JP2016063831A - インフルエンザウイルス再集合方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ここでヘマグルチニン遺伝子および／もしくはノイラミニダーゼ遺伝子の転写および／もしくは翻訳が抑制される、リアソータントウイルスを生成するための方法を提供すること。【解決手段】一実施形態において、リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法が提供され、該方法は：（ｉ）培養宿主を、第１のインフルエンザ株および第２のインフルエンザ株に感染させる工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の該培養宿主と、阻害因子とを、接触させる工程であって、ここで該阻害因子は、（ｉ）の該インフルエンザ株のうちの少なくとも一方のヘマグルチニン遺伝子および／もしくはノイラミニダーゼ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる、工程；（ｉｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程、を包含する。【選択図】なし

Description

この出願は、米国仮出願第６１／３９６，１１０号（２０１０年５月２１日出願）の利益を主張し、この米国仮出願第６１／３９６，１１０号の完全な内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。

（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス再集合の分野にある。さらに、本発明は、インフルエンザウイルスに対して防御するためのワクチンを製造することに関する。

（背景技術）
インフルエンザ感染に対する最も効率的な防御は、循環している株に対してワクチン接種することであり、可能な限り迅速にワクチン生成のためのインフルエンザウイルスを生成することが重要である。

野生型インフルエンザウイルスは、代表的には、卵および細胞培養物において非常にゆっくりと増殖する。ワクチン生成のためにより迅速に増殖するウイルス株を得るために、上記循環しているインフルエンザ株（本明細書でワクチン株ともいわれる）を、より迅速に増殖する高収量バックボーン株（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ）と再集合させる（ｒｅａｓｓｏｒｔ）ことは、現在一般的な実施である。これは、細胞培養物中の細胞もしくは孵化鶏卵の羊水を、上記ワクチン株および上記バックボーン株に共感染させる（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔ）ことによって、達成され得る。次いで、上記バックボーン株のヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質に特異的な抗体は、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質を有するインフルエンザウイルスを複製からブロックするために添加される。この処理の数回の継代にわたって、上記ワクチン株に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメント、ならびに上記バックボーン株に由来する他のウイルスセグメント（すなわち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２をコードするもの）を含む、迅速に増殖するリアソータントインフルエンザウイルスが選択され得る。

現在のアプローチは、いくつかの欠点を有する。例えば、最終の高増殖リアソータントを得るためには、代表的には、新たなインフルエンザ株が到着してから約３５日間かかる。このことは、インフルエンザワクチンの生成における遅延を引き起こす。さらに、上記ウイルスを数回継代する必要性は、抗原性の所望でない変化を生じ得る、上記ＨＡ抗原における変異のリスクを増大させる。再集合されないウイルスの増殖を阻害するためのポリクローナル抗血清の使用はまた、偶発的なウイルス性因子および他の夾雑物を導入するリスクを増大させる。

本発明の目的は、リアソータントインフルエンザウイルスを生成するためのさらに改善された方法を提供することである。

（好ましい実施形態の要旨）
本発明者らは、今や、ウイルス生成の間に（例えば、ＲＮＡ阻害を使用することによって）上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させると、リアソータントウイルスが生成される速度を大いに増大させることができるということを、驚くべきことに発見した。上記方法は、抗体の使用に依存しないので、動物由来生成物の使用が回避され得るという利点をさらに有する。さらに、リアソータントウイルスを得るために必要とされる継代がより少ないので、自発的変異の可能性がより低い。

本発明は、リアソータントインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ｉ）培養宿主を、第１のインフルエンザ株および第２のインフルエンザ株に感染させる工程；（ｉｉ）上記工程（ｉ）の培養宿主と、阻害因子とを接触させる工程であって、ここで該阻害因子は、上記工程（ｉ）のインフルエンザ株のうちの１つのヘマグルチニン遺伝子および／もしくはノイラミニダーゼ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる、工程；（ｉｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程、ならびに必要に応じて、（ｉｖ）上記工程（ｉｉｉ）において得られたウイルスを精製する工程、を包含する。

本発明の方法は、（ｖ）培養宿主を、上記工程（ｉｉｉ）もしくは工程（ｉｖ）において得られたリアソータントウイルスに感染させる工程；（ｖｉ）上記工程（ｖ）からの宿主を培養して、上記ウイルスをさらに生成する工程；および必要に応じて、（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）において得られたウイルスを精製する工程、をさらに包含し得る。

