BRPI1000173A2 - cepa bacteriana modificada e uso da mesma - Google Patents

Abstract

CEPA BACTERIANA MODIFICADA E USO DA MESMA A presente invenção refere-se a um mutante de Salmoneila Gaílinarum defectivo quanto aos genes CobS e CbiA (SGCobSCbiA), associados à produção de cobalamina pela bactéria em condições anaeróbicas para uso como vacinas. A presente invenção refere-se, ainda, ao uso da referida cepamutante de Salmoneila Gaílinarum para induzir proteção em aves contra a infecção pela cepa homóloga natural e cepa de Salmonella Enteritidis através de uma vacina.

Description

CEPA BACTERIANA MODIFICADA E USO DA MESMA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um mutante deSalmonella Gallinarum defectivo quanto aos genes CobS eCbiA (SGCobSCbiA), associados à produção de cobalamina pelabactéria em condições anaeróbicas para uso como vacinas. Aausência desses genes tornou a cepa atenuada. Esta cepa foiutilizada para induzir proteção em aves contra a infecçãopela cepa homóloga natural e cepa de Salmonellaenteritidis. Os resultados foram motivadores, havendo quedade ação patogênica das cepas de campo em questão.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As salmoneloses são enfermidades provocadas porbactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae, gêneroSalmonella, espécies S. bongori e S. enterica. Esta últimadivide-se nas subspécies enterica, salamae, arizonae,diarizonae, houtenae e indica. São bastonetes Gram-negativos, anaeróbios facultativos, catalase-positivos,oxidase-negativos, redutores de nitratos e nitritos, nãoformadores de esporos Salmonella Gallinarum é imóvel.

Salmonella Gallinarum (SG) é um parasita intracelular,anaeróbico facultativo que provoca uma enfermidadecaracterística em aves, o Tifo Aviário. Este sorotipo estáfortemente associado ao sistema fagocítico-mononuclear e odesencadeamento da doença dependem da capacidade bacterianade sobreviver e replicar-se dentro de macrófagos do fígadoe do baço (BARROW et al.f 1994; WIGLEY et al., 2002). Aoinvadir e colonizar os macrófagos do hospedeiro, Salmonellaspp. utiliza vários fatores de virulência para superar osobstáculos, que são ativados com a internalização dabactéria (FIELDS et al., 1986; RICHTER-DAHLFORS et al. ,1997; VAN IMMERSEEL et al., 2004).

Após a invasão do organismo animal e das célulasfagocitárias, SG causa doença severa, caracterizada pelaalta morbidade e mortalidade em aves (SHIVAPRASAD, 1997).Este comportamento não foi observado com a cepa mutante SGàcobSàcbih da presente invenção que tornou-se atenuada enão causou a doença.

SMITH (1956) verificou que uma cepa rugosa de SG(SG9R) havia perdido a capacidade de provocar o TifoAviário em aves e que poderia ser empregada como vacina.

WIGLEY et al. (2005) observaram que a atenuaçãoresidia na diminuição do período de vida da bactéria nofígado e no baço das aves. Embora por processos distintos,mas em virtude de comportamento semelhante, pesquisou-se oemprego de SG àcobSàcbiA como candidata a cepa vacinai,visando o controle da infecção de aves por SG e SE.

As vacinas vivas contra Salmonella spp. disponíveisatualmente, são preparadas à partir de cepas atenuadas.Embora se considere que estas vacinas sejam capazes degerar uma forte resposta imune celular, algumas estimulandotambém a produção de anticorpos, a proteção conferidacontra o sorotipo SE, é limitada (MASTROENI et al., 2000).

Outros estudos foram realizados com relação a estamatéria como pode ser observado nos diferentes documentosabaixo:

0 documento WO 00/68261 é relacionado aos micro-organismos atenuados que podem ser usados em composições devacina para a prevenção ou tratamento de infecçõesbacterianas ou virais. Os inventores utilizaram uma cepa deSalmonella Typhimurium e provocaram mutação alterando genesrelacionados com ilha de patogenicidade.

O documento US 6,399,074 refere-se, em geral, àvacinas para aves domésticas e outras aves e, maisparticularmente, à vacinas para proteger aves domésticas eoutras aves contra infecção por bactéria gram-negativapatogênica para aves. São utilizadas cepas com alteraçõesrelacionadas aos antigenos somáticos.

O documento PI 0410355-6 refere-se a uma composição devacina compreendendo uma combinação de um microorganismo S.Typhimurium mutante de deleção genética e um microorganismoE. coli mutante de deleção genética adequada para aplicaçãoem massa a aves. É também provido um método seguro e eficazpara proteger aves contra as destruições de infecção edoença por E. coli e Salmonella.

O documento PI 0211151-9 se refere a uma salmoneladiferente da presente invenção e está direcionado aocomponente do adjuvante, sendo ainda proposto usar a vacinacom antigenos heterólogo de outro agente patogênico paraseres humanos.

O documento PI 0507588-2 refere-se às culturas deSalmonella vivas atenuadas para uso como vacinas. Asculturas de Salmonella do presente documento têm umacapacidade substancialmente reduzida de crescer e replicarna presença de bilis. A capacidade reduzida de crescimentoé devida à mutação de desvio metabólico induzida porexposição a uma combinação de ácido nalidixico erifampicina por um tempo e sob condições suficientes parainduzir a mutação.

O documento PI 0109322-3 refere-se a uma bactériaSalmonella mutante atenuada que contém genes de virulênciainativada que é proporcionada para uso em vacinas eficazese seguras. Esta invenção utiliza sorotipos diferentesdaqueles utilizados na presente invenção e as mutaçõesforam realizadas em genes da ilha de patogenicidade.

O documento PI 0604997 refere-se a uma vacina contra- enfermidade provocada por estreptococo, em cavalos.Salmonela seria apenas o vetor, carreando proteína doestreptococo.

O documento US 6,890,538 refere-se a uma vacina contravírus simples da herpes (HSV) compreendendo uma bactérianão patogênica ou atenuada.

Em alguns dos documentos acima, a cepa de Salmonellafoi usada como vetor de antígenos de outros agentespatogênicos (antígenos heterólogos). Entretanto, nenhumdeles descreve alterações nos genes CobS e CbiA(SGCobSCbiA) nem modifica alguma cepa de SalmonellaGallinarum. Portanto, não existe coincidência de produtos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se uma cepa mutante deSalmonella Gallinarum (SEQ. ID. No. 1) contendo alteraçãonos dois genes CobS e CbiA (SGCobSCbiA) relacionados com asíntese de cobalamina por Salmonella em ambienteanaeróbico.

A presente invenção refere-se, ainda, ao uso dareferida cepa mutante de Salmonella Gallinarum para induzirproteção em aves contra a infecção pela cepa homóloganatural e cepa de Salmonella Enteritidis através de uma vacina.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOSA FIGURA 1 contém a foto do Eletrofotograma do gel deagarose 1% com as bandas referentes aos genes íntegros ealterados, onde:

MW: marcador de peso molecular (1Kb plus DNA Ladder);1-3, fragmento àcobS Specr de SG (2964bp) ; 4 - 5,fragmento cobS (original) de SGNalr (994bp); 6, Controlepositivo com STM F98 àcobS Specr (2964bp); 7 - 9, fragmentoàcbiA Kanr de SG (1930bp) ; 10 - 11, fragmento cbiA(original) de SGNalr (1360bp); 12 - 13, Controle positivocom STM F98 AcbiA Kanr (1930bp).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção foi iniciada para estudar aparticipação de genes responsáveis pela respiração dabactéria em anaerobiose, considerando-se que salmonelas sãoparasitas intracelulares. Para tanto, foram construídosmutantes, de Salmonella Gallinarum (SG), contendo genesinoperantes para a produção de algumas enzimasrespiratórias que se manifestam durante a vida da bactériaem ambiente anaeróbico. Um dos mutantes tornou-secompletamente apatogênico para aves. Este mutante foientão, usado para imunizar as aves que posteriormente foramdesafiadas com cepas selvagens de S. Gallinarum (SG) etambém S. Enteritidis (SE). S. Enteritidis tem importânciaem saúde pública decorrente de casos humanos envolvendoprodutos alimentícios de origem avícola. Nos dois casos,observou-se proteção das aves pela cepa "vacinai".

A presente invenção foi realizada preparando-se umacepa de Salmonella enterica sorovar Gallinarum contendoalteração em dois genes relacionados com a síntese decobalamina por Salmonella em ambiente anaeróbico (SGcobS-cbiA-). Estas alterações tornaram a cepa apatogênica paraaves e demonstrou ser capaz de provocar resposta imuneconseguindo proteger as aves contra o Tifo Aviário e contraa infecção por Salmonella Enteritidis.

A biossintese de cobalamina (CBL) só é encontradaentre organismos procarióticos, aeróbicos, anaeróbicos eanaeróbicos facultativos, incluindo-se SalmonellaTyphimurium. Esta macromolécula constitui-se em nutrienteessencial para a vida de animais e seres humanos. EmSalmonella Typhimurium, sua síntese ocorre em condições deanaerobiose, podendo ser sintetizada em aerobiose ouanaerobiose quando a bactéria for suprida com assubstâncias precursoras como cobinamida (Jeter et al.,1984; Escalante-Semerena, 1990). 0 operon responsável pelabiossintese de Ado-CBL contém 17 genes CbiA-P, que estãoenvolvidos na produção da porção inicial da molécula (anéiscorrin) e genes envolvidos na integração do nucleotídeo àcobinamida (Cob UST). As salmonelas são bactériasanaeróbicas facultativas capazes da biossintese decobalamina (CBL) durante o crescimento em anerobiose. Asvias de produção da vitamina B12 são muito complexas,requerendo a atividade catalitica de mais de 24 enzimas.CbiA (Cobyrinic acid a,c-diamide sintetase) é a primeiraglutamina aminotransferase na via anaeróbica para abiossintese de vitamina B12. Esta enzima chama a atençãopor catalisar reações químicas em diversos pontos dosubstrato. 0 operon contém 17 genes Cbi e 3 Cob.

Os mutantes defectivos quanto aos genes CobS e CbiAoriundos de Salmonella Gallinarum foram então preparadosconforme metodologia dos protocolos contidos no manual detécnicas de biologia molecular presentes em MolecularCloning volumes 1,2 e 3 (Sambrook & Russel, 2001), e notrabalho de Turner et al. (1998), para preparo de genesdefectivos relacionados com a respiração anaeróbica de S.Gallinarum.

