JPH10503093A - 無蛋白培養における生物製剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明には、インフルエンザのようなウイルスおよびそれから製造したワクチン、および無蛋白条件下で培養した脊椎動物細胞を利用することによりウイルスベクターから誘導される組換え蛋白を製造するための方法が含まれる。細胞バイオマスを含むこの細胞は、改良されたウイルス増殖能を示し、費用と時間がかかるウイルスの継代と精製を必要としない。さらに、本発明には、活性化物質を使用し、ウイルスの活性化部位を修飾し、増強ループを使用することにより、ウイルスの増殖を増強する方法も含まれる。ウイルス再結合体を製造するための改良法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 無蛋白培養における生物製剤の製造法 発明の分野 本発明は、高増殖再集合体および弱毒ウイルスの製造を含む、継代を必要とし ない比較的高収量の、実質的にあらゆるインフルエンザウイルスを含む種々のウ イルスを増殖させるための方法に関する。さらに、本発明はそれらウイルスから のワクチンの製造法を提供する。本発明は多様なウイルスの培養を支持すること ができる細胞バイオマスにも関する。本発明は該細胞バイオマスを使用すること によるウイルス、ウイルス抗原、および組換え蛋白の製造にも関する。 発明の背景 効率的なワクチン製造にはウイルスが大量に増殖し、宿主系から高収量で産生 されることが必要である。異なるタイプのウイルスは許容される収量を得るため に異なる増殖条件を必要とする。したがって、ウイルスが増殖する宿主は大いに 重要である。ウイルスタイプの機能として、ウイルスは一次組織培養細胞、樹立 細胞系、またはニワトリの有胚卵のような有胚卵中で増殖してよい。 ウイルス株が増殖する培養条件も、ウイルス株の許容される高収量を達成する ために大いに重要である。したがって、所望のウイルス株の収量を最大にするに は、所望のウイルス株の産生に有利な環境を得るために、宿主系と培養条件の両 方を特に適合させなければならない。したがって、種々のウイルス株の許容され る高収量を達成するために、数多くの異なるウイルスに最適な増殖条件を提供す る系が必要である。多くのウイルスは非常に特異的な宿主系に限定されており、 そのいくつかはウイルス産生にとって非常に効率が悪い。 ウイルス宿主系として用いる哺乳動物細胞のいくつかはウイルスを高収量で産 生するが、そのような細胞は腫瘍誘発特性を有するため、それらをワクチン製造 に使用する上で規制的制約がある。事実、世界保健機構（ＷＨＯ）の適用ガイド ラインはウイルスワクチン製造用に２〜３の細胞系しか認められていないことを 示している。培養液に加える動物またはヒト供給源由来の蛋白添加物および／ま たは細胞培養中の血清を使用することから生じる問題（すなわち、バッチの違い による品質および組成物の差、およびマイコプラズマ、ウイルス、またはＢＳＥ 物質が混入する危険性はよく知られている。一般に、血清、またはアルブミン、 トランスフェリン、もしくはインスリンのような血清由来物質は、培養およびそ れから製造される生物学的生成物に混入しうる望ましくない物質を含有するかも 知れない。さらに、ヒト血清由来添加物は、血清によって伝染し得る肝炎やＨＩ Ｖのようなすべての既知のウイルスについて検査する必要がある。ウシ血清およ びウシ血清由来生成物、例えば、トリプシンにはＢＳＥ混入の危険性がある。さ らに、すべての血清由来生成物にはさらに未知の物質が混入している危険性があ る。したがって、血清または他の血清由来化合物を必要としない培養条件および 効率的な宿主系を得るために多くの試みがなされている。 時間の経過と共に、多くのウイルスがその血清型を変化させる。ウイルスの血 清型のあらゆる変化に対応して、新たなウイルス血清型に対する免疫を誘導する ためにワクチンを変える必要がある。特定の新たなウイルス血清型に対するワク チンによってもたらされる防護効率を維持するために、その新たな血清型に対す る免疫をもたらす新規ワクチンを製造する必要がある。新規ワクチンを製造する には新たなウイルス株を増殖させなければならない。多くのウイルス、特にイン フルエンザウイルスは血清型が非常に急速に変化するため、その培養系はビリオ ンを含むウイルス抗原を、そのウイルスの感染シーズン中にワクチンが製造でき る十分な速さで大量に製造できなければならない。 多くの場合、新しいウイルス株の最適増殖条件はそれらの前のものを増殖させ るのに用いる条件と異なる。したがって、新しいウイルス株の最適な増殖に必要 なものを得るために容易に調整しうる培養系が強く望まれている。さらに、新し い株の高生産量を得ることの要求といった実際的な動機から、インフルエンザの ようなウイルスの大規模生産に応用可能な方法が強く望まれる。 血清型を頻繁に変化させるウイルスの１つの典型的な例はインフルエンザウイ ルスである。インフルエンザはヒトの主要な呼吸器病であり、それにより毎年数 千人が死亡している。 インフルエンザウイルスには大きく３つのタイプ、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型が ある。これらのタイプはそれらの内部蛋白間の血清学的交差反応性がないことに よって定義される。さらに、インフルエンザＡ型ウイルスは、それらの糖蛋白、 血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）蛋白の抗原性の違いに基づ いてサブタイプに分類される。ヒトは主としてインフルエンザＡ、Ｂ、およびＣ 型ウイルスの感染によって生じる疾患に感受性である。 現在、ヒトにおけるインフルエンザ感染の最も重要な原因はＢ型、およびイン フルエンザＡ型のサブタイプＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２によるものである。したが って、Ｂ型およびインフルエンザＡ型のサブタイプＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２の抗 原は、本発明のインフルエンザワクチン内に一般的に組み入れられる抗原である 。現在利用可能なワクチンの防御率は７５〜９０％の範囲である。 インフルエンザＨＡ抗原はウイルスに対する宿主の防御的免疫応答の主な標的 である。有効なインフルエンザワクチンの開発における問題の１つは、ＨＡ蛋白 をコードする遺伝子の突然変異率が高いため、その抗原性が頻繁に変化すること によって生じる。したがって、有効なワクチンを製造するために、最近のインフ ルエンザ分離株から新しいワクチンを製造しなければならないことが多い。 新しいウイルス分離株を回収する通常の方法には、咽頭スワブまたは同様の供 給源を回収し、次いで、ニワトリ有胚卵中で分離株を培養することが含まれる。 卵中での初期培養は困難かも知れないが、ウイルスはその卵宿主に適応し、卵中 でウイルスの大規模生産が可能である。 インフルエンザワクチンの通常の製造法には、常にニワトリ有胚卵中でのウイ ルスの増殖が含まれてきた。次に、この方法で増殖したウイルスを用いて、弱毒 生ウイルス、死全ウイルス、またはサブユニットワクチンが製造される。しかし ながら、ニワトリ有胚卵を含む、インフルエンザワクチンを製造するための通常 の方法論は、１週間に数千個もの卵を取り扱うことを含め、非常にやっかいであ る。通常の操作では、卵を明かりに透かして検査し、殻を殺菌し、各卵の尿膜腔 内に少量のウイルスを注射により接種しなければならない。次に、注射された卵 を３３〜３７℃で４８〜７２時間インキュベーションし、再度明かりに透かして 検査し、一夜冷蔵し、次いで開けて尿膜液を採取する。次に、採取した液を濾過 および／または遠心して不純物を除した後、さらに精製処理を行う。次に、確実 に卵蛋白を含まないようにするために、徹底的に精製する必要がある（Requirem ents For Inactivated Influenza Vaccine，World Health Organization Techni cal Report Series，384(1966)）。 通常のニワトリ胚操作では、インフルエンザワクチン１用量を製造するのに１ 〜２個の卵が必要である。したがって、ワクチン１００万用量を製造するには１ ００万個以上の卵胚を処理する必要がある。要するに、インフルエンザウイルス ワクチンの通常の製造法には、自動化が困難な、したがって集約的な労働を要し 、時間がかかり、高価であり、汚染が生じる多くの工程が含まれる。したがって 、集約的な労働が必要でなく、製造する用量あたりの必要な生物組織が少なくて 済み、汚染されにくい方法が求められている。 インフルエンザウイルスワクチンを製造するために、一次ニワトリ胚細胞（「 ＣＥＣ」）または樹立哺乳動物細胞系を用いる標準的組織培養技術を適応させる 試みが数多くなされている。これらの試みは、数多くのウイルス株が通常の培養 中では複製されないために成功しなかった。いくつかの株では、Madin-Darbyイ ヌ腎（ＤＭＣＫ）系のような樹立哺乳動物細胞系を用いることで複製がよりうま くいった。それにもかかわらず、多くのウイルス株はＭＤＣＫ系中で複製されな いであろう。さらに、ヒト用ワクチンの製造に潜在的発癌性を有する細胞を使用 することに関連して副作用が生じる恐れがあるため、この目的に、高度に形質転 換された細胞系であるＭＤＣＫを用いることは除外されてきた。 一次組織培養または樹立細胞系で多くのインフルエンザ株を増殖させる上での 主な困難さの１つとして、宿主細胞中でインフルエンザ血球凝集素が蛋白分解に より開裂して活性化する必要があることが挙げられる。該ウイルスＨＡ₀前駆体 のＨＡ１およびＨＡ２サブフラグメントへの開裂は、ウイルスが新たな細胞に感 染するのに必要な工程である。したがって、宿主細胞中の新しいウイルス粒子が 新しい細胞に感染することができるビリオンに変換するには開裂が必要である。 開裂は、統合ＨＡ₀膜蛋白が感染細胞の小胞体から原形質膜に輸送される間に起 きることが知られている。輸送過程で、血球凝集素は、前駆体ＨＡの、アミノ末 端フラグメントＨＡ１とカルボキシ末端ＨＡ２への酵素分解的開裂を含む、一連 の共−および後−翻訳修飾を受ける。 インフルエンザビリオンが開裂または非開裂いずれかのＨＡ糖蛋白を含むこと がわかっているという事実は、開裂がウイルスの組立と感染細胞からの放出に必 ずしも必要でないことを示している。しかし、ＨＡの開裂は新しい宿主細胞の感 染開始に特に必要である。 非開裂ＨＡは細胞表面のノイラミン酸含有レセプターへのウイルスの吸着に関 与し得ることが知られているが、感染サイクルの次の工程である融合には関与で きない。開裂によるＨＡ２の疎水性アミノ末端の暴露は、それが標的細胞内に挿 入され、それによりウイルスと標的細胞膜との間にブリッジを形成するのを可能 にするために必要である。この後に、２つの膜の融合とウイルスの標的細胞への 侵入が起きる。 血球凝集素の蛋白分解的活性化は、多くの酵素、およびプロインスリン、プロ ゲスチン、ならびにプロオピオメラノコルチンのようなホルモン前駆体を用いて 観察されたパターンに従う。これにはトリプシン様エンドプロテアーゼによるア ルギニン残基の開裂が含まれる。利用可能な証拠は、エンドプロテアーゼがカル シウム依存性で、最適ｐＨが中性である細胞内プロテアーゼであることを示唆す る。しかしながら、これらの観察結果の他は、この細胞内酵素の性状については ほとんどわかっていない(Klenkらの、「The Molecular Biology of Influenza V irus Pathogenicity」、Adv.Virus Res.,34:247-281(1988))。 活性化プロテアーゼは細胞酵素であるため、感染細胞のタイプによってインフ ルエンザ血球凝集素が開裂されるかどうかが決定される。哺乳動物インフルエン ザウイルスおよび非病原性トリインフルエンザウイルスの血球凝集素は限られた 数の細胞タイプの蛋白分解的開裂にのみ感受性である。一方、Ｈ５〜Ｈ７サブタ イプ間の病原性トリウイルスの血球凝集素は、広範囲の種々の宿主細胞に存在す るプロテアーゼによって開裂される。したがって、ウイルスの病原性特性に対応 し得る血球凝集素開裂能の違いによって宿主範囲に違いが生じる。 開裂能の違いは血球凝集素の開裂部位のアミノ酸配列の違いによる。配列分析 から、非病原性トリおよびすべての哺乳動物インフルエンザウイルスの血球凝集 素分子のＨＡ１およびＨＡ２フラグメントが単一アルギニンによって結合してい ることがわかっている。反対に、病原性トリ株は共通の特徴であるリジン−アル ギニンまたはアルギニン−アルギニンを有する開裂部位に数個の塩基性アミノ酸 配列を有する。すべてのインフルエンザウイルスの血球凝集素は、該塩基性アミ ノ酸の除去を生じる同じ一般的メカニズムによって開裂する。 広範囲のインフルエンザウイルス株の開裂に不可欠なプロテアーゼ活性は有胚 卵および全ニワトリ胚に相当する細胞凝集物中で利用可能である。しかしながら 、ニワトリ胚から調製した通常のＣＥＣ培養では全ニワトリ胚のプロテアーゼ活 性の一部しか得られないため、限られた範囲のインフルエンザウイルス株しか複 製されない。ＣＥＣ培養を調製するための標準的方法には、頭部および内部臓器 の回収と、複数のトリプシン処理工程が含まれる。これらの方法は、特に、多く のインフルエンザ株が複製されることが知られている、脳、心臓、肺、肝臓、お よび腎細胞の減少を生じる(Scholtissekらの、「Multiplication of Influenza A Viruses with Cleavage and Non-cleavable Hemagglutinin in Chicken Embry Membranes or Organes，and Cell Cultures Derived Therefrom」、J.Gen.Viro l.,69,2155-2164(1988))。したがって、標準的方法では主に繊維芽細胞からなる 高度に選択された細胞ポピュレーションを生じるため、この方法が支持しうるウ イルス株は制限される。 インフルエンザウイルス産生を改善する試みが以前になされてきた。例えば、 標準細胞培養中の多くのインフルエンザＡ株の限られた複製は、組織培養液にト リプシンを加えることによって改善されることが報告されている。例えば、トリ プシンの添加によりＣＥＣ培養中で増殖した種々の株の感染性は有意に増加する (Lazarowitzらの、「Enhancement of the Infectivity of Influenza and ViIru ses by Proteolytic Cleavage of the Hemagglutinin Polypeptide」、Virolog lutinin with Multibasic Site is Activated by Furin，a Subtilisin- like E ndoprotease」、ＥＭＢＯ J.,11:2407-2414(1992)）は、ＭＤＢＫ細胞中のＨＡ 活性化酵素がフリン様プロテアーゼであることを確認した。そのような酵素はヒ トおよびマウス組織から分離され、真核細胞サブチリシン様エンドプロテアーゼ のニューファミリーを構成する。 他のワクチン製造法を開発する別の試みがなされてきた。米国特許第4,783,41 1号（Gabliks）は金魚細胞培養でインフルエンザワクチンを製造する方法につい て考察している。その樹立後にGabliks培養に感染させるためのウイルス粒子が ニワトリ胚培養または感染ＣＤ-1株マウスから得られた。該ウイルスをそのよう な金魚細胞培養で少なくとも２回継代し、生ワクチンとして使用してよい弱毒ウ イルスが得られる。 米国特許第4,500,513号（Brownら）は、トリプシン、キモトリプシン、または カルボキシペプチダーゼのような蛋白加水分解酵素が部分感染培養と共にインキ ュベーションされ、さらにウイルスに感染した細胞の割合を増加させ、確実に最 大細胞変性効果が得られる液体細胞培養または細胞単層培養からワクチンを製造 するための非修飾ウイルス粒子を製造することを開示している。ウイルスの回収 は、最大細胞変性効果を有するウイルスの増殖期の時点で行われる。しかしなが ら、Brownのすべての実施例は、ヒトワクチンの製造に利用できないイヌ腎細胞 系について記載している。Brownらの方法におけるウイルスの最大細胞変性効果 により、ウイルス収量は１回のウイルス複製のみに限られる。さらに、Brownは ウイルスゲノムの操作も培養条件の最適化も開示していない。したがって、Brow nの方法は、対応するワクチンの効率的な製造に必要なウイルスの大規模な製造 に応用できない。 米国特許第4,205,131号（Almeida）は、蛋白分解酵素のトリプシンを含む無血 清培地の存在下で、細胞培養中でロタウイルスを増殖させる方法を開示している 。より高レベルのトリプシンの細胞に対する致死効果により、BrownのようにAlm eidaのウイルス収量は１回の複製で産生される収量に限定される。 より最近、別の研究者らが細胞系培養中でのインフルエンザウイルスの産生を 試みている。例えば、Katzら（J.Infect.Dis.160:191-98(1989)）はＭＤＣＫ細胞 と有胚卵の羊膜腔におけるインフルエンザの増殖特性を比較している。KatzはＭ ＤＣＫ細胞から得られるインフルエンザの力価が有胚卵のそれと比べたとき有望 であることを見いだした。しかしながら、ＭＤＣＫ細胞を使用するには問題があ る。例えば、ＭＤＣＫ細胞はヒト用ワクチンを製造するための許可された細胞系 ではない。さらに、Katzの方法はＭＤＣＫ細胞系中でウイルスを複数回、連続的 に継代する必要があるため、費用がかかり、さらに重要なことは時間がかかる。 Kaverinら(J.Virol.69:2700-03(1995))は、血清含有培地で増殖したＶＥＲＯ 細胞中でのインフルエンザウイルスの増殖を試みている（ＶＥＲＯ細胞は世界保 健機構により一般的なワクチン製造用として許可されている）。 しかし、KaverinはＶＥＲＯ細胞中でのインフルエンザウイルスの増殖におい て困難にぶつかり、その困難を明らかにＶＥＲＯ細胞から放出される因子によっ て生じる培養細胞中のトリプシン活性の低下と結びつけた。