本発明は、リアソータントインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ｉ）培養宿主を、少なくとも１つの標的セグメントを有する第１のインフルエンザウイルス株に感染させる工程；（ｉｉ）上記培養宿主に、第２のインフルエンザウイルス株に由来する標的セグメントをコードする１つ以上の発現構築物を導入する工程；（ｉｉｉ）上記培養宿主と、上記第１のインフルエンザ株の標的セグメントの転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子とを、接触させる工程；（ｉｖ）リアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程；および必要に応じて、（ｖ）上記工程（ｉｖ）において得られたウイルスを精製する工程、を包含する。

本発明は、発現構築物を含む細胞を提供し、上記発現構築物は、（ｉ）第１のインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザＢ型ウイルスのゲノムのうちの８つのウイルスセグメントすべて；（ｉｉ）第２のインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザＢ型ウイルスのゲノムのうちの少なくとも１つの標的セグメントであって、ここで上記第２のインフルエンザ株の標的セグメントは、上記第１のインフルエンザ株の標的セグメントとは配列において異なる、少なくとも１つの標的セグメント；ならびに（ｉｉｉ）阻害因子であって、ここで上記阻害因子は、上記第１のインフルエンザ株における標的セグメントの転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる、阻害因子、をコードする。

本発明はまた、リアソータントインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、リアソータントウイルスを生成するために、この細胞を培養する工程を包含する。上記方法は、培養宿主を、上記細胞から得られたリアソータントウイルスに感染させる工程、次いで、上記宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程、および次いで、（必要に応じて）、このようにして得られた上記さらなるウイルスを精製する工程、をさらに包含する。

本発明はまた、インフルエンザウイルスを生成するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）培養宿主を、本発明の方法によって得られたリアソータントウイルスに感染させる工程；（ｂ）上記工程（ａ）からの宿主を培養して、上記ウイルスを生成する工程；および必要に応じて、（ｃ）上記工程（ｂ）において得られたウイルスを精製する工程、を包含する。

本発明はまた、ワクチンを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ｄ）上記実施形態のうちのいずれか１つの方法によって、ウイルスを調製する工程、および（ｅ）上記ウイルスからワクチンを調製する工程、を包含する。

（インフルエンザ株）
インフルエンザウイルスは、セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスは、８つのセグメント（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、ＭおよびＮＳ）を有するのに対して、インフルエンザＣ型ウイルスは、７つのセグメントを有する（ＮＡセグメントはない）。上記ウイルスは、ゲノム複製を開始するには、少なくとも４つのウイルスタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびヌクレオタンパク質）の存在を必要とする。

本発明の方法は、インフルエンザバックボーン株およびワクチン株を使用する。上記使用されるバックボーン株およびワクチン株は、通常、以下に記載されるように、阻害因子によって差次的に阻害され得る１つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つもしくは８つの）ウイルスセグメントにおいて異なる。上記バックボーン株は、所望のセグメントについて上記ワクチン株よりも多く阻害され、従って、リアソータント株の生成が好都合である。

上記ワクチン株は、汎流行性でありかつ汎流行性間期の（流行期（ｓｅａｓｏｎａｌ））インフルエンザ株であり得る。上記ワクチン株は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６を含み得る。上記ワクチン株は、インフルエンザＡ型ウイルス ＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８もしくはＮ９を含み得る。上記ワクチン株が、流行期インフルエンザ株である場合、上記ワクチン株は、Ｈ１もしくはＨ３サブタイプを有し得る。本発明の一局面において、上記ワクチン株は、Ｈ１Ｎ１株もしくはＨ３Ｎ２株である。

上記ワクチン株はまた、汎流行性の株もしくは潜在的に汎流行性の株であり得る。汎流行性のアウトブレイクを引き起こす可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、以下である：（ａ）現在循環しているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して、新たなヘマグルチニンを含む（すなわち、１０年を超えてヒト集団において顕性でなかったもの（例えば、Ｈ２）、または上記ヒト集団において以前に全く認められなかったもの（例えば、一般に、トリ集団においてのみ見いだされてきたＨ５、Ｈ６もしくはＨ９）。その結果、上記ヒト集団は、上記株のヘマグルチニンに対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）上記ヒト集団において水平伝播し得る；および（ｃ）ヒトに対して病原性である。Ｈ５ヘマグルチニンタイプを有するワクチン株は、好ましい。ここで上記リアソータントウイルスは、汎流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対して免疫化するためのワクチンにおいて使用される。他の考えられる株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の潜在的に出現する汎流行性株が挙げられる。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへと拡がり得るかもしくは拡がってしまった潜在的汎流行性株（例えば、ブタ起源のＨ１Ｎ１インフルエンザ株）に対して防御するためのワクチンにおける使用のために、リアソータントウイルスを生成するのに特に適している。

