HU194496B

HU194496B - Process for preparing a living vaccine against marek disease

Info

Publication number: HU194496B
Application number: HU851448A
Authority: HU
Inventors: Boer Gerben F De
Original assignee: Centraal Diergeneeskundig Inst
Priority date: 1984-04-09
Filing date: 1985-03-27
Publication date: 1988-02-29
Also published as: NL8401120A; JPH0317808B2; IL74809A0; EP0159743B1; US4673572A; YU44687B; MX7718E; HUT38542A; EP0159743A1; JPS6123A; CA1251397A; AU4156185A; DD232822A5; IN163229B; WO1985004588A1; ZA852564B; IL74809A; YU59985A; ATE56364T1; ES541930A0

Description

A Marek-kór a csirkék rosszindulatú nyiroksejtburjánzási (limfo-proliferatív) betegsége, amelyet egy herpeszvírus, a Marek-kór vírus okoz. Ezt 1907-ben ismerték fel először, ez még ma is a legpusztítóbb a baromfivírusok között.

A találmány egy nagyon immunogén és nem patogén víruskészítménnyel foglalkozik, ez a vírus az 1. szerotípusú madársejttenyészeteken végzett sorozatos passzálásokkal és tarfolt (plakk) tisztítással készül. A jelen víruskészítmény előnyösen egy nagyon immunogén és nem patogén MDV-klónból áll, amely klón a CVI-988 jelű MDV-törzsből származik. Az eredeti vírusizolátumot, vagyis a CVI-988 MDV-szülőtörzset, egy egészséges laboratóriumi csirkéből nyerték, mint olyan kis virulenciájú izolátumot, amelyet sejttenyészeteken végzett sorozatos passzálásokkal gyengíteni lehet [Rispens és munkatársai: Avian Diseases 16, 108-125 és 126-138 (1972)1 Azóta a madársejttenyészetben mintegy 35 passzálás után nyert víruskészítményt sikeresen alkalmazzák csirkék vakcinálására Marek-kór (MD) ellen. Kezdetben a vírus gyengítését kacsaembrió-fibroblaszt (DEF) tenyészetben hajtották végre. A kacsákat azonban nehéz speciális, patogénmentes (SPF) körülmények között tartani. Ez szükségessé teszi mindegyik termelési tétel kiterjedt vizsgálatát abból a célból, hogy a madarakra patogén mikroorganizmusok távoíléte garantált legyen. Csirkék tartása SPF-körülmények között kevesebb problémát jelent. Ezen felül a csirkesejtek előnyösek, mivel nem visznek be az MD-vakcinákba az állatfajra idegen sejteket. Következéskép en az 1967-1978 közti időszakban a CVI-988 MDV-törzset csirkeembrió fibroblaszt sejttenyészethez (CEF) adaptálták, és a CVI-988 MDV-vakcina előállítói átálltak CEF-ben végzett vakcina-előállításra.

Bár a CVI-988 MDV szülőtörzsre alapuló vakcinák a gyakorlatban nagyon kielégítő eredményeket nyújtanak [Maas és munkatársai: World Poultry Sci., 38, 163-176 (1982)1 ezek MD-károsodásokat válthatnak ki az MD-re nagyon fogékony SPF Rhode Island Red (RIR) csirkékben, amikor ezeket a csirkéket a normális szabadtéri dózis tízszeresével inokuláljuk [Avian Phathology, 6, 395-403 (1977)].

A Marek-kór elleni, használatban levő egyéb vakcinák a következők:

A) Pulyka herpeszvíruson (Turkey Herpesvirus, HVT FC 126) alapuló vakcina [Avian Diseases 14, 413-429 (1970) és 3642574 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], amely vírus 3. szerotípusú madár-herpeszvírusok (Avian Herpesvirus) közé tartozik. Ennek a vakcinának a sejtmentes formáját a 3783098 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás írja le.

B) Egy virulens MDV-törzs (HPRS-16) gyengítésével nyert vakcina [Journal of General Virology, 4, 557-564 (1969), és 3674861 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], amely törzs az 1. szerotípusú madár-herpeszvírusok közé tartozik.

C) Egy 2. szerotípusú Marek-kór vírusnak (SB-1) nem onkogén vírustörzsén alapuló vakcina [Journal National Cancer Institute, 60, 1075-1082 (1978) és 4160024 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírási Ezt az vakcinát hatásosan alkalmazzák általában HVT-vakcinákkal képzett keverékként.

A jelen találmány szerint víruskészítményt, előnyö2 sen vakcinát szolgáltatunk, amely nagymértékben immunogén és nem patogén baromfiakban, külünösen csirkékben.

A jelen találmány szerinti víruskészítmény az 1. szerotípusú madár-herpeszvírusok közé tartozó élő MDV-klónt tartalmaz, amely klón képes az említett készítménnyel inokulált csirkéket megvédeni a Marekkór (MD) vírusok virulens és nagyon virulens biológiai variánsainak ismételt fertőzései ellen. A találmány szerinti víruskészítmény előnyösen olyan kiónt tartalmaz, amelyet a CVI-988 MDV-vírusizolátumból nyerünk DEF-ben végzett sorozatos passzálással és hat tarfolttisztítási lépéssel a 39. és 49. DEF-passzálás között. Ezt a vírusklónt, amelyet CVI-988 MDV „C” kiónnak nevezünk, nagy mértékű immunogén tulajdonságai miatt választottuk ki, és a miatt, mert nem patogén RIR csirkékre.

Tekintettel ennek alkalmazására oltóvírusként vakcinatermelésben, a szóban forgó vírust CEF-hez adaptáltuk váltakozó víruspasszálás segítségével, CEF-ben és DEF-ben az 52. és 63. sejttenyészet-passzálások között. Ezt a kiónt, a 65. CEF-passzálásban (CVI-988, MDV CEF₆₅ ,,C”-klón) 1984. március 28-án letétbehelyeztük PC PV 1 számon a Phabagen Collectionnál (Vakgroep Moleculaire Biologie, Transitorium 3, Padualaan, 8, 3584 CH, Utrecht, Hollandia).

Ezenkívül deponáltuk a törzset 1-426 számon a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes gyűjteménynél is (Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur Roux, 75015, Párizs, Franciaország).

Ezen túl a találmány tárgyát képezi egy eljárás víruskészítmény, elsősorban vakcina, előállítására Marekkór ellen, amely készítményre az jellemző, hogy az 1. szerotípusú madár-herpeszvírusok közé tartozó Marek-kór vírusnak egy élő vírusklónját használja fel, amely klón képes az említett klónnal inokulált csirkék megvédésére a Marek-kór (MD) vírusok virulens és nagyon virulens biológiai variánsainak ismételt fertőzései ellen.