Kaverinは、繰り返 してトリプシンを加えることと、ＶＥＲＯ細胞中でウイルスを連続的に継代する ことによってこの問題に対処した。ＶＥＲＯ細胞中で１０代継代後にのみ、Kave rinは有胚卵およびＭＤＣＫ細胞を用いて得られたのと同じ高さの力価を得た。G ovorkovaら(J.Infect.Dis.172:250-53(1995))も同様の結果を得た。 しかしながら、KaverinもGovorkovaも血清を含有する培地を使用する問題には 対処しなかった。一般的に血清含有培地はバッチごとの一貫性を欠き、ウイルス の産生および精製工程を面倒にする望ましくない夾雑物を含んでいる。この夾雑 物には、重大な安全上の問題を生じ得るＢＶＤＶ、Bluetongueウイルス、プリオ ン、もしくはＢＳＥのような夾雑ウイルス、および／または免疫原性蛋白が含ま れる。 先行技術文献では無血清培地を用いるウイルスの増殖も試みられている（EP11 5442、U.S.4,525,349、U.S.4,664,912参照）。これらの方法では、最初に宿主細 胞を血清含有培地で増殖させ、各ウイルスで感染させる直前に血清含有培地を無 血清培地に交換する。 ＶＥＲＯ細胞はＭＦＳＳ２のような無血清培地での増殖に適応している(Mert enらの、Cytotech．14:47-59(1994))。ＭＤＳＳ２は増殖因子を欠くが、まだか なりの非血清蛋白が存在している（３０〜４０mg蛋白／mL）(Mertenらの、Biolo gicals 23:185-89(1995))。したがって、ＭＤＳＳ２には、血清含有蛋白のよう な他の血清含有培地に関連する問題が全くないわけではない。 ウイルスおよびその抗原、およびウイルスベースの発現系中で組換え蛋白を産 生するための安全で有効な方法が絶えず求められている。さらに、容易に利用可 能な物質を用い、連続継代によりウイルスを特定細胞基質に適応させるといった 時間のかかる操作を最小限に止めた、適用できる規制基準にかない、多くの種々 のウイルスおよびウイルス株、特に通常の方法では効率的に増殖できないそれら に適合し得るウイルス増殖法が求められている。 発明の要約 本発明の目的は、細胞培養からウイルスを高収量で生産する方法と、ウイルス からのワクチン製造法を提供することである。 本発明は、最小限のヒトの操作によりＣＥＣまたはＶＥＲＯ細胞のような、脊 椎動物細胞から持続的かつ連続的にウイルスを生産する方法を提供することも目 的とする。 本発明の別の目的は、外因性物質で増強することにより培養中のウイルス活性 を最適化する方法を提供することである。 さら本発明の別の目的は、すべてのタイプの細胞生成物、すなわち、ウイルス や組換え蛋白、または他の細胞生成物を、種々の生成物の特定の要求に容易に適 合することができる柔軟な系中で高収量で産生する方法を提供することである。 さらに本発明の目的は多くの種々のウイルスの増殖を支持する細胞バイオマス を提供することである。 さらに本発明の別の目的は、ウイルス、ウイルス抗原、または組換えウイルス を含むウイルスによって産生される蛋白のような生物学的生成物を製造するため の、夾雑蛋白のない細胞バイオマスを提供することである。 さらに本発明の目的は、細胞培養から全ウイルスを含むウイルス抗原を効率的 に産生する方法、ならびにそのウイルスまたはウイルス抗原由来のワクチンを製 造する方法を提供することである。 さらに本発明の別の目的は、培養液由来の夾雑蛋白を含まない組換え蛋白を製 造する方法を提供することである。 これらおよび他の目的に従って、本発明は、ＶＥＲＯ細胞のような脊椎動物細 胞培養を得、（血清および非血清蛋白を含まない）無蛋白培地中のみで細胞を増 殖させ、この培養にウイルスを感染させ、ウイルスを感染させた細胞培養をイン キュベーションして、培地中でウイルスを増殖させ、ウイルス含有培地を生産す る工程を含むウイルスの生産方法を提供する。この方法の修飾には、脊椎動物細 胞の培養を得る工程後と細胞を感染させる工程前に、無蛋白培地中で脊椎動物細 胞を少なくとも６世代、好ましくは少なくとも１２世代、より好ましくは少なく とも１８世代、またはさらにより好ましくは少なくとも２４世代増殖させること が含まれる。 本発明の別の局面は、（ａ）無蛋白培地中で単に培養された脊椎動物細胞培養 を得、（ｂ）該培養にウイルスを感染させ、（ｃ）ウイルスを感染させたこの細 胞培養をインキュベーションしてウイルスを増殖させる工程を含む、ウイルスを 含むウイルス抗原の製造法を提供することである。好ましくは、該ウイルスは複 数の連続継代を行うことなく該培養中で増殖する。ウイルスは、オルソミクソウ イルス科、パラミクソウイルス科、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、フラ ビウイルス科、アレナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、 およびアデノウイルス科のウイルスのようなあらゆるタイプの動物ウイルスであ り得る。好ましいウイルスにはポリオウイルス、ＨＡＶ、ＴＢＥＶ、黄熱ウイル ス、風疹ウイルス、ＨＣＶ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、 インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、レオウイルス３型 、アデノウイルス１型〜４７型、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＥＢＶ 、ロタウイルス、およびワクシニアウイルスが含まれる。より好ましいウイルス には、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣのようなインフルエンザウイルスである 。ウイルスの増殖に用いる細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−Ｍ Ｋ２細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ、ＷＩ−３８、およびＭＲＣ−５細胞が含ま れ る。好ましくは該細胞は細胞バイオマス中のＶＥＲＯ細胞である。 本発明の別の局面では、この方法には、さらに（ｄ）工程（ｃ）の細胞培養の 一部を取り出し、（ｅ）工程（ｄ）の部分を、ウイルスの活性化を増強する少な くとも１つの物質と接触させ、（ｆ）工程（ｅ）の部分に、該物質のあらゆる細 胞毒性作用を阻害するかまたは減弱させる少なくとも１つの化合物を加え、（ｇ ）この培養に工程（ｆ）の部分を戻すことが含まれる。好ましくは該ウイルスの 活性化を促す物質はプロテアーゼである。ウイルスの活性化を増強する物質は、 ウイルスと宿主細胞膜の融合をもたらす糖蛋白を開裂させるプロテアーゼである ことが好ましい。増殖するウイルスがインフルエンザである場合、プロテアーゼ はインフルエンザ血球凝集素を開裂させる。好ましくは、該プロテアーゼは、プ ロナーゼ、サーモリシン、サブチリシンＡ、または組換えプロテアーゼのような 原核生物供給源由来である。 本発明の別の局面において、細胞バイオマスがウイルスを連続継代をすること なく脊椎動物細胞で持続的に増殖させるものである、無蛋白条件下のみで培養し た該細胞を含む細胞バイオマスを提供する。細胞バイオマスは無蛋白培地中の担 体上で細胞を増殖させることにより得ることができる。 さらに本発明の別の局面において、（ａ）担体および無蛋白培地を含む容器中 、全くの無蛋白条件下で細胞を増殖させ、細胞を該担体上で増殖させ、該担体に 吸着したバイオマスを形成し、（ｂ）細胞バイオマスと担体を、細胞バイオマス を担体から分離させる物質と接触させる工程を含む細胞バイオマスの製造法を提 供する。好ましくは該物質はプロテアーゼである。プロテアーゼは、サーモリシ ン、サブチリシンＡ、またはプロナーゼのような原核生物から誘導されることが 好ましい。 まだ本発明の別の局面において、（ａ）無蛋白培地中のみで脊椎動物細胞培養 を増殖させ、（ｂ）この培養にウイルスを感染させ、（ｃ）ウイルスを感染させ た細胞培養をインキュベーションし、（ｄ）脊椎動物細胞中で所望の表現型を有 するウイルス株を選択し、（ｅ）工程（ｄ）からドナーウイルスを分離する工程 を含む、オルソミクソウイルスのような分節化(segmented)ウイルスからドナー ウイルスを作製し、再集合体ウイルスを作製する方法を提供する。好ましくは、 該ウイルスはインフルエンザウイルスであり、所望の表現型は高収量表現型また は弱毒有毒表現型である。工程（ｃ）のウイルスは、感染哺乳動物の喉スワブか ら分離された、野生型インフルエンザウイルス、高収量ドナーインフルエンザウ イルス、再集合体インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス 、低温順化インフルエンザウイルス、弱毒インフルエンザウイルス、およびニワ トリ有胚卵またはインフルエンザウイルス株に適応した細胞培養で継代したウイ ルスを含み得る。ウイルスを増殖させるための細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ− １細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＷＩ−３８、およ びＭＲＣ−５細胞が含まれ得る。本発明によって得ることができる好ましいドナ ーウイルスとして、ＶＥＲＯ細胞中で高収量表現型を有するA/Orth/17/95（H1N1 ）が挙げられる。 さらに本発明の別の局面において、（ａ）無蛋白培地中の脊椎動物細胞培養を 、高収量および／または弱毒有毒表現型のような所望の表現型を有する第１オル ソミクソウイルスおよび現在のワクチン株の少なくとも１つの抗原決定基を有す る第2オルソミクソウイルスと共培養し、工程（ａ）の脊椎動物細胞培養をイン キュベーションして該ウイルスおよび該ウイルスの再集合体を増殖させ、（ｃ） 該共感染培養から、第１オルソミクソウイルスの、高収量および／または弱毒有 毒表現型といった所望の表現型、および第２オルソミクソウイルスの少なくとも １つの抗原決定基を含む再集合体ウイルスを選択する工程を含む再集合体オルソ ミクソウイルスの製造法を提供する。好ましくは該オルソミクソウイルスはイン フルエンザウイルスである。 工程（ｃ）には、第１オルソミクソウイルスの抗原決定基と結合するが、第２ オルソミクソウイルスの抗原決定基には結合しない抗体を使用することができる 。第２オルソミクソウイルスをウイルス製造用に選定することが好ましい。 好ましい態様において、該再集合体オルソミクソウイルスはＶＥＲＯ細胞のバ イオマスから製造される。 さらに本発明の別の局面では、ドナーウイルスの抗原決定基と結合するが、ワ クチン製造用に選定されたウイルスの抗原決定基とは結合しない、ワクチン製造 用の再集合体ウイルスを選択するための抗体を提供する。好ましくは、該抗体は ドナーウイルスの血球凝集素およびノイラミニダーゼのような外表面糖蛋白と結 合する。 本発明は、ウイルス含有培地の部分を取り出し、該部分を、ウイルスの活性化 が生じるのに十分な時間該活性化を増強する少なくとも１つの物質と接触させ、 次いで、阻害または弱毒化が生じるのに十分な時間少なくとも１またはそれ以上 の物質のあらゆる細胞毒性効果を阻害または減弱させる１またはそれ以上の化合 物を取り出した部分に加え、次いで該部分を細胞培養に戻す工程を使用すること によりウイルスを含むウイルス抗原の改良された製造法をも提供する。本発明に 用いるのに適した脊椎動物細胞には、ニワトリ胚培養細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ −１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびMDBK細胞、ならびに多数 の細胞タイプを含む脊椎動物細胞凝集物が含まれる。 本発明によって製造されるウイルスを含むウイルス抗原には、オルソミクソウ イルス科、パラミクソウイルス科、およびレオウイルス科の抗原が含まれ、好ま しくはインフルエンザウイルスである。該ウイルスの活性化を増強する物質は、 インフルエンザ血球凝集素を開裂させるプロテアーゼのようなウイルスと宿主細 胞膜の融合をもたらす糖蛋白を開裂させるプロテアーゼであることが好ましい。 適切なプロテアーゼはトリプシンファミリーおよびサブチリシン様酵素ファミリ ーからなる群から選ばれてよい。より具体的には、該プロテアーゼはトリプシン 、キモトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、サブチリシンＡ、エラスターゼ 、ペプシン、パンクレアチン、カルボキシペプチダーゼ、およびフリンからなる 群から選ばれてよい。より好ましいプロテアーゼはプロナーゼ、サブチリシンＡ 、またはサーモリシンのような原核生物供給源由来のプロテアーゼである。 本発明の方法は、容器中でウイルスの活性化を増強する物質かまたは担体上に 固定化された物質を有することもできる。 ある具体的態様では、インフルエンザウイルスには糖蛋白の開裂部位を修飾す るかまたは新しい開裂部位を作製するための変更がなされた。この方法をインフ ルエンザウイルスに適用する場合、インフルエンザウイルスの血球凝集素をアミ ノ酸ＫＫＲＫＫＲの開裂部位を含むように変化させることが好ましい。本発明は 、ダイズトリプシンインヒビター、卵トリプシンインヒビター、およびアプロチ ニンのような活性化物質のあらゆる細胞毒性効果を阻害、減弱、または除去する 化合物を使用することも含むことができる。好ましくは、該インヒビターは容器 中に供給されるかまたは担体上に固定される。 本発明の方法は、培養の増殖、感染、および活性化レベルをモニターし、増殖 、感染、および活性化レベルを最大にするために培養条件を変更し、培養からウ イルスを回収し、次いで回収したウイルスを用いてワクチンを製造する工程を含 むこともできる。さらに、本発明の方法は、上記の方法により得られるワクチン を動物に投与することによるインフルエンザウイルス感染の治療または予防法を 提供する。 本発明の方法は、脊椎動物細胞の細胞培養を提供し、無蛋白培地中で細胞を増 殖させ、細胞培養をウイルスに感染させ、ウイルスに感染した細胞培養をインキ ュベーションして培地中でウイルスを増殖させてウイルス含有培地を生産し、ウ イルス含有培地の部分を取り出し、該部分をウイルスの活性化を増強する少なく とも１つの物質と接触させ、該部分に、ウイルスの活性化を増強する１またはそ れ以上の物質の細胞毒性効果を阻害、減弱、または除去する少なくとも１つの化 合物を加え、取り出したウイルス含有培地の部分を細胞培養および培地に戻す工 程を含む、ウイルスを含むウイルス抗原の生産を増強または最適化する工程を含 むこともできる。 本発明の方法には、供給、増殖、感染、およびインキュベーション工程が所望 により第１容器中で実施され、接触および添加工程が第2容器中で実施され、さ らに、供給、増殖、感染、インキュベーション、取り出し、接触、添加、および 戻す工程を閉じられたサイクルなどの中で行うことができるように第１および第 ２容器が環状（ループ）に接続されることも含まれる得る。本発明の範囲内の他 の選択肢には、供給、増殖、感染、およびインキュベーション工程が第１容器中 で実施され、接触工程が第２容器中で実施され、添加工程が第３容器中で実施さ れることが含まれる（ここで、所望により、第１容器、第２容器、および第３容 器はすべての工程がバッチ単位でかまたはサイクル的といった方法で行うことが できるように環状に接続される）。 本発明は種々のタイプの脊椎動物細胞を用いて実施することができる。例えば 、本発明の方法の脊椎動物細胞は多くの細胞種、またはニワトリ胚細胞培養、Ｖ ＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞 、ＷＩ−３８およびＭＲＣ−５細胞から選ばれる細胞種を含んでいてよい。 本発明の好ましい形において、ウイルスはインフルエンザウイルスであってよ く、感染細胞は無蛋白培地中の出発物質から増殖したＶＥＲＯ細胞である。トリ プシン、キモトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、サブチリシンＡ、エラス ターゼ、ペプシン、パンクレアチン、カルボキシペプチダーゼ、およびフリンか らなる群から選ばれるトリプシンファミリーまたはサブチリシン様酵素から選ば れる１またはそれ以上のプロテアーゼであり得るインフルエンザ血球凝集素を開 裂させるプロテアーゼのような、ウイルスを活性化するための物質が加えられる 。 本発明の方法には、培養の増殖、感染、および活性化レベルをモニターし、培 養条件を変化させて細胞およびウイルスの増殖、感染、および活性化レベルを最 大にし、培養からウイルスを回収し、回収したウイルスを用いてワクチンを製造 し、本方法により得られるワクチンを動物に投与することによりインフルエンザ ウイルス感染を治療および予防する工程も含まれ得る。 本発明の方法には、第1容器に培養中の細胞を供給し、第２容器に培養細胞の 部分を移し、所望の生成物の製造を最適化するために１またはそれ以上の物質を 加えて、第２容器で該細胞の部分を活性化し、第３容器に培養細胞の部分を移し 、第３容器中の培養細胞の部分に化合物を加えて１またはそれ以上の外因性物質 の細胞毒性効果を減弱させる工程を含む、１またはそれ以上の培養細胞生成物の 製造を最適化する工程も含み得る（ここで、第１、第２、および第３容器は環状 ループ系などに接続され、第１容器に培養細胞の部分が戻される）。本方法は、 該培養中に実質的にすべての細胞を含み得る培養の部分を処理し、細胞の増殖お よび産生するための最適条件を提供する培養液中で細胞およびウイルスを培養す る ためのバッチまたは連続的製造法も提供する。 本発明の方法には、脊椎動物細胞の培養を得、無蛋白培養中で細胞を増殖させ 、ウイルスの活性化に関与する蛋白中に修飾された開裂部位（ここで、修飾され た開裂部位は脊椎動物細胞培養中の開裂酵素に対するウイルスの感受性を増加さ せる）を有するウイルスに該培養を感染させ、該ウイルスを感染させた細胞培養 をインキュベーションして、ウイルスを増殖させ、ウイルスを含む培地を製造す る工程を含む、ウイルスの活性化に関与する蛋白を発現するウイルスの感染性を 調節（例えば増大）することも含まれる。