NO129095B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine mot rhinopneumonitisvirus-infeksjon ved hester (hoppers virusabort) .

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine mot rhinopneumonitis-infeksjoner hos hester (hoppers virusabort).

Rhinopneumonitisvirus (hoppers virusabort-virus) fører overveiende ved foler til en respiratorisk sykdom og ved gravide hopper ofte til abort. Rhinopneumonitisvirus tilhører gruppen

■Herpesvira og er utbredt over hele verden. Viruset kan i et stutteri anrette store økonomiske skader. Tidligere var det ved podning ikke mulig å hindre den virusbetingede epidemiske fole-kasting i hestestutteri. Alle forsøk på å fremstille et virksomt podningsstoff av inaktivert eller attenuert virus mot hoppeabort har forløpt utilfredsstillende, da det enten ikke var å oppnå noen

immunitet eller podningsvira disponerte alltid stadig over en for sterk"virulens.

Således førte en overfor gullhamster utviklet levende vaksine ennå til såkalt podningsaborter.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine mot rhinopneumonitisvirus-infeksjon ved hester (hoppers virusabort), idet fremgangsmåten er karakterisert ved at man attenuerer rhinopneumonitisvirus etter dyrkning ved kontinuerlige passasjer i primære cellekulturer fra organer av får eller svin, eller i cellekulturer av stabile cellelinjer, dvs. celler som ubegrenset vokser og formerer seg til tap av de sykdomsfrembringende egenskaper for hesteorganismen, blander den virusholdige innhøstning eventuelt med et adjuvans og eventuelt tørker lyofilt.

Rhinopneumonitis/. (hoppers virusabort) frembringes av

et virus som har fått betegnelsen det equine Herpesvirus I, eller Rhinopneumonitisvirus fra hest. Eksempelvis skal det som Rhinopneumonitisvirus-stammer nevnes stammene RAC-H, Hannover I835, Army 183 og Ky-D. Rhinopneumonitisviruset utvinnes eksempelvis ved avstryk-ning av folers neseslim og av homogeniserte organer av et abortert hestefoster.

Dyrkningen av viruset kan foregå på kjent måte i cellekulturer (sammenlign Dulbecco og Vogt, J. exp. Med. 99_, (1954), side 167 og Youngner, Proe. Soc. exp. Biol. Med. 8_5, (1954), side 202) eller på dyr. Den tjener det formål å isolere og å formere virus, for å utvinne tilstrekkelig materiale for videre undersøkelser som passasjer, titreringer og nøytr.alisasjonsprøver.- Vanligvis etterfølges isoleringen av 3 - 10 formeringspassasjer.

Som utgangsmateriale for fremstilling av cellekulturene for virusdyrkning og virusformering kommer det på tale organer som nyrer, milt, testikler, hud av hester, storfe, svin, sauer, geiter, aper og mindre forsøksdyr som gullhamster -og kaniner såvel som per-manente celle-linjer, som eksempelvis BHK 21-celler, AND-celler, HeLa-celler, PK 15-celler og RK-13-celler. Virusenes dyrkning kan også foretas i forsøksdyr, eksempelvis gullhamstere. Fortrinnsvis kommer det i betraktning nyrer fra hester eller grisunger såvel som gullhamstere.

Attenueringen foregår i cellekulturer som stammer fra organer av får- og svin, spesielt fra fåre- og svinenyrer, fortrinnsvis grisenyrer. Også cellekulturer av stabile celle-linjer kan an-

vendes for attenueringen.

Antallet passasjer som må gjennomgås til tap av sykdomsfrembringende egenskaper av rhinopneumonitisvirus for verts-organismen, dvs. for hesten, er sterkt avhengig av typen av den anvendte cellekultur. Således fører 20 - 40, fortrinnsvis 25 - 30 fårenyrekulturpassasjer eller også 240 til 300, fortrinnsvis 250 til 280 grisenyrekulturpassasjer til attenuering. Por den avslut-tende attenuering er det utslagsgivende følgende kriterier.

a) Infeksjonstiter for gullhamster etter intraperitoneal infeksjon må i forhold til utgangsverdien minst være gått tilbake

med tre tipotenser. For titreringen fremstilles fortynningsrekker i tierpotenser, pr. fortynning podes 4 gullhamstere med hver gang 0,2 ml intraperitoneal og beregnes etter metoden Behrens B., Arch. exp. Path., Pharmak. 140, 237 (1929) og Kårber G., Arch. exp. Path., Pharmak. 162, 480 (1931). b) Bibehold av de immuniserende egenskaper (antigenitet) ved gullhamster må være sikret i forhold til det anvendte utgangsvirus. Hertil blir hullhamster podet med det attenuerte virus (0,5 ml, parenteralt) og 3 uker senere infisert (intraperitonealt) med det virulente utgangsvirus (10.000 LD^Q/ml). Over 70$ av de prøvede dyr må overleve belastningsinfeksjonen. c) Høydrektige hopper mellom 7- og 9. drektighetsmåned, som er mottagelig overfor virusabort-virus, må etter intramuskulær