A jelen találmány szerinti ilyen kiónt úgy nyerünk, hogy az 1. szerotípusú madár-herpeszvírusok közé tartozó Marek-kór vírusokat sorozatosan passzálunk madár-sejttenyészetben és tarfolt-tisztítást végzünk, ezáltal a kiónt immunogén és nem patogén tulajdonságai alapján választjuk ki, a nem patogén tulajdonságot elsősorban a nagy mértékben MD-érzékeny RIR csirkékre értve.

A kiindulási anyagként használt Marek-kór vírus előnyösen a CVI-988 MDV-vírus. Előnyös kiónt nyerünk a CVI-988 MDV vírusizolátum sorozatos passzálásával kacsaembrió-fibroblasztban (DEF) és hat tarfolttisztítási lépéssel a 39. és 49. DEF-passzálás között. Amint fentebb megállapítottuk, ezt a kiónt, amelyet CVI-988 MDV „C”klónnak nevezünk, nagymértékű immunogén tulajdonságai miatt és RIR csirkékre is vonatkozó nem patogén tulajdonságai miatt választottuk ki. A vírus-klón adaptálása mind kacsa-, mind csirkeembrió-fibroblaszt sejttenyészetekhez (DEF illetve CEF) előnyös.

A találmány egyik tárgya tehát olyan Marek-kór víruskészítmény előállítása, amely általában nem patogén baromfiakra, elsősorban csirkékre, sőt, még a nagyon fogékony Rhode Island Red csirkékre sem.

A találmány egy másik tárgya olyan Marek-kór víruskészítmény előállítása, amely nagymértékben immunogén.

A találmány egy ismét másik tárgya olyan Marékkor víruskészítmény előállítása, amely képes megvédeni az inokuált csirkéket Marek-kór vírusok virulens és nagyon virulens biológiai variánsai ellen.

A találmány további tárgya egy olyan vírustörzsklón előállítása, amely a CVÍ-988 MDV-szülőtörzsből származik, de amely lényegesen kevésbé patogén anélkül, hogy immunogén tulajdonságait elvesztené.

A találmány még további tárgya Marek-kór vírus 1. szerotípusú kiónjai családjának előállítása a sorozatos passzálással madársejt-tenyészetekben, és tarfolttisztítással, amely által olyan törzset lehet kiválasztani, amely a nem patogén, viszont immunogén tulajdonság kedvező kombinációjával rendelkezik.

A jelen találmány tárgya nagy mértékben immunogén víruskészítmény előállítása, amely 1. szerotípusú madár-herpeszvírusok közé tartozó Marek-kór vírus élő vírusklónját tartalmazza, és amely készítményt az

1. szerotípusú madár-herpeszvírusok közé tartozó valamely Marek-kór vírus, előnyösen a CVÍ-988 MD-vírus madársejttenyészetben végzett sorozatos passzázsával nyerünk, és amely klón képes az említett kiónnal inokulált csirkék védelmére az MD-vírusok virulens és nagyon virulens biovariánsai, mint pl. az MDV K, MDV GA-5, MDV RB/1B és MDV Tun, ismételt fertőzései ellen, és amely lényegében nem patogén az MD-re nagy mértékben érzékeny SPF RIR csirkékre sem.

Kísérleti vakcina előállítása.

A vírustörzset DEF-ben végzett 51 sorozat passzálás útján gyengítjük, beleértve hat tarfolt-tisztítási lépést is a 39. és 49. passzálások között, amelyben egy lokalizált citopatológiai változás (vírus tarfolt) vírusnyeredékét alkalmazzuk inokulumként. A „C” kiónt a végső tarfolt-tisztítási lépésnél nyerjük. Ilyen egyrétegű telepeket (mono-lager) inokulálunk a vírus végponthígításaival, és az újonnan kialakított vírust in situ lokalizáljuk 0,85% agar hozzáadásával a tápközeghez. A CEF-hez való adaptálást úgy kapjuk, hogy váltakozva passzálunk CEF-ben és DEF-ben az 52. és 63. passzálások között, és ezután a sejttenyészetek passzálását CEF-ben végezzük. 3-5 napos tenyésztési idő után, az inokulumban levő vírus dózisától függően, fajlagos citopatológiai változások figyelhetők meg.

A kacsaembrió-fibroblasztokat 13 napos, kacsatojásban kialakult embrió tripszines emésztésével nyerjük. Tenyésztőedényeket (Petrí-csészék vagy Roux-palackok) oltunk be 0,8xl0⁶ sejt/ml-t tartalmazó sejtszuszpenziókkal. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk olyan tápközegben, amelyben a CO₂ százalékos arányát 5%-on tartjuk. A növesztő tápközeg összetétele a következő:

Ásványmentesített víz 818 ml

Earle 199. (Gibco) tápközeg (lOx koncentrált)90 ml

NaHCOj, 1,4%-os 87 ml

Boíjúszérum 60 ml

Nátrium-benzil-penicíllin,

000 nemzetközi egység/ml

Sterptomycin szulfát 5 ml

000 nemzetközi egység/ml

Pimafucin (0,25%/ml)

Vitaminkoncentrátum (BME, Gibco) 1 ml

Glutamin, 2,6%-os 3,8 ml

Két napos tenyésztési időszak után összefüggő egysejtréteg (monolayer) képződik, és a fertőzést az előző víruspasszálásból származó fertőzött sejtek szuszpenziójával végzett inokulálással hajtjuk végre. A citopatológiás hatás mértéke szerint a sejteket az egyes fertőzött tenyészetekből 4-20 friss tenyészet fertőzéséhez használjuk fel. Ebben a lépésben a fenntartó tápközeg a következőket tartalmazza:

Ásványmentesített víz 810 ml

F-10 tápközeg (lOx) (Gibco) 50 ml

Earle 199. tápközeg (10x) (Gibco) 40 ml

Triptóz-foszfát tápközeg (Gibco) 40 ml

NaHCO₃, 1,4%-os 75 ml

Boíjúszérum 30 ml

Antibiotikumok stb. lásd, mint a fentebbi tápközegnél.