本方法は、ウイルスがその血球凝集素 の開裂部位を修飾するかまたは血球凝集素の新しい開裂部位、好ましくはＫＫＲ ＫＫＲなどを作製するように変化させたインフルエンザウイルスであり、該脊椎 動物細胞がニワトリ胚培養細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２ 細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびＭＤＢＫ細胞、ならびに多様な細胞種を含む脊椎動 物細胞凝集物である場合に特に有用である。 ウイルスの感染性の増大に関する本発明の局面には、ウイルスを含む培地の部 分を取り出し、該部分を、該ウイルスの活性化を増強する少なくとも１つの物質 と接触させ、このウイルス含有部分に、ウイルスの活性化を増強する少なくとも １またはそれ以上の物質の細胞毒性効果を阻害、減弱、または除去する少なくと も１つの化合物を加え、細胞培養および培地に取り出した部分を戻す工程が含ま れてもよい。ウイルスの活性化を増大させる好ましい物質は、ウイルスの活性化 に関与する蛋白を活性化するプロテアーゼ、例えば、好ましくはトリプシン、キ モトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、サブチリシンＡ、エラスターゼ、ペ プシン、パンクレアチン、カルボキシペプチダーゼ、およびフリンからなる群か ら選ばれるトリプシンファミリーまたはサブチリシン様酵素ファミリーから選ば れるプロテアーゼを含むインフルエンザ血球凝集素を開裂させるプロテアーゼで ある。より好ましいプロテアーゼはプロナーゼ、サブチリシンＡ、またはサーモ リシンのような原核生物供給源由来のプロテアーゼである。 さらに本発明の別の局面では、ヒト供給源またはブタ、ウシ、ヒツジ、および ニワトリ（卵）のような動物供給源由来の蛋白、または病原性物質である蛋白の ような培養液由来の夾雑蛋白を含まない培養ウイルスを提供する。 さらに本発明の別の局面では、ヒト供給源またはブタ、ウシ、ヒツジ、および ニワトリ（卵）のような動物供給源由来の蛋白、または病原性物質である蛋白の ような培養液由来の夾雑蛋白を含まないウイルス抗原を提供する。ウイルスまた はウイルス抗原はＴＢＥＶ、ＨＡＶ、ＨＳＶ、パルボウイルス、またはインフル エンザウイルス由来であることが好ましい。 本発明の別の局面では、ヒト供給源またはブタ、ウシ、ヒツジ、およびニワト リ（卵）のような動物供給源由来の蛋白、または病原性物質である蛋白のような 培養液由来の夾雑蛋白を含まないウイルス抗原を含むワクチンを提供する。該ウ イルスは弱毒ウイルスであり得るか、または不活化されてもよい。好ましくは、 該ワクチンはウイルス抗原に加えて、医薬的に許容される担体を含む。該ワクチ ンは非経口的または経口的に哺乳動物に適用することができる。該ウイルス抗原 は、好ましくはウイルス感染から哺乳動物を予防するかまたは治療するためのワ クチンを製造するために使用される。 本発明のさらに別の局面では、（ａ）無蛋白培地中のみで培養した脊椎動物細 胞培養を得、（ｂ）該細胞培養を、組換え蛋白を発現するウイルスベクターで感 染させ、（ｃ）該ウイルスベクターを感染させた該感染細胞培養をインキュベー ションして該ウイルスを増殖させ、（ｄ）該組換え蛋白を回収する工程を含む組 換え蛋白の製造法を提供する。該ウイルスベクターは好ましくはワクシニアウイ ルスである。該ウイルスベクターによって発現される組換え蛋白は、ウイルス蛋 白、細菌蛋白、および血液因子からなる群から選ばれる。 好ましい態様の詳細な説明 本発明は、ウイルス、ウイルス抗原、またはウイルス発現ベクターから誘導さ れる組換え蛋白のような生物学的生成物を産生するための新しい系を提供する。 新しい方法論は、望ましくない夾雑物に関して安全性が高い生物学的生成物を大 規模に製造するのに使用可能な脊椎動物細胞バイオマスを製造するために開発さ れた。本発明の「細胞バイオマス」は、血清蛋白が欠如していることを含む無蛋 白条件下で培養された脊椎動物細胞が含まれる。無蛋白環境から得られる細胞を 使用することによりウイルスを細胞で連続継代する必要がなくなる。 本明細書で用いている用語「無蛋白」は、該状況において蛋白、血清、非血清 蛋白などがないことを表す。例えば、「無蛋白」培地は蛋白を含まないであろう し、ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭＨＡＭ’Ｓ Ｆ１２のような最小基礎培地から作製 することができる。「無蛋白」培養は無血清培地中で増殖した細胞を含み、「無 蛋白」条件は無蛋白培地中で細胞を増殖させることを示すであろう。そのような 培養は細胞由来の蛋白および所望により特に加えられたあらゆる蛋白を含むであ ろう。したがって、細胞の無蛋白培養において、該培養は細胞由来蛋白および加 えられたあらゆる蛋白のような所望の蛋白を含むであろうが、ＭＤＳＳ２中の蛋 白のような蛋白含有培地由来の望ましくない蛋白は含まないであろう。 好ましくは、該細胞は最初のアンプルから無蛋白条件下のみで細胞バイオマス に成長する。培養液は好ましくは合成最小培地ならびに酵母エキス、ならびにα −シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２ −ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキスト リン、ジ−メチル−β−シクロデキストリン、またはトリ−メチル−β−シクロ デキストリンのようなシクロデキストリンの誘導体からなる。好ましくは、血清 含有培地中で培養されていてもよい細胞コレクションまたは他の供給源由来の細 胞系を入手した後、該細胞系は、完全に蛋白を含まず、ウイルスが高収量である ことを保証するのに十分な多くの世代、無蛋白増殖条件下で維持される。したが って、本発明の方法では、ウイルスに感染させる前に、無蛋白培養条件下におけ る哺乳動物細胞の増殖は、複数世代、好ましくは少なくとも６世代、より好まし くは少なくとも１２世代、さらにより好ましくは少なくとも１８世代、さらによ り好ましくは少なくとも２４世代行われる。 本発明は、無蛋白条件下で最初のアンプルまたは細胞系から大規模の細胞バイ オマスに増殖する細胞バイオマスをも提供する。細胞バイオマスには、驚くべき ことに蛋白含有培地で増殖した細胞より高密度を達成する担体に吸着した細胞を 含む培養中の細胞および細胞凝集物が含まれる。本発明の細胞バイオマスは無蛋 白培養条件へのいかなる順化期も必要としない。ＡＴＣＣまたはＷＨＯのような 細胞コレクションから得られる細胞は血清含有培地中で得られるが、いかなる順 化処理も行うことなく速やかに無蛋白条件に移すことができる。 本発明の細胞バイオマスを用いることにより細胞が適応性を欠くことによる時 間の損失がないため、先行技術よりも大きな改善が得られる。感染前に増殖させ る必要がある細胞バイオマスの世代数は、血清存在下で増殖する細胞培養におい て必要とされる数より多くない。通常１００〜約３００世代の、多世代にわたり 細胞を増殖させ後、ある形質転換細胞系は発癌性となる。したがって、本発明は 、高価な継代培養が必要なために生じる発癌性の危険性を避ける利点を有する継 代方法または培養液由来のあらゆる夾雑化合物を有しない細胞バイオマスを提供 する利点を兼ね備えている。 さらに、本発明の系は血清含有培養液中で増殖した細胞に比べて驚くほど細胞 密度が増加した細胞バイオマスを提供する。高細胞密度の細胞バイオマスにより 生物学的生成物のためのより経済的製造方法が提供される。 本発明の好ましい態様において、細胞は、微小担体のような種々の不溶性基質 を含む担体上で増殖する。微小担体に吸着した細胞を含む細胞バイオマスは大規 模発酵系に用いられる。微小担体に吸着した細胞は担体上で多層になって増殖し 、該細胞は無蛋白培養条件下で担体から剥がれない。このことは、先行技術文献 は支持担体から細胞が剥がれ、次いで凝集塊および細胞凝集物が形成されること を報告していることから顕著で予測されなかった知見である。 本発明の細胞バイオマスを製造するのに使用する適切な脊椎動物細胞はＶＥＲ Ｏ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ−２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＭＲＣ−５、およびＷ Ｉ−３８からなる群から選ばれる細胞を含む固定依存性細胞である。細胞バイオ マスの細胞は、担体に直接または間接的に結合する。ガラス、架橋デキストラン 、ゼラチン、または合成物質は該担体用の物質として十分に適するものと考えら れる。粒子直径が１００μm〜３０００μmの範囲内である微小担体は本発明の目 的に非常に効果的であると考えられる。 微小担体は平滑な表面または多孔構造を有してよい。本発明の好ましい態様では 、細胞バイオマスはアフリカミドリザル腎細胞系、好ましくはＶＥＲＯ細胞系か ら誘導される。 本発明の細胞バイオマスはヒト供給源、またはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ま たはニワトリ（卵）のような動物供給源由来の蛋白を含まない、安価な合成培地 を使用することによって得られる。本発明に使用する培地は、安全基準に関して 高品質であることが保証される。さらに、本発明は微小担体１ｇあたりの細胞密 度の増加をもたらす。本発明は生物学的生成物の生産効率の増大をもたらす。さ らに、微小担体量を減らすことが該生産過程において必要である。 さらなる局面において、本発明の細胞バイオマスは種々のウイルス、およびあ る好ましい態様ではインフルエンザウイルスのすべてのタイプおよび株の効率的 なウイルス生産と高収量の生産をもたらす。本発明は、同じウイルスが感染した 血清含有細胞培養と同様またははるかに高い収量をもたらす細胞バイオマスでの 細胞増殖をもたらす。驚くべきことに、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣのよう な先行技術文献の細胞培養中で増殖しなかったウイルスが、本発明の細胞バイオ マスでは効率的なウイルスの複製と増殖を示す。さらに、血清由来細胞培養で増 殖しなかったウイルス、特にインフルエンザウイルスは、本発明の細胞バイオマ スでは増殖する。通常の細胞培養では増殖しなかったウイルスでは本発明の細胞 バイオマスを用いると効率的なウイルス生産が行われたことは予期しがたいこと であった。 本発明の細胞バイオマスは細胞培養の大規模生産用の安価で操作しやすい系を 提供する。さらに、本系は、血清含有条件下で細胞生産が保証できない場合でも 、いつでも細胞系に対して同じ増殖計画を用いることができる。得られるバイオ マスは少なくとも５００Ｌの大規模発酵系に使用可能である。該バイオマスの柔 軟性によりこのシステムはウイルス、ウイルス抗原、または組換え生成物の生産 に適用することができる。 さらに、本系を、ワクチンや医薬生成物のような生物学的生成物の生産に使用 する場合、培地由来の夾雑物を除去するための精製工程を減らすかまたは除外す ることができる。血清成分が細胞培養中で産生された蛋白、ウイルス、またはウ イルス抗原に吸着されることは当該分野でよく知られている。蛋白成分を含まな い培地を用いて細胞バイオマスを製造することにより、時間のかかる精製工程を 避けることができる。さらに、ＢＳＥ、ウシ下痢ウイルス、またはブルータング ウイルスのような考えられる夾雑物質を不活化するために行う処理は時として非 常にきびしく、したがって、得られる生成物の生物活性に望ましくない影響を与 える。本発明の細胞バイオマスは、培養液由来の夾雑物質を欠く生物学的生成物 を生産することができる。 本発明の細胞バイオマスを使用して得られる生物学的生成物はより精製し易く 、培養液または培養液添加物由来の潜在的病原物質に関してより安全である。 本発明の細胞バイオマスは安全な生物製剤を生産するための安全で品質の保証 された細胞培養系を提供する基準を満たすための最も経済的な方法を示す。 本発明は、最初の脊椎動物細胞系または一次細胞培養を提供し、細胞系または 培養を無蛋白培地中で培養することによりマスター細胞バンクを作製する工程を 含む細胞バイオマスの製造法も提供する。最初の細胞系はヒトに適用するのに使 用する生物製剤を製造するのに許容される細胞系を提供するAmerican Type Cult ure Collection（「ATCC」）、ＷＨＯ、またはあらゆる研究所から得ることがで きる。最初の細胞系は生物学的生成物を大規模に生産するためにＷＨＯが示した すべての基準を満たす新しい細胞系であってもよい。最初の細胞系は、さらに無 蛋白培地に適応させる必要なしに無蛋白培地中で培養される。二次培養法は、プ ロナーゼ、サーモリシン、またはサブチリシンＡのような原核生物供給源由来の プロテアーゼを用いる他は、通常の血清含有条件で用いられる方法と同様の方法 で行うことができる。したがって、本発明の細胞バイオマスはトリプシンのよう な真核生物のプロテアーゼを使用することによる危険性に関して安全である。 あるウイルスは増殖するために活性化工程を必要とする。このウイルスにはイ ンフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣのようなオルソミクソウイルス科ファミ リーのウイルス、パラインフルエンザウイルス１、２、３、および４型やニュー カッスル病ウイルスのようなパラミクソウイルス科ファミリーのウイルス、また はレオウイルス科ファミリーのウイルス、例えばロタウイルスＡ、Ｂ、およびＣ 型が含まれる。これらウイルスの活性化には蛋白分解開裂反応が含まれる。 インフルエンザウイルスの増殖にあたっては、真核細胞供給源由来のプロテア ーゼの代わりに、プロナーゼ、サーモリシン、またはサブチリシンＡのような原 核生物供給源由来のプロテアーゼを用いて活性化を行うことが好ましい。該方法 には、無蛋白培地中でさらに増殖させることによりマスター細胞バンクから実施 細胞バンクを製造する工程も含まれ得る。 本発明には、先に詳述した細胞バイオマスを提供し、細胞バイオマスにウイル スを感染させ、ウイルスを感染させた該バイオマスを無蛋白条件下でインキュベ ーションする工程も含まれ得る。好ましくは、細胞バイオマスは無蛋白培地中で 数代にわたって増殖させた細胞から誘導される。該バイオマスの適切な脊椎動物 細胞は、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ−２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＭＲＣ −５、およびＷＩ−３８からなる群から選ばれる細胞を含む固定依存性細胞、好 ましくはアフリカミドリザル腎細胞系由来の、最も好ましくはＶＥＲＯ細胞系由 来の該細胞が含まれる。無蛋白培地を用いる以外は標準的条件下で、細胞バイオ マスをウイルスと感染させ、該ウイルスを感染させた細胞バイオマスを培養する 。細胞の増殖、感染、およびウイルスの生産を定期的にモニターする。モニター は自動または他の方法で行うことができ、モニターした結果を用いて該産生方法 を調節することができる。 細胞バイオマスをウイルスで感染およびインキュベーションすることにより、 ウイルス含有上清および／またはウイルスおよびウイルス抗原を含む細胞バイオ マス細胞培養を含む細胞培養を得る。使用するウイルスの性状に応じて、産生さ れるウイルス粒子は細胞培養上清中にみいだされ、そして／または細胞バイオマ スと結合している。 溶解性ウイルスの例にはインフルエンザウイルスおよびワクシニアウイルスが 含まれ、非溶解性ウイルスの例にはＴＢＥＶが含まれる。 感染および増殖時において、細胞によって産生されたすべてのウイルス粒子が 上清に放出されるわけではない。これら粒子はむしろ、まだ細胞バイオマスの細 胞と結合している。したがって、細胞培養は上清中にウイルス粒子と、細胞バイ オマスと結合した完全なウイルス粒子およびウイルス蛋白を含む。ウイルス収量 を増大させるために、上清からのウイルス粒子を回収し、細胞バイオマスと結合 したウイルスおよび／またはウイルス抗原を分離する。細胞バイオマスの細胞中 にみいだされるウイルスは溶解により細胞から放出される。細胞は、細胞を界面 活性剤、加熱処理、超音波処理、フレンチプレス、または他の細胞溶解法を用い て処理するような通常の方法によって溶解させることができる。細胞から放出さ れたウイルスは回収され、濃縮され、精製される。 まだ細胞バイオマスまたは細胞断片と結合しているウイルス抗原は、当該分野 で知られた化学的または機械的方法によって細胞または細胞断片から抽出するこ とができる。これらの方法には、細胞または細胞断片、特に膜からウイルス抗原 を放出させるのに適切な界面活性剤による処理、または超音波処理が含まれる。 次に、細胞バイオマスから分離された、ウイルスを含むウイルス抗原は、さらに ショ糖勾配による分配、クロマトグラフィーカラムへの吸着、洗浄、および精製 ウイルスまたはウイルス抗原の溶出を含む精製工程にかけることができる。使用 するクロマトグラフィーカラムはイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ ークロマトグラフィー、またはサイズ濾過クロマトグラフィーから選ばれる。 さらに、本発明には細胞バイオマスからウイルスを分離し、上清からウイルス を回収し、ウイルスを精製し、次いでこのウイルスを用いてワクチンを製造する 工程も含まれ得る。本発明には細胞バイオマスの細胞から細胞内ウイルスを放出 させ、ウイルスを分離精製し、このウイルスからワクチンを製造する工程も含ま れ得る。さらに、本発明には、細胞バイオマスの細胞または細胞断片と結合した ウイルス抗原を抽出し、細胞バイオマスからウイルス抗原を分離し、ウイルス抗 原を分離し、該抗原を精製し、この抗原でワクチンを製造する工程が含まれ得る 。 本発明の方法は、細胞バイオマス、およびすべての工程が種々のウイルスと細 胞バイオマスとの接近性が増大した無蛋白条件下ですべての工程が行われる生成 物の生産方法、および該細胞バイオマスからウイルスおよびウイルス抗原を得る ための改良された方法を組み合わせることができる。本方法によれば、この細胞 バイオマスと生産方法を用いて最大ウイルスおよびウイルス抗原収量が得られる 。 