eller subkutan injeksjon av det attenuerte virus (5 ml, virustiter

g K 7 n

mellom 10 iJ og 10'' J KID,-0/ml) ikke bli syke og ikke abortere. Lokale podningsreaksjoner må ikke opptre. En kortvarig bifaset feberøkning mellom 18 og 48 timer og den 8. og 9. dag er ikke farlig for første podning. Ved 2. vaksinasjon bør det ikke mer iakttas en feberreaksjon. d) Foler i alder på 2 - 3 måneder som ikke har noen spesifikk antilegeme mot Rhinopneumonitisvirus må etter parenteral injeksjon med det attenuerte virus (5 ml, virustiter mellom 10^'^ og 10 7 ' 5 KID^q/itiI) ikke bli syke. En kortvarig temperaturøkning er ufarlig (sml. under punkt c).

Tilsettes et adjuvans, så kan det hertil eksempelvis benyttes mineralske adjuvanter (fortrinnsvis aluminiumhydroksyd og aluminiumfosfat). Det kan også her tilsettes andre ved vaksine-produksjon vanlige tilsetninger og hjelpestoffer, eksempelvis sta-bilisatorer. • ' " Vaksinen skal ha en titer fra IO<6>,<00> til lb7 ,5° KID^/ml, fortrinnsvis IO<7>,50 KIDcn/ml.

Hvis det er ønskelig kan vaksinen, også.tørkes lyofilt.

Virkningen av vaksinen ifølge oppfinnelsen ble målt

på drektige hopper. Hertil ble tre drektige hopper, som er i 2. til 3. drektighetsmåned og/eller i 7. til 8. drektighetsmåned, podet med 5 ml av vaksinen ifølge oppfinnelsen og en kontroll forblir upodet. I 9. til 11. drektighetsmåned (i siste . tredjedel av. drektigheten opptrer hoppenes virusabort) ble forsøksdyrene infisert med 10 ml av den infeksiøse rhinopneumonitis-virus (stamme Hannover 1835) ved subkut.an injeksjon. De tre immuniserte dyr bragte ved slutten av den normale drektighetstid sunne foler til verden, mens kontroll-dyrene på grunn av virusinfeksjon folekastet.

Fremstillingen av cellekulturen og gjennomføring av passasjene foregår på i og for seg kjent måte. En hensiktsmessig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er nærmere forklart i det følgende: Nyrer av får eller griser knuses mekanisk og med en 0 , 25%- ig trypsinoppløsning i fosfatpuffer, pH 7 ,6,,fordøyes intra-cellulærstoffet. Cellene utløser seg herved enkeltvis fra vev-sammensetningen, forblir imidlertid uten innvirkning av trypsin og bibeholder deres delingsevne. De i trypsinoppløsningen suspenderte celler utsentrifugeres, vaskes flere ganger, f.eks. med fosfat-puffret 0 ,85%-ig natriumkloridoppløsning og resuspenderes deretter 1 en kulturvæske.

Som kulturvæske egner det seg eksempelvis Hanks oppløs-ning, Earles oppløsning og Eagles medium, Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) med laktalbuminhydrolysat, kalveserum med amnion-væske , fortrinnsvis storfeamnionvæske såvel som virusmedium VM 2a.

En foretrukket kulturvæske er Hanks eller Earles opp-løsning med 0,5% laktalbuminhydrolysat, 10% kalveserum, antibiotika, f.eks. 100 IE penicillin og 50 gamma streptomycin eller 100 gamma dihydrostreptomycin/ml såvel som 0,01% fenolrødt som indikator. Kulturvæsken innstilles ved tilsetning av natriumbikarbonat eller begassing med 5% karbondioksyd på en pH-verdi fra 7,0 til 7,5, fortrinnsvis 7,3.

De i mediet suspenderte celler fylles i glasskår og dyrkes ved ca. 37°C' Nyrecellene avsetter, seg derved fast på glass-bunnen, formerer seg ved celledeling og danner hurtig, en tett snever til hverandre føyet cellemasse. Etter ca. 3 - 4 dager blir det forbrukte næringsmedium erstattet med nytt. Når cellekulturmassen er utvokset, vanligvis etter ytterligere 2 til 3 dager, podes den f.eks. ved Roux-skål-kulturer med 0,5 ml, ved smårør-kulturer med 0,1 mm av den tilsvarende virussuspensjon.