SPF-baromfitenyészetből való 11 napos, embriót tartalmazó tojásokat alkalmazunk CEF egyrétegű tenyészetek készítéséhez. A tenyésztő tápközeg a fentebb említett tápközeggel azonos. Azokban az időszakokban, amikor a vírustörzset nem tartjuk fent DEFben vagy CEF-ben végzett vírusszaporítás útján, a vírt st folyékony nitrogénben tároljuk -196 °C hőmérsékleten. A fertőzött sejtek fagyasztását növesztő tápközegben (lásd fentebb) végezzük, 10%-ra növelt borjúszérummal és azonos százaléknyi mennyiségű dimetilszulfoxiddal (DMSO). A hűtési sebességet a+20 °C-tól -40°C-ig terjedő tartományban automatikusan szabályozva 1 °C/perc értéken tartjuk. A csövek vírustiterének becslését CEF-ben végzett tarfoltméréssel végezzük.

A csirkék intramuszkuláris inokulálását közvetlenül azután végezzük, amint a vakcinát helyreállítottuk. A fentebb leírt fenntartó tápközeg megfelel hígítónak. Minden madár 0,5 ml inokulumot kap, amely a sejttel összekapcsolt MD-vírus kívánt adagját tartalmazza.

Nagy léptékű termelés.

A kereskedelmi forgalomba kerülő Marek-kór vakcinát elvileg azonos módon készítjük, mint a kutatólaboratóriumban. A nagyobb léptékre tekintettel gördülő palackrendszereket alkalmazunk álló tenyésztőedények (Roux-palackok) helyett. Az inokulumanyagok ellenőrzését, az előrehaladás ellenőrzését a termelés közben, a végtermék vizsgálatát az idegen mikroorganizmusok távollétére és vírustartalomra való tekintettel azok szerint az irányelvek szerint végezzük, amelyeket szakértők nemzetközi csoportja állapított meg [Report of the Avian Products Standardization Committee of the International Association of Biological Standardization (A Nemzetközi Biológiai Szabványosítási Társaság Madár-termék Szabványosítási Bizottságának beszámolója), szerkesztették Hulse, E. C. és munkatársai 29-42. oldal, Genfi Svájc: Biostandards]. Aktivitás szempontjából a Marek-kór vakcináknak eleget kell tenniök bizonyos védő index követelményének. Ez a vakcináit és nem vakcináit csoportokban a fertőzést követően és egy előre meghatározott időtartamon belül megbetegedett állatok százalékos arányával fejezhető ki. A víruskészítmény ímmunogén tulajdonságainak becsléséhez sokkal pontosabb módszer magában foglalja az 50%-os védödózis mérését (PD₅₀), amint ez a következő irodalmi helyen le van írva: Journal of Biological Standardization, 9, 15-22 (1981).

Az élő, tisztított MD-vakcina jellemzői

Ártalmatlanság RIR csirkékhez.

Amint a fenti bevezetésben jeleztük, a CVI-988 MDV törzsön alapuló, jelenleg rendelkezésre álló

MDV-vakcinák, amelyeket a 35., szövettenyészeten végzett passzálás után használunk, kielégítő védelmet nyújtanak. A vakcina azonban MD-elváltozásokat okoz az SPF RIR csirkékben, amelyek nagyon fogékonyak MD-re. A CVI-988 MDV-klónok egész sorának patogén tulajdonságait tanulmányoztuk SPF RIR csirkékben.

Ezeket a tanulmányokat azért kezdeményeztük, mert korábban kimutatták, hogy a CVI-988 DEF₅, „C” MDV-klón és a CVI-988 DEF₉₇ „E” MDV-klón nem patogén SPF RIR csirkékre. A CVI-988 DEF₅₁ „C” MDV-klónnal, a CVI-988 CEF₅₉ „C” MDV-klónnal és a CVI-988 CEF₆₅ „C” MDV-klónnal végzett ártalmatlansági tanulmányokat az I. és II. példákban mutatjuk be. Ezek azt mutatják, hogy a találmány szerinti „C” vírus-klón nem patogén RIR csirkékre. A CVI-988 CEF₆₃ „A” MDV-klónnal, CVI-988 CEF₆₂ „B” MDVklónnal, CVI-988 CEF₆₇ „C”’ MDV-klónnal és CVI-988 CEF₅₉ „C” kiónnal (ahol az utolsó kettő „C” tarfoltból ered, amelyet 49. DEF passzálásból gyűjtöttünk, de kissé eltérő sejtpasszálási előélettel) végrehajtott ártalmatlansági tanulmányokat a III. példában mutatjuk be. Ezek a kísérletek azt demonstrálják, hogy két csirkében, ahol az egyik „A” klónnal, a másik „C”’ kiónnal volt inokulálva. Marék-kórra fajlagos szövettani elváltozásokat figyelünk meg.

Az „A ” antigén lépcsőzetes redukciója

Az „A” antigént eredetileg mind a sejtkivonatokban, mind az MD-vírussal fertőzött sejtek tenyészfolyadékában kimutatták immundiffúziós elemzéssel [j. Gén. Virol. 4, 557-564 (1969)]. Az „A” antigénről úgy gondolják, hogy 54K és 70K molekulasúlyok közti tartományban levő glikoproteinekből áll [j. Gén. Virol. 64, 2597-2610 (1983)].

A különböző CVI-988 MDV-tételeknek, amelyeket „A” antigén jelenlétére vizsgáltak, sejttenyészetpasszálási történetét összevontan a következőképpen jelöljük:

-MDV CVI-988 CEF₃₇ (DEF,_₄· CEF/DEF₅.₁₄.

cef_{)5 37}).

- MDV CVI-988 CEF_6S „C” klón (DEF_{I 5I} CEF/ DEF₅₂_5₇. CEF₅₈,₅₉. DEF/CEF₆₀_₆₅) tarfolt-tisztítási lépések a 39. és 49. passzálás között.

- MDV CVI-988 DEF₉₉ „E” klón (DEF,_₉₉. tarfolttisztítási lépések a 87. és 94. passzálások között).

- MDV CVI-988 DEF₁₆₆ (DEF,.₁₆₆).

Az MDV CVI-988 CEF₃₇-et, MDV CVI-988 CEF₆₅„C” kiónt, MDV CVI-988 DEF₉₉ „E” kiónt és MDV CVI-988 DEF₁₆₆-ot vizsgálunk át „A” antigén jelenlétére immunprecipitációs tanulmányok segítségével, MDV-gp 54/70-re irányuló nyúlszérumot alkalmazva amelyet Dr. Velicer, L. (Lansing, MI, USA) volt kedves rendelkezésünkre bocsátani.

„A” antigént nem mutatunk ki CVI-988 DEFi₆₆MDV felülúszó folyadékban, de a 35., 65. és 99. passzázsokkal fertőzött sejttenyészetekben ez termelődött. A sorozatos sejttenyészet-passzálások és tarfolt-tisztítások során a termelt „A” antigén mennyiségének fokozatos csökkenését figyeljük meg. A CVI-988 CEF₆₅MDV „C” klón által termelt „A” antigén mennyisége durván 90%-kal alatta volt a CVI-988 CEF₃₇ MDV által történő „A” antigén kifejeződésnek.