Os mutantes foram preparados por conjugação etransdução conforme descrito abaixo:

1. Conjugação do gene defectivo (Canc ou Spcr) emSalmonella gallinarum

0 gene defectivo, presente em Escherichia coli S17.1Àpir, será inserido no, recipiente final, S. Gallinarum.,cepa resistente ao ácido nalidixico (SG9Nalr) . Culturas deEC S17.11À pir e as cepas de SGNalr, serão preparadas,individualmente, em ágar Luria-Bertani (LB) incubado a37°C/24horas em agitação. Com auxilio de uma alçabacteriológica, o crescimento das duas culturas serámisturado e espalhado na superfície de ágar LB, que seráincubado a 37°C/90 minutos. Usando a alça bacteriológica, ocrescimento será colhido e adicionado a 10 mL de caldo LB,que será espalhado, também com alça, sobre a superfície deágar LB contendo ácido nalidixico (20ug/mL) e canamicina ouespectinomicina. As placas serão incubadas a 37°C/24 horas.As colônias emergentes serão semeadas em ágar LB contendodiscos impregnados com os antibióticos ácidos nalidixico30μg), cloranfenicol e canamicina ou espectinomicina.

Colônias Nalr, Canr ou Spcr e Cs, serão submetidasao teste de aglutinação frente ao antígeno somático antiFator 9 e à acriflavina.

Colônias 09(+) e acriflavina (-) serão submetidas àPCR para caracterização definitiva do mutante desejado.A PCR será realizada utilizando-se os primers 1 +4 de cada mutante.

2. Transdução

O preparo de mutantes contendo dois genes defectivosfoi realizado através de transdução.

As cepas de Salmonella Nalr, SG, SP e SE, contendo osgenes defectivos CbiACanr, serão cultivadas em IOmL decaldo LB, incubado a 37°C/24h. Essas culturas apresentam,aproximadamente, 1,0 χ IO10 ufc/mL. Serão adicionados 5pLde uma solução do bacteriófago 0P22, para se obter umarelação de 0,030/1 bactéria. A mistura será incubada a37°C/24h sob agitação. A seguir, centrifuga-se o cultivo a4000rpm/25minutos/4°C, filtra-se o sobrenadante (45um) eprocede-se à contagem do 0P22 em ágar LB com camada deSalmonella (SP, SE ou SG). Posteriormente, a solução debacteriófago será adicionada em cultura de Salmonella (10mLde caldo LB), preparada em agitação a 37°C/24h. Essacultura apresenta, aproximadamente, 3,0 χ 10^9 ufc/mL.

A seguir, prepara-se culturas das salmonelas contendoo gene defectivo CobS Spcr. Antes da adição dobacteriófago, a cultura será centrifugada, conformedescrito acima e ressuspensa em ImL de caldo LB. Nestecaso, a relação OP22/SG deverá ser de 0,8/1,0. 0 0P22 serácultivado na cepa de Salmonella Nal^rCbiACan^r, o qual seráadicionado à cultura de Salmonella Nalr CobS Spcr. Amistura será incubada a 37°C/30 minutos e depois espalhadaem placas de ágar LB contendo ácido nalidixico (20yg/mL) ecanamicina (30ug/mL), que será incubado a 37°C/24horas.Colônias emergentes serão purificadas em ágar LB maisdiscos de antibiogramas impregnados com os antibióticosácido nalidíxico (30μg/mL) e canamicina (30μg/mL), sendoincubadas a 37°C/24horas. As colônias serão submetidas àtécnica da PCR para confirmação dos resultados.

3. Teste genotipico da cepa vacinai SG AcobSAcbiApara a detecção da deleção nos genes cobS e cbiA

Após os testes preliminares, para caracterização finaldas cepas obtidas, procedeu-se à PCR e eletroforese.

-3.1. Preparo do PrimersOs primers foram preparados com base no genoma deSalmonella Typhimurium (MCCLELLAND et al., 2001).

Gene cobS

Primer 1: F 5' - gagatctagaacgaatctgctgtttgcgct - 3' (SEQ2)

Primer 4: R 5' - agtctagaacagacccagcagaaagatc - 3' (SEQ 3)

Gene cbiA

Primer 1: F 5' catctagaaaggcatcacgcatttattc - 3' (SEQ 4)

Primer 4: R 3' - tgtctagacagccagtgctgcaacattt - 5' (SEQ 5)

-3.2. Preparo da amostra:

μL X/mistura

X=23, 00 μί H2O, 3,0 IOX buffer, 3,0 2mM dNTP, 0,9μL MgCl,

0,5 μL primer 1

0,5 μL primer 4

0,4 μL taq DNA polimerase (Invitroven 10342-020)colônia bacteriana

-3.3. PCR (Reação de Cadeia Polimerase)

Para confirmar se a cepa utilizada para preparar oinóculo vacinai era SG kcobSàcbiA realizou-se a PCR paradetectar a presença dos genes alterados.

Uma cepa de S. Typhimrium F98 com deleção nestesmesmos genes (STM F98 àcobSàcbih) foi utilizada comocontrole positivo.

A solução empregada para a realização da PCR eracomposta de 50 μΐ., correspondendo a: 47,9 μΐ de solução X-mix, 0,6 μΐ. de cada primer (1 e 4), 0,5 μΐ, de Taq DNApolimerase (Invitrogen, USA) e 0,4 μΐ de DNA (100ng/^L).

As condições para a realização da PCR foram: 95°C por4 minutos e 25 ciclos utilizando-se: 95°C por 20 segundos,45°C por 1 minuto e 72°C por 3 minutos. Utilizou-se umperíodo de extensão a 72°C de 5 min. Após a reação, asamostras permaneceram a 4 0C e era adicionado 6μΙ* de"loading buffer" em cada.

3.4. Eletroforese das amostras

As amostras foram submetidas à eletroforese em gel deagarose para análise do tamanho dos fragmentos obtidos(Aparelho: Consort E863, 600V 250mA, cuba Horizon 11-14 CE,Life Technology). 0 gel consistirá de 90mL (agarose a 10%,diluída em solução tampão TAE - 4,84g TRIS base, l,034mLácido acético glacial, 2mL 0,5M EDTA pH 8,0, IOOOmL H2O),acrescido de 9pL de solução aquosa a 1% de brometo deetídio (Sigma E-4391). As amostras, mais o marcador de pesomolecular (IpL DNA Gibco 10787-018, 2pL de solução corante,7μL água destilada) foram submetidos a uma correnteelétrica de 80V. Após 3 horas e 30 minutos, o gel foicolocado sob luz ultravioleta e fotografado. Os resultadosestão demonstrados na Figura 1.

Os testes abaixo foram realizados pela via oralinoculando no papo das aves 0,5 mL de cultura contendocélulas viáveis de SG (IO8 UFC/mL) . A via oral é vantajosaem aves por se tratar de criação em escala industrial,contendo elevado número de animais (milhares). Granjas deaves reprodutoras podem ter cerca de 50.000 aves por.núcleoe aves de postura comercial, de 10.000 a mais de 100.000.Este produto também pode ser aplicado por via parenteral.

4. Ensaios in vivo

Esses ensaios seguiram os modelos adotados porBERCHIERI et al. (2001a, b) . As aves foram criadas emgaiolas de bateria com água e ração ad libitum.

No momento da chegada das aves, foram coletadasamostras de sangue para testes sorológicos visando àdetecção de anticorpos anti-Salmonella e suabes de fundo decaixa, conforme ZANCAN et al. (2000) para pesquisa deSalmonella spp. Os experimentos foram realizados após ostestes terem sido executados no momento da chegada das avesde um dia. Os resultados foram negativos para a pesquisa deSalmonella spp e anticorpos anti-Salmonella,

respectivamente.

O comportamento bioquímico de Salmonella Gallinarum(Fisiologia bacteriana) foi determinado a partir de provaspositivas: glicose, H2S, lisina, maltose, dulcitol,salicina, celobiose, tartarato, gelatina, mucato eornitina; e ainda por provas negativas: uréia, indol,triptofano, motilidade, sacarose, gás, citrato, malonato.

5. Cepas bacterianas

Foi utilizada uma cepa de SG, resistente ao ácidonalidíxico (Nalr) , com mutação dupla, contendo parte dosgenes cobS e cbiA deletados de seu genoma (SG ãcobSbcbiA) .Para o desafio, nos experimentos de avaliação damortalidade, infecção sistêmica e prevenção do tifo aviáriofoi utilizada uma cepa selvagem de SG resistente ao ácidonalidíxico (SGNalr) e uma cepa de SE resistente ao ácidonalidixico e à espectomicina (SENalrSpecr) para os estudosde avaliação do potencial de imunização cruzada contra ainfecção por SE. As bactérias estão armazenadas no centrode coleção espanhol de Cultivos Tipo através do número deacesso 7632.

6. Preparo dos inóculos

As culturas, para cada inóculo, foram preparadas apartir de suas respectivas cepas (SGNalr, SG bcobSkcbiA eSENalrSpecr) , que foram semeadas em caldo Luria-Bertani(LB) (Invitrogen 12780-052) e incubadas por 24 horas a37°C, em agitação (IOOrpm). Uma amostra de cada cultura foidiluída decimalmente em 0,9 mL solução salina, pH 7,4 (PBS)na proporção de 1:10. De cada diluição foi retirado 0,lmL,que era despejado em placas contendo ágar verde brilhante(Oxoid CM0263) contendo novobiocina (lpg/mL) e ácidonalidíxico (20 μg/mL) (VB Nal/Nov), que foram incubadas a37°C/24h. O número de colônias por mililitro de caldo LBfoi transformado em Iogi0 para apresentação dos resultados.As culturas continham aproximadamente 10^8 UFC/mL.

7. Aves

Foram utilizadas aves susceptíveis ao tifo aviário(BERCHIERI et ai., 2000; OLIVEIRA et ai., 2005), devariedade vermelha (Hy-line Brown) e de variedade branca(Hy-line W36) de linhagem comercial, para postura de ovosde mesa e pintinhos com um dia de vida provenientes deincubatório comercial de aves de corte (COBB 500). As avesde postura foram alojadas em gaiolas de baterias de cria erecria, já os pintinhos de corte foram colocados em caixasde madeira teladas. As aves receberam aquecimento elétricodurante o período inicial, água e ração ad libitum.

8. Avaliação da infecção de aves por SG AcobSAcblAem comparação com a cepa de SG original

8.1. Experimento 0l: Avaliação da mortalidade

Para a avaliação do comportamento do mutante obtido,este foi inoculado em aves comparativamente à cepaselvagem. Foram utilizadas aves de variedade vermelha delinhagem comercial para postura de ovos de mesa.

Para cada cepa foram utilizados dois grupos contendo cada um 20 aves.

Pintinhos de um grupo receberam 0,5 mL de uma culturapreparada em caldo LB, incubada a 37°C/24h em agitação e dooutro, esta cultura diluída a 10~2 em caldo LB. 0 inóculofoi administrado por via oral, no quinto dia de vida.

