又はエルシニア群に属する細菌を含む場合には経口投与することが好ましい。

本発明の更に別の態様は本発明のワクチンの製造方法に関する。このような方法は本発明の弱毒生菌又は本発明の組換えキャリヤー生菌と医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む。

ｌｅｕＸ変異体の構築
Ｗａｎｎｅｒシステム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｊｕｎｅ６，２０００．９７（１２）：６６４０−４５．）を使用してＳ．チフィムリウムＳＲ−１１ｌｅｕＸ遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換した。

本実施例では野生型Ｓ．チフィムリウムＳＲ−１１を使用したが、記載する原理はｌｅｕＸ遺伝子をもつ全細菌に同様に適用可能である。

Ｓ．チフィムリウムＳＲ−１１ｌｅｕＸフランキング配列に相同の配列をカナマイシンカセットのプライマーの５’末端に付加した。フォワードプライマー：

とリバースプライマー：

（配列中、大文字はｌｅｕＸ配列であり、小文字はカナマイシンプライマーである）を使用してプラスミドｐＫＤ４に由来するカナマイシンカセットをＰＣＲにかけた。プラスミドｐＫＤ４に由来するカナマイシン（〜１７００ｂｐ）カセットを増幅するために、プライミング部位を含むプライマーセットをＦｉｓｈｅｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１．５ｍＭＭｇＣｌ_２）と共に標準ＰＣＲ反応で使用した。サイクル条件は９４℃で４分を１サイクル；９４℃で３０秒、５５℃で１５秒、７２℃で７５−１０５秒を３５サイクル；７２℃で７分を１サイクルとした。反応液を１００μｌずつ８本貯留し、５μｌをゲル上にて調べ、直線性ＰＣＲ産物をエタノール沈殿させ、水２〜４μｌに再懸濁した。

Ｓ．チフィムリウムＳＲ−１１細胞に温度感受性プラスミドｐＫＤ４６をエレクトロポレーション導入した。これらの細胞をアラビノースの存在下に３０℃で増殖させると、プラスミドはλＲｅｄリコンビナーゼを発現する。細胞（Ａ_６００＝０．６）を遠心分離と冷１０％グリセロールで３〜４回洗浄することによりエレクトロポレーション導入に対しコンピテントにした。次に直線性ＰＣＲ産物をコンピテント細胞にエレクトロポレーション導入した。リコンビナーゼはカナマイシンカセットを含む欠失ｌｅｕＸ遺伝子で野生型ｌｅｕＸ遺伝子を置換するように作用する。カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）を添加したＬｕｒｉａ寒天プレートで３７℃にて一晩増殖させることにより、欠失ｌｅｕＸ遺伝子を含むＳ．チフィムリウムＳＲ−１１クローンを選択すると共に、温度感受性ｐＫＤ４６プラスミドを脱落させた。

ｌｅｕＸ欠失／抗生物質カセット挿入の５’及び３’即ち上流と下流のプライマーを使用して変異体を確認した。Ｓ．チフィムリウムＳＲ−１１ｌｅｕＸ突然変異体の場合には、ＰｓｔＩ部位を含み、ｌｅｕＸ遺伝子の５’及び３’領域に相同のプライマー（これらのプライマーをＰｓｔＬｅｕｘ５’：

及びＰｓｔＬｅｕｘ３’：

と言う）を使用して予想される約１７００ｂｐバンド（野生型バンドは４００ｂｐ）を増幅した。２．５ｍＭＭｇＣｌ_２とＦｉｎｎｚｙｍｅＤｙＮＡｚｙｍｅｌｌポリメラーゼを反応で使用した。サイクル条件は９４℃で４分を１サイクル；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１０５秒を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクルとした。

動物試験
実験デザイン
安全性と効力の両者を試験するために、ＳＲ１１−ＬｅｕＸ^（−）（ＬｅｕＸマイナス突然変異体）約１０^７ＣＦＵを孵化日と１５日齢でブロイラーに経口接種した。