Mivel a találmány szerinti víruskészítményt (CVI-988 CEF₆₅ MDV „C” klón) teljesen legyengítettnek tekinthetjük a nagymértékben fogékony RIR csir4 kékre való patogenicitás szempontjából, indokolt az a következtetés, hogy az MDV legyengítése nem mindig kapcsolódik össze az „A” antigén kifejeződés teljes elvesztésével.

I. PÉLDA

A CVI-988 DEF_5! MDV „C” klón patogenicitásának meghatározása a RIR csirkék szempontjából, összehasonlítva az FC 126 HVT-vel és CVI-988 CEF,, MDV-vel.

A vizsgálatot SPF RIR csirkékkel hajtjuk végre a Houghton Poultry Research Station-ban (Houghton Baromfikutató Állomás, Anglia). A csirkéket módosított Horsfall-Bauer-izolátorokban tartjuk. A madarakat „ad libitum” etetjük forrázott takarmánnyal. Az állatokat naponta megvizsgáljuk 24 héten át MD klinikai tüneteinek előfordulására. A csirkéket egynapos korban inokuláljuk intramuszkulárisan 10000 FFU szóban forgó vírussal 0,5 ml szövettenyésztő közegben, amely a szokásos szabadtéri dózis tízszeresének felei meg. Az összes vakcinakészítmény a vírust sejttel kapcsolt formában tartalmazza.

RIR csirkéből álló csoportot inokulálunk CVI-988 CEF₃₅ MDV-vel, a kereskedelmi vakcinával. Egy másik, 20 RIR csirkéből álló csoport a találmány szerinti víruskészítményt kapja (CVI-988 DEF,, MDV „C” klón). 43 RIR csirkéből álló csoportot HVT FC 126-tal inokulálunk.

Az elhullt és halódó állatokat kivesszük és boncolásnak vetjük alá. A szöveteket mikroszkóposán vizsgáljuk meg. A megfigyelési periódus végén az összes megmaradt csirkét leöljük és megvizsgáljuk mind makroszkóposán, mind mikroszkóposán. Az idegi elváltozásokat Payne és Biggs szerint osztályozzuk [Journal of the National Cancer Institute, 39,281-302 (1967)], mint gyulladásos (B típusú) elváltozásokat és nyirokduzzanatos (A típusú) elváltozásokat. A megnövekedett limfoid beszűrődést és a limfocitás hiperplasiát a belső szervekben a Marek-kór jeleinek tekintjük. A csirkék teljes számát korrigáljuk a nem fajlagos mortalitás alapján 21 napon belül a kikeltés után.

Az eredményeket az 1. táblázat mutatja be, az MD mikroszkópos patológiai és/vagy mikroszkópi jeleit mutató csirkék számának és a vizsgálatnak alávetett összes csirkék számának a hányadosa formájában. A RIR csirkék inokulálása a kereskedelmi vakcinával (CVI-988 CEFjj MDV): a 8 csirke közül 5-ben paralízist indukál. A paralízis társul a perifériás idegek és a nervus plexi endo-neurális gyulladásával (B típusú elváltozás). További két csirkét veszünk ki, amikor haldokolnak. Ezek a csirkék szintén B típusú elváltozásokat mutatnak a perifériás idegekben. Egy csirke, amely a vizsgálat során hullott el, nem mutatja semmiféle jelét a Marek-kómak. Az első két hétben 12 csirke pusztul el véletlenszerű okokból.

Sem makroszkopikus jelek, sem mikroszkópos elváltozások nem láthatók RIR csirkéknek abban a csoportjában, amelyet a találmány szerinti vakcinakészítménnyel inokulálunk. Megfigyelünk viszont paralízist egy RIR csirkében, amelyet HVT FC 126-tal inokuláltunk. A perifériás idegek mikroszkópos vizsgálata kis elváltozásokat tár fel, amelyek endoneurálís limfómára jellemzők. A megfigyelési periódus végén a mikroszkópos vizsgálat B típusú elváltozásokat mutat három, HVT FC 126-tal inokulált csirke perifériás idegeiben. A klinikai paralízisben szenvedő egyik csirke nem fajlagos neuritist mutat.

-4194496

1. TÁBLÁZAT

Két kereskedelmi vakcina összehasonlítása a találmány szerinti vakcinával: patogén tulajdonságok

Inokulom	Csirkék száma	Nem fajlagos háláló zás 1.	Halálozás 24 héten belül	Boncolás 24 hét után	MD pozitív szám (csirkék teljes száma 2.)
ideg- duzza- dás	B típusú elváltó zás	A típusú elváltó zás	MD ne- ga- tív
B típusú elvál- tozás	MD ne- ga- tív
CVI-988 CEF₃₅ MDV	20	12	5	7	-	1		-	7/8(88%)
CVI-988 DEF_SI MDV	20	2	-	-	-	-	-	18	0/18(0%)
„C” klón
HVT FC 126	43	4	-	-	1	2	3	33	1/39(10%
Kontroll	20	3	-	-	-	-	-	17	0/17(0%)
1. Nem fajlagos halálozás 21 napon belül a keltetéstől számítva.
2. A csirkék teljes száma korrigálva a nem fajlagos halálozás szerint.

194 496

II. PÉLDA

Hasonló ártalmatlansági vizsgálatot RIR csirkéket alkalmazva, ahogyan az I. példában leírtuk, hajtunk végre két, találmány szerinti CEF-hez adaptált készítménnyel (CVI-988 CEF_6s „C” MDV-klón és CVI-988 CEF_s4 „C” MDV-klón).

CVI-988 CEF₆₅ „C” MDV-klón:

RIR csirkét, amelyet a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból keltünk ki, inokulálunk intramuszkulárisan 10000 FFU-val, közvetlenül keltetés után. A csirkéket módosított Horsefall-Bauer-izolátorokban tartjuk.

Tíz hét múlva az inokulálástól számítva 6 csirkét távolítunk el az izolátorból (5 kakas, 1 tyúk) és felboncoljuk. A timuszon, Fabricius-tömlőn, májon, lépen, mind a bolygó-, mind a bordaközi idegeken, valamint a légcsövi és csípőidegeken, továbbá a nervus plexiken mindkét oldalon végzünk szövettani vizsgálatot.

A 24 hetes megfigyelési periódus után a vizsgálatot a 10 megmaradó nőstény csirkén végzett boncolással fejezzük be. A szövettani vizsgálathoz kiválasztott szövetek szintén a fent leírtak.