上記バックボーン株は、任意の公知のインフルエンザウイルス株であり得るが、上記バックボーン株が細胞および／もしくは卵の尿膜腔液において迅速に増殖するインフルエンザウイルス株であることは好ましい。これは、ワクチン生成のために迅速に増殖するインフルエンザウイルスを得るために、リアソータントインフルエンザウイルスがしばしば生成されるので、好ましい。このようなバックボーン株の例としては、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０およびＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に従って生成されるリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１つ以上のＲＮＡセグメント（代表的には、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来する６つのセグメントであり、上記ＨＡおよびＮＡセグメントは、ワクチン株由来である（すなわち、６：２リアソータント））を含み得る。上記リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスはまた、ワクチン調製のために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスもしくはリアソータントウイルスを生成するために有用な任意の他のウイルス株に由来する１つ以上のＲＮＡセグメントを含み得る。リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスは、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０）に由来する６つより少ない（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの）ウイルスセグメントを含み得る。リアソータントインフルエンザＢ型ウイルスは、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）に由来する６つより少ない（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの）ウイルスセグメントを含み得る。

本発明のリアソータントインフルエンザ株は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９株に由来する１つ以上のゲノムセグメント、好ましくは、上記ＨＡセグメントおよび／もしくは上記ＮＡセグメント（なぜなら、これらは、主要なワクチン抗原であるからである）を含み得る。従って、例えば、上記ＨＡ遺伝子セグメントは、配列番号８より、配列番号７に密に関連している（すなわち、同じアルゴリズムおよびパラメーターを使用して、配列番号７と比較した場合に、配列番号８よりも高い程度の配列同一性を有する）Ｈ１ヘマグルチニンをコードし得る。配列番号７および配列番号８は、８０％同一である。同様に、上記ＮＡ遺伝子は、配列番号１０よりも配列番号９に密に関連するＮ１ノイラミニダーゼをコードし得る。配列番号９および配列番号１０は、８２％同一である。

リアソータントインフルエンザＢ型ウイルスはまた、生成され得る。インフルエンザＢ型ウイルスは、異なるＨＡサブタイプを現在示さないが、２つの別個の系統に入る：Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様。これら系統は、１９８０年代後期に出現した。そしてこれら系統は、互いに抗原的におよび／もしくは遺伝的に区別され得るＨＡを有する［１］。本発明のリアソータントインフルエンザＢ型株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株もしくはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するＨＡを含み得る。

Ａ／ＰＲ／８／３４株、Ａ／ＡＡ／６／６０株、Ｂ／ＡＡ／１／６６株、およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９株に由来するウイルスセグメントおよび配列は、広く入手可能である。それらの配列は、公のデータベース上で入手可能である（例えば、ＧＩ：８９７７９３３７、ＧＩ：８９７７９３３４、ＧＩ：８９７７９３３２、ＧＩ：８９７７９３２０、ＧＩ：８９７７９３２７、ＧＩ：８９７７９３２５、ＧＩ：８９７７９３２２、ＧＩ：８９７７９３２９（配列番号１〜６もまた参照のこと））。

バックボーン株の選択は、一緒に使用される上記ワクチン株に依存し得る。一般に、そのＨＡセグメントおよび／もしくはＮＡセグメントが、核酸レベルもしくはアミノ酸レベルでより高い程度の同一性を示さない株を選択することは望ましい。なぜなら、このことは、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントの転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子を見いだすことをより容易にし得るからである。例えば、同一性の程度は、９９％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満もしくは７５％未満であり得る。上記バックボーン株および上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡウイルスセグメントは、異なるサブタイプであり得る。例えば、Ｈ３Ｎ２株がワクチン株として使用される場合、Ｈ１Ｎ１サブタイプを有するバックボーン株（例えば、Ａ／ＰＲ／８／３４）が、使用され得るか、逆もまた同様である。しかし、本発明の方法において同じＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有するバックボーン株およびワクチン株（例えば、Ｈ１ワクチン株およびＨ１バックボーン株）を使用することもまた可能であるが、ただし上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写および／もしくは翻訳は、優先的に低下させられ得る。