As aves foram observadas durante quatro semanas,registrando-se a mortalidade.

8.2. Experimento 02: Avaliação da infecção sistêmica

Para este ensaio, foram utilizadas 80 aves devariedade vermelha de linhagem comercial para postura de ovos de mesa. As aves foram divididas em dois gruposcontendo 40 aves. Aves de um grupo foram infectadas com oinóculo (sem diluição) da cepa original e as do outro grupocom a cepa mutante, no quinto dia de vida. 2, 5, 7, 14, 21e 28 dias pós-infecção (dpi), cinco aves de cada grupo,foram sacrificadas para a estimativa da presença de SGNalre SG ΔcojbSΔcjbiΔ em baço e fígado.

As amostras de baço e de fígado foram colocadas emsolução salina, pH 7,4 (PBS) na proporção de 1:10,maceradas e diluídas decimalmente em 0,9 mL de PBS. De cada diluição retirou-se 0,lmL, que era despejado em placascontendo ágar verde brilhante (Oxoid CM0263) contendonovobiocina (lyg/mL) e ácido nalidixico (20 yg/mL) (VBNal/Nov), que foram incubadas a 37°C/24h. O número decolônias por grama de órgão foi transformado em Iogi0 paraanálise dos resultados. Na ausência de crescimento, aosfrascos contendo a amostra homogeneizada em PBS (1:10), eraadicionado igual volume,de caldo selenito (Oxoid CM395)contendo novobiocina (0,04%) (caldo SN), preparado emconcentração dupla. 0 frasco era incubado a 37°C/24h e aseguir, seu conteúdo era semeado em ágar VB Nal/Nov, comincubação a 37°C/24h.

9. Avaliação do potencial do mutante SG AcoJbSAcbiAcomo cepa vacinai sobre a cepas selvagens de SG e SE

9.1. Experimento 03: Proteção de aves utilizando SGΔcobSΔcbiA contra a infecção por SG

Este experimento foi realizado com aves de linhagem depostura comercial para ovos de mesa, variedade, vermelha.

Os inóculos da cepa vacinai de SG ΔcobSΔcbiA e da cepadesafio de SGNalr foram preparados conforme o procedimentodescrito anteriormente no item 6.

Foram formados três grupos contendo 4 0 aves cada. Asaves do grupo A foram vacinadas aos cinco dias de vida, dogrupo B aos cinco e vinte e cinco dias de vida e as aves doGrupo C não receberam nada (controle) . A dose vacinaiconsistia de 0,5mL da cultura de SG ΔcobSΔcbiA, inoculadopor via oral, diretamente no papo. Aos 45 dias de vida,todas as aves foram desafiadas com 1,0 mL de inóculo,contendo a cepa selvagem de SGNalr.

As aves foram examinadas durante 28 dias, registrando-se a mortalidade e os sinais clínicos apresentados. No 28°dia de vida, as aves remanescentes foram sacrificadas paraa realização de exame bacteriológico de fígado, utilizando-se suabes estéreis de algodão. As amostras foram colocadasem tubos contendo 2 mL de caldo SN e incubadas a 37°/24h.

Após o enriquecimento, as amostras foram semeadas em ágarVB Nal/Nov. A seguir, as placas foram incubadas a 37°Cdurante 24 horas. Decorrido este período, procedeu-se àleitura das placas.

9.2. Experimento 04: Proteção de aves utilizando SGAcoJbSAcbiA contra a infecção por SE

Este experimento foi realizado com aves de linhagem depostura comercial para ovos de mesa, variedade branca.

Os inóculos da cepa vacinai de SG àcobSkcbiA e da cepadesafio de SENalrSpecr foram preparados conforme oprocedimento descrito anteriormente no item 6.

Foram formados três grupos contendo 4 0 aves cada. Asaves do grupo A foram vacinadas aos cinco dias de vida, dogrupo B aos cinco e vinte e cinco dias de vida e as aves doGrupo C não receberam nada (controle) . A dose vacinaiconsistia de 0,5mL da cultura de SG kcobSàcbiA, inoculadopor via oral, diretamente no papo.

Neste ensaio foram avaliadas a excreção fecal e ainfecção sistêmica da cepa utilizada no desafio.

A avaliação da excreção fecal foi feita pesquisando-sea presença de SENalrSpecr nas fezes, duas vezes por semana,durante quatro semanas, por meio da colheita de fezescloacais com suabes estéreis de algodão. Os suabes foramcolocados em tubos contendo 2 mL de caldo SN. Apósagitação, foram semeados em ágar VB Nal/Nov. A seguir, asplacas e tubos foram incubados a 37°C por 24 horas. Naausência de crescimento em ágar VB Nal/Nov, semeava-senovamente os suabes enriquecidos em placas contendo ágar VBNal/Nov com incubação a 37°C/24horas. Decorrido esteperíodo, era realizada a leitura das placas.

Para avaliar a infecção sistêmica, 2, 5, 7, 14, 21 e28 dias pós-infecção (dpi) , 5 aves, de cada grupo, foramsacrificadas para a estimativa da quantidade de SE em baço,fígado e conteúdo cecal (BERCHIERI et al., 2001a,b).

As amostras de baço, de fígado e de conteúdo cecalforam colocadas em solução salina pH 7,4 (PBS) na proporçãode 1:10, maceradas (conteúdo cecal era homogeneizado) ediluídas decimalmente em 0,9 mL de PBS. De cada diluiçãofoi retirado 0,lmL, que era despejado em placas de ágar VBNal/Nov, as quais eram incubadas a 37°C/24h. O número decolônias por grama de órgão foi transformado em logio paraanálise dos resultados. Na ausência de crescimento, aosfrascos contendo a amostra homogeneizada em PBS (1:10), eraadicionado igual volume de caldo SN, preparado emconcentração dupla. 0 frasco era incubado a 37°C/24h e oseu conteúdo era semeado em ágar VB Nal/Nov, com incubaçãoa 37°C/24h. Decorrido este período, era realizada a leituradas placas.

10. Análise estatística

Os dados relativos à mortalidade foram analisados peloteste não paramétrico do Qui-quadrado com nível designificância de 5% (p<0,05) (GREENWOOD & NIKULIN, 1996). Oteste de comparação múltipla de Tukey foi utilizado naanálise dos resultados obtidos nas contagens de SG e SE dosórgãos ao nível de significância de 5% (p<0,05) (DANIEL,1991) .

11. Avaliação da infecção de aves por SG AcoJbSAcbiAem comparação com a cepa de SG original

11.1 .Experimento 1: Avaliação da mortalidade

Na Tabela 1 estão presentes os dados referentes àmortalidade de aves que receberam os inóculos sem serdiluído e o diluído a 10-2 da cepa SG bcobSkcbiA e da cepaselvagem SGNalr. Durante os 28 dias de observação, nosgrupos de aves que receberam o mutante SG kcobSàcbiA,diluído ou não, a mortalidade foi nula. No grupo controle,a cepa de SGNalr causou mortalidade em 83,3% das aves quereceberam a cultura sem diluição e em 60% das aves quereceberam a cultura diluída 100 vezes. No 28° dpi, as avesremanescentes foram sacrificadas, para a realização doexame bacteriológico de fígado. SGNalr ou SG àcobSkcbiA nãoforam recuperadas nas aves de seus respectivos grupos.<table>table see original document page 19</column></row><table>11.2.Experimento 2: Avaliação da infecção sistêmica

Os suabes de fundo de caixa e os testes sorológicosrealizados no momento da chegada das aves de um dia,apresentaram-se negativos para a pesquisa de Salmonella spp eanticorpos anti-Salmonellal respectivamente.

Os resultados quanto à infecção sistêmica estão naTabela 2. A quantidade de SG AcobSàcbiA em fígado e baço dasaves foi significativamente menor do que a da cepa selvagem(SGNalr), no 5o e 1° dpi. Além de menor multiplicação, a cepamutante SG ∆cobS∆cbiA foi encontrada no fígado das aves aténo 1° dpi, enquanto que a cepa selvagem, persistiu no fígadoe no baço das aves do grupo controle até o 14° dpi. A partirdo 21° dpi, a cepa mutante SG àcobSAcbiA não foi encontradaem nenhum dos órgãos examinados e o grupo controle não tinhanenhuma ave para a inspeção devido à mortalidade.Tabela 2

<table>table see original document page 21</column></row><table>12. Avaliação do mutante SG AcoJbSAcblA como cepavacinai contra a infecção pelas cepas selvagens de SG e SE

12.1. Experimento 3: Proteção de aves utilizando SGAcobSAcbiA contra a infecção por SG

Os dados apresentados na Tabela 3 revelam que a cepamutante SG àcobSàcbiR conferiu proteção contra a cepaselvagem SGNalr, reduzindo a mortalidade entre as avesvacinadas. A mortalidade foi de 15% entre as aves do grupoA, 25% entre as aves do grupo B e 75% entre as aves dogrupo C (controle) , que não receberam o inóculo da cepamutante. A diferença entre a mortalidade das aves dosgrupos AeBea mortalidade das aves do grupo C (controle)foi estatisticamente significativa (p<0,05).Tabela 3. Mortalidade de aves vacinadas oralmente comcultura de SG ΔcobSΔcbiA e desafiadas oralmente com a cepaselvagem SGNalr.

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Letras diferentes indicam diferença estatisticamentesignificativa (χ2, p<0,05).12.2.Experimento 4: Proteção de aves utilizando SGAcoJbSAcbiA contra a infecção por SE

Para a avaliação da proteção das aves pela cepa de SGàcobSãcbiA contra SE analisou-se a excreção fecal medianteexame de suabe de cloaca e a infecção sistêmica estimando-se a presença de SENalrSpecr em baço, fígado e conteúdocecal.

Na Tabela 4 estão os resultados referentes à análiseda excreção fecal de SENalrSpecr. No grupo B, no qual asaves receberam a cepa vacinai de SG àcobSàcbiR aos 5 e 25dias de vida, houve redução significativa (p<0,05) daexcreção fecal da cepa de SENalrSpecr utilizada no desafio.Os suabes cloacais foram realizados duas vezes por semananas aves dos grupos A, B e C. 0 número de aves testadasdiminuía conforme eram realizados os sacrifícios para acolheita das amostras de órgãos.

Na Tabela 5 estão apresentados os .resultados daavaliação da infecção sistêmica pela cepa de SENalrSpecr,utilizada no desafio das aves. A vacinação das aves com omutante SG AcojbSAcjbiA, reduziu o número de SENalrSpecr embaço, fígado e ceco das aves dos grupos AeB, emcomparação às aves do grupo C (controle). No 2° e 5o dpi, acontagem de SENalrSpecr no conteúdo cecal das aves do grupoC (controle) foi significativamente maior (p<0,05) do queno grupo B e no 5o e 1° dpi a contagem de SENalrSpecr nofígado das aves dos grupos AeB também diferiuestatisticamente em relação ao grupo C (controle).Tabela 4. Número de suabes positivos após a inspeção dacloaca de aves brancas para postura, para detecção deSENalrSpecr utilizada como cepa desafio após a vacinação deaves com cultura de SG AcobSàcbiA.