A Marék-kórnak sem klinikai, sem makroszkópos jelei, sem MD-vel társuló szövettani elváltozások nem figyelhetők meg a 16 vizsgálati csirke egyikén sem.

CVI-988 CEF₅₉ „C” MDV-klón:

RIR csirkét, amelyeket a Wickham Laboratoriestől kapott SPF RIR-tojásokból keltünk ki, inokulálunk 10 000 FFU-val közvetlenül a keltetés után. A csirkéket módosított Horsefall-Bauer-izolátorokban tartjuk.

Két csirke pusztul el nem fajlagos okokból. 24 hetes vizsgálati időtartam után a vizsgálatot a fennmaradó 11 csirkén végrehajtott boncolással fejezzük be (5 és 6

). A11 csirke egyikén sem figyeljük meg a Marek-kór klinikai vagy makroszkópos jeleit.

Szövettani megfigyelést hajtunk végre a timuszon, a Fabricius-tömlőn, a lépen, májon, mind a bolygó-, mind a bordaközi idegeken, valamint a légcsövi és csípőídegeken, és a nervus plexin mindkét oldalon.

Egy csirkében ( ) limfoid hiperplázia figyelhető meg a májban. Tömlőfiiggő tüszős szerkezeteket figyelünk meg, ezért az elváltozások nem tekinthetők neoplasztikusnak,

III. PÉLDA

Hasonló ártalmatlansági vizsgálatot végzünk RIR csirkéket alkalmazva, amint ezt az I. és II. példákban leírtuk, „A”, „B” és „C” kiónokkal, amelyek mind a CVI-988 DEF MDV 48. passzálásából erednek (mind a „C”’ klón, mind a „C” klón a 49. DEF passzálásban levő azonos tarfoltból származnak). Ezenkívül „D” kiónt is vizsgálunk.

CVI-988 CEF_Ö MDV „A” klón:

RIR csirkék amelyek a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10000 FFU-val közvetlenül a keltetés után. A vizsgálati módszer azonos, mint a Π. példában leírt módszer.

Marek-kór klinikai vagy makroszkópos jeleit nem észleljük. A szövettani vizsgálatban azonban gyulladásos elváltozásokat, Payne és Biggs szerinti [j. Natl. Cancer Institute 39,281-302 (1967)1 B típusú elváltozásokat figyelünk meg a 24. héten boncolt 10 csirkéből egynek a nervus plexijében.

CVI-988 CEF₆₂ MDV „B” klón:

RIR csirkét, amelyek a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10000 FFU „B” kiónnal. A vizsgálati módszer azonos mint a II. példában leírt módszer. A Marék-kórnak sem klinikai, sem makroszkópos jelei, sem MD-vel társuló szövettani elváltozások nem észlelhetők a 18 vizsgált csirke egyikében sem.

CVI-988 CEF₆₇ MDV „C”’ klón:

RIR csirkét, amelyek a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10 000 FFU „C”” klónnal, amely DEFben végzett passzálásokon ment keresztül az 54. paszszálásig. A vizsgálati módszer azonos, mint a II. példában leírt módszer. A Marek-kómak sem klinikai, sem makroszkópos jelei, sem MD-vel társuló szövettani változások nem észlelhetők a 14 vizsgált csirke egyikében sem.

CVI-988 CEF₅₉ MDV „C”” klón:

RIR csirkét, amelyek a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10000 FFU-val közvetlenül a keltetés után.

hetes megfigyelési időszak után a vizsgálatot boncolással fejezzük be. Három csirke nem fajlagos okokból elpusztul, ezért a boncolást a megmaradó 10 csirkén végezzük el (6 és 4 ).

Marek-kómak sem klinikai, sem makroszkópos jeleit nem figyeljük meg a 10 csirke egyikében sem.

Szövettani vizsgálatot végzünk a timuszon, a Fabricius-tömlőn, májon, mind a bolygó-, mind a bordaközi idegeken, valamint a légcsövi és csípőidegeken, és a nervus plexin mindkét oldalon. Egy csirkében ( ) gyulladásos, B típusú elváltozást észlelünk a csípőidegen.

CVI-988 DEF₉₇ MDV „D” klón:

RIR csirkét, amelyek a Houghton Poultry Research Station-tól (Anglia) kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10 000 FFU „D” kiónnal. Ellentétben az „E” klónnal, ez a „D” klón csak DEF-ben végzett sejttenyésztési passzálásokon megy keresztül, és a tarfolt-tisztítási lépéseket a 87. és 94. passzálások között hajtjuk végre. Két csirke pusztul el nem fajlagos okokból. A vizsgálati eljárás hasonló az

I. példában leírt eljáráshoz. A Marek-kómak sem klinikai, sem makroszkópos jeleit, sem MD-vel társuló szövettani elváltozásokat nem figyelünk meg a 18 vizsgált csirke egyikén sem.

Védő hatékonysági tanulmányok.

Egy vakcinakészítmény immunogén tulajdonságait a legpontosabban egy 50% védődózis (PD₅₀) méréssel [Journal of Biological Standardization 9, 15—22 (1981)] határozzuk meg.

A PD₃₀-et úgy határozzuk meg, mint a tarfolt- vagy gócképző egységek (focus forming unit, FFU) számát in vitro vizsgálatban meghatározva -, amely az SPF csirkék csoportja (MD-fogékony részének 50%-ának megvédéséhez szükséges a Marek-kór klinikai tünetei és elváltozásai ellen. A kihívást jelentő fertőzést életük

9. napján hajtjuk végre virulens MDV intramuszkuláris injekciójával olyan dózisban, amelyről ismert, hogy nem vakcináit csirkék több mint 70%-ában MD-elváltozásokat idéz elő 10 hetes megfigyelési időszak alatt. Az így nyert vizsgálati eredményeket statisztikailag lehet feldolgozni egy számítógép-program segítségével, amelyet az UCLA Health Sciences Computing Facili-69

194 496 ties fejlesztett ki (BMD03S, 1964. június 1-i változat). További információkat ad meg ennek a statisztikai módszernek az alkalmazásáról a következő irodalmi hely: Journal of Biological Standardization 9,15-22 (1981). Az említett számítógép-program lehetővé teszi a vizsgálati eredmények probit-analízisét és a probit regressziós vonalak meredekségének meghatározását. A PD₅₀-et patológiás tünetek alapján számítjuk ki a vizsgálati állatoknak abban a részében, amely MD-fogékonysággal bír. A természetes rezisztenciát a kontroll csoportban fejezzük ki.