本発明の好ましい態様では、該細胞バイオマスはＶＥＲＯ、ＣＶ−１、または ＬＬＣ−ＭＫ２細胞から得られ、該ウイルスはインフルエンザウイルス、ＴＢＥ Ｖ、ＨＳＶ、ＨＡＶ、ＣＭＶ、またはワクシニアウイルスである。 本発明に使用することができるウイルスの例としては、オルソミクソウイルス 科、パラミクソウイルス科、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、フラビウイ ルス科、アレナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、および アデノウイルス科のウイルスファミリーからなる群のウイルス、好ましくはポリ オウイルス、ＨＡＶ、ＴＢＥＶ、黄熱ウイルス、風疹ウイルス、ＨＣＶ、ムンプ スウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウ イルス、フニンウイルス、レオウイルス３型、アデノウイルス１〜４７型、ＨＳ Ｖ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ロタウイルス、およびワクシニアウ イルスが挙げられる。 転写および翻訳エレメントの制御下で発現される外来核酸を含む組換えウイル スベクターも本発明に従って増殖させることができる。ウイルスベクターはアデ ノウイルスベクター、またはポックスウイルスベクター、好ましくはワクシニア ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクター中に挿入される外来核酸はウイ ルス蛋白、好ましくは抗原、細菌蛋白、および血液因子のような組換え蛋白をコ ードし得る。好ましいウイルス抗原はｇｐ１６０またはｇｐ１２０のようなＨＩ Ｖのウイルス蛋白、ＨＢｓＡｇ、ｐｒｅＳ２、またはｐｒｅＳ１のようなＨＢＶ のウイルス蛋白、ＨＣＶのウイルス蛋白、パルボウイルスのウイルス蛋白、ＨＡ Ｖのウイルス蛋白、ｐｒＭ／ＭまたはＥのようなＴＢＥＶのウイルス蛋白、ＨＡ またはＮＡのようなインフルエンザウイルスのウイルス蛋白である。好ましい細 菌抗原はBorrelia、Pseudomonas、およびHaemophilus influenzaeから選ばれる 細菌抗原である。好ましい血液因子には第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、 第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロテインＣ、プロ テインＳ、フォン・ウィルブランド因子、およびアンチトロンビンＩＩＩが含ま れる。 本発明の好ましい態様において、細胞バイオマスはＶＥＲＯ、ＣＶ−１、また はＬＬＣ−ＭＫ２細胞から得られ、ウイルスはインフルエンザウイルスである。 無蛋白条件下で数代にわたって増殖した細胞から得られる細胞バイオマスを使用 することは先行技術文献には開示されていなかった。本発明を用いることにより 、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、またはＬＬＣ−ＭＫ２のような細胞系におけるインフル エンザウイルスのすべての株を生産することが可能となった。驚くべきことに、 インフルエンザ株は本発明の細胞バイオマスで増殖するが、通常の血清含有細胞 培養ではほどんどまたは全く増殖しないことがわかった。 上記のごとく、インフルエンザウイルスの感染性はしばしば活性化工程に依存 する。インフルエンザウイルスの活性化は、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ） を開裂させる細胞プロテアーゼ活性により生じる。多くのインフルエンザ株が本 発明の細胞バイオマスで増殖するが、通常の細胞培養では増殖しないことがわか ったので、本発明の細胞バイオマスは、インフルエンザウイルスの感染性を増大 させるが、通常の細胞培養では利用できない活性プロテアーゼを提供する。プロ テアーゼのような活性化物質は、本発明の細胞バイオマスと共に用いることがで きる。活性化は、サブチリシンＡ、プロナーゼ、またはサーモリシンのような原 核生物供給源由来の外来プロテアーゼ、または組換え技術によって産生されるプ ロテアーゼを加えることにより達成することができる。 さらに、本発明は、培養細胞が通常耐える濃度よりはるかに高い濃度でプロテ アーゼを使用することによりＨＡ活性化レベルをさらに増大させるために提供さ れる。この感染性の増大は「増強ループ(loop)」を用いることによって達成され 、それにより本発明に従って培養および感染した細胞を含む細胞発酵器からのウ イルス含有培地、細胞、またはその両方の部分は、サブチリシンＡまたはプロナ ーゼのような１またはそれ以上のプロテアーゼを含む容器またはカラムに定期的 または連続的に取り出される。一定のインキュベーション時間後、取り出した培 地、細胞、またはその両方をプロテアーゼ活性を阻害する物質を含む容器に移し 、次いで該培地を細胞含有発酵器に戻す。本発明の局面において、増強ループは 、特定の蛋白またはウイルスの産生を増加させるような細胞増殖パラメーター または結果の最適化にも適用できる。 本発明の別の局面では、培養液由来の夾雑化合物を含まないウイルスが提供さ れる。 本発明の別の好ましい態様では、培養液由来の夾雑化合物を含まないウイルス 抗原が提供される。これらの夾雑化合物にはヒト供給源、またはブタ、ウシ、ヒ ツジ、ヤギ、またはニワトリ（卵）のような動物供給源由来のもの、または病原 性物質である蛋白が含まれる。 ウイルスの生産に使用される細胞バイオマスは無蛋白条件下で増殖し、原核生 物供給源由来のプロテアーゼと共に継代および二次培養される細胞から得られる 。感染およびウイルス生産過程では、該バイオマス生産過程で用いる以外の添加 物を使用しない。これにより本方法は、生産過程から得られる生物学的生成物が ヒト供給源、またはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはニワトリ（卵）のような 動物供給源由来のあらゆる夾雑化合物、または病原性物質である蛋白を含まない ことを保証する。 本発明の別の局面では、ヒト供給源、またはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、また はニワトリ（卵）のような動物供給源由来のあらゆる夾雑化合物を含まないウイ ルスまたはウイルス抗原を含むウイルスワクチンを提供する。このウイルスは減 毒ウイルスであり得るかまたは不活化されてよい。ウイルス抗原はウイルス感染 を治療および予防するためのワクチンを製造するのに使用される。ワクチン製造 用の好ましいウイルス抗原はＴＢＥＶ、ＨＡＶ、ＨＳＶ、またはインフルエンザ ウイルス由来のウイルス抗原である。 本発明は、最終的に増殖した変異体を調節することも可能である。例えば、ニ ワトリ有胚卵中で普通に生産されるインフルエンザワクチンウイルスは感染患者 由来の最初のウイルスを完全には複製しない。卵でのウイルスの生産ではウイル ス増殖時の多様な突然変異が蓄積されるだけでなく、哺乳動物ポピュレーション では決して生じないかも知れない卵特異的変異体も選択される。これがいくつか のインフルエンザウイルスワクチンの効果が乏しい主な理由の１つである。 本発明は、インフルエンザウイルス株を感染哺乳動物細胞から直接脊椎動物細 胞培養に移し、ニワトリ有胚卵中で行われる方法の欠点を排除しながらウイルス を高収量で増殖させる効率的な方法を提供する。本発明では、最新のインフルエ ンザ伝染病のウイルス株に対する適切な抗原性を含まない卵特異的変異体が選択 される危険性も排除され、ワクチン製造における卵物質夾雑物に付随する危険性 も排除される。 本発明の方法のある重要な局面は、高収量で生産され得るウイルス株に柔軟性 があることである。特に、本発明はこれまで知られていなかった高収量であらゆ るタイプのインフルエンザウイルスを生産する方法を提供する。本発明は、すで に存在するあらゆるインフルエンザ株、または将来生じるかも知れないインフル エンザ株に有用である。本発明が提供する方法はインフルエンザウイルスの考え られるあらゆる要求に適応可能である。 ある好ましい態様において、本発明が提供する方法には、ウイルス含有培養液 の「治療部分」を培養容器から定期的または連続的に取り出して「増強ループ」 に入れ、次いで該治療部分を培養容器に戻すことが含まれる。増強ループでは、 該治療部分はウイルスの感染性を増大させる１またはそれ以上の物質で暴露され る。用語「物質」は、プロテアーゼの断片、相同体、類似体、突然変異蛋白、疑 似物、およびプロ酵素を含む天然または合成起源のプロテアーゼを表す。通常蛋 白分解開裂により活性化をもたらし得る他の化合物も本発明の範囲に含まれ、し たがって「物質」である。例えば、トリプシンやサブチリシンＡのようなウイル スの活性化を増強する高濃度のプロテアーゼは、治療部分中に導入することがで きる。次いで、プロテアーゼを中和、阻害、または除去し、治療部分を培養容器 に戻すことができる。したがって、培養に対するプロテアーゼの望ましくない効 果を低下または除去しながら、ウイルスに対するプロテアーゼの望ましい効果が 得られる。その結果、本発明の方法は、容易に大規模生産速度を拡大することが できるウイルスの高収量生産をもたらす。今まで、大きな発酵容器で反復洗浄に よりプロテアーゼの除去を行うことは事実上不可能であったため、ウイルスの活 性化にプロテアーゼを使用する方法はウイルスの大規模生産に応用できなかった 。 本発明の局面において、「増強ループ」では、細胞に対するプロテアーゼの毒 性効果を実質的に除去しながら、培養中の細胞が通常耐える濃度よりはるかに高 濃度の蛋白分解酵素を使用し、ウイルスの活性化（例えば、ＨＡの開裂）レベル を増大させることができる。この有利な局面は、細胞発酵容器からウイルス含有 培地の部分を、カラム、チューブ、パイプ、マニホールド、反応フラスコ、また は他のタイプの第２容器のような第２の場所に取り出し、その中で、プロテアー ゼまたはウイルスの活性化を増強する物質と接触させる系を用いることによって 達成される。ウイルスを活性化するのに十分な期間インキュベーションした後、 取り出した部分を、カラム、チューブ、パイプ、マニホールド、反応フラスコ、 または他のタイプの第２容器のような第3の場所に移し、その中で、ウイルスの 活性化を増強する物質またはプロテアーゼの細胞毒性効果を阻害または減弱させ るプロテアーゼインヒビターまたは化合物と接触させる。ウイルスの活性化を増 強する物質またはプロテアーゼの細胞毒性効果を阻害または減弱させるのに十分 な期間インキュベーションした後、取り出した部分を細胞発酵容器に戻す。 本発明には、標準的方法論では活性化することができない新しいウイルス株の 効果的な生産を保証するために、トリプシンまたは他の蛋白分解酵素に対するウ イルス株の感受性を変化させる局面も含まれる。クレームした本発明の特異的な 概念は本発明以前には認識されていなかった。 本発明の増強ループの局面では、さらに、高濃度の外因性酵素を用いて無蛋白 脊椎動物細胞系およびＣＥＣ培養中のウイルス活性化を増強することができる。 具体的には、感染細胞およびウイルスを含む培地をインキュベーションした後、 プロテアーゼまたは他の酵素を、プロテアーゼと結合し得る固定化抗体のような 使用する酵素のインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターによって時々中和 または除去される。本発明のこの局面では、より低濃度のトリプシンを用いる他 の方法に比べて活性化の程度が高く、また本方法ではトリプシンが一定間隔で中 和または除去されるバッチによる生産と単回回収ではなく連続的なウイルスの生 産と回収が行える。最も重要なことは、本発明はインフルエンザおよび他のウイ ルスを高収量で産生するための大規模発酵に容易に拡大することができる方法を 提供する。 インフルエンザウイルスのすべての株を含むすべてのタイプのウイルスを高収 量で製造するために、本発明は脊椎動物細胞で効率的にウイルスを生産する方法 を提供する。主としてインフルエンザウイルスを高収量で生産するために計画さ れた本発明の方法は、プロテアーゼのような、細胞宿主に有害な物質を必要とす るあらゆるウイルスを高収量で生産するのに使用することができる。 活性化工程に必要なウイルスの例には、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およ びＣのようなオルソミクソウイルス科ファミリーのウイルス、パラインフルエン ザウイルス１、２、３、および４型もしくはニューカッスル病ウイルスのような パラミクソウイルス科ファミリーのウイルス、および例えば、ロタウイルスＡ、 Ｂ、およびＣ型のようなレオウイルス科ファミリーのウイルスがある。 ウイルスの生産レベルをさらに増強するために、本発明者らは、所望により、 ウイルス生産細胞培養を１またはそれ以上の物質で処理することにより、インフ ルエンザ血球凝集素を開裂させ、新たに生産されたウイルスを感染性にする方法 を提供する。 本発明のある局面では、プロテアーゼによるインフルエンザ血球凝集素の開裂 は、宿主細胞の一次培養およびウイルスによる宿主細胞の感染と物理的に分けら れる。これにより、先行技術文献に記載されているよりはるかに高いプロテアー ゼ濃度にすることができる。プロテアーゼが一次培養中の培地の一部であった先 行技術文献では、細胞処理または宿主細胞の増殖速度に対する毒性作用を最小に するためにプロテアーゼ濃度を低く保つ必要がある。その結果、血球凝集素の蛋 白分解開裂によるインフルエンザウイルスの活性化は完全でなく、非感染性ウイ ルス粒子が培養中に維持された。この問題に対処するための先行技術文献の方法 としては、ニワトリ有胚卵中でインフルエンザウイルスを増殖させることが含ま れる。しかしながら、この技術には、夾雑物が混入しやすい多くの厳しい作業工 程があるため多くの不都合がある。 本発明では、ウイルスが少なくとも１回複製される時間の間宿主細胞をウイル スと共にインキュベーションした後、１またはそれ以上のプロテアーゼを加える 。 本発明のある局面では、ウイルスのプロテアーゼによる活性化は、プロテアーゼ の細胞毒性作用を排除または最小限にしながら、ウイルスと活性化プロテアーゼ の接触を促すカラム、パイプ、チューブ、コイル、または他の容器であり得る「 活性化容器」を使用することにより、一次培養容器から取り出した場所で生じる 。したがって、新しい創造的な方法は、インフルエンザＨＡ開裂のようなウイル スの活性化レベルをさらに増大させるために、培養細胞が通常耐えうる濃度より はるかに高い濃度でサブチリシンＡのようなプロテアーゼを使用することができ る方法を提供する。 該ループの活性化容器中で、感染細胞、ウイルス、および１またはそれ以上の プロテアーゼを含む培地をインキュベーションした後、プロテアーゼインヒビタ ーなどによってプロテアーゼを不活化または除去する。本発明のある局面では、 この中和工程は一次培養容器と活性化容器の両方とは別の場所で生じる。 プロテアーゼを効率的に不活化した後、活性化ウイルスは、宿主細胞の増殖に 伴うプロテアーゼの望ましくない干渉なしに培養過程に戻すことができる。この 局面により本発明はウイルスの連続的産生および回収のための好都合かつ効率的 な方法を提供する。 本発明の増強ループの局面は、あらゆるタイプのウイルスおよびあらゆるタイ プの細胞生成物の生産に適応可能である。本発明の増強ループ系では細胞増殖お よび合成速度のパラメーターを独立して最適化することができる。したがって、 該増強ループ系は、ウイルスまたは別の細胞生成物、例えば組換え蛋白の効率的 な合成速度を、これが効率的でないと一次培養の細胞過程に毒性または有害であ る活性化工程に必要とするすべての場合に使用可能である。 発酵、活性化、および不活化工程が物理的に分かれているため、そのように分 かれていなければ通常の細胞培養系において細胞が耐えないであろう化学的また は物理的条件下で活性化および不活化工程を行うことができる。その結果、本発 明の活性化工程はより効率的であり生産速度が非常に増加する。通常の細胞培養 系において細胞が耐える条件は、化学的または物理的性質のもの、すなわち、細 胞に有害な濃度が必要とされる物質、およびある長さの時間存在すると細胞に有 害である温度または圧力のような物理的条件である。 本発明により高収量で産生されるインフルエンザウイルスは、多様な起源のも のであってよい。それらは感染哺乳動物、好ましくはヒトの咽頭スワブから直接 分離された野生型インフルエンザウイルスであってよい。例えば、本発明の方法 のある局面では、インフルエンザウイルスのあらゆる株に感染したヒトからの咽 頭スワブを希釈し、本発明によって提供される無蛋白脊椎動物細胞に直接接種す るのに用いる。さらに、本発明により高収量で生産することができるインフルエ ンザウイルスは、無蛋白脊椎動物細胞の接種前に、あらかじめ宿主細胞で継代さ れた野生型インフルエンザウイルスであってよい。継代はニワトリ有胚卵または 脊椎動物培養細胞、例えばＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＬＬＣ−ＭＫ２、も しくはＣＶ−１細胞、初代ニワトリ胚細胞系、または種々の細胞タイプを含む、 例えば脊椎動物胚由来の細胞凝集物中で行ってよい。 さらに、インフルエンザウイルスは、高収量または弱毒有毒表現型のウイルス のような、再集合体インフルエンザウイルスまたはドナーインフルエンザウイル スであってよい。本発明によれば、弱毒有毒ウイルスには、温度感受性または低 温順化インフルエンザウイルス株が含まれる。 本発明のある特定の態様では、無蛋白脊椎動物培養細胞はＶＥＲＯ細胞である 。ＶＥＲＯ細胞はヒト医学に使用されるワクチンを製造するために登録されてい るいくつかの細胞系の１つであり、好都合である。したがって、ヒトを免疫する のに使用するワクチンを製造するのにＶＥＲＯ細胞を使用するにあたってさらに 承認を得る必要はない。しかしながら、本発明以前は、インフルエンザウイルス の生産にＶＥＲＯ細胞を使用する試みは、収量が許容できないほど低いか、また は蛋白含有培地の使用と、多くの継代が必要であった。 