ワクチン接種後に臨床観察により安全性を評価した。更に、８、１５、２２及び３０日にクロアカスワブを採取し、腸管におけるワクチン株の有無を調べた。スワブを使用してブリリアントグリーン寒天（ＢＧＡ）に直接及びＲａｐｐａｐｏｒｔＶａｓｓｉｌｉａｄｉｓブロスで増菌後に接種した。ワクチン接種した５羽を３０日齢で検死し、その肝臓と脾臓を培養し、ワクチン株が腸管から侵入しているか否かを調べた。

効力を試験するために、テトラサイクリン耐性野生型Ｓ．ｔ．株１．４×１０^６ＣＦＵを３０日齢で経口攻撃感染させた。攻撃感染から２週間後に動物を安楽死させ、肝臓、脾臓、クロアカスワブ及び盲腸内容物スワブを培養して攻撃株の有無を調べた。テトラサイクリンを添加したＢＧＡ（ＢＧＡｔｅｔ）に直接及び増菌培地（テトラサイクリンを添加した緩衝ペプトン水）でインキュベーション後に臓器とスワブを接種した。

動物
サルモネラ菌に汚染されていないブロイラー育種群から種卵を入手した。

結果
スプレー及び経口ワクチン接種後に臨床異常は観察されなかった。ＳＲ１１−ＬｅｕＸ^（−）株はワクチン接種動物の一部の８、１５、２２及び３０日齢のクロアカスワブから培養された。３０日齢で、ワクチン株はワクチン接種した動物の５３％から依然として排泄されたが、検死した５羽の肝臓と脾臓からは再分離されなかった。

表１に示すように、非ワクチン接種動物の肝臓と脾臓からは攻撃株が分離された。更に、ほぼ全部の非ワクチン接種対照動物のクロアカと盲腸から攻撃株が再分離された。

ＳＲ１１−ＬｅｕＸ^（−）をワクチン接種した結果、感染から１４日後に攻撃株は完全に除去された。更に、ワクチン接種した動物の肝臓と脾臓に攻撃株は検出されなかった。

以上の結果から明らかなように、ＬｅｕＸ^（−）細菌はＬｅｕＸ^（−）変異が弱毒変異でありながら生ワクチンで安全且つ有効である。

Claims

機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをもたないエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属のワクチン用弱毒生菌。
ｌｅｕｘ遺伝子の変異の結果として機能的ｔＲＮＡ_５ ^ｌｅｕをもたない請求項１に記載のワクチン用弱毒生菌。
前記細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、エンテリチジス（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、コレラエスイス（ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、デュブリン（ｄｕｂｌｉｎ）、チフィ（ｔｙｐｈｉ）、ガリナルム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、アボルツソビ（ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉ）、アボルツス−エクイ（ａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ）又はプロルム（ｐｕｌｌｏｒｕｍ）から構成される群から選択される請求項１又は２に記載のワクチン用弱毒生菌。
前記変異が挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のワクチン用弱毒生菌。
前記細菌が異種遺伝子をもつことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のワクチン用弱毒生菌。
前記異種遺伝子がｌｅｕｘ遺伝子に挿入されていることを特徴とする請求項５に記載のワクチン用弱毒生菌。
請求項１から６のいずれか一項に記載の細菌と医薬的に許容可能なキャリヤーを含有することを特徴とする、病原細菌感染又はその病原作用に対する動物又はヒトの防御用弱毒生ワクチン。
アジュバントを含有することを特徴とする請求項７に記載の弱毒生ワクチン。
凍結乾燥形態であることを特徴とする請求項７又は８に記載の弱毒生ワクチン。
病原細菌感染又は感染の病原作用に対する動物の防御用ワクチンの製造における請求項１から６のいずれか一項に記載の弱毒生菌の使用。
請求項１から６のいずれか一項に記載の弱毒生菌と医薬的に許容可能なキャリヤーを混合することを特徴とする請求項７から９のいずれか一項に記載のワクチンの製造方法。