Virusdyrkningen og virusformeringen gjennomføres vanligvis ved 37°C. Vevkulturcellene formerer da viruset og avgir de ny-dannede viruspartikler til det omgivende næringsmedium. Det virusholdige medium av en cellekultur anvendes for podning av neste cellekultur og på denne måte gjennomføres attenueringspassasjene.

Tilsvarer det ved passeringer fremstilte virus de om-talte kriteria for attenuering, så kan virussuspensjonen anvendes som vaksine. Derved anvendes som kulturmedium VM 2a eller et annet, ikke serumholdig, syntetisk medium. Videre kan det være hensiktsmessig å tilsette et adjuvans som f.eks. aluminiumhydroksyd, og ved frysetørkning'å fremstille et tørrpreparat. Det egner seg for-trinnlig etter gjenoppløsning i et oppløsningsmiddel, f.eks. puffret Aqua dest., til immunisering av hester mot rhinopneumonitis hos hester (hoppers virusabort).

Eksempel 1.

Med en steril vattdott utvinnes neseslim fra en infisert fole. Vattdotten utspyles i 5 ml Hanks medium. Denne spylevæske sentrifugeres ved lavt omdreiningstall i 15 minutter (3000 omdr./ minutt). Den overstående væske (4,5 ml) inkuberes med 0,5 ml streptomycin-penicillin-oppløsning en halv time og deretter podes 2 ml ut på hestenyrekulturer som er tilberedt i 100 ml Erlenmeyerkolber og overdekket med 10 ml kulturvæske. En slik podet kultur utvaskes etter 1 til 24 timers adsorbsjon, overhelles med vekstmedium (Hanks oppløsning med .0,5% laktalbuminhydrolysat og 2,0% kalveserum samt antibiotika og fenolrødt) og holdes ved 37°C. Virusinnhøstningen underkastes ytterligere 5 hestenyrékulturpassasjer og overføres deretter på fårenyrekulturpassasjer. Som podningsmengde tjener 2 ml av den foregående passasje, fra den 20. passasje er det tilstrekkelig med 1 ml. Også herved anvendes som vekstmedium Hanks oppløsning med 0,5% laktalbuminhydrolysat og 2,0% kalveserum samt antibiotika og fenolrødt. Kulturene kontrolleres mikroskopisk daglig i 6 - 10 dager. Hver 5. passasje utføres serumfritt og prøves.på gullhamstere, om viruset er attenuert. Etter 25 fårenyrekulturpassasjer oppnås dette mål. Den virusholdige innhøstning fra 25. passasje utvinnes og blandes med 0, 1% aluminiumhydroksyd. Denne vaksines virusinnhold utgjør 10^,<0> KID^0/ml.

Eksempel 2.

Under sterile betingelser uttas lever, lunge, milt og nyre fra et. abortert hestefoster og de enkelte organer utrives i morter med natriumklorid-fosfatpuffer pH 7,2, 100 IE/ml penicillin og 100 gamma/ml dihydrostreptomycin samt med sjøsand og sentrifugeres (20 minutter, 3000 omdr./min.). Sentrifugatets overstående væske has i mengder på hver gang 0,5 ml på minst fire reagensglass - kulturer av svinenyrer (uten vekstmedium) for adsorbsjon. Etter 2 ".: timiws^-aduoasfes^oa—v-ed 37°C i dyrkningsskap fjernes podningsmateri-alet fra cellekulturen og kulturen overhelles med hver gang 2,0 ml vekstmedium (steril storfeamnionvæske, antibiotika og fenolrødt). Kulturene kontrolleres mikroskopisk daglig. Når det er opptrådt en spesifikk cytopatogen effekt, blir den overstående væske i kulturen etter adsorbsjonsmetoden overført på en ny kultur og passasjene videreført på denne måte. Etter ca. 5 passasjer var det tilstrekkelig med 0,1 ml av den overstående væske fra den forutgående kultur for den videre passasjeføring. Etter 100 passasjer overføres ennå bare 100 IE/ml. Hver 20. passasje prøves på gullhamster. Ved 255. passasje hadde infektiositetstiteren for gullhamster avtatt med tre tipotenser. Den overstående væske av kulturen etter denne passasje blandes med 0,1% aluminiumhydroksyd. Virusinnholdet utgjør 10<7>,<0 >KID™/ml.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine mot Rhinopneumonitisvirus-infeksjon ved hester (hoppers virusabort), karakterisert ved at man attenuerer Rhinopneumonitis-virus etter dyrkning ved kontinuerlige passasjer i primære cellekulturer fra organer av får eller svin, fortrinnsvis .får- eller grisenyrecellekulturer eller i cellekulturer av stabile cellelinjer til tap av de sykdomsfrembringende egenskaper for hesteorganismen, blander den virusholdige innhøstning eventuelt med et adjuvans og eventuelt tørker lyofilt.