本発明のある態様において、ウイルスワクチンを最終的に製造するために増殖 させるウイルスは、再集合体オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザ ウイルスである。再集合は分節(segmented)ウイルス、例えばインフルエンザウ イルスの特異的特徴である。宿主細胞の二重感染、すなわち、宿主細胞に少なく とも２株のインフルエンザウイルスのような分節ウイルスが感染すると、１つの 単一宿主細胞中で２つの感染ウイルス由来の部分（分節）の混合物が生産される 。ウイルスの組立て時には、理論的にこれらの部分のすべての組み合わせが可能 である。 したがって、ウイルス子孫のいくつかは、最初の感染ウイルスの１つと同一で あり、他の子孫は新しい組み合わせ、すなわち「再集合体」である。所望の再集 合体は、望ましくない特性を有するウイルスを抑制または排除することによって 好ましい活性を特異的に選択することができる。抑制または排除は、望ましくな い抗原に対する適切な抗体を用いて達成することができる。 先行技術文献において再集合体を得るための方法が示されている（Kilbourne, E.D.の、Plotkin S.A.およびMortimer,E.A.編、Vaccines,1994中、参照）。簡単 には、ワクチンを製造するためのインフルエンザウイルス株およびドナーインフ ルエンザウイルスを用いて、ニワトリ胚尿膜嚢に同時に感染させる。先行技術文 献に記載の技術を、卵中で数回継代したドナーウイルスに用いる。重要なことは 、先行技術文献では再集合を生じる過程は卵中で生じる。これは卵特異的ウイル ス変異体を選択する上で不都合である。卵特異的ウイルス変異体は、必ずしもヒ トからヒトへとポピュレーション中で伝搬するインフルエンザ変異体の抗原性を すべて示すわけではない。したがって、卵特異的ウイルス変異体を選択した再集 合体ウイルスを用いて開発したワクチンの免疫性の効果は低下するかも知れない 。 先行技術文献に関連する問題は、本発明では避けることが可能である。本発明 のドナーウイルスは、好ましくは外表面抗原性以外の再集合体に対する特性を与 えるウイルスである。ドナー特性は高収量表現型、弱毒有毒表現型、または他の 所望の表現型に関連する特性であってよい。したがって、ドナーウイルスは、ワ クチンが望まれるインフルエンザウイルスの外抗原特性をまねるかまたはそれに 似る再集合体ウイルスの能力と逆行性に干渉することなく再集合体ウイルスに所 望の特性を提供する。 ドナーウイルスの外表面抗原に対して抑制性の抗体を用いて、所望のウイルス の抗原特性がドナーウイルスの所望の特性と結合している再集合体を選択する。 例えば、「高収量ドナーインフルエンザウイルス」は再集合体インフルエンザウ イルスを生産するのに用いるのが好ましいウイルスの１つである。本発明はその ような高収量ドナーインフルエンザウイルスの製造法を提供する。具体的には、 脊椎動物細胞培養は、ウイルスに感染させる前に、細胞培養を少なくとも１世代 、好ましくは少なくとも６細胞世代、より好ましくは少なくとも１２細胞世代、 さらに好ましくは１８細胞世代、さらに好ましくは少なくとも１８細胞世代、さ らに好ましくは少なくとも２４細胞世代無蛋白条件に順化させた、好ましくは哺 乳動物細胞、例えば、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、または ＭＤＢＫ細胞を提供する。この培養に野生型インフルエンザウイルスを感染させ る。 野生型インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスを感染させた哺乳 動物、好ましくはヒトから直接分離してよい。本発明は、例えば、感染哺乳動物 から咽頭スワブを採取して希釈し、脊椎動物細胞の無蛋白培養に直接感染させる 工程を含む方法による、野生型インフルエンザウイルスの直接分離法を提供する 。さらに、野生型インフルエンザウイルスは、本発明に従って無蛋白脊椎動物細 胞培養中で増殖させる前に、ニワトリ有胚卵または哺乳動物培養細胞、例えば、 ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、または種々の細胞タイプを含む細胞凝集物（例え ば脊椎動物胚由来）中で継代されてよい。 次に、野生型ウイルスはその起源に関わらず脊椎動物細胞培養とインキュベー ションされる。細胞は最もよく増殖するインフルエンザウイルス株のために選ぶ ことができる。この最もよく増殖するインフルエンザ株は、当該分野で知られた 方法に従って分離および精製され、さらに本発明の局面により提供される、再集 合体インフルエンザウイルスのすべてのタイプのための親株または「高収量イン フルエンザドナーウイルス」となる。本発明の顕著な局面は、高収量ドナーイン フルエンザウイルスが脊椎動物培養細胞中で高収量で増幅させるためによく順化 していることである。本発明の特定の態様において、高収量ドナーインフルエン ザウイルスはＶＥＲＯ細胞中で高収量増幅されるために完全に順化している。 例えば、ある詳細な態様において、本発明は脊椎動物細胞に完全に順化し、卵 物質と接触したことがない高収量ドナーインフルエンザウイルスを提供する。例 えば、実施例１１に示すように、ある高収量ドナーインフルエンザウイルス株は A/Orth/17/95(H1N1)である。A/Orth/17/95(H1N1)は、無蛋白培地中でＶＥＲＯ細 胞上で、１９９４／１９９５シーズンのインフルエンザウイルス株に感染したヒ ト患者の咽頭スワブから直接継代された。A/Orth/17/95(H1N1)は、ＶＥＲＯ宿主 細胞に完全に順化しており、ＶＥＲＯ細胞中で高収量のウイルスおよびウイルス 抗原が得られる。重要なことはA/Orth/17/95(H1N1)株はニワトリ卵物質と決して 接触したことがない（すなわち、この株は卵物質を１００％持っていない）。さ らに本発明の株の利点は、該株が哺乳動物細胞系中で高収量増幅するために選ば れたものであり、卵特異的もしくは卵胚特異的適応性のために選ばれたものでは ないという事実である。 高収量ドナーインフルエンザウイルスの外表面抗原と結合する抗体を生じさせ るために、さらに本発明は高収量ドナーインフルエンザウイルスの外表面抗原を 分離し、この分離した抗原を哺乳動物細胞に投与することを含む方法を提供する 。インフルエンザウイルスの外表面抗原の分離には、ブロメリンによるウイルス エンベロープからの該抗原の開裂が用いられる。本発明によれば、該外表面抗原 は高収量ドナーインフルエンザウイルスの糖蛋白血球凝集素およびノイラミニダ ーゼである。 さらに、本発明は高収量ドナーインフルエンザウイルスの外表面糖蛋白と結合 する抗体を提供する。ある特定の態様において、この抗体は高収量ドナーインフ ルエンザウイルスA/Orth/17/95(H1N1)の外表面糖蛋白、血球凝集素、およびノイ ラミニダーゼと結合する。本発明のある態様は、再集合体オルソミクソウイルス 、好ましくはインフルエンザウイルスを生産することである。 本発明による再集合体のある製造法は以下の通りである。最初に、ウイルスに 感染させる前に、少なくとも１世代、好ましくは少なくとも６細胞世代、より好 ましくは少なくとも１２細胞世代、さらに好ましくは１８細胞世代、さらに好ま しくは少なくとも１８細胞世代、さらに好ましくは少なくとも２４細胞世代無蛋 白条件に順化させた、脊椎動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えば、ＶＥＲ Ｏ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、またはＭＤＢＫ細胞培養が提供され る。この培養は２つの異なるインフルエンザウイルス株、インフルエンザウイル ス株（Ｉ）および（ＩＩ）で共感染される。 説明すると、インフルエンザウイルス株（ＩＩ）はワクチン製造用に選定され たインフルエンザウイルス株である。ウイルス株(ＩＩ)の外表面糖蛋白はワクチ ン中に含まれることが望ましい抗原である。典型的にはインフルエンザウイルス 株(ＩＩ)はシーズン毎に変化してよい。ＷＨＯは、インフルエンザ株は各シーズ ン用のワクチンを生産するために選定することと決定している。選定されたワク チンは現在インフルエンザ伝染病を引き起こしているウイルスの外表面抗原を有 していなければならないため、このウイルスはワクチン製造業者が自由に選ぶこ とはできない。 典型的には、野生型インフルエンザウイルス株は高収量での製造に抵抗する。 製造業者は生ウイルスワクチンとして使用するために弱毒有毒ウイルスを使用す ることを好むことが多い。したがって、代わりとして、高収量に加えてまたは弱 毒有毒性を有するドナーインフルエンザウイルスを用いて再集合体ウイルスを作 製することができる。 したがって、本発明は、ワクチンを開発すべきウイルスの所望の抗原性を保持 しながら、高収量を得ることができ、そして／または弱毒有毒性を有するウイル スを得るための方法を提供する。本発明の方法は、卵またはニワトリ胚中での生 成物では生じる望ましくない抗原性および夾雑物を有しない再集合体ウイルスを もたらす。 本発明では、インフルエンザウイルス再集合体を製造するために脊椎動物細胞 無蛋白培養が提供される。この細胞培養の、インフルエンザウイルス株（Ｉ）お よび（ＩＩ）による共感染後に、この培養をインキュベーションし、２種類の異 なるインフルエンザウイルス株のそれぞれおよびこれらウイルスのすべてのタイ プの再集合体を増殖させる。次に、所望の再集合体インフルエンザウイルス株を 選択する。所望の再集合体インフルエンザウイルス株を選択するために、選択用 の特異抗体を使用する（Kilbourne EDの、Plotkin SAおよびMortimer EA編、Vac cines(1994)中、参照）。 選択用特異抗体はドナーウイルスの外表面糖蛋白、典型的には血球凝集素およ びノイラミニダーゼに対するものである。選択用特異抗体は数増殖周期にわたり 培地中に加えられる。最初のドナーウイルスの同じ子孫または該ドナーウイルス の血球凝集素および／またはノイラミニダーゼを保持する再集合体上の外表面糖 蛋白であるドナーウイルスの外表面糖蛋白と結合することにより、これら抗体は 所望しないウイルス株の増幅を抑制する。したがって、ワクチン製造用に選定さ れたインフルエンザウイルスの外表面抗原を保有するウイルスのみを増殖させる ことができる。 抑制抗体を含む幾度かの増殖周期において、所望の再集合体は強く豊富化され 、分離することができる。次に、分離された再集合体は本発明に従って増殖させ ることができ、この再集合体からワクチンが製造されよう。 本発明のある態様において、再集合体インフルエンザウイルスを生産するのに 用いられるインフルエンザウイルス株（Ｉ）は高収量ドナーインフルエンザウイ ルスである。そのような高収量ドナーおよび高収量ドナーインフルエンザウイル スそれ自身の製造法は本発明によって提供される。再集合体の高収量表現型は複 数の継代によって選ばれる。選ばれた再集合体はウイルス株（ＩＩ）によって提 供される外表面糖蛋白をコードしている遺伝子部分、およびウイルス株（Ｉ）の 高収量表現型に関与するすべての遺伝子部分を保持している。選択的圧下にない 部分は２つのウイルス株のいずれに由来するものであってもよい。 ある態様において、再集合体インフルエンザウイルスを生産するのに使用する インフルエンザウイルス（Ｉ）は、弱毒有毒インフルエンザウイルスである。弱 毒有毒インフルエンザウイルスの生産は、当該分野で知られている。ワクチン製 造用に選定されたインフルエンザウイルス株の外表面抗原を有する再集合体ウイ ルスを製造するには、「弱毒マスター株」が望ましい。弱毒マスター株は、試験 によりヒトにおいて弱毒化されていることが示されており、外表面糖蛋白をコー ドしている遺伝子部分以外の遺伝子部分を与えることにより再集合体にこの弱毒 特性を移すことができる株である。インフルエンザウイルス株（Ｉ）として使用 可能な弱毒マスター株は好ましくは低温順化または温度感受性ウイルス突然変異 体である。 選択された再集合体はウイルス株（ＩＩ）によって提供される外表面糖蛋白を コードしている遺伝子部分、およびウイルス株（Ｉ）の弱毒表現型の決定基に含 まれる遺伝子部分を保持している。これらの特徴のいずれにも関連していない部 分はウイルス株（Ｉ）またはウイルス株（ＩＩ）から誘導することができる。 ワクチン製造用に選定されたインフルエンザウイルス株の外表面抗原を保持し ている再集合体インフルエンザウイルス、およびドナーインフルエンザウイルス の弱毒表現型は、生インフルエンザウイルスワクチン、すなわち、ヒトまたは他 の哺乳動物に投与する前に不活化する必要がないワクチンウイルスを製造するの に用いることができる。 本発明はワクチン製造用に選定されたインフルエンザウイルスの外表面抗原を 保持し、適切なドナーウイルス株から誘導された高収量または弱毒表現型を有す る再集合体インフルエンザウイルスを提供する。すべての再集合体ウイルスは本 発明の方法によって増殖させることができる。 本発明の再集合体ウイルスの特定の態様において、該ウイルスはワクチン製造 用に選定されたウイルスの血球凝集素およびノイラミニダーゼ、および高収量ド ナーウイルスの高収量表現型を保持するインフルエンザウイルスである。例えば 、本発明のこの局面の特定の態様は、高収量ドナーウイルスがA/Orth/17/95(H1N 1)である場合に達成される。 本発明の別の態様では、再集合体ウイルスはワクチン製造用に選定されたウイ ルスの血球凝集素およびノイラミニダーゼ、および弱毒マスターウイルス株の弱 毒表現型を有するインフルエンザウイルスである。この局面のより特定の態様に おいて、弱毒マスターウイルス株は温度感受性突然変異体インフルエンザウイル ス株である。本局面のさらに別の特定の態様において、弱毒マスターウイルス株 は低温順化インフルエンザウイルス株である。本局面の再集合体インフルエンザ ウイルスを用いて生ウイルスワクチンを製造することができる。 別の好ましい態様において、感染ヒトまたは他の哺乳動物から直接誘導された ウイルスは、本発明の脊椎動物細胞培養、すなわち、あらかじめ無蛋白増殖条件 に適応している培養中で増殖する。さらなる特定の態様において、感染哺乳動物 、好ましくはヒトから直接誘導されるウイルスは感染哺乳動物から直接得られ、 本発明の脊椎動物細胞培養、すなわち、無蛋白増殖条件にあらかじめ順化させた 培養と接触させられる。 インフルエンザタイプウイルスが最近感染した哺乳動物から得られる場合は、 そのようなウイルスは現在の伝染病を引き起こしているものと思われ、したがっ て、ワクチン製造用に選定されるウイルス株であろう。 インフルエンザウイルスのニワトリ卵選択サブポピュレーションは哺乳動物細 胞培養中で増殖した同じ供給源由来のウイルスとは抗原的に異なることが記載さ れている（Schildらの、１９８３、Nature 303:706-709）。哺乳動物細胞培養を 用い、本発明に記載の方法に従って最近感染した哺乳動物由来のインフルエンザ ウイルス株の生産により、感染哺乳動物から直接得られるインフルエンザウイル スと同一または非常に同様な抗原特性を示す均一なインフルエンザウイルス子孫 が得られる。したがって、本発明は、多数の継代後でも、依然としてウイルスの 最初の抗原特性を保持しながら、宿主細胞変異体の選択を排除する方法を提供す る。 製造過程において、対象ウイルスを特定の宿主細胞に順化させることが望まし いかも知れない。順化したウイルスの血球凝集素（ＨＡ）の開裂能を変えること により順化を達成することができる。特定ウイルス株のＨＡの開裂能の変更は、 既知の部位指向性突然変異誘発およびＰＣＲ技術によって生じることができる。 本発明でこれらの技術を用いることにより、実質的にあらゆるインフルエンザウ イルス株を、酵素活性に感受性であるように修飾することができる。これは血球 凝集素の天然の免疫プロフィールを維持しながら行うことができる。したがって 、本発明の方法論により、すべてのタイプのインフルエンザウイルスを高力価で 大規模生産することができる。 本発明のある局面において、インフルエンザウイルスを修飾し、血球凝集素中 に、修飾された、好ましくはより効率的な開裂部位を作製する。そのような調節 された開裂部位は好ましくはＫＫＲＫＫＲなど、すなわち、塩基性アミノ酸であ るリジン、リジン、アルギニン、リジン、リジン、アルギニンである。調節され た開裂部位は、あらゆるタイプのインフルエンザウイルスの天然に生じる血球凝 集素開裂部位を置換するために本発明にしたがって計画される。好ましい（すな わち「マスター」）開裂部位ＫＫＲＫＫＲは、Veyらの、Virology,188:408-13(1 992)に記載のごとくプロテアーゼを認識するためのコンセンサス配列、Ｒ−Ｘ− Ｋ／Ｒ−Ｒにしたがって計画される。 したがって、本発明には、他の方法論では活性化させることができない株が生 じる場合は、トリプシンのようなプロテアーゼに対するウイルス株の感受性を変 化させるという有利な局面が含まれる。インフルエンザの場合は、相違を示す開 裂能を決定するＨＡのいくつかの構造的特性があるが、その鍵となる因子は開裂 部位のアミノ酸配列である。開裂に対する血球凝集素の感受性はこの分子の固定 された特性ではない。本発明は、血球凝集素を有利に変化させ、利用可能なプロ テアーゼによる開裂に対するその感受性を保証する。 具体的には、血球凝集素を変化させ、新規宿主細胞に対象ウイルスを順化させ ることができる。新規宿主細胞タイプ中で順化したウイルスの血球凝集素の開裂 能は、開裂部位に密接した単一のアミノ酸置換によって得ることができる場合が ある。したがって、特定ウイルス株のＨＡの開裂能の変化は既知の部位指向性突 然変異誘発およびＰＣＲ技術によって生じることができる。本発明においてこれ らの技術を使用することによって、実質的にあらゆるインフルエンザウイルス株 を酵素活性に感受性であるように修飾することができる。これは血球凝集素の天 然の免疫プロフィールを維持しながら行うことができる。したがって、本発明の 方法論により、すべてのタイプのインフルエンザウイルスを高力価で大規模生産 することができる。 本発明までは、ウイルス株自身が効率的な開裂部位を供給した場合にのみイン フルエンザウイルスを高収量で増殖させることが可能であった。