A védő hatékonysági tanulmányok a CVI-988 MDV-törzsbőI nyert különböző vírus-klónokkal (nem „C” kiónokkal) a következő eredményeket adják.

CVI-988 CEF₅₅ MDV „A” klón:

Az „A” klón védőhatékonysága nagyon gyenge. A PD_S(| kísérletek lapos dózisválaszvonalat adnak, 100 illetve 500 FFU vírusdózisoknál a vizsgált 40 csirkéből 19 illetve 7 csirke szerez védelmet MDV-K fertőzés ellen.

CVI-988 CEF₅₅ NDV „B” klón:

A CEF-hez adaptált „B” klónnal végrehajtott PD₅₀kísérlet 31,9 FFU-értéket ad, amely szignifikánsan nagyobb, mint a CVI-988 CEF₅₉ MDV „C” kiónnál nyert PDso érték (p < 0,05).

CVI-988 CEF₅₉ MDV „C”’ klón:

A CEF-hez adaptált „C”’ klónnal végrehajtott PD₅₀kísérlet 41,6 FFU-értéket ad, amely szignifikánsan nagyobb, mint a CVI-988 CEF₅₉ MDV „C” klónnal nyert PD_5[1 érték (p < 0,05).

CVI-988 DEF₉₇ MDV „D” klón:

Ez a „D” klón túlgyengítettnek mutatkozik. Viszonylag kisszámú csirkét véd meg az MDV-K-fertőzés ellen.

Az ártalmatlansági és védőhatékonysági tanulmányokra alapozva azt a következtetést lehet levonni, hogy a CVI-988 MDV „C” klón a legjobb jelölt egy Marek-kór vakcina kifejlesztéséhez.

A találmány szerinti vírus-klón védő hatékonyságát a IV-VIII. példákban mutatjuk be.

IV. PÉLDA

CVI-988 DEF₅₁ MDV „C” klón immunogenicitásának meghatározása a CVI-988 CEF₃₅ MDV-vel és HVT FC 126-tal összehasonlítva.

Ebben a vizsgálatban egy jelen találmány szerinti víruskészítmény, a CVI-988 DEF₃₁ MDV „C” klón immunogén aktivitását hasonlítjuk össze két, a gyakorlatban széles körben alkalmazott készítményével (CVI-988 CEF₃₅ MDV és HVT FC 126). Ebből a célból meghatározzuk a PD_S0-et, amely azt az FFU-számot jelenti, amely csirkék egy csoportja MD-fogékony része 50%-ának megvédéséhez szükséges az MD klinikai tüneteitől és/vagy makroszkópos elváltozásaitól.

A fertőzést GA-5 virulens MDV-klónnal [Journal of the National Cancer Instítute, 51, 929-939 (1973)] végezzük.

White Leghorn „A” törzsbe (WLA) tartozó SPFcsirkéket alkalmazunk. A vizsgálati csirkék különböző csoportjait módosított Horsefall-Bauer-izolátorokban tartjuk. Az egyes adagolási csoportokba tartozó csirkéket két izolátorba osztjuk szét. A madarakat ad libitum táplálják forrázott takarmánnyal.

Az inokulálás után a víruskészítményt tarfolt-titrálásnak vetjük alá CEF-ben vagy DEF-ben. A csirkéket az

MD klinikai tüneteire vizsgáljuk. Ez alatt az időtartam alatt az elhullott vagy megbetegedett csirkéket eltávolítjuk az izolátorokból. A vizsgálati időtartam végén az öszszes megmaradó madarat átvizsgáljuk az MD tüneteire.

A 2. táblázat mutatja be az MD klinikai tüneteit és/vagy makroszkópos elváltozásait mutató csirkék számát és a vizsgálati állatok számát dóziscsoportonként. A vizsgált víruskészítmények mindegyike ad védelmet a GA-5 MDV-vel végzett intramuszkuláris fertőzés ellen, a legnagyobb vírusdózis a leghatásosabb. A három vizsgálatból nyert adatok probitanalízise lehetővé teszi a PD₅₀ értékek kiszámítását 14 és 33 FFUegységek között. Nem voltak szignifikáns különbségek megfigyelhetők a három vizsgált víruskészítmény PD₅o értékei között.

2. TÁBLÁZAT

Három PD₅₀ mérés összehasonlítása, amelyet CVI-988 DEFj, MDV „C” klónnal, CVI-988 CEF₃₅MDV-vel és HVT FC 126-tal végzünk.

Vakcina CVI-988 DEF_í; MDV „C” klón	CVI-988 CEF₃₅MDV GA-5	HVT FC 126 GA-5
Fertőző vírus	GA-5
Legnagyobb dózis (FFU)	1000	500	500
Sorozathígítások lépésekben A megvédettek száma/összes szám	1:5	1:5	1:5
Legnagyobb dózis:	28/30	24/27	30/31
	29/32	21/24	30/32
	25/31	18/26	21/31
Legkisebb dózis:	12/32	9/23	8/32
	9/32
Vakcina nélkül:	3/32	5/22	4/28
PDso* PDso 95%-os konfidencia	33	14	14,7
intervalluma	16,5-66	4,4-44,9	6,7-32,1
A probit regreszsziós vonal
meredeksége A meredekség	1,07	0,87	1,50
standard hibája	0,18	0,23	0,27

* Az MD-re fogékony csirkék 50%-ának védelméhez szükséges FFU száma.

V. PÉLDA

Ugyanazt a vizsgálatot, mint a IV. példában, hajtjuk végre a találmány szerinti CVI-988 DEF₅₄ MDV „C”’ klónnal és CVI-988 CEF₅₄ MDV „C” klónnal, összehasonlítva a CVI-988 CEF₃₅ MDV-vel és a HVT FC126 + MDV SB-1 keverékkel. A fertőzést virulens MDV-K-val hajtjuk végre.

Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg.

VL. PÉLDA

Ugyanazt a PD₅₀ meghatározást végezzük el, mint amelyet a IV. és V. példáknál leírtunk, három, találmány szerinti víruskészítménnyel, CVI-988 DEF₅₄

-711

MDV „C”’ kiónnal, CVI-988 CEF₅₄ MDV „C” kiónnal és CVI-988 CEF₆5 MDV „C” klónnal, összehasonlítva a CVI-988 CEF,., MDV kereskedelmi készítménnyel. A fertőzést RB/1B MDV-vel hajtjuk végre. Ez a vírus a nagyon virulens MD-izolátumok egyik képviselője, amelyet problémát okozó csirkenyájakból nyertek az Egyesült Államokban. Ezt a szóban forgó izolátumot az USA-ban egy HVT-vel vakcináit tojó csoportból izolálták.