GRUPOS

<table>table see original document page 25</column></row><table>

dpi: dias pós-infecção; D: Resultado da semeadura direta(Oh) ; E: Resultado da semeadura após enriquecimento (24h);

T: Total. Letras diferentes indicam diferençaestatisticamente significativa . (χ2, p<0,05).

Grupo A: vacinação com a cepa SG àcobSàcbiA aos 5 dias de vida

Grupo B: vacinação com a cepa SG àcobSàcbiA aos 5 e 25 diasde vida

Grupo C: controle (não vacinado).Tabela 5. Contagem (Log10) do numero de celulas viaveis (UFC/g) da cepa desafioSENalrSpecr, em baco, figado e conteudo cecal de aves brancas para postura, vacinadas

<table>table see original document page 26</column></row><table>

dpi: dias pos-infeccao; 0: Negativo; Medias (µ) seguidas de letras iguais nao diferemestatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).Grupo A: vacinacao com a cepa SG ΔcobSΔcbiA aos 5 dias de vidaGrupo B: vacinacao com a cepa SG ΔcobSΔcbiA aos 5 e 25 dias de vidaGrupo C: controle (nao vacinado).13. Discussão dos resultados

Conforme consta na Tabela 1, nos grupos em que as avesreceberam o mutante SG àcobSàcbiA, não se observoumortalidade, enquanto que nos grupos controles, a mortalidade foi de 83,3% (25/30) quando utilizou-se oinóculo sem diluição e de 60% (18/30) quando o inóculo foidiluído a IO"2 em caldo LB, à semelhança de resultadosobservados em estudos anteriores sobre o Tifo Aviário(BARROW et al., 1987; OLIVEIRA et al., 2005).

Complementando os estudos a respeito da relação entrea cepa mutante e aves, foram feitos estudos a respeito dainfecção sistêmica. Conforme pode-se observar na Tabela 2 acepa mutante foi recuperada do fígado até o 1° dpi,enquanto a cepa selvagem permaneceu neste órgão até o 14°dpi, assim como foi descrito anteriormente por OLIVEIRA etal. (2005) com a infecção de aves de postura adultas,utilizando a mesma cepa de SG. A contagem, bacteriana nosórgãos revelou uma menor quantidade de SG AcojbSAcjbiA emrelação à cepa selvagem SG. Aos 21 dpi, SG àcobSàcbiA nãofoi encontrada nos órgãos examinados, enquanto que o grupocontrole não possuía nenhuma ave, devido à mortalidadecausada pela cepa selvagem. Assim sendo, pode-se afirmarque a deleção dos genes cojbS e cbiA trouxe à cepa mutantetranstornos metabólicos que refletiram no seu comportamentoin vivo, com relação ao crescimento e à virulência noorganismo hospedeiro. A alteração metabólica demicrorganismos leva ao comprometimento da sua sobrevivênciano organismo hospedeiro. SHAH et al. (2007) verificaramsituação similar quando tornaram o gene metC inoperante em uma cepa de SG. A incapacidade desta bactéria em sintetizarmetionina interferiu no seu crescimento nos órgãosinvadidos (fígado e baço), diminuindo de formasignificativa a sua virulência.

A via de biossíntese da cobalamina em Salmonella spp.pode ficar comprometida quando algum gene do operon cobtorna-se inoperante, sendo incapaz de sintetizar estamolécula, se substâncias precursoras não forem encontradasno ambiente (GRABAU & ROTH, 1992) . A cobalamina é umamolécula importante para Salmonella Typhimurium, cujaprincipal função seria atuar na degradação de fontes decarbono, como o propanediol e o tetrationato, para aobtenção de energia (JETER, 1990; AILION et al., 1993;BOBIK et al., 1999; PRICE-CARTER et al., 2001). Portanto,essa substância exerce influência na multiplicaçãobacteriana e sua ausência pode levar à atenuação dabactéria (FIELDS et al., 1986). A partir dos resultadosobtidos na presente invenção nota-se a. influência dacobalamina no metabolismo bacteriano de SG. No entanto,essa participação pode variar entre os sorotipos deSalmonella spp., como descrito no trabalho anterior(BJÕRKMAN et al., 1996), uma cepa de Salmonella Typhimuriumcom alteração de genes envolvidos na biossíntese decobalamina continuou expressando a mesma virulência.

A cepa utilizada na presente invenção apresentou doisgenes alterados, relacionados com a biossíntese dacobalamina, enquanto que mutantes de SG contendo alteraçãono gene cojbS ou cbiA, individualmente, não tiveram avirulência diminuída da mesma maneira (PAIVA et al., 2007).A deleção simples pode não ter sido suficiente parabloquear a biossíntese de vitamina B12, talvez porque abactéria utilize processo alternativo que não dependadaquela enzima, enquanto a alteração dupla conseguiu causardanos irreparáveis.

Segundo JETER et al. (1984), mutantes de SalmonellaTyphimurium incapazes de sintetizar cobalamina caem em trêsclasses fenotipicas: 1a. Deleção na parte I do operon cob:a bactéria sintetiza cobalamina só quando for fornecidocobinamida; 2°. Deleção na parte II do operon cob: abactéria sintetiza cobalamina só quando for fornecidodimetil-benzimidazol (DMB); 3°. Quando a deleção ocorre naparte III do operon cob>: os mutantes falham na síntese decobalamina mesmo quando se fornecem ambos os precursores(cobinamida e DMB) . O gene cbiA localizado na parte I dooperon cob é o primeiro local de leitura para iniciar asíntese da cobalamina e em Salmonella Typhimurium codificauma amidase que atua em fase tardia da via biossintética(ROTH et al., 1993). Assim, no mutante SG ΔcobSΔcbiA forameliminados um gene da parte I (cbiA) e um da parte III(cobS), quebrando a via de biossíntese da cobalamina.

Os genes que codificam enzimas para o metabolismo decarboidratos, nucleotídeos ou aminoácidos, são chamados degenes de manutenção e são conhecidos por participarem dosmecanismos de virulência, através da aquisição denutrientes essenciais para o crescimento intracelular deSalmonella enterica. A cobalamina é importante quando atuacomo cofator em reações como as das enzimas homocisteínametil transferase (CAUTHEN et al., 1966) e etanolaminaamônia liase (SCARLETT & TURNER, 1976), responsáveis,respectivamente, pela síntese de metionina e degradação daetanolamina. Assim, o amplo espectro de atuação, sugere queesta molécula seja imprescindível, não por possuir apenasuma função essencial, mas por ser um catalisador de váriasetapas do metabolismo bacteriano.

De acordo com os resultados acima, a deficiência decobalamina interferiu na multiplicação e persistência deSG, indicando que a atenuação está ligada à perda dacapacidade de sobreviver dentro do sistema fagocítico-mononuclear.

De acordo com os dados apresentados na Tabela 3 avacinação por via oral, com a cepa SG kcobSàcbiA, protegeuas aves contra o desafio com a cepa selvagem de SG. Emgrupos de 20 aves, sobreviveram 17 aves naquele em que seutilizou uma dose vacinai, 15 quando se empregou 2 dosesvacinais, permanecendo apenas 5 aves vivas após o desafiopela cepa selvagem de SG, diferindo dos grupos vacinados(X r p<0,05). A resposta imune gerada pela aplicação de umadose vacinai teve a mesma eficácia que a utilização de duasdoses. Esses resultados sugerem que a cepa SG bcobSbcbiApode imunizar as aves por meio da inoculação oral,conseguindo diminuir a incidência de Tifo Aviário. Algunsresultados semelhantes foram relatados anteriormente com autilização da cepa SG9R. Segundo BOUZOUBAA et al. (1989),uma cepa selvagem de SG que provocou a mortalidade em 60%de aves do grupo controle, não causou mortalidade no grupode aves vacinadas com SG9R, embora tenha provocado lesõesnecróticas focais no fígado em até 55% das aves, àsemelhança de relato anterior (SILVA et al., 1981). Emexperimento descrito por LEE et al. (2005), após o desafiocom uma cepa patogênica de SG a mortalidade variou de 95 a100% nos grupos controles, enquanto que nos gruposvacinados com SG9R essa variação foi 0 a 5%. Assim comoSG9R, a cepa SG kcobSàcbiA poderá ser utilizada com sucessono controle do Tifo Aviário, com algumas vantagens como aausência de lesões severas em órgãos e a possibilidade dediferenciá-la de outras cepas de SG. CHACANA & TERZOLO(2006) notaram que a vacinação com uma cepa atenuada de SE(Salmonella TAD E) foi capaz de proteger aves contra osorotipo SG após a aplicação de três doses. Porém, aimunidade não foi duradoura e quando o desafio foirealizado em maiores intervalos de tempo, a mortalidade dasaves vacinadas foi igual à do grupo controle. Portanto, amelhor proteção contra o Tifo Aviário é obtida quandoutilizam-se vacinas preparadas a partir de cepas de SG.

Tendo-se em vista que os sorotipos Gallinarum eEnteritidis possuem composição antigênica semelhante,pertencendo ao sorogrupo Dl (0: 1, 9, 12), investigou-se apossibilidade de se utilizar a cepa de SG. AcobSkcbiA comovacina para controlar a infecção de aves por SE. Foramrealizados dois experimentos para a avaliação da proteçãocontra uma cepa desafio de SE, sendo um com aves de posturade linhagem branca e o outro com pintinhos de corte.

No experimento com as aves de postura, após o desafioinspecionou-se a excreção fecal e a colonização de fígado,baço e ceco por SE. Os resultados referentes ao exame dossuabes cloacais (Tabela 4), demonstram uma redução naexcreção fecal de SE no grupo em que as aves receberam duasaplicações da cepa SG àcobSkcbiA, aos 5 e aos 25 dias (χ2,p<0,05). Não houve diferença no número de suabes positivosentre o grupo das aves que receberam uma dose da cepavacinai, aos cinco dias e o grupo controle (χ2, p>0,05) .SILVA et al. (1981) relataram à redução de 20% na excreçãofecal de STM em aves vacinadas por via oral ou subcutâneacom a cepa SG9R. BARROW et al. (1991), notaram que nãoocorreu redução da excreção fecal de uma cepa de SE,utilizada para desafiar as aves após a vacinação com SG9R.