本発明によって 提供されるような血球凝集素開裂部位の修飾により、あらゆるタイプのインフル エンザウイルスを脊椎動物細胞培養中で高収量で増殖させることができる。この 結果、ある時間に得られるポピュレーション中に存在するすべてのインフルエン ザ株に有効なワクチンを製造することができる。 本発明のある局面によれば、インフルエンザウイルスの高収量生産は、ＨＡ活 性化、すなわちウイルスの活性化のレベルを増加させ、本発明に従って培養し、 感染させた細胞を含む細胞発酵器からのウイルス含有培地をトリプシンのような １またはそれ以上のプロテアーゼを含む容器に連続的に取り出す増強ループ系を 使用することによって達成することができる。ある時間インキュベーションした 後、この培地をプロテアーゼ活性を阻害または除去する物質を含む容器に移し、 次いで最終的に該培地を細胞含有発酵器に戻す。 ある態様において、本発明は非常に有利な特性を特徴とするインフルエンザウ イルスの製造法を提供する。特に、本方法ではインフルエンザウイルスを高収量 で生産することができ、以前の方法よりはるかに高濃度のプロテアーゼを使用す ることができ、その結果、インフルエンザウイルスのすべての株を含むウイルス の効率的な活性化が可能である。さらに、本発明の柔軟性により、その増強ルー プの局面はインフルエンザのあらゆる血清型および他のウイルスに対する生産条 件の容易な適応を可能にする。 さらに、インフルエンザ血球凝集素のような活性化に関与する蛋白の開裂部位 の修飾に関する局面に利点があり、これにより通常の方法では低収量でしか培養 することができないウイルスの収量を実質的に増加させることができる。本発明 の方法のさらなる利点は、それにより得られる、実質的に卵蛋白を含まないイン フルエンザウイルスの生成物に関する。さらに、本発明のインフルエンザウイル ス生産法は、他の細胞培養法に比べてはるかに高いウイルス力価をもたらす。ま た、本発明は、試験したすべてのヒトインフルエンザウイルス株を、有胚卵を使 用する際の不都合なしに有胚卵で得られるのに近いレベルに増殖させることがで きる方法を提供する。最後に、本発明の方法では、ウイルス生産を大規模発酵器 に拡大することにより高生産効率を達成することができる。 本発明の利点を以下の実施例に例示する。実施例は本発明の例示のためのもの であって、本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例および表におい て、B/MassachusettsはB/Massachusetts/71を表し、またB/PanamaはB/Panama/45 /90を、B/YamagataはB/Yamagata/16/88を、BrazilはA/Brazil/11/78(H1N1)を、C aliforniaはA/California/10/78(H1N1)を、Singapore 6はA/Singapore/6/86(H1N 1)を、TaiwanはA/Taiwan/1/86(H1N1)を、Texas 36はA/Texas/36/91(H1N1)を、US SRはA/USSR/90/77(H1N1)を、A2 SingaporeはA/Singapore/1/57(H2N2)を、Beijin gは A/Beijing/353/89(H3N2)を、GuizhoはA/Guizho/54/89を、HonkongはA/Hongk ong/1/68(H3N2)を、Hongkong 5はA/Hongkong/5/83(H3N2)を、Shanghai16はA/Sha nghai/16/98(H3N2)を、TexasはA/Texas/1/77(H3N2)を、VictoriaはA/Victorla/3 /75(H3N2)を表す。 実施例１ 有胚卵およびプロテアーゼ含有または不含スピナー培養によって生産される種々 のインフルエンザ株から得られる血球凝集素価 表１に記載のインフルエンザ株は、ニワトリ有胚卵またはＣＥＣスピナー培養 いずれかの感染に使用された。 ＣＥＣスピナー培養凝集物は、WO91//09937に開示のごとくニワトリ卵から分 離された胚を機械的に破砕することによって産生した。バイオマス培養１００ｍ Ｌを作製するには２個の有胚卵が必要である。ＣＥＣスピナー培養１００ｍＬを 、インフルエンザウイルス含有尿膜液１ｍＬで感染させた。感染後速やかにプロ テアーゼを加えた。 トリプシン（Seromed）またはサブリチシンＡ(Fa．Novo)をそれぞれ２０ｍＵ ／ｍＬおよび３μg/mLの濃度で培地に加えた。ＣＥＣスピナー培養を、毎日培地 容量の半分（５０ｍＬ）を除去しながら３〜４日間インキュベーションした。プ ロテアーゼ含有または不含新鮮培地を終量１００ｍＬとなるように培養に加えた 。４日間インキュベーションし、ウイルス含有培地を毎日回収した後、プールし た細胞培養液をまとめてＨＡ価を測定した。ＨＡ価はHirstの「The Agglutinati on of Red Cells by Allantoic Fluid of Chick Embryos Infected with Influe nza Virus」、Science,94:22-23(1941)、およびBarrettらの、「Viruses」、Met hods of Immunological Analysis中、Massyeff R.F.、Albert W.H.、およびStai nes N.A.編、第２巻、VCH Weinheim，116-132(1993)の記載に従って測定した。 １０〜１１日齢の有胚卵を、ウイルス含有尿膜液２００μＬ／卵で感染させた 。感染卵は、Bernettの、「Influenza Virus Infections of the Chick Embryo by the Amniotic Route」、Austral.J.Exp.Biol.Med.Sci.,18:353-360(1940)の 記載に従って３７℃で２〜3日間インキュベーションした。卵を開け、既述のご とくＨＡ価を測定した。 表１は有胚卵とプロテアーゼ含有または不含スピナー培養によって生産した種 々のインフルエンザ株から得られる血球凝集素価を比較している。データは本発 明に従ったプロテアーゼの添加とＣＥＣスピナー培養の使用によりほとんどの株 の収量が、すべて他の培養法に伴う不都合なしに、有胚卵培養中で増殖したウイ ルス株の収量に近いレベルまで増加することを示している。 実施例２ 有胚卵およびＣＥＣバイオマス培養によって生産された種々のインフルエンザ株 から得られるウイルス収量 有胚卵およびバイオマスＣＥＣスピナー培養に表２および実施例１に記載の種 々のインフルエンザウイルス株を感染させた。 有胚卵は最大７ｍＬの尿膜液を産生し、これを接種７２時間後に回収する。バ イオマス培養１００ｍＬを作製するには２個の有胚卵が必要である。４８および ７２時間後に培養容量の半分を、また９６時間後に全量を回収することにより９ ６時間にわたってウイルス含有培地２００ｍＬを収集する。バイオマス培養から 回収されたウイルス抗原は、接種卵からのそれが最大７ｍＬであったのに対し、 １００ｍＬ／卵であった（容量で１４倍の増加）。この因子を考慮すると、本発 明の方法は有胚卵法に比べて高いウイルス抗原収量をもたらす。これについては 表２に計算値を例示している。 表２は有胚卵によって生産された種々のインフルエンザ株と本発明により生産 されたそれから得られるウイルス収量を比較している。ＨＡ価は既述のごとく卵 １個から得られるバイオマススピナー培養１００ｍＬおよび尿膜液７ｍＬ／卵に ついて計算された。すなわち、表２中のデータは実施例１の結果から計算された プロテアーゼ含有または不含ＣＥＣスピナー培養における卵１個あたりの全ウイ ルス収量を表す。使用したインフルエンザ株に応じて、バイオマススピナー培養 法は有胚卵で得られる収量に比べてウイルス抗原が約２〜１４倍増加する。プロ テアーゼを加えずに感染バイオマススピナー培養をインキュベーションするとB- Panama、Brazil、USSR、およびTexas36について卵で得られるウイルス収量に近 いウイルス収量に達し、この収量はプロテアーゼによって増加させることができ なかった。他のすべてのインフルエンザウイルス株のウイルス収量はプロテアー ゼを加えることにより増加した。すなわち、バイオマス細胞培養の内因性プロテ アーゼ含有量の不足は、ウイルス血球凝集素を活性化するためにプロテアーゼを 外因性に加えることにより克服することができる。 実施例３ ＣＥＣ発酵器培養におけるインフルエンザウイルス生産の大規模化 １００ｍＬスピナー培養を自動化２Ｌ発酵器に大規模化した。２Ｌ発酵器のバ イオマス細胞培養に、３７℃で連続的に培地交換しながら、ＨＡ価６〜８のイン フルエンザウイルス含有尿膜液２ｍＬを接種した。 大規模発酵器培養を用いる本発明の方法では、増強ループ系中でトリプシン活 性化を用い、所望のウイルス含有培地の部分を発酵器からトリプシンまたはあら ゆる他の必要なプロテアーゼを含む容器に連続的に取り出す。濃度それぞれ２０ ｍＵ／ｍＬおよび３０μg/mLのトリプシンまたはサブチリシンＡを含む容器中で 、ウイルスを約１時間にわたり活性化させる。次に、トリプシン活性化ウイルス を含む培地を、残留するトリプシン活性を中和するのに十分な濃度のダイズトリ プシンインヒビター（Sigma）を含む容器に約１時間注ぎ込む。次に、中和され たトリプシンとウイルスを含む培地を、さらに複製サイクルを行うために発酵器 に戻す。発酵器からバイオマス細胞培養液を連続的に取り出し、新鮮培養液を加 えることにより、９６時間の間にウイルス含有培地４〜５Ｌが得られた。本発明 の方法では、通常の方法（高濃度のプロテアーゼは細胞培養およびウイルスと長 期間にわたってインキュベーションするとそれらに有害な作用を示すと思われる ）で可能と思われるよりはるかに高濃度のトリプシンを用いてウイルスを活性化 することができる。 表３はウイルスCalifornia株に応用した、増強ループ系を用いてトリプシンに より活性化し、次いでトリプシンインヒビターを用いることができる方法の利点 を示している。 実施例４ ＭＤＣＫ細胞培養、標準的ＣＥＣ培養、およびＣＥＣバイオマス凝集物における インフルエンザウイルスのＨＡ価の比較 有胚卵、ＣＥＣ発酵器培養、ＣＥＣおよびＭＤＣＫ単層培養に表４に記載のイ ンフルエンザウイルス株を感染させた。有胚卵の感染は実施例１の記載に従い、 実施例３に記載の発酵器培養を用いて実施した。 一次ニワトリ胚細胞はMayrらの、Arch.ges.Virusforsch.,10:72-102(1961)の 記載に従って増殖させ、ＨＡ価が６〜８単位のインフルエンザウイルス含有尿膜 液に感染させた。 ＭＤＣＫ細胞の連続細胞系を単層で増殖させ、ＨＡ価が６〜８単位のインフル エンザウイルス含有尿膜液に感染させた。インキュベーションは最大細胞変性効 果（ｃｐｅ）が発現するまでか、または最大７２時間行い、ＨＡ価を既述のごと く測定した。 これらのデータは、本発明の方法では、ＣＥＣ単層培養または他の細胞培養法 に比べてＣＥＣ発酵器培養において試験したすべてのウイルスで高収量が得られ ることを示している。表４は、トリプシンおよびサブチリシンＡの存在および非 存在下におけるＭＤＣＫ細胞培養、標準的ＣＥＣ培養、およびＣＥＣバイオマス 凝集物中のインフルエンザＡの種々の株およびあるＢ株について得られるＨＡ価 を比較している。ＭＤＣＫ培養においてわずかに高い力価を得ることができるが 、この細胞はヒトワクチン製造用として許可されていない。トリプシンまたはサ ブチリシンによるCalifornia、Singapore 6、Hongkong、Hongkong 5、およびBei jingの活性化は、標準的ＣＥＣ培養、またはＭＤＣＫ培養中で活性化するかまた は活性化せずに得られる力価より高い力価をもたらす。 実施例５ インフルエンザウイルスワクチンで免疫した後の抗体応答 インフルエンザＡ H1N1株 Brazilを既述のごとく有胚卵中で増殖させ、尿膜液 を回収し、プールし、−２０℃で凍結させた。該株を既述のごとくＣＥＣバイオ マス発酵器培養中でも増殖した。組織培養液上清は100,000M.W.カットオフフィ ルターを用いる限外濾過により濃縮し、この物質および有胚細胞由来の尿膜液を ２０％ショ糖クッション上で超遠心にかけて精製した。ウイルスペレットを緩衝 剤に再懸濁し、１５分間のＵ．Ｖ．／プソラレン処理（１０μg/mL 塩酸 ４−ア ミノエチルトリオキサレン、Ｕ．Ｖ．強度２０ｍＷ／ｃｍ²）によって不活化し た。次に、抗原調製物を希釈し、濃度２０μg/mLとし、アジュバントとしてＡｌ （ＯＨ）₃を加えた。 次に、マウス１０匹のグループを用量１０μgの抗原で免疫し、４週間後に同 用量でブースターをかけた。ブースター注射の２週間後、動物を屠殺し、表５に 示すごとく血清ＨＡＩ価およびＥＬＩＳＡ価を測定した。 これらのデータは、標準的卵技術または本発明の方法によって増殖したBrazil 株で免疫することにより生じたＨＡＩおよびＥＬＩＳＡ抗体価と有意差がないこ とを示している。 実施例６ ウシ胎児血清を含む通常の培地およびトリプシン存在または非存在下の無蛋白培 地中のＶＥＲＯ単層培養における種々のインフルエンザ株のＨＡ価の比較 通常のＶＥＲＯ細胞および無蛋白ＶＥＲＯ細胞に表６に記載のインフルエンザ ウイルス株を感染させた。ＶＥＲＯ細胞の連続的細胞系は、５％ウシ胎児血清を 含む通常のＤＭＥＭ培地（ダルベッコイーグル培地）または無蛋白ＤＭＥＭ培地 いずれか中で単層で増殖した。細胞を、ＨＡ価６〜８単位のインフルエンザウイ ルス含有尿膜液に感染させた。最大細胞変性効果が発現するまでか、または最大 ７２時間インキュベーションし、既述のごとくＨＡ価を測定した。感染後培地に トリプシンを添加しないかまたは０．００２％トリプシン（Seromed）を添加し た。表６にまとめたデータは、いくつかのウイルス株では５％ＦＣＳを含む培地 にトリプシンを加えることにより低収量でウイルスが生産される。しかしながら 、重要なことは、トリプシンと共に無蛋白培地を使用することにより試験したす べてのウイルス株は高収量で生産されることである。 実施例７ 有胚卵、無蛋白ＶＥＲＯ単層培養、およびトリプシン存在および非存在下の無蛋 白ＶＥＲＯ発酵器培養中の種々のインフルエンザウイルスについて得られるＨＡ 価の比較 有胚卵、無蛋白ＶＥＲＯ単層培養、および無蛋白ＶＥＲＯ発酵器培養に表７に 記載のインフルエンザウイルス株を感染させた。有胚卵の感染は実施例１の記載 に従い、実施例３に記載の発酵器培養を用いて実施した。無蛋白ＶＥＲＯ細胞の 連続細胞系を単層で増殖させ、ＨＡ価が６〜８単位のインフルエンザウイルス含 有尿膜液に感染させた。インキュベーションは最大細胞変性効果（ｃｐｅ）が発 現するまでか、または最大７２時間行い、ＨＡ価を既述のごとく測定した。 表７にまとめたデータは、無蛋白ＶＥＲＯ細胞中で増殖した種々のウイルス株 は有胚卵中で増殖したウイルス株のＨＡ価に近づくことを示している。 実施例８ 血清存在下または無蛋白条件下で培養したＣＶ−１およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞中 の種々のインフルエンザ株について得られたＨＡ価の比較 表に示すように、ＣＶ−１細胞およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、無蛋白条件下（ ＰＦ）または５％ウシ胎児血清存在下（ＦＣＳ）の蛋白含有条件下で単層として 増殖させた。ＨＡ価６〜８の、ウイルス含有尿膜液に細胞を感染させた。インフ ルエンザウイルス株は表に示した。ＨＡ価に対するトリプシンの影響を証明する ために、すべての実験を、表８に示すようにトリプシン非存在下、または0.002 ％トリプシン存在下で行った。実験は実施例６に記載のごとく行った。 表８にまとめたデータは、両細胞系（ＣＶ−１およびＬＬＣ−ＭＫ）とも、無 蛋白条件下およびトリプシン存在下で最大ＨＡ価が得られることを示している。 実施例９ 血清存在下または無蛋白条件下で培養したＭＤＣＫ細胞中の種々のインフルエン ザ株について得られたＨＡ価の比較 表９に示すように、ＭＤＣＫ細胞を無蛋白条件下（ＰＦ）または５％ウシ胎児 血清存在下（ＦＣＳ）の蛋白含有条件下で単層として増殖させた。ＨＡ価６〜８ のインフルエンザウイルス含有尿膜液に細胞を感染させた。インフルエンザウイ ルス株は表９に示した。ＨＡ価に対するトリプシンの影響を証明するために、す べての実験を、表９に示すようにトリプシン非存在下、または0.002％トリプシ ン存在下で行った。実験は実施例６に記載のごとく行った。 表９にまとめたデータは、ＣＶ−1細胞およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞の場合と同 様に、無蛋白条件下およびトリプシン存在下で最大ＨＡ価が得られることを示し ている。 実施例１０ インフルエンザA/Hongkong/1/68ウイルス株ＨＡ開裂部位の「マスター開裂部位 」ＫＫＲＫＫＲへの変更 インフルエンザA/Hongkong/1/68 を、ニワトリ有胚卵中で増殖させ、抗体精製 し、溶解させ、次いでウイルスＲＮＡを標準的部位指向性突然変異誘発方法論に 従って調製した（Enamiらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3802-3805(1990)。こ のウイルスＲＮＡを逆転写させ、ＨＡの末端非コードおよび保存領域と相補的な プライマーを用いるＰＣＲを行った。この領域の保存により、５’−プライマー （配列１：5'-ATGATGTCTAGAAGCAAAAGCAGGGGATAATTC-3'）および３’−プライマ ー（配列２：5'-ATGATGCTGCAGTTTAGTGAGGGTTAATAGTAGTAACAAGGGTGTTTT-3'）を、 広範囲のインフルエンザウイルス株に使用することができる。さらにクローニン グするために、５’−プライマーはＸｂａＩ制限部位を有し、３’−プライマー はＰｓｔＩ制限部位を有し、さらに３’−プライマーはＴ３−プロモーター配列 を有した。適切な制限酵素（ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ）を用いて制限部位をトリ ミングした後、ＨＡ ｃＤＮＡをｐＵＣ１９(New England BioLabs)の複数のクロ ーニング領域のＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位中にサブクローンし、ｐＵＣ１９− ＨＡベクターを得た。