A PD₅o értékek párjai közt - amely PD₅₀ értékeket különböző meghatározásokban nyeljük - megfigyelt különbségek szignifikanciáját a log-valószínűség-hányados (log-likelihood-ratio) vizsgálatból származó számítógép-programmal határozzuk meg 50 [Kendall és Stuart, a „The Advanced Theory of Statistics” című kiadványban, 2. kötet, 3. kiadás Charles GrifFin Co. Ltd. kiadása, 24, 234-272 (1973)1 A PD₅₍₎ mérések akkor hasonlíthatók össze, ha a kísérleti csirkék azonos törzsét alkalmazzuk, ha az MD-tüneteket és elváltozásokat csak makroszkópos vizsgálattal jelöljük, és ha a fertőzés vagy virulens MDV-vel, vagy nagyon virulens MDV-biovariánssal történik. A statisztikai értékelés csak akkor valósítható meg, ha az összehasonlított probit regressziós vonalak és az MD kifejeződésére való rezisztencia meredekségei a két szériánál nem különböznek szignifikánsan.

3. TÁBLÁZAT

Négy PD₅₀ mérés összehasonlítása, CVI-988 DEF_J4MDV „C”’ kiónnal, CVI-988 CEF₅₄ MDV „C” klónnal, CVI-988 CEF35 MDV-vel és HVT FC126+MDV SB-1 keverékkel végezve.

Vakcina CVI-988 DEF₅₄ CVI-988 CEF₅₄CVI-988 CEF₃₅HVT FC126 +
MDV „C”’ klón MDV „C” klón Fertőző	MDV K	MDV SB-1 K
vírus	K	K
Legnagyobb dózis (FFU)	500	500	500	500
Sorozathígítások lépésekben	1:5	1:5	1:5	1:5
A megvédettek száma/összes szám Legnagyobb dózis:	28/30	29/29	30/30	27/27
	17/30	26/29	25/29	26/29
	13/28	25/30	22/29	24/29
Legkisebb dózis:	12/30	18/28	14/30	22/29
Vakcina nélkül	10/28	15/29	7/30	12/29
PD50·	26,5	12,9	10,3	6,4
PD50 95%-os konfidencia intervalluma 10,8-64,8	3,4-48,5	3,3-32,1	0,48-85,4
A probit regressziós vonal meredeksége	1,24	1.22	1,20	0,79
A meredekség standard hibája	0,34	0,42	0,29	0,30

* Az MD-re fogékony csirkék 50%-ának védelméhez szükséges FFL) száma

VII. PÉLDA

PD₅₀ kísérletet hajtunk végre egy találmány szerinti CEF-adaptált vírussal, a CVI-988 CEF₅₉ MDV „C” klónnal. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be. A VI. példában említett feltételek alapján ennek a vizsgálatnak az eredményei statisztikailag öszehasonlíthatók a CVI-988 CEF₃₅ MDV-vel végrehajtott két PD₃₀ viszgálattal, amelyet már a 2. és 3. táblázatban bemutattunk (és amely eredményeket itt ismét bemutatunk).

Hasonló statisztikai összehasonlítást teszünk a CVI-988 CEF₅₉ MD „C” klón PD_5Ű értékével és CVI-988 CEF35 MDV-vel végrehajtott hat méréssel. Az utóbbi PD_5o kísérletek a J. Bioi. Standardization, 9, 15-22 (1981) irodalmi helyen vannak leírva.

A VI. és VII. példákból az alábbi következtetéseket lehet levonni:

- Statisztikai összehasonlítást végzünk kilenc pár PD₅₀ méréssel, amelyben a vakcinálást vagy CVI-988 CEF₃₅ MDV-vel, vagy CVI-988 MDV „C” klónnal végezzük.

- A CEF_S, „C” klón cagy CEF₆₅ „C” klón készítmények PD₅₍, értékei mind alatta vannak a CVI-988 CEF₃₅MDV-vel nyert értékeknek.

- A különbségek a PD₅₀ értékek között négy összehasonlításban szignifikánsak (2xp<0,01, 2xp<0,05). Egy esetben a különbség nem szignifikáns. Négy esetben statisztikai értékelés nem hajtható végre az összehasonlított görbék meredekségei közti vagy a nem vakcináit csoportokban megfigyelt természetes rezisztenciák közti különbségek miatt.

4. TÁBLÁZAT

Négy PD₅₀ mérés összehasonlítása, CVI-988 DEF₄₄MDV „C”’ klónnal, CVI-988 CEF₅₄ MDV „C” klónnal, CVI-988 CEF₆₅ MDV „C” klónnal és CVI-988 CEF₃₅MDV-vel.

Vakcina	CVI-988 DEF54 MDV „C’^M klón	CVI-988 CEF54 MDV „C” klón	CVI-988 CEF₆₅MDV „C” klón	CVI-988 cef₃₅ MDV
Fertőző
vírus	RB/IB	RB/IB	RB/IB	RB/IB

Legnagyobb
dózis (FFU)	2500	2500	560	2500
Sorozat- hígítások lépésekben	1:5	1:5	1:5	1:5
Λ megvédettek száma/összes szám Legnagyobb dózis:	23/23	21/21	40/41	20/20
	23/24	17/20	39/40	20/20
	19/24	20/20	33/41	15/20
Legkisebb dózis:	9/24	16/19	17/38	9/20
Vakcina nélkül:	0/25	0/18	4/38	2/20
PDso*	31,6	**	6,5***	34,3
PD50 95%-os konfidencia intervalluma	6,9-144		2,0-21,5	5,6-211
A probit regressziós vonal meredeksége	1,53		1,19	1,73
A meredekség standard hibája	0,34		0,22	0,48

* Az MD-re fogékony csirkék 50%-ának védelméhez szükséges FFU száma. ** A dózísválasz-görbe szabálytalan lefutása miatt a PD50 értéket nem tudjuk kiszámítani.

*** A CVI-988 CEFö5 MDV „C” klón PD50 értéke szignifikánsan különbözik a másik két PD50 értéktől (p< Ö,Ö1).

-813

5. TÁBLÁZAT

PD₅₀ mérések statisztikai összehasonlítása, CVI-988 CEF₅₉ MDV „C” klónnal végezve, és CVI-988 CEF₃₅MDV vakcinálással két mérésben végezve.