Na presente invenção, envolvendo a utilização da cepa SGbcobSàcbiA, a excreção fecal de SE foi reduzida em cerca de55% quando as aves receberam duas doses da cepa vacinai enenhuma ave excretou a cepa desafio após o 5o dpi. Enquantoa excreção de SE foi observada durante toda a faseexperimental pós desafio (22° dpi), nas aves do grupo ondese aplicou uma dose da cepa vacinai e do grupo controle(sem vacinação) (Tabela 4). Esses resultados sãomotivadores, tendo-se em vista que BETANCOR et al. (2005)também observaram a redução da excreção fecal de SE, emaves vacinadas (duas doses) com cepa atenuada de SE, mascom a presença da bactéria nas fezes por período maislongo, de 15 dias.

Conforme consta na Tabela 5, houve redução naquantidade de SE recuperada no fígado das aves vacinadascom uma dose de SG bcobSàcbiA a partir do 5 o e Io dpi,enquanto que no grupo em que as aves receberam duas dosesvacinais, a redução foi significativa no conteúdo cecal nos2° e 5o dpi, no fígado nos 5o e 1° dpi e no baço no 5o dpi.

Assim, pode-se afirmar que a cepa vacinai foi capaz dereduzir a infecção de aves por SE, quando foram utilizadasduas doses. Esses resultados são inovadores, tendo-se emvista que, as vacinas vivas disponíveis são incapazes deimpedir completamente a instalação de SE no ceco e acolonização dos órgãos das aves, sendo às vezes expressivana proteção conferida contra a infecção sistêmica (BARROWet al., 1991; COOPER et al., 1994; GANTOIS et al., 2006).

Vacinas contendo outros sorotipos de Salmonella paraproteger aves contra SE também já foram avaliadas. HASSAN &CURTISS (1994b), utilizaram uma cepa atenuada SalmonellaTyphimurium Acya Acrp visando inibir a presença desorotipos de Salmonella dos grupo B, C, D e E em aves. Emaves vacinadas na 2a e 4a semana e desafiadas por SE nasexta semana de vida, a proteção contra a colonização doceco foi fraca, já a redução da quantidade de SE recuperadanos órgãos foi melhor quando foram utilizadas cepas poucoinvasivas para desafiar as aves.

CERQUETTI & GHERARDI (2000) utilizaram uma cepaatenuada de SE para vacinar aves nos primeiros dias devida. A cepa vacinai conferiu boa proteção contra ossorotipos SE e SG, quando o desafio foi realizado em 14dias após a aplicação da última dose imunizadora, mas nãofoi capaz de proteger contra o desafio por STM. Esta cepaapresentou algumas características que podem desfavorecer asua utilização no campo. Foi necessário aplicar quatrodoses vacinais, o que aumenta o estresse das aves e o custoda vacinação para os produtores. Após a última dose, asaves excretaram a cepa vacinai no ambiente por até duassemanas. A cepa SG àcobSbcbiA possui algumascaracterísticas vantajosas quando considera-se seu uso comovacina. A inoculação de apenas uma dose, administrada porvia oral, foi eficaz contra SG. Outra vantagem que SGΔcobSΔcbiA tem sobre as demais cepas vacinais disponíveis,principalmente contra SE, baseia-se no fato de que mesmoapós a sua inoculação oral, a excreção fecal e aconseqüente contaminação do ambiente são inexpressivas,além da necessidade de poucas aplicações (no máximo duas)para uma proteção efetiva contra o sorotipo heterólogo.

Em um estudo a campo, FEBERWEE et al. (2001a) relacionaram a redução de infecções por SE em lotes de avespoedeiras comerciais à utilização da vacina SG9R, emconjunto com a aplicação dé um programa de biosseguridade,incluindo outras medidas sanitárias que diminuem o risco deinfecções por SE. Na presente invenção, os inóculos utilizados para desafiar as aves continham grandequantidade de bactéria, que dificilmente seria encontradaem condições normais a campo. As condições em que osexperimentos foram executados propiciavam a constantereinfecção das aves devido à alta contaminação no ambientedentro dos infectórios. O uso da cepa SG àcobSàcbiA emgranjas avicolas ainda não foi testado, mas os resultadosdos ensaios realizados indicam que SG àcobSkcbiA poderá seruma importante ferramenta para combater infecções por SG eSE.

Face aos resultados favoráveis ao uso da cepa SGkcobSàcbiA como vacina, investigou-se seu emprego paraevitar a colonização cecal de aves por SE no inicio davida, na forma de exclusão competitiva. Já foi relatado quecepa de Salmonella Typhimurium consegue inibir acolonização cecal de aves por cepas homólogas (BERCHIERI JR& BARROW, 1990). COOPER et al. (1994), conseguiram impedira colonização cecal de aves recém nascidas por SE,aplicando oralmente um inóculo contendo uma cepa atenuadade SE no primeiro dia de vida. No experimento em que pintinhos de corte receberam SG kcobSàcbiA no primeiro diade vida, não ocorreu inibição de SE que foi inoculada porvia oral no segundo dia de vida, a qual colonizou e semultiplicou no ceco das aves de ambos grupos. A quantidadede SE encontrada no conteúdo cecal dos pintinhos do grupocontrole e do grupo vacinado, sacrificados no 5° dpi, foielevada e não diferiu entre si (Tabela 6). Assim sendo, acepa SG kcobSãcbiA não impediu a colonização cecal pelacepa desafio, como fez a cepa atenuada de SE (COOPER et al,1994). METHNER et al. (2001) analisaram a utilização de umacepa de STM atenuada para impedir a colonização cecal depintinhos desafiados por uma cepa patogênica homóloga no 3odia de vida, sem sucesso. A colonização do intestino poruma cepa "vacinai" de Salmonella seria uma forma deproteger aves recém eclodidas e aves recém vacinadas contraa infecção por cepas patogênicas, pois durante esteperíodo, a resposta imune ainda é limitada. Porém, estaação parece estar distante da capacidade das cepas vacinaisdisponíveis, incluindo-se a SG kcobSkcbiA. Cepas atenuadasde SE mostraram melhores resultados; no entanto, sãoexcretadas no ambiente, o que é uma característicaindesejável para uma vacina. A proteção do trato intestinaldas aves durante este período parece ser exercida, maissatisfatoriamente, pelo método de exclusão competitiva(METHNER et al., 2001; STERZO et al., 2005).

A cepa atenuada SG àcobSàcbiA mostrou-se capaz deproteger aves contra o desafio pela cepa patogênica de SG etambém foi eficaz em reduzir a infecção por SE quandoinoculada duas vezes em aves de postura. Destarte, osresultados obtidos na presente invenção são promissores edeverão nortear futuros estudos visando a aplicação da cepaSG ãcobSàcbiA como vacina no controle da infecção de avespor SG e SE, em condições experimentais controladas, bemcomo estendê-los para pesquisas aplicadas ao campo.

Portanto, dentro das condições experimentais adotadasna presente invenção concluiu-se que:

A cepa SG àcobSàcbiA tornou-se atenuada e nãocausou mortalidade^em aves.

A aplicação de uma ou duas doses da cepa SGkcobSàcbiA é capaz de proteger aves contra o desafio poruma cepa selvagem de SG.

A inoculação de duas doses da cepa SG AcojbSAcJbiAfoi capaz de gerar imunidade cruzada e proteger aves contrao desafio por uma cepa de SE.

Houve redução significativa da quantidade de SE encontrada no fígado, no baço e no conteúdo cecal das avesque receberam duas doses de SG bcobSbcbiA.

A aplicação de duas doses da cepa SG àcobSàcbiAcausou grande redução da excreção fecal de SE utilizadapara desafiar as aves.

A cepa SG àcobSàcbiA é invasiva e não foi capazde impedir a colonização do ceco pela cepa de SE.

A vacinação com duas doses de SG AcobSàcbiAcausou redução de SE nos órgãos, no conteúdo cecal e naexcreção fecal, desta forma, a proteção conferida pela cepavacinai deve ser classificada como parcial.

A cepa SG àcobSàcbiA possui vantagens, como aimpossibilidade de ser excretada nas fezes, a completaatenuação, a excelente imunogenicidade contra SG, aincapacidade de infectar humanos e a possibilidade de ser detectada e diferenciada por técnicas moleculares.A descrição da invenção, detalhada, acima, e osexemplos aqui descritos foram apresentados apenas com asfinalidades de ilustração e descrição e não como limitação.Portanto, é considerado que a presente invenção compreende5 quaisquer e todas as modificações, variações ouequivalentes compreendidos no escopo dos princípiossubjacentes básicos revelados acima e aqui reivindicados.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

<120> CEPA BACTERIANA MODIFICADA E USO DA MESMA

<130> 13861/2008 - FCAV-Unesp.