部位指向性突然変異誘発はPaleseら（WO91/03552）の記載 に従って実施した。 インフルエンザA/Hongkong/1/68 のＨＡ開裂部位を「マスター開裂部位」に突 然変異させるために、使用した３’−プライマーの配列は（配列３：5'-ATGATGA GGCCTCTTTTTTTTCTCTTTTTCTCTGGTACATTCCGCA-3'）（ここで、ヌクレオチド配列TC T TTT TTT TCT CTT TTTは、最初の開裂部位のＫＱＴＲと置換する所望のアミノ 酸配列ＫＫＲＫＫＲをコードする配列AAA AAG AGA AAA AAA AGA-3'の逆相補配列 である）であった。このヌクレオチド配列の上流の３’−プライマーは、それを ＨＡ ｃＤＮＡの３’−部分に融合させるＳｔｕＩ制限部位を持っていた。５’ −プライマー（配列１）は上記のクローニングで使用した５’−プライマーと同 じであり、インフルエンザA/Hongkong/1/68、およびＸｂａＩ制限部位を有する その５’−末端にいかなる突然変異も有していなかった。 ＰＣＲ−生成物を分離し、適切な制限酵素（ＸｂａＩおよびＳｔｕＩ）を用い てトリミングした。インフルエンザA/Hongkong/1/68のＨＡ ｃＤＮＡを保持する ｐＵＣ１９−ＨＡベクターも制限酵素ＸｂａＩおよびＳｔｕＩで消化し、ＰＣＲ −生成物に対応するｐＵＣ１９−ＨＡの部分を除去した。この部分の代わりに、 トリミングしたＰＣＲ−生成物をプラスミド中に連結した。ＳｔｕＩ制限部位は インフルエンザA/Hongkong/1/68のＨＡ配列中に天然に生じる。突然変異誘発が うまく行われたことを確認するために、ＰＣＲ−生成物を保持するｐＵＣ１９− ＨＡベクター中に挿入されたＰＣＲ−生成物をＫｓｐ６３２Ｉで消化して直線化 し、Ｔ３−プロモーターから転写し、アミノ酸配列ＫＫＲＫＫＲの変化したＨＡ 開裂部位を有するインフルエンザA/Hongkong/1/68のＨＡ部分を表すネガティブ 鎖ＲＮＡを得た。Luytjesらの、「Amplification，Expression，and Packaging of a Foreign Gene by Influenza Virus」,Cell,59:1107-13(1989)に従ってリボ ヌクレオ蛋白（ＲＮＰ）トランスフェクション系を用い、ＫＫＲＫＫＲ ＨＡ開 裂部位を有するインフルエンザA/Hongkong/1/68をＭＤＣＫ細胞中で増殖した。P aleseらの方法とは反対に、選択は自動的により効率的な開裂部位を好むので、 非選択系が必要であった。さらに、ＨＡ開裂部位以外は２つのタイプのウイルス に違いはなかったため、この２つのウイルス（最初のものおよび突然変異体）は 同じ血清型に属した。修飾インフルエンザウイルス株インフルエンザA/Hongkong /1/68中のマスター開裂部位の存在はApplied Biosystems 373 DNA Sequencerを 用いるヌクレオチド配列決定により確認された。 これらのデータは、標準的卵技術または本発明の方法により増殖したBrazil株 で免疫して生じたＨＡＩおよびＥＬＩＳＡ抗体に有意差はみられなかったことを 示している。 実施例１１ 高収量ドナーインフルエンザウイルス株A/Hongkong/17/95（H1N1）の構築 急性インフルエンザ感染症のすべての症状を示す患者から咽頭スワブを得た。 咽頭スワブをＰＢＳ（ｐＨ７．２）２ｍＬで希釈し、振とうさせて鼻細胞物質を 除去した。種々の量の本溶液を用い、単層で増殖した無蛋白ＶＥＲＯ細胞の連続 細胞系に感染させた。３日後、ウイルスを新たな無蛋白単層ＶＥＲＯ細胞に接種 した。これを３回接種した。次に、１つの単一ウイルス株が豊富化されているこ とがわかった。その高収量表現型を血球凝集素アッセイにより測定し、また、そ の抗原特性を血球凝集素阻害アッセイによって測定した。 このインフルエンザウイルス株はインフルエンザA/Orth/17/95（H1N1）と名付 けられ、ウイルス再集合体の生産に使用される高収量ドナー株となった。この株 は、その高収量表現型を維持しながら研究所で広範に継代されている。 インフルエンザA/Orth/17/95の血球凝集素およびノイラミニダーゼは精製ウイ ルスをブロメリンで処理し、ショ糖勾配沈殿法で精製することにより精製された 。次に、インフルエンザA/Orth/17/95 の２つの糖蛋白に対するモノクローナル 抗体およびヤギポリクローナル抗血清を製造した。 実施例１２ 高収量ドナーウイルスとしてA/Orth/17/95（H1N1）株を用いる高収量再集合体イ ンフルエンザウイルスの構築 無蛋白単層ＶＥＲＯ細胞を、種々に希釈した高収量ドナーウイルスインフルエ ンザ A/Orth/17/95およびＷＨＯが1995/1996シーズンのワクチン製造用に推奨し ているインフルエンザウイルスA/Johannesburg/33/94(H3N2)と共感染させた。最 高のＨＡ価を有する子孫を、インフルエンザA/Orth/17/95の外表面糖蛋白、血球 凝集素、およびノイラミニダーゼに対するポリクローナル抗体で処理した。次に そのウイルス子孫を限られた希釈で継代した。該ポリクローナル抗体存在下の継 代をさらに２回繰り返した。次に、抗体なしに継代を１回行った。この４回目の 継代を分析し、インフルエンザA/Orth/17/95の抗原決定基とは明らかに異なるが 、インフルエンザウイルスA/Johannesburg/33/94（H3N2）の抗原決定基とは同じ である再集合体ウイルスの抗原決定基を決定した。再集合体ウイルスの外表面上 のA/Johannesburg/33/94の血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ） の存在は、この特異的ウイルス株のＨＡおよびＮＡに対するポリクローナル抗血 清を用いる赤血球凝集阻害アッセイにより測定された。 実施例１３ 無蛋白ＶＥＲＯ細胞の生産 ＡＴＣＣ(ＡＴＣＣＣＣＬ８１)から得られるアンプルから部分標本を得、無蛋 白培地に接種した。培地で細胞を４周期増殖させた後、さらに使用するために保 存する、実施用細胞バンクを得た。 ローラーボトルを用いて、実施用細胞バンクから無蛋白ＶＥＲＯ細胞を４周期 後に２．５ｘ１０⁸／ボトルの密度に増殖させた。１６個のそのようなボトルか らの細胞を１２Ｌ発酵器に移した。プロナーゼ（濃度０．１ｍｇ／１０⁸細胞） を用いて継代し、その支持体から細胞を剥離させた。 発酵器培養を３回継代して細胞４ｘ１０¹²個を得た。次にこれらの細胞を各ウ イルスに感染させた。 ウイルスの増殖は以下の実施例に記載されている。ウイルス増殖後、ふるい（ ２００メッシュ）を用いて微小担体を除去し、30,500ｇで遠心して細胞および細 胞断片を除去した。限外濾過（ＮＭＷＩ、２００ｋ）によりウイルスを調製した 。 無蛋白培地中でＶＥＲＯ細胞を培養することにより血清含有培地中でＶＥＲＯ 細胞を培養するより高い細胞密度が得られる。１５０Ｌ発酵器中で無蛋白条件下 で７日間発酵すると細胞２．２ｘ１０⁹個／Ｌが得られるが、２．５％ＦＣＳ含 有培地中での同等の培養では細胞１．８ｘ１０⁹個／Ｌが得られる。ここで得ら れた数字はそれぞれ５回の個々の実験の平均値を示している。 実施例１４ 無蛋白ＶＥＲＯ細胞中のＴＢＥウイルスおよびワクシニアウイルスの生産 無蛋白ＶＥＲＯ細胞または通常のＶＥＲＯ細胞を９００ｃｍ²ローラーボトル 中で増殖させた。無蛋白ＶＥＲＯ細胞は実施例１３に記載の培地中の無蛋白条件 下に保ち、通常のＶＥＲＯ細胞を２．５％ＦＣＳを加えた同じ培地で増殖させた 。細胞密度２．８−３ｘ１０⁸個のＶＥＲＯ細胞に、ＴＢＥウイルス（０．０５ ｐｆｕ／細胞）または種々の組換えワクシニアウイルス株（０．１ＴＣＩＤ５０ ／細胞）を接種した。使用した組換えワクシニアウイルスは、ＨＩＶ ｇｐ１６ ０遺伝子を有するｖｇｐ１６０ＭＮ（ＥＰ５６１０３４）、ヒト第ＩＩ因子ｃＤ ＮＡを有するｖＰＴＩ（ＦＩＩ）（ＥＰ５６１０３４）、ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮ Ａ を有するＦＩＸ＃５（ＥＰ５６１０３４）、およびＴ７−プロモーターの制御下 でＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子を有するＶＰＥ−５(Barrettらの、Aids Res.Human Retr ovir.5:159(1989))であった。 ＴＢＥＶの増殖はＥＬＩＳＡによって測定し、組換えワクシニアウイルスの収 量はＴＣＩＤ５０／ｍＬを測定することにより測定した。表１０に示す結果は、 明らかに、血清含有培地中に増殖した通常のＶＥＲＯ細胞だでなく無蛋白ＶＥＲ Ｏ細胞でもＴＢＥＶおよび組換えワクシニアウイルスが増殖し得ることを示して る。組換えワクシニアウイルスＦＩＸ＃５の場合、無蛋白ＶＥＲＯ細胞における 収量は通常のＶＥＲＯ細胞培養に比べ増加した。 実施例１５ 有胚卵中で種々のインフルエンザウイルス株から得られるＨＡ価と原核生物プロ テアーゼのサブチリシンＡ（３０μg/mL）およびプロナーゼ（０．１ｍｇ／１０⁸ 細胞）を含む無蛋白ＶＥＲＯ細胞中で得られる各力価の比較 無蛋白ＶＥＲＯ細胞を実施例１３に記載のごとく生産した。細胞をＨＡ価６〜 ８のインフルエンザウイルス含有尿膜液で感染させた。最大細胞変性効果が発現 するまでか、または最大７２時間インキュベーションし、既述に従ってＨＡ価を 測定した。表１１にまとめたデータは、原核生物プロテアーゼのサブチリシンＡ またはプロナーゼの存在下で無蛋白ＶＥＲＯ細胞を増殖させることにより得られ るインフルエンザウイルスの収量は有胚卵中で得られる収量に達する。 実施例１６ 無蛋白ＶＥＲＯ細胞および通常のＶＥＲＯ細胞培養を用いて得られるヘルペスシ ンプレッスクウイルス（ＨＳＶ−１）収量の比較 感染前に５％ＦＣＳおよび感染後に１％ＦＣＳを含有する培地中でインキュベ ーションした無蛋白ＶＥＲＯ細胞または通常のＶＥＲＯ細胞を、０．１、０．０ ５、または０．００１ ＴＣＩＤ₅₀/細胞でＨＳＶ−１で感染させた。感染細胞が ９０〜１００％細胞変性効果を示した時に、感染細胞からの培地上清を回収した 。 実施例１７ 増強ループ系中の無蛋白ＶＥＲＯ細胞中におけるロタウイルスの大規模生産 ロタウイルスは幼い子供および動物、特に子ブタにおける重篤な胃腸炎の最も 重要な原因である。より大きな子供および大人における感染および病気も普通に 生じる。ロタウイルスについてはEstes MKおよびKapikian AZおよびChanock RM の、Fieldsら編、VIROLOGY,Vol.2中（Raven Press NY）に総説されている。 ロタウイルスは内および外殻を有するエンベロープを持たないウイルスである 。該カプシッドは少なくとも８つの異なる変異体が存在する血球凝集素様ポリペ プチド（ＶＰ４）を含んでいる。インフルエンザウイルス同様に、ロタウイルス は培養細胞中で増幅するために蛋白分解酵素を必要とする。トリプシンのような 蛋白分解酵素はＶＰ４の開裂によって感染性を増強する。さらに、効率的なウイ ルスの活性化に必要なプロテアーゼ濃度は高く、著しい細胞毒性効果がみられた 。インフルエンザウイルスおよびロタウイルスは頻繁に血清型が変化する点でも 共通している。したがって、最近のウイルス分離株に頻繁に切り換えるのに耐え る強力なウイルス製造系が求められている。このためには本発明が提供するよう な柔軟性のある系が必要である。発酵および活性化工程を物理的に分離すること により、活性化を種々の血清型の要求に具体的に適応させることができる。 ロタウイルスを大規模で生産するために、無蛋白ＶＥＲＯ細胞のバイオマス細 胞培養の２Ｌ発酵器にヒトロタウイルスＣ型０．５ｍＬを接種し、３７℃で連続 的に培地交換しながら増殖させた。活性化において無感染性ウイルスを活性化す るために、所望のウイルスを含む培地の部分を細胞培養容器から濃度５０μg/mL のプロナーゼを含む活性化容器に連続的に取り出した。ここで、約１時間にわた りウイルスを活性化した。次に、プロナーゼで活性化されたウイルスを含む培地 を、残留プロナーゼ活性を中和するのに十分な濃度のダイズトリプシンインヒビ ターを含む容器に約１時間注ぎ込んだ。次に、中和されたプロナーゼとウイルス を含む培地を、別の回の複製を行うために細胞培養容器に戻した。発酵器からバ イオマス細胞培養液を連続的に取り出し、新鮮培養液を加えることにより、３日 間の期間中にウイルス含有培地５Ｌを得た。本発明の方法は、そのような長期間 のインキュベーションを行う際に、高濃度のプロテアーゼが細胞培養に細胞変性 効果を示すことによりウイルス生産に影響を及ぼす通常の方法で可能な濃度より はるかに高濃度のプロナーゼを用いてウイルスを活性化することができる。 本発明の好ましい態様を示す説明、表、および実施例は例示するためのもので あって、本発明を限定することを意図したものではない。本発明の精神および範 囲内の種々の変化および修飾は本明細書の記載から当業者に明らかとなるであろ う。

【手続補正書】 【提出日】１９９７年８月１９日 【補正内容】 請求の範囲 １．（ａ）無蛋白培地中のみで培養したサル腎細胞培養を得、 （ｂ）該培養を、オルソミクソウイルス科からなる群から選ばれるウイルスに感 染させ、 （ｃ）該ウイルスを感染させた該細胞培養をインキュベーションして該ウイルス を増殖させる工程を含むウイルス抗原の製造方法。 ２．該ウイルスが該培養で複数回連続的に継代することなく増殖するものであ る請求項１に記載の方法。 ３．該ウイルスがインフルエンザウイルスＡ、ＢまたはＣである請求項１また は２ に記載の方法。 ４．インフルエンザウイルスが血球凝集素中の開裂部位を修飾するかまたは新 しい開裂部位を生じる様に変化している請求項３に記載の方法。 ５．該サル腎細胞がＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞 からなる群から選ばれるものである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６．該サル腎細胞培養がＶＥＲＯ細胞の細胞バイオマスである請求項５に記載 の方法。 ７．該ウイルスの活性化を増強する物質が細胞または細胞バイオマスの培養に 加えられる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．該ウイルスの活性化を増強する該物質がプロテアーゼである請求項７に記 載の方法。 ９．該プロテアーゼが原核細胞供給源由来である請求項８に記載の方法。 １０．該プロテアーゼがプロナーゼ、サーモリシン、およびサブチリシンＡま たはその機能性誘導体 からなる群から選ばれるものである請求項９に記載の方法 。 １１．該活性化を増強する該物質が容器中にあるかまたは担体上に固定されて いるものである請求項１０に記載の方法。 １２． （ｄ）工程（ｃ）の培養の部分を取り出し、 （ｅ）工程（ｄ）の培養の該部分を該ウイルスの活性化を増強する少なくとも１ つの物質と接触させ、 （ｆ）工程（ｅ）の該部分に、該物質のあらゆる細胞毒性作用を阻害するかまた は減弱させる少なくとも１つの化合物を加え、 （ｇ）工程（ｆ）の該部分を該培養に戻す工程を含む請求項１〜１１のいずれか に記載の方法。 １３．該物質のあらゆる細胞毒性作用を阻害するかまたは減弱させる該化合物 がダイズトリプシンインヒビター、卵トリプシンインヒビター、およびアプロチ ニンからなる群から選ばれるものである請求項１２に記載の方法。 １４．該物質の細胞毒性作用を阻害するかまたは減弱させる化合物が容器中に あるかまたは担体上に固定化されているものである請求項１３に記載の方法。 １５．工程（ａ）−（ｄ）が第１容器中で行われ、工程（ｅ）−（ｆ）が第2 容器中で行われるものである請求項１２に記載の方法。 １６．第１容器および第２容器が、工程（ａ）−（ｇ）を環状で行い得るよう にループに接続されているものである請求項１５に記載の方法。 １７．工程（ａ）−（ｄ）が第1容器中で行われ、工程（ｅ）が第2容器中で行 われ、工程（ｆ）が第３容器中で行われるものである請求項１２に記載の方法。 １８．第１容器、第2容器、および第3容器が工程（ａ）−（ｇ）を環状で行い 得るようにループに接続されでいるものである請求項１７に記載の方法。 １９．工程（ａ）−（ｇ）がバッチで行われるものである請求項１８に記載の 方法。 ２０．さらに、（ｈ）該培養の増殖、感染、および活性化レベルをモニターし 、（ｉ）増殖、感染、および活性化レベルを最大にするように該培養の条件を変 える工程を含む請求項１２に記載の方法。 ２１．さらに（ｊ）該培養から該ウイルスを回収する工程を含む請求項２０に 記載の方法。 ２２．さらに(ｋ)該回収されたウイルスを用いてワクチンを製造する工程を 含む請求項２１に記載の方法。 ２３．請求項１〜２２のいずれかに記載の方法によって生産されるインフルエ ンザウイルス。 ２４．ヒト供給源、またはブタ、ウシ、ヒツジ、およびニワトリ（卵）由来の 蛋白を含む 動物供給源由来の蛋白、または病原性物質である蛋白を含む培養液由 来の夾雑蛋白を含まない培養インフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイ ルス抗原 。 ２５．請求項１〜２２のいずれかに記載の方法によって得られる請求項２４に 記載のインフルエンザウイルス。 ２６．請求項２３〜２５のいずれかに記載のウイルスまたはウイルス抗原およ び医薬的に許容される担体 を含むワクチン。 ２７．ウイルスが弱毒ウイルスである請求項２６に記載のワクチン。 ２８．該ウイルスが不活化されているものである請求項２６に記載のワクチン 。 ２９．ウイルス感染に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンを製造するた めの請求項２３〜２５のいずれかに記載のウイルスまたはウイルス抗原の使用。 ３０．（ａ）無蛋白培地のみで培養したサル腎細胞培養を増殖させ、 （ｂ）該細胞培養をオルソミクソウイルスに感染させ、 （ｃ）該オルソミクソウイルスに感染させた該細胞培養を培養し、 （ｄ）所望の表現型を有するオルソミクソウイルス株を選択し、 （ｅ）工程（ｄ）からドナーオルソミクソウイルスを単離する工程を含む再結合 体ウイルスを作製するためのドナーオルソミクソウイルスの製造方法。 ３１．