Vakcina Fertőző vírus	CVI-988 CEF₅₉MDV „C” klón K	CVI-988 CEF₃₅ CVI-988 CEF₃₅
MDV GA-5	MDV K
Legnagyobb
dózis (FFU)	500	500	500
Sorozathígítások
lépésekben	1:5	1:5	1:5

A megvédettek száma/összes szám

Legnagyobb
dózis:	35/36	24/27	30/30
	39/39	21/24	25/29
	27/36	18/26	22/29
Legkisebb dózis:	24/40	9/23	14/30
Vakcina nélkül:	5/38	5/22	7/30
PD₅₀*	3,6	14**	10,3
PD50 95%-os konfidencia intervalluma	0,7-19	4,4-44,9	3,3-32,1
A probit regressziós vonal meredeksége	1,06	0,87	1,20
A meredekség standard hibája	0,23	0,23	0,29

* Az MD-re fogékony csirkék 50%-ának védelméhez szükséges FFU száma.

** Szignifikánsan nagyobb, mint a CEF59 „C” klón PD50 értéke (p< 0,05).

6. TÁBLÁZAT

CVI-988 MDV hat PD₅₀ értékének - a kb. 35. sejttenyészet passzázsánál - és a CVI-988 CEF₅₉ MDV „C” klón értékének összehasonlítása.

Kísérlet száma	CEF59 „C” klón	I.	II.	III.	IV.	V.	Vi.
Fertőző vírus	K	K	K	K	K	K	GA-5

Legnagyobb dózis	500	250	690	690	5120	276	433
Sorozathígítás lépésekben A megvédettek száma/	1:5	1:5	1:10	1:4	1:4	1:4	1:4
összes szám Legnagyobb dózis	35/36	29/29	36/39	10/10	22/22	15/21	19/21
	39/39	19/26	28/39	9/10	21/21	14/19	14/21
	27/36	15/31	13/43	6/10	22/22	7/19	3/20
Legkisebb dózis:	24/40	9/21	9/32	2/10	20/22	5/20	1/22
					12/20	2/21	1/22
					9/22	4/22
Vakcina nélkül:	5/38	7/26	17/44	3/20	4/22	5/41	0/30
PD50* PD50 95%-os	3,6	35f	701	441	16**	54**	751
konfidencia-				17	'-118	6,0-483
intervallum	0,7-19	3,4-359	16-299	1,8-	-133	36-159
A probit regressziós vonal meredeksége A meredekség standard	1,06	2,44	1,38	2,22	1,72	0,98	1,41
hibája	0,23	1,64	0,30	0,80	0,47	0,27	0,23

* Az MD-re fogékony csirkék 50%-ának védelméhez szükséges FFU száma.

** A PD-érték szignifikánsan nagyobb, mint a CEF59 „C” klón PD₅o értéke (IV. kísérlet: p< 0,05; V. kísérlet: p< 0,01).

A PD50 értékek közti különbségek statisztikai értékelése nem valósítható meg a probit regressziós görbék különböző meredekségei miatt (I. és III. kísérlet), vagy a természetes védelem százalékaiban levő különbségek miatt (II. és VI. kísérlet).

- Azt a következtetést lehet levonni, hogy a CVI-988 MDV „C” klón sokkal jobb védőhatékonyságú, mint a CVI-988 CEF₃₅ MDV, amikor SPF-csirkékben alkalmazzák.

VIII. PÉLDA

MD-vírusok nagyon virulens biovariánsainak egy csoportjából izolálunk egy reprezentánst HVT FC126tal vakcináit baromfinyájból Tuniszban. A kiindulási állományban 29%-os MD-gyakoriságot figyelünk meg. Az izolátum (MDV Tun) rendkívül virulens tulajdonságokat mutat, egy fertőzött SPF csirkének csupán 100 fehér vérsejtje a standard megfigyelési időtartam, 10 hét alatt 70% fölötti MD-veszteséget okoz 9 napos korú, nem vakcináit csirkék csoportjában. A nagyon virulens MD-vírus biovariánsok fenti reprezentánsát alkalmazzuk, mint fertőző vírust két PD₅₀ kísérletben, amelyben a CVI-988 CEF₆₅ MDV „C” klón és a HVT FC126 védőhatékonyságát hasonlítjuk össze. Ezeknek a kísérleteknek az eredményét a 7. táblázatban mutatjuk be.

Azt a következtetést lehet levonni, hogy a találmány szerinti vakcinakészítmény jobb védelmet nyújt az MDV-Tun fertőzés ellen, mint az összehasonlításul alkalmazott HVT-vakcinák.

7. TÁBLÁZAT

A CVI-988 CEF₆₅ MDV „C” klón és HVT FC126 által nyújtott védelmek összehasonlítása MDV Tun fertőzése ellen.

Vakcina CVI-988 CEF₆₅ MDV „C” klón	HVT FC126 MDV Tun
Fertőző vírus	MDV Tun
Legnagyobb dózis (FFU)	268	500
Sorozathígítások lépésekben	1:5	1:5
A megvédettek száma/összes szám
Legnagyobb dózis:	38/38	37/41
	38/38	30/41
	28/40	18/39
Legkisebb dózis:	19/40	9/41
Vakcina nélkül:	8/38	11/39
PD50*	5,2**	60,8
PD50 95%-os konfidencia
intervalluma	1,6-16,4	27,3-136
A probit regressziós vonal
meredeksége	1,75	1,35
A meredekség standard hibája	0,43	0,27

* Az MD-re fogékony csirkék 50%-ának védelméhez szükséges FFU száma.

** A CVI-988 CEF₆5 MDV „C” klón PD₅₀ értéke szignifikánsan különbözik a HVT FC126 PDjo értékétől (p< 0,05).

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás Marek-kór (MD) elleni vakcina készítésére alkalmas vírusklón előállítására, CVI-988 MDV-törzs madársejttenyészetben végzett sorozatos passzázsával, azzal jellemezve, hogy a madársejttenyészeten végzett sorozatos passzálást tarfolt-tisztítási lépésekkel kombináljuk, és a kiindulási törzsnéljobb immunogenitású és kevésbé patogén, különösen az MDre erősen érzékeny RIR csirkékre nézve kevésbé patogén kiónokat kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás CNCM1-426 számon deponált MDV CVI-988 C klón előállítására, azzal jellemezve, hogy a CVI-988 MDV-törzs madársejttenyészeten végzett 35. és 54. passzálási lépései között 4-8 tarfolt-tisztítási lépést iktatunk közbe, majd további 9-15 passzálást végzünk, és a kapott vírusklónok kö5 zül egy magas MDV-titerű törzset kiválasztunk.
3. Eljárás Marek-kór elleni vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított vírusklónt a vakcinagyártásban szokásos, gyógyászatilag elfogadható se10 gédanyagokkal összekeverve vakcinává alakítunk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vírusklónként a CNCM 1-426 számon deponált MDV CVI-988 C kiónt használjuk.

(rajz nélkül)