<160> 5

<210> 1<211> 24457<212> DNA

<213> Salmonella enterica sorovar Gallinarum

<400> 1

caaggcgcag tgccggaagc accgatttga atggaacggc gagcaccggc tggtgcgctt 60

taccgacgtg cgccactatg atgatgaagg ctttccgcgc cactcgtggc gctatgagtt 120

cgataatggc gtgaccaccc tatatccctg tccgacgcga aaatcctcag tatcaagcct 180

tctgataatc cctttaagct gatcgattct cacggtcggt atctgcttgt taatccgggc 240

ttgtgggtcc aggcgctcaa ggagcgtgaa gtgcggcgca atgttttcgc cttccggcgc 300

gtttcctgac gtagacgcga ttatcggcga caggtctccg gcgatggtga tgaagccgcg 360

gcacaataag gccttaacgg gatacagaac cgcctcccgc taaggcttca ttcagccact 420

ttccatatca cataaatacg cctcttccgc tcctgtccag cagcaggcga cagctcattt 480

cgttagcgaa acggtggctc attaaacgtg cgtaatttac gtgagtgcaa acgatcacct 540

tctgcgcgta gtaaatcaat agcacgaata ccaatttgca aatgttctga aatagccccc 600

tcataaaacc ggtttgcctg cccgggcagt ttaatttcac cgtgtaaagg tttgtcagaa 660

acacaaagca gcgtgccgta aggcacgcgg aagcgatagc cctgggctgc aatcgtcgcg 720

ctctccatat caatcgcgac cgcgcggcta aggttgaatc gcagcgccga tgcggaataa 780

cgaagctccc agttacgatc atccgtggtg acgaccgttc ccgtgcgcag tcgctgtttc 840

acctcttcac cgggcattcc gctaaccgct ttggtggcgt cgtacagcgc acgctgtact 900

tccgcaatgc ttggaatagg aatatcaggc ggcagaacgg catccagcac atgatcatcg 960

cgtaagtagg catgggccag cacataatca ccaatcgcct gactttctcg taaccctcca 1020

cagtgcccaa tcataagcca gacgtcaggc cgcaacacgg ccaaatggtc gcaaatcgtt 1080

ttagcatttg aagggccgac accgatattt accagcgtaa tcccctgccc atctgccgtt 1140

accaggtgcc aggcgggcat ctgatgcttc ttccaggcca gatcggaaat agcctcttcc 1200

ggcgcttccg tttctgccgt gatccaaatt ccgccggcac aggaaagcgc gatataggga 12 60

ctgtcaggat caagaatttg gctgcatccc cagcgcacaa actcatcgac,atagcgggtg 1320

tagttggtaa acaaaacgaa gggctgaaaa tgttcaaccg gcgtaccggt atagtgccgt 1380

aaccgggcca acgagaagtc aacacgacgc gcgtcgaagt gcgatagcgg atagaattcg 1440

ccggggtgga acagaccgtc tgccgtctca tcgccaatct gcgccagttc tgtggtagga 1500

aaatggcgcg ttagcccggc gctcatagaa cgatccagcg tcagagccga gccatcgatc 1560

acataaggat acgggatctc atggtgcgag gcctctaccg caatatgcgc gccataatca 1620

tggtaaacga ggttaagctg ttccagaaga taagcgcgaa atagcgcagg ccgcgtaacg 1680

gtagtggtat aacagccggg atgagtaaag cgtccaaaag cgcgtgtttt aggcgggttc 1740

ggtgtcgcgc catcccagct tacagacagc gaaggataaa caaacagtcc gttaagcctg 1800

gcgtggggat cgggcagcgt accgttatca acatagtcag cgatggcttc acggagcgcg 1860

ttaaccgact gctcgtatag ctcctccagg cgatccagcg cctgctcggg cgttaggttt 1920

gtgcctttat tttccatatt attctcctta gcgttcacag gtgaggcacg tcattcgata 1980

gtatgacagc aaaggaggaa actaaagggg ttagcgtaag ggtggcgaca gtaaacatga 2040

accctttaaa aagaaaagag aactatctta gcgccaccat catcgctcaa aaagaagggt 2100

actggtacag ccatttgtta agttcattac aattagtcat ataaccattt cccggctttt 2160

gctgactcga tcagcatgct gatagtgaaa tctgggacgg gtacaggttc cgttttcttg 2220

aacggatgcc atgaaaaagg gtgattagga aaataggttt ctattctgaa gttacctcgc 2280

tcgacattga gttcctcgaa gaatttattc atgagatctt cggcttcaag ttcatcaatg 2340

ctcagatcag tatcaaggtc aatctctggt gttaattcca cttgcttaat gttgaaaaga 2400

tatgtgccag cataaggccg tacaagctcg taaacttgct gttcaatatt gtctaccata 2460

acttatcatt gccccgagca atggtattgt agtcgcgtat agtgcaatat gttatttgtg 2520

acacatctgc ggcaaggata atttccccga tcaaaggaat ggaacgtcca acaaacggcg 2580

caatgttacg aaccataaca cgtctggctg tccatggggt gtaaccgcct aaccatgtcg 2640

gaagggatat tccaaaggga aattttgact ttttaaacac tgcacgtgca gtcctggacg 2700

cgtatgatgt gcctttagtc gctccagcgg gtttcgccct tgtccaaaga ttattacgac 2760

ctgatgccaa agcaacaaca gccccgaaat ctgcaacacc aatcccaaac tggcttgcgg 2820

tattctcaca aaaaatcata acagaagttc ggcagcagtc agattggatt ttcctgcata 2880

gaagtatgtt ccatttagtt cttctactgt atccattaga aactctatag ttactatttt 2940

ggtttactta ttgtacatcc ttgtttcgaa tgaaagaaat caatcttttg ggaaagaacg 3000

gatcaagatc actggaaata tctgaaatca gatgaaagag acagtcgcga ttcccaccag 3060

gggcatcacc tggcaagctt gtgtgatcgc tccgtttgaa ccgaacacat ctatatgtca 3120gcatactgat acgggtttga tcttgcggat agcggtatcg gttaatgcca tacgtagggg 3180

ctccattttc tcagcgaacc gtgaagcctc cgattaagcc cccaaaaacc atggatgtca 3240

aaaaacccgg taaaccctct caggtcaacc gggtaaagat aatttattgt tttttaaacg 3300

tctccggact caccaggata tcccgaaact aaaatctggc tcctctgact ggactcgaac 3360

cagtgacata cggattaaca gtccgccgtt ctaccgactg aactacagag gaatcgtgtg 3420

aacggggcga atattaacga ggtgcccctg gcttgtcaaa gcctgttttc acaaaaaaag 3480

ttcgtttgct gctttattcc acacttcggt taaaattcac cgtttcctga tgattttcac 3540

agcaaaaagc gcttactccc tctttacgcg cgggtatctc cacagccagc gcccgcttat 3600

cagacgccag taaaacagtg cgccacgcac ggcccagtca agaaacatcc ccagccaaac 3660

ccctacaacc cccataccca gcacaatacc aagcgtatac cctgccacaa cgcgacagcc 3720

ccacatcccc agcatcgata cccacatcgc aaatcgcaca tcgcgcgcgc ctttaaaacc 3780

cgacggcaac acccacgcgg ccgcccaaat tggcataaag gcagcattaa gccagagcag 3840

aactttcact acctctttta cgtcctgctc ctgggtataa aatgaggcaa acagacccgc 3900

aaacggcgcc gtcccccagg caattgccgt aagtacgata gtcgacatcc agaatacatg 3960

gcgcagttga cgctctgcct gaccaatttg cccggtacca agacgcttac cggtgataat 4020

agtcgacgcc gaaccaaggg cgttacccgg caggttgata agcgccgcca cggaaaaggc 4080

aataaagtta cccgcaataa cgttagtgcc cattccggcg acaaacattt gcgtcagtag 4140

cttgccaccg ttgaacagca ctgattcaat gctcgccgga ataccgatac ccatcacttc 4200

ccagataatg ccgaaattca gcggcttcag atagcttttc agcggaatgc gcagcgccgg 4260

attaaaacca atcatcagca cccaaataat cgctaccgcg ccgatgtagc gcgaaatggt 4320

taatcccagc cccgcgccgg caaaacccag cccttgccag gagaaagccc cgtaaatcag 4380

gatgctgctg ataataatat tgagaatgtt catcccgccg ttaatcatca acgggatttt 4440

cgtattccct gccccacgca gcgcgccgct accgattagc gcaattgccg cagccggata 4500

actcagcacc gtcagttcaa ggtacgttaa cgccagcccc tttacttctg gcgtcgcctc 4560

gcctgcgaca atattaataa tttcactgcc gaaataatga atgaccactg ccagcacaac 4 620

ggcaaatagc gtcataatca ccagcgactg gcgcgccgcc gcccttgcgc gtcgcctgtc 4680

gcgcttgccg aggctaaagg cgaccaccac cgtagtacca agatcgatag ccgcaaaaaa 4740

agccataatt accatattaa aactgtcggc aagccccacg cccgccattg cttccttgcc 4800

cagccaactg acgagaaaag tactgagcac gcccattagc aaaacacagg tattttccag 4860

aaaaataggg atagcaagtg gggtgatttc acgccagaac aacactttgt agctcttgcg 4 920

tttggcatac cagggcgtac ggacgacagc ctggcgtaag gcagtggaga cgttcaaaat 4 980

ggaccttaaa gaagagagtt gaaaccacat ttcaataatg agcgagaaat cgtaaggctg 5040

caaagctttt tgcagaaaaa atgtctgcaa atgcaacaaa gtgatgagat aacccgcaat 5100

cgaatctgta agaggttaaa tggggtttga caaaaatttt tccgccgcta atatacgacc 5160

ccacacgatt cctctgtagt tcagtcggta gaacggcgga ctgttaatcc gtatgtcact 5220

ggttcgagtc cagtcagagg agccagattt tagtttcggg acatcccagc gagtccagag 5280

acgtttaaaa aaacaagaac ttatctttac ccggttgacc tgataaggtc taccgggttt 5340

cttgacatcc atagttttta ggggcctaat cgggggcctc acggttcgct.gagaaaatgg 5400

agcccctgcc atgacactca ctactaatac agatactcca gcccatgaaa accagcaatg 54 60

cgacaggata tttaaaggcc aggcctgccc gcgctaatgt tgaccggcat tccggaacgg 5520

cgctccagca cctcattaac ccgcgaagta tcaacgtcat cccctttgat aaacgtgcgc 5580

agcactggcg taacgggcaa tggaactttt ttgtctgact caaattcagc acggttgcga 5640

gaaagcggtt cgtgtacctc cagccaacga ctgccatccg gctctaccga aaatttaacg 5700

ggcctgtcga taatctgaac gcgggttcct acaggaacat ggtcgaataa atatttaata 5760

tcgtcattgc gtaaacggat acagccctga ctgacgcgaa ggccaatgcc aaagttagcg 5820

ttagtgccat ggatggcata taacctgccg atatatattg cgtatagccc catagggtta 5880

tccggccccg caggcaccat cgcgggcagc gtttttccct ctttagcata ttcccgacgc 5940

gtattagccg ttggcaccca aaccgggcca tcttgtttgc gttcaaccgc agttacccag 6000

ttgcgcggcg tttcacggcc agcctgacca ataccaatag gtagcacctc aaccgtattc 6060

gtgcctgcgg gataataata aaggcgcatc tcggcgacgt ttaccacaat accttcacga 6120

acggtgtcag gcagaatcaa ctgctgcggc accaccagtg tggaaccaga ctgaggtaaa 6180

aacacatcca cgccgggatt cgcttcaagc atattactca gcccttgacc gtagcgggcg 6240

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aacaagacga aaaacggaaa aaaaggtgtg atacgacgca ttatatccct tcctttgtcg 6420

cggcaggtgt gcgttaagta tagctttttt ctcacatggc tggtgttgtg cgcccgggtt 6480

atgttgcgtt tgcgttcccc tccggcagga caatattact ggccgccaac tcccccatgt 6540

tgtggaacat ggcgcacgcg gcttccacga tcggcatcgc cagcgccgcg ccgcttcctt 6600

cacctaaccg catcgccata tgcaaatagg gttccataga caaatgcgcg agcgcgatgc 6660

gggcgccctt ttccgccgaa aagtgcgacg ggatcagata aggtctcacc gcaggcgcaa 6720

tctgacaggc cgccagcgct gccgagtagg aaagaaagcc atccagcaat acgggtaagc 6780

cacaccttgc cgcgccaagc atcacgccgg tcatcccgac cagatcaaaa ccacccacct 6840

tcgacaacac atcaatgccg tcgcgcggat tgggctgatt aatcgcaatc gcccgccgca 6900

cgacgtccac tttattatcg atgcgggaag gcggaagatt cgcgccaatc cccaccacct 6960

cttttgcatc acttcctgta aaaacgctga ccatcgcggc ggctggcgta gtgttcgcca 7020

ttcccagctc ccctacgcca aataaggtca cgccgcgttg cgccaggtcg caggtgtagc 7080

gggaaacctc cagcaaaagc gcctcagcct gcaagcgact catcgccggg ccaacggcaa 7140

tatttccgca gccgcgcgcg acgcgcatat taactacgcc aggaataggt tcggcatcaa 7200taccgacatc aatgacatgc accttcgcac cggcctgagc ggcaagcacg catacgccgg 7260