所望の表現型が高収量表現型または弱毒有毒表現型である請求項３０に 記載のウイルス製造法。 ３２．該ウイルスが弱毒インフルエンザウイルス、低温順化インフルエンザウ イルス、温度感受性インフルエンザウイルス、再結合体インフルエンザウイルス 、高収量ドナーインフルエンザウイルス、感染哺乳動物の咽頭スワブから分離さ れた野生型インフルエンザウイルス、およびニワトリ有胚卵またはインフルエン ザ ウイルス亜株に順化した細胞培養で継代されたウイルスからなる群から選ばれる ものである請求項３０に記載のウイルス製造法。 ３３．該細胞がＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞 か らなる群から選ばれるものである請求項３０に記載の方法。 ３４．該ウイルスがA/Orth/17/95(H1N1)であり、ＶＥＲＯ細胞中で高収量表現 型を有するものである請求項３０に記載の方法によって得られる高収量ドナーイ ンフルエンザウイルス。 ３５．（ａ）無蛋白培地中のみで培養したサル腎細胞培養を、高収量表現型を 有する第1オルソミクソウイルスおよび少なくとも１つの抗原決定基を有する第2 オルソミクソウイルスに共感染させ、 （ｂ）工程（ａ）の該細胞培養をインキュベーションして該ウイルスおよび該ウ イルスの再結合体を増殖させ、 （ｃ）該共感染培養から、該第1オルソミクソウイルスの高収量表現型および該 第2オルソミクソウイルスの少なくとも１つの抗原決定基を含む再結合体ウイル スを選択する工程を含む再結合体オルソミクソウイルスの製造法。 ３６．該オルソミクソウイルス系のウイルスがインフルエンザウイルスである 請求項３５に記載の方法。 ３７．工程（ｃ）が、該第1ウイルスの抗原決定基と結合するが該第2ウイルス の抗原決定基には結合しない抗体を使用するものである請求項３５に記載の方法 。 ３８．該第2オルソミクソウイルスがワクチン製造用に選定されたものである 請求項３５に記載の方法。 ３９．該サル腎細胞培養がＶＥＲＯ細胞のバイオマスである請求項３５に記載 の方法。 ４０．（ａ）無蛋白培地中のみで培養したサル腎細胞培養を、弱毒有毒表現型 を有する第1オルソミクソウイルスおよび少なくとも１つの抗原決定基を有する 第2オルソミクソウイルスに共感染させ、 （ｂ）工程（ａ）の該サル腎細胞培養をインキュベーションして該ウイルスおよ び該ウイルスの再結合体を増殖させ、 （ｃ）該共感染培養から、該第1オルソミクソウイルスの弱毒有毒表現型および 該第2オルソミクソウイルスの少なくとも１つの抗原決定基を含む再結合体ウイ ルスを選択する工程を含む再結合体オルソミクソウイルスの製造法。 ４１．該オルソミクソウイルス系のウイルスがインフルエンザウイルスである 請求項４０に記載の方法。 ４２．工程（ｃ）が、該第1ウイルスの抗原決定基と結合するが該第2ウイルス の抗原決定基には結合しない抗体を使用するものである請求項４０に記載の方法 。 ４３．該第2オルソミクソウイルスがワクチン製造用に選定されたものである 請求項４０に記載の方法。 ４４．該サル腎細胞培養がＶＥＲＯ細胞のバイオマスである請求項４０に記載 の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/00 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ (31)優先権主張番号 ０８／４８３．５２２ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４８７，２２２ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＮＯ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ムント，ヴォルフガング オーストリア、アー−1080ヴィーン、フロ リアニガッセ57／１／２／６番 (72)発明者 ドルナー，フリードリッヒ オーストリア、アー−1230ヴィーン、ペー ターリニガッセ17番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）無蛋白培地中のみで培養した脊椎動物細胞培養を得、 （ｂ）該培養をウイルスに感染させ、 （ｃ）該ウイルスを感染させた該細胞培養をインキュベーションして該ウイルス を増殖させる工程を含むウイルス抗原の製造方法。 ２．該ウイルスが該培養で複数回連続的に継代することなく増殖するものであ る請求項１に記載の方法。 ３．該ウイルスがオルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、レオウイ ルス科、ピコルナウイルス科、フラビウイルス科、アレナウイルス科、ヘルペス ウイルス科、ポックスウイルス科、およびアデノウイルス科からなる群から選ば れるものである請求項２に記載の方法。 ４．該ウイルスがポリオウイルス、ＨＡＶ、ＴＢＥＶ、黄熱ウイルス、風疹ウ イルス、ＨＣＶ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、インフルエ ンザウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、レオウイルス３型、アデノウ イルス１〜４７型、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ロタウイル ス、およびワクシニアウイルスからなる群から選ばれるものである請求項３に記 載の方法。 ５．該ウイルスがインフルエンザウイルスである請求項４に記載の方法。 ６．インフルエンザウイルスが血球凝集素中の開裂部位を修飾するかまたは新 しい開裂部位を生じる様に変化している請求項５に記載の方法。 ７．該細胞がＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＣＫ細 胞、ＭＤＢＫ細胞、ＷＩ−３８細胞、およびＭＲＣ−５細胞からなる群から選ば れるものである請求項１に記載の方法。 ８．該細胞がＶＥＲＯ細胞である請求項７に記載の方法。 ９．ＶＥＲＯ細胞がバイオマスを形成するものである請求項７に記載の方法。 １０．さらに、（ｄ）工程（ｃ）の培養の部分を取り出し、 （ｅ）工程（ｄ）の該部分を該ウイルスの活性化を増強する少なくとも１つの物 質と接触させ、 （ｆ）工程（ｅ）の該部分に、該物質のあらゆる細胞毒性作用を阻害するかまた は減弱させる少なくとも１つの化合物を加え、 （ｇ）工程（ｆ）の該部分を該培養に戻す工程を含む請求項１に記載の方法。 １１．該ウイルスの活性化を増強する該物質がプロテアーゼである請求項１０ に記載の方法。 １２．該ウイルスがインフルエンザであり、該プロテアーゼがインフルエンザ 血球凝集素を開裂させるものである請求項１１に記載の方法。 １３．該プロテアーゼが原核細胞供給源由来である請求項１２に記載の方法。 １４．該プロテアーゼがプロナーゼ、サーモリシン、またはサブチリシンＡか らなる群から選ばれるものである請求項１３に記載の方法。 １５．該活性化を増強する該物質が容器中にあるかまたは担体上に固定されて いるものである請求項１０に記載の方法。 １６．該物質のあらゆる細胞毒性作用を阻害するかまたは減弱させる該化合物 がダイズトリプシンインヒビター、卵トリプシンインヒビター、およびアプロチ ニンからなる群から選ばれるものである請求項１０に記載の方法。 １７．該物質の細胞毒性作用を阻害するかまたは減弱させる化合物が容器中に あるかまたは担体上に固定化されているものである請求項１６に記載の方法。 １８．工程（ａ）−（ｄ）が第１容器中で行われ、工程（ｅ）−（ｆ）が第２ 容器中で行われるものである請求項１０に記載の方法。 １９．第１容器および第２容器が、工程（ａ）−（ｇ）を環状で行い得るよう にループに接続されているものである請求項１８に記載の方法。 ２０．工程（ａ）−（ｄ）が第1容器中で行われ、工程（ｅ）が第2容器中で行 われ、工程（ｆ）が第３容器中で行われるものである請求項１０に記載の方法。 ２１．第１容器、、第2容器、および第3容器が工程（ａ）−（ｇ）を環状で行 い得るようにループに接続されているものである請求項２０に記載の方法。、 ２２．工程（ａ）−（ｇ）がバッチで行われるものである請求項２１に記載の 方法。 ２３．さらに、（ｈ）該培養の増殖、感染、および活性化レベルをモニターし 、 （ｉ）増殖、感染、および活性化レベルを最大にするように該培養の条件を変え る工程を含む請求項１０に記載の方法。 ２４．さらに（ｊ）該培養から該ウイルスを回収する工程を含む請求項２３に 記載の方法。 ２５．さらに(ｋ)該回収されたウイルスを用いてワクチンを製造する工程を含 む請求項２４に記載の方法。 ２６．該ウイルスがオルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、および レオウイルス科からなる群から選ばれるものである請求項１〜２５のいずれかに 記載の方法。 ２７．請求項１〜２６のいずれかに記載の方法によって生産されるインフルエ ンザウイルス。 ２８．ヒト供給源、またはブタ、ウシ、ヒツジ、およびニワトリ（卵）のよう な動物供給源由来の蛋白、または病原性物質である蛋白のような培養液由来の夾 雑蛋白を含まない培養ウイルス。 ２９．請求項１に記載の方法によって得られる請求項２８に記載のウイルス。 ３０．ヒト供給源、またはブタ、ウシ、ヒツジ、およびニワトリ（卵）のよう な動物供給源由来の蛋白、または病原性物質である蛋白のような培養液由来の夾 雑蛋白を含まないウイルス抗原。 ３１．ＴＢＥＶ、ＨＡＶ、ＨＳＶ、またはインフルエンザウイルス由来の請求 項２８〜３０のいずれかに記載のウイルスまたはウイルス抗原。 ３２．請求項２８〜３１のいずれかに記載のウイルスまたはウイルス抗原を含 むワクチン。 ３３．ウイルスまたはウイルス抗原および医薬的に許容される担体を含む請求 項３２に記載のワクチン。 ３４．ウイルスが弱毒ウイルスである請求項３２または３３に記載のワクチン 。 ３５．該ウイルスが不活化されているものである請求項３２または３３に記載 のワクチン。 ３６．ウイルス感染に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンを製造するた めの請求項２８〜３１に記載のウイルスまたはウイルス抗原の使用。 ３７．インフルエンザウイルス感染に対して哺乳動物を免疫するためのワクチ ンを製造するための請求項２８〜３１に記載のインフルエンザウイルスまたはウ イルス抗原の使用。 ３８．ＴＢＥウイルス感染に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンを製造 するための請求項２８〜３１に記載のＴＢＥウイルス／ウイルス抗原の使用。 ３９．ヘルペスウイルス感染に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンを製 造するための請求項２８〜３１に記載のＨＳＶ／ＨＳＶ抗原の使用。 ４０．Ａ型肝炎ウイルス感染に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンを製 造するための請求項２８〜３１に記載のＡ型肝炎ウイルス／ウイルス抗原の使用 。 ４１．（ａ）無蛋白培地のみで培養した脊椎動物細胞培養を得、 （ｂ）該細胞培養を、組換え蛋白を発現するウイルスベクターに感染させ、 （ｃ）該ウイルスベクターに感染させた該細胞培養を培養して該ウイルスを増殖 させ、 （ｄ）該組換え蛋白を回収する工程を含む組換え蛋白の製造方法。 ４２．該ウイルスベクターがワクシニアウイルスである請求項４１に記載の方 法。 ４３．該組換え蛋白がウイルス蛋白、細菌蛋白、および血液因子からなる群か ら選ばれるものである請求項４１に記載の方法。 ４４．請求項４１に記載の方法によって得ることができる組換え蛋白。 ４５．無蛋白条件下のみで培養した脊椎動物細胞を含む細胞バイオマスであっ て、ウイルスを該細胞で継代することなしにウイルスを増殖させ続けるものであ る細胞バイオマス。 ４６．該細胞が無蛋白条件下で連続的に継代されるものである請求項４５に記 載の細胞バイオマス。 ４７．無蛋白培地中の担体上で該細胞を増殖させて得られるものである請求項 ４５および４６に記載の細胞バイオマス。 ４８．該バイオマスが脊椎動物細胞、好ましくはＶＥＲＯ細胞を含むものであ る請求項４５〜４７に記載の細胞バイオマス。 ４９．（ａ）細胞が担体上で増殖し、該担体に吸着されたバイオマスを形成す るように担体および無蛋白培地を含む容器中で無蛋白条件下のみで細胞を増殖さ せ、 （ｂ）該バイオマスおよび該担体を、該担体から該バイオマスを引き離す物質と 接触させる工程を含む細胞バイオマスの製造法。 ５０．該物質がプロテアーゼ、好ましくはサーモリシン、サブチリシンＡ、ま たはプロナーゼのような原核生物由来のプロテアーゼである請求項４９に記載の 方法。 ５１．（ａ）無蛋白培地中のみで脊椎動物細胞培養を増殖させ、 （ｂ）該培養にオルソミクソウイルスを感染させ、 （ｃ）オルソミクソウイルスを感染させた該細胞培養をインキュベーションし、 （ｄ）脊椎動物細胞中で所望の表現型を示すオルソミクソウイルス株を選択し、 （ｅ）工程（ｄ）から該ドナーオルソミクソウイルスを分離する工程を含む再集 合体ウイルスを製造するためのドナーオルソミクソウイルスの製造法。 ５２．所望の表現型が高収量表現型または弱毒有毒表現型である請求項５１に 記載のウイルス製造法。 ５３．該ウイルスが弱毒インフルエンザウイルス、低温順化インフルエンザウ イルス、温度感受性インフルエンザウイルス、再結合体インフルエンザウイルス 、高収量ドナーインフルエンザウイルス、感染哺乳動物の咽頭スワブから分離さ れた野生型インフルエンザウイルス、およびニワトリ有胚卵またはインフルエン ザウイルス亜株に順化した細胞培養で継代されたウイルスからなる群から選ばれ るものである請求項５１に記載のウイルス製造法。 ５４．該細胞がＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＣＫ 細胞、およびＭＤＢＫ細胞からなる群から選ばれるものである請求項５１に記載 の方法。 ５５．該ウイルスがA/Orth/17/95(H1N1)であり、ＶＥＲＯ細胞中で高収量表現 型を有するものである請求項５１に記載の方法によって得られる高収量ドナーイ ンフルエンザウイルス。 ５６．（ａ）無蛋白培地中の脊椎動物細胞培養を、高収量表現型を有する第1 オルソミクソウイルスおよび少なくとも１つの抗原決定基を有する第2オルソミ クソウイルスに共感染させ、 （ｂ）工程（ａ）の脊椎動物細胞培養をインキュベーションして該ウイルスおよ び該ウイルスの再結合体を増殖させ、 （ｃ）該共感染培養から、該第1オルソミクソウイルスの高収量表現型および該 第2オルソミクソウイルスの少なくとも１つの抗原決定基を含む再結合体ウイル スを選択する工程を含む再結合体オルソミクソウイルスの製造法。 ５７．該オルソミクソウイルス系のウイルスがインフルエンザウイルスである 請求項５６に記載の方法。 ５８．工程（ｃ）が、該第1ウイルスの抗原決定基と結合するが該第2ウイルス の抗原決定基には結合しない抗体を使用するものである請求項５６に記載の方法 。 ５９．該第2オルソミクソウイルスがワクチン製造用に選定されたものである 請求項５６に記載の方法。 ６０．該脊椎動物細胞培養がＶＥＲＯ細胞のバイオマスである請求項５６に記 載の方法。 ６１．（ａ）無蛋白培地中の脊椎動物細胞培養を、弱毒有毒表現型を有する第 1オルソミクソウイルスおよび少なくとも１つの抗原決定基を有する第2オルソミ クソウイルスに共感染させ、 （ｂ）工程（ａ）の脊椎動物細胞培養をインキュベーションして該ウイルスおよ び該ウイルスの再結合体を増殖させ、 （ｃ）該共感染培養から、該第1オルソミクソウイルスの弱毒有毒表現型および 該第2オルソミクソウイルスの少なくとも１つの抗原決定基を含む再結合体ウイ ルスを選択する工程を含む再結合体オルソミクソウイルスの製造法。 ６２．該オルソミクソウイルス系のウイルスがインフルエンザウイルスである 請求項６１に記載の方法。 ６３．工程（ｃ）が、該第1ウイルスの抗原決定基と結合するが該第2ウイルス の抗原決定基には結合しない抗体を使用するものである請求項６１に記載の方法 。 ６４．該第2オルソミクソウイルスがワクチン製造用に選定されたものである 請求項６１に記載の方法。 ６５．該脊椎動物細胞培養がＶＥＲＯ細胞のバイオマスである請求項６１に記 載の方法。 ６６．抗体がドナーウイルスの抗原決定基と結合するがワクチン製造用に選定 されたウイルスの抗原決定基には結合しないものであるウイルス製造用の再結合 体ウイルスを選ぶための抗体。 ６７．抗体が該ドナー抗体の該表面糖蛋白と結合するものである請求項６６に 記載の抗体。 ６８．該糖蛋白が血球凝集素およびノイラミニダーゼからなる群から選ばれる ものである請求項６７に記載の抗体。 ６９．（ａ）無蛋白培地中のみで培養した脊椎動物細胞培養を得、 （ｂ）該培養に、該細胞中の開裂酵素に対するウイルスの感受性を増加させるよ うに血球凝集素中の開裂部位が修飾されたウイルスを感染させ、 （ｃ）該ウイルスを感染させた該細胞培養をインキュベーションして該ウイルス を増殖させ、ウイルス含有培地を調製する工程を含むウイルスの活性化に関与す る蛋白を発現させるウイルスの感染性を増加させる方法。 ７０．さらに、（ｄ）工程（ｃ）の培養の部分を取り出し、 （ｅ）工程（ｄ）の該部分を、該ウイルスの活性化を増強する少なくとも１つの 物質と接触させ、 （ｆ）工程（ｅ）の該部分に、該物質のあらゆる細胞毒性作用を阻害または減弱 させる少なくとも１つの化合物を加え、 （ｇ）該培養に工程（ｆ）の該部分を戻す工程を含む請求項６９に記載の方法。 ７１．（Ａ）第１容器に培地中の細胞を入れ、 （Ｂ）該細胞の部分を第2容器に移し、 （Ｃ）所望の生成物の生産を最適化するための少なくとも１つの外因性物質を加 えることにより該第2容器中の該細胞の該部分を活性化し、 （Ｄ）工程（Ｃ）の該細胞の該部分を第3容器に移し、 （Ｅ）該第3容器中の該細胞の該部分に、該外因性物質のあらゆる細胞毒性作用 を減弱させる化合物を加え、 （Ｆ）該細胞の該部分を該第1容器にもどす（ここで、該第1、第2、および第3容 器は環状ループ系に接続されている）工程を含む１またはそれ以上の培養細胞生 成物の生産を最適化する方法。