ttgttccccg cgtcatattc gccgcctgaa tcgccgtcac gattttgggc gaaaccgcta 7320

cgccttcatc ccagacgcca tggtcggcgc acatcaccag caccgccttt tcacctacct 7380

gcggcgtacc gttaagaccc ggcatacccg cgagctgaac ggctaaggtt tccagtctgc 7440

ccaggctgcc cggcggtttg agcaggccgt caatatgttg ctgcgcacgc gccatcgcct 7500

cggcgtccgg cgcaggaatg tcacggagta aagcgtgtag tgtctgcata agatgtctcg 7560

tccgtaataa tcggctcata acagagccag cagaaagatc aattcaccaa gttcgatcgc 7620

cgcgcccagc gtatcgccgg tttgaccgcc aagcgtacgt ttaagcaact ggccaaggat 7680

gaaaatcgcc gcgcatgtga ccaccattgc ggccaaccct tgcataccag gcagtaatac 7740

cgtggcgacg attaccgcca atcccagagt aatgcaggtt tgccgtccgc tgactttacc 7800

gataaataca ttgccaagcc cctcttcacg ggcgtagcga tgacggtaca tcaataaaac 7860

ggcgctgccg cgtccggccg cacaggccgc cgccaacgcc gccaacattg gcgttccacg 7920

taacgccagt tcgctgacca ccagaatttt tgccagtagc acaaaaataa gcgccagccc 7980

gccatgggtt cccagacgac tatcacgcat aatctccagc attcgctcac atgagggaag 8040

cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc gagcgccatc 8100

tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc 8160

cacacagtga tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc 8220

gagctttgat caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc gagattctcc 8280

gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta 8340

agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc 8400

cagccacgat cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa catagcgttg 8460

ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag gatctatttg 8520

aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct ggcgatgagc 8580

gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc agaatcgcgc 8640

cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat cagcccgtca 8700

tacttgaagc tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag 8760

atcagttgga agaatttgtt cactacgtga aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat 8820

aaggaaaaaa tgccatcgca ggtatcggcc agcccatcca ggcgccagcg ccagaataca 8880

gaacaacgcc gctagcggaa taccacacca gggttgcagg aggatgaaaa tcaggccgct 8940

tacgcccccc agaatcaacc cgataaaggg aaacatcacg atcccacgcg aatactgctc 9000

gaaatccagt ccctgcgacc agcgtgacgg cacgggcaag cggctaataa aagcgagcat 9060

ggcccaaaac agcttactca tttaattttg actccaatac ctgagactac cagccagacc 9120

tcatccgccg ctgccgccag tcgttggttg acccgaccgg caatatcacg aaaatggcgc 9180

gccagacggt tttccgggac gatccccatt cccacctcat ttgtcaccag taccactttc 9240

gccgggcagc gctggcaggc tgcaattaaa atctgaattt catcgtcaat ggcgcgctcc 9300

atcgccgcgt aatcccactg ttcgggatcg ttctcgcctc ccagcgcaaa cagcagattc 9360

gtcaccatgg tggtaataca ttccagcaaa atcgcgtcgt caggggcaag atccgcggta 9420

atcaacgtat caagatgccg ccagcattct gcggtccgcc agtgtgccgg, cctgccatct 9480

ttatgatgct gaattctcgc cgccatctcg tcatcaagaa tctgcgaggt ggcgatatac 9540

agtacctgcg gcgcatcgcc aattaaggct tcagcatgac ggcttttacc actacgtgcc 9600

ccgcccgtca ccagaatcat cataccggct cctgatgttg ttgcatgatg gtataaattt 9660

tatcaatatc aatatgttgc cgcatcgctt ccgccagcag atcaaattgc cgcgctttat 9720

gatccgcata acaaaaagtc gtttcccacg gcgcaagccc ctttcgcgcc cgtaacccat 9780

tgaccaccgc acgggtaaag gcatcgctgt caaacaggcc gtgaaggtaa gtgccaaacg 9840

ccagtccgtc ggcggtgacc gcgccatccg ccacagagca tccatttttc tgtaacgtca 9900

tggccgtaca gcatccttcc tgcagcaccg tttcccccat gtgaatttca taaccgcgta 9960

ccggtagccc cgccgcggca gccagccagc cgggcagctc gcctgacatt gtcgcgttaa 10020

cctgcgtcgt ggttttatcc tgtgcaaagc gagtgattgt attaagcagc cccaggcccg 10080

gctgcgtacc cagccccgac tccacctcat ccacaatggt gtcgcccagc atctggtagc 10140

cgccgcaaat ccccatcacc ggcacgccct gccgatgtgt ctgcaatacc gcatccgcca 10200

tcccgctttc gcgcagccag gcgaggtcgc tcagcgtatt cttactgccc ggcaggatca 10260

ccagatcaac gtcagtcaac gcttccgggc ggcgaatata gcgtatgcgc acatccggct 10320

gcgccgccag agcgttaaaa tccgtaaagt tagaaatatg tggcagttgc acaatggcaa 10380

tagtgatatc acggggggcg ttaccgcgat atttatcgtt ttgcagcgcg acgccatctt 10440

catcttccag atccacatcc agccacggca tcactcccag gaccgggacg ccggtaagcg 10500

attcgatttg ttcgataccg gaatagagta gcgccacgtc gccgcggaat ttgttgataa 10560

tgacgccctt tactctgtca cgctcctgtt tatgcagcag cgccagcgtg ccataaatag 10620

cggcgaatac gccgccccgg tcgatatccg ccaccagaat aaccggacac tgggccattt 10680

ccgccattcc catattgacg atatcgcgat cgcgcagatt gatttccgcc gggcttccgg 10740

cgccttccag cacaataacg tcatattcct gcgccaggct gttatagacc gcaaggattt 10800

gctcacgcaa acgcggttta tagtcatggt aactaaccgc atccatattg gtcgccactt 10860

tccccatcag cacgacctgc gcctggcgat cgctggtcgg tttgagcagc accgggttca 10920

tacgcacatc tggcgtgatc cccgcggctt ccgcctgaaa aatttgcgcc cgccccatct 10980

ctttaccatc cggcgtaata ccagaattaa gcgccatatt ttgcgattta aacggcgcgg 11040

tacgcagacc atcctgataa aaaatgcggc ataaacccgc cgccagcaca cttttgccga 11100

cgtcggatgc cgtcccctgc aacataactg cctgcgtcat gacgcctccc tgaatgcgca 11160

cttttgcatt cgatgaaaaa actccgtttc tgttttacac agcggcagtc ccagttgagt 11220

atgaagtttg accagccagg gctgggttag ccccgcgtgt tccatcgctt ccgtacacgc 11280gaaaacctcg ccaggcgcgc catgcgtcag gatctggccc tggcgtaata cgtatacggc 11340

atcgctaatt tcataaataa gatcgatatc atggctggat ataatgacat gattgccctg 11400

cgccacaatc cgcctgatga tagcaatcat ctgagtgcgc cctgcgggat cgagaccagc 11460

agtgggttca tccagcaata gatagcgcgc ctgtagcacc agcgctccgg cgatagccac 11520

acgttttttt tgcccatgac tcaaacactg aatgggctga tggcgaaaat gttgggcgtc 11580

aaccagcgtt agcgcctcgt cgacgcggcg cgtgatttcc gcctccggca cccccaaatt 11640

acgtaaacta aatgcaatat cgctatcgat atcagtataa aaaatctgct gttcagggtc 11700

ctgaaaaacc gtcgcaactt gctggcgcag cgccagtagt ccgcgcttgc tgtaatccag 11760

cggttttccc tgccacaaca cggccccttt ttgcggacgc aacaagccgc tcaggttcat 11820

aaaaagcgta gacttcccac agccgttcgc gcccaccaaa ccggtaacag gcgaaagcga 11880

aaaatccata tttaaccctt taagtaccgg ctcattctga taacgaaacc acaggtctga 11940

agtggcaagc ataatagtcc ttacaggtga aaatcaccct gatacagttt gatatccagc 12000

gtggtggtca tttgctgata acgcattaac acccgcgtaa acaggagtcc agccagcatc 12060

gccagagatc gatagccgtt cggcaggctg caataaccaa aacgcagcgt ttgcgcacga 12120

cggattgcca ccgcctcatc cagaagaata aagagaaagc gccacgttaa caggatttgc 12180

tcggtaagca ggcgtggaat atgcgcgcgc ttaagcaagc taattaactg cggaaacggt 12240

aggttcatca ccagccacaa cgtcgcggac agcgccgtca ggctacgcca gaacgtttca 12300

ttcgccgtaa ccacgcccgc acgggtaatc ccgatccagt acggcccaac agatatgcca 12360

gccagcagca tttgcggctc gcggctgatg ctgaagataa tcgttatcac gccgaccaac 12420

aaaaatccaa aaggtatcgc catccatcga caccagcgcc agagggatat gcgcaatagc 12480

caacagctca atccggcaat gatcagcagc tcaatgccct gccctacagg cggcagaaca 12540

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cagcggcttt gatagctgag tcgatcaagc ccggtcatca cggcgttgtt tacctttgca 12660

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cgcaatagcc tgaatctggc tttccgcttc gccgtctgaa ccgccatatt caccgccatg 12840

gttaataaaa aacggcagaa tcaccagcgc caccaccatc gctaacaaca tcaacgtttt 12900

tttcatttta atgtccttgt acggtaatca cttgccgttt ggttaactgg tcataaatca 12960

tgacggttaa taaaccttca gcaatggcga caggaatctg tgtgaggcag aaaatcccca 13020

taaacttcac aacagaccct gtcgctccgg catggggatc gggaaacgca acgccaagct 13080

ggactgaagt cacaaaatag gtcgccaaat ccgccagcat cgcgcacaga aaaacggcga 13140

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caatcaccgc catcgacatt ccatttgcgc caagcgtcgt caggccaccg tgcgccagca 13260

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caaagcttta atacgggcga accggccata cactttcatc aacaccaggc tatcatgctg 13860

ttgtagcgcc tgggctattt ccgcttccgg cgcggtacaa gaaataaccg ccagcgattg 13920

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ggggacaatc tccagccact ccgggcagcc gattcgctgg agtaaaaaaa tccaggtact 14040

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tcgtcgccgt taataatgtg caacgactga atcgccacgt cctgatatcc ctgtgcggca 14940

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cgaatgatca ttccggaagt gaaggcgcga aacaggtcgc gatcgggaca ggacgccgcc 15060

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ctgaccacca gaagcgcttt tttcattttt actccttagc tgcggccagc cagcgcgata 15180

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ggcgcgcaat aacgatgcaa ggaatgcccg catccagaca gggctgaact ttttcctgat 15300

atcccccctc cgcgccggac gctttggtaa tgaccacgtc ggcccggcac tggtggtaaa 15360acgcggcgtt aaaatcagcg ctgaacggcc cacacagagc gaaaatttct ccaacgccga 15420

accccagttc gctgcagcgt tgaatcacct ccgccacggg cagtacgcgc gccagcaacg 15480

ttttttccgc cagcccggca cgccagacgg ccagatcttt actgccggtc gtcagtaaca 15540

cgcgcggacc aaaacgcctc gctatctcgc aggcatcggc aatactgcgc gccgtataga 15600

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tatcatcagc ccatcctgaa cataggtcgt tttattacca acgatgacca gactggtcat 16020

atctaccggt tcaaaatcca tatcgccgag cgtagtcagc catttttcct ctttcttacg 16080

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tgcgatactg gcggtcatcc ccggaataag gcgaacctct acatccagct tctgcttgct 16380

caccagctcc agcaccagtc ccgccatgcc gtaaataccg gcgtcgccgc tgctaatcag 16440

cgccacgtta tgcccggcct gcgccagctc aatcgccgcc tggcagcgtt caatctctct 16500

gcacatcccg gttttgatca cctgcttatc gccggtaaag gctttcacca ggtgggtgta 16560

ggttttataa ccgacgacga tttccgccgc ctgaagcgcc tcaatcgcct ccatcgtcat 16620

cattgcctgc gaaccggggc caataccaat tacgctcaac atcagtgtgc aactcctaaa 16680

gtaatagtga cgccctgttc tcgcagggtc tcgcctaaca attgtccctg gcttaataac 16740

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ggaaaatggt gttcgaattc gcgtaacgct tcggcggtaa aggttttaaa aggcacgcgg 16860

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ggaataaatc cctcttcccg cagtttttca ctggtaaagc aggttaacgg cagcatcgcg 17640

gcgagtctct ttgccagcgc cacgccgccg ggcgtcaggc aaaacaacgc aatggattca 17700

ggctttacgg tattcatggc taaagtccgc tgcataaagt cttgagtagt gatactcctt 17760

acccagaaaa ttcccgacca ggattagcgc cgtcttacgg atgccagcat cacgtacttt 17820

gtcgctaata tccgctaacg tgccgcgaac gçtctgactt tccggccagg tagccttata 17880

aatgaccgcg acaggcgtag ttgccggata accgccggca atgagacgtt ccgccacccg 17940

gtgaatacgc tgaacggaga gataaatcgc catcgacgtc tggtgactgg cgaacgcctc 18000

cagttgttcg cgcgccggta ctggcgtacg cccttccaga cgggtaataa tgagactctg 18061

cgatacctcc ggtacggtat attccacacc cagctccgcc gcagcgccga gaaacgcgct 18120

gacgccaggc actacctgcc agtcgatacc acggcgagtt aactcctcgc cttgctcacg 18180

tacggagccg tacagcgaga catcgcccgt ttgcaaacgc accaccgttt ttcccgcctt 18240

cacgcccgcc gccatcagct cgataatctg ctcaagatgc agttcggcgc tgtcgtagcg 18300

ttctgcctgc gcggggcagt aatccagcag ttcggtattg atcagcgaac cggcatagat 18360

aactacctgc gcctgttgca gcaggcggta gcctttaagc gtgatcagct cgcgatcgcc 18420

cggcccggcg ccgacgaacc atacacagcg tggatcaaat gtctctgaca tggttttctt 18480

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caagatgcgc cagcgcgcta tgaaggtttt cctgcaagat aaaggtcatc accagacggc 18660

caccgggatg cagatggccc atcgcccagt caatcagcgc cgtcagatgt ccgccgctgc 18720

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tatcgatatt gccgcaggca aagcgctgac gattctcatc aagcagccgt agtgcggcag 18840

gattacgctc gatagccgtc acctgcaacg aaggaaattg cagcgccgct tcaattgaga 18900

cgcttcccgt tcccgccccg acgtcaatca ggtgactggc gcggtggagc tcaagtttcg 18960

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acgggtagcc agtggatccg ctcattttcc atcgccagat tttcaccaat caccattaag 19140

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tggctactgg tcaaccacat gtcattcata tcaattccag cctgtgcgca cagatactgt 19320

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atatccgcgcttaccgcctgtgccgtccagcgacgggacgcaggcggcgtgatggttatatatcgcaatccgaccagcgtcgattttgatccgcctcttccgcccatttgttaatcctgaccgacatcgggccgcgagttcggccccacgtacgattgattaccttcgcctcagcattcccctgctggcctgacgatggaccgccgccgtagaccggcgcattgacgatagaaatggctagcccaccacgattaccgaaacattgaacggacagcgacaccgtggtatcgatcggcagagcttgataatgaatgtcgctacatactgtcggcgccagggttatcgcgctgggccaccgagggctactgtggacacagtccctacgtcgtcccaccattgagaaagaggaaccacggcgcgagagttttatcggcgtgggcagccaaaccatcgccccgacgacaatagcggatggggccacaagaatcgttgggcgaaatcattcctgtagggataaaatagcgttggctttgctgtgacgtgctccccagccgcccgcatccaacatggggtgcgacaaggcaaaggtagaatttatgcctcaccactgggtgaaaatatgtaattgtcaataacggttcaagtctggaggtgatttctgttggacgagggtgagtttt

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tcgttcgccgggcgtggtcttcccacgaccagaatatggtcgcagcatctaagccatatggtgagtaactgcatcggcaaggatgacccaccgacaaaataaccgttcgcatctccagttccggtagtgctgcgcccgcgatcgcttcgcccgagcggcagtaatctcactccacgtcatggcgactccaatcagatgttccggtggtatagctcgctcacgttactgcccctctttggatcacgttatgtgtttttctcgcgtttgtgcacgtcgccagtgcacggatgtgtccagccagcggactggcaactgttggcacgccagatacacatcaatcatccagggctaaggcgccggtcacgccagccccagcaacactgaccatacttgacggcttgcgataatgcgctggctgaagcaaggtcgtccggccagcgcgctgcgccacacattacgccgctgcacaatcgccgatgagctcgccgccatagctggcaatcgcgaaccaaattcatggcgcctcacaaattcgccatcaccaccacactattcaacggatatgggtatgtatgggaagtgatgttacacatcaagcatgaaaacagcagctggcagtgcgatcgcgtagagtgatttttaagctattgccttatttttagaccgatacacagaaacgg

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ctcgatgagt ttttctaagg cagtgagcaa taatgttcaa tggcattttt gaggagctga 23640

tagtgggcgt cgctagtgac gcgattcaca atcacgcccg cgaggttgag ggtcgggtcg 23700

aagtgctgaa atcccataac ggtagccgca agcgacgttg aaacagcctt gccgtccacc 23760

agtaggatga ccgggcaacc aagctgtttg gccatcgcgg ctgtgctgcá gtaattgggg 23820

tcgacgccat agccgtcata caaccccatg accccttcaa tgacagcgat atccgcctgc 23880

cgcatttgtt cgcaaaataa ggcgttgaga acaggaggag gaagcatgaa actgtcaaga 23940

ttacgggacg ccacgccaca gatagcggta tgccagccgg tatcaaggta atctggccca 24000

actttaaacg gctgtacgcg cagcgcgcgt ttttgcagca gcctcaacaa accaagcgtc 24060

accgtggttt tgccgcaacc gcttcctgtg cctgcaagaa taaatgcgtg atgccttgcc 24120

gccattaccc tgatcctgtt cagggtggta ggggtataca ggtacgcgca tgttcagtct 24180

ttcgactgta cgcgtcttcg caacccactt cccaccgaag ttgttggtta tcaccgacag 24240

gcaggtcttc tggcttagcg tcctcctcgc ccgtccttcc caatcttgcg atcagtggtc 24300

tttacggggt cgtcagcatc açagcagcgg gggctgcggg ggattttcac ccccttccct 24360

accacaaatg tggcaaacct gttggtttac gttatggctg tacggcacac ccataacgác 24420

aattaataat gtgctacgtt ttacatttct gtgagca 24457

<210> 2<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<223> Primer 1 - Gene cobS<400> 2

gagatctaga acgaatctgc tgtttgcgct 30

<210> 3<211> 28<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<223> Primer 4 - Gene cobS<400> 3

agtctagaac agacccagca gaaagatc 28

<210> 4<211> 28<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<223> Primer 1 - Gene cbiA<400> 4

catctagaaa ggcatcacgc atttattc 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<223> Primer 4 - Gene cbiA

<400> 5

tgtctagaca gccagtgctg caacattt

28

Claims (13)

1. Cepa bacteriana modificada caracterizada pelofato de ser identificada pela SEQ. ID No. 1.

2. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser defectivaquanto aos genes cobS e cbiA.

3. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser atenuadadevido à deleção de ambos os genes cobS e cbiA.

4. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 3, caracterizada pelo fato da deleção ocorrerem um gene na parte I do óperon cob, onde o cbiA estálocalizado e um gene na parte III do óperon cob.

5. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato dos genes seremassociados à produção de cobalamina em ambiente anaeróbico.

6. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser preparadapor conjugação e transdução.

7. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de ter sidopreparada a partir de Salmonella enterica sorovar Gallinarum.

8. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 3, caracterizada pelo fato dos primers paradetecção da deleção nos genes cobS serem os primer 1 (SEQ.ID No. 2) e primer 2 (SEQ. ID No. 3).

9. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 3, caracterizada pelo fato dos primers paradetecção da deleção nos genes cbiA serem os primer 1 (SEQ.ID No. 4) e primer 2 (SEQ. ID No. 5).

10. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de serimpossibilitada de ser excretada nas fezes.

11. Cepa bacteriana modificada, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de serincapacitada de infectar humanos.

12. Cepa bacteriana modificada caracterizada pelofato de ser conforme a amostra CECT 7632.

13. Uso da cepa bacteriana modificada conformedefinida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,-6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de ser paraproduzir uma vacina para induzir proteção em aves contra ainfecção pela cepa homóloga natural e cepa de SalmonellaEnteritidis.