（阻害因子）
本発明において使用するのに適した阻害因子は、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子と比較して、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させ得るものである。転写レベルもしくは翻訳レベルのいずれかにおける上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質レベルの優先的な低下は、リアソータントインフルエンザウイルスの形成に好都合である。なぜなら、その可能性は、それらの相対的な存在量が増大するにつれて、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質が組み込まれることを増大させるからである。

上記阻害因子が転写インヒビターである場合、上記阻害因子は、少なくともｘ＋５％（例えば、ｘ＋１０％、ｘ＋２０％、ｘ＋３０％、ｘ＋４０％）だけ上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写を低下させる場合に、転写を優先的に低下させるとみなされるが、ただし、上記阻害因子は、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写を、ｘ％以下（例えば、ｘ−５％、ｘ−１０％、ｘ−２０％、ｘ−３０％もしくはｘ−４０％）だけ低下させる。ここで上記低下は、上記阻害因子で処理しなかったコントロールサンプルと比較して測定される。この状況において、ｘは、０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９であり得る。従って、例えば、上記バックボーン株のＨＡ遺伝子の転写が３０％だけ低下させられる場合、上記ワクチン株のＨＡの転写は、最大２５％だけ低下させられるべきである。上記阻害因子による上記遺伝子の転写低下を測定するための適した方法は、当業者には明らかである。例えば、２つの別個の細胞培養物が、上記目的のインフルエンザウイルスに感染させられ得る。上記感染させた培養物のうちの一方は、上記目的の阻害因子と接触させられると同時に、他方の感染させた培養物は、処理されないか、または上記培養物が感染させられた上記インフルエンザウイルスのＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写を低下させないことが公知の物質（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）もしくは関連しない遺伝子に対して特異性を有する阻害因子）で処理される。次いで、ＲＮＡは、両方のサンプルから単離され得、ｃＤＮＡは、上記単離されたＲＮＡから転写され得、リアルタイムＰＣＲが、上記両方のサンプルに由来するｃＤＮＡで、上記阻害因子の存在下および非存在下で上記ＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の発現レベルと比較するために、上記遺伝子に特異的なプライマーを使用して行われ得る。

翻訳インヒビターは、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質レベルを、少なくともｙ＋５％（例えば、ｘ＋１０％、ｘ＋２０％、ｘ＋３０％、ｘ＋４０％）だけ低下させる場合に、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の翻訳を優先的に低下させるとみなされるが、ただし、上記阻害因子は、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写を、ｙ％以下（例えば、ｘ−５％、ｘ−１０％、ｘ−２０％、ｘ−３０％もしくはｘ−４０％）だけ低下させる。ここで上記低下は、上記阻害因子で処置しなかったコントロールサンプルとの比較において、測定される。この状況において、ｙは、０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９であり得る。従って、例えば、上記バックボーン株のＨＡ遺伝子の翻訳が、３０％だけ低下させられる場合、上記ワクチン株のＨＡの転写は、最大２５％だけ低下させられるべきである。上記ＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の翻訳の低下を測定するために適した方法は、当業者に明らかである。例えば、２つの別個の細胞培養物は、上記インフルエンザウイルスに感染させられ得る。上記感染させた培養物のうちの一方は、上記目的の阻害因子と接触させられると同時に、他方の感染させた培養物は、処理されないか、または上記培養物が感染させられた上記インフルエンザウイルスのＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質の翻訳を阻害しないことが公知の物質（例えば、ＰＢＳもしくは関連しない遺伝子に対して特異性を有する阻害因子）で処理されるかのいずれかである。タンパク質は、両方のサンプルから単離され得、上記ＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質のタンパク質レベルは、分析され得、そして定量的ウェスタンブロット分析によって比較される（例えば、参考文献２の第５７章を参照のこと）。

１つより多くのバックボーン株が、本発明の方法において使用される場合、阻害因子は、上記使用されるバックボーン株のうちの少なくとも１つのＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる場合に、適切である。

インフルエンザウイルスが、本発明に従って再集合されるたびに上記阻害因子の適切さを試験することは一般には必要ではない。なぜなら、再集合のために使用されるバックボーン株は、種々の異なるワクチン株に使用され得るからである。従って、いったん特定のバックボーン株に適した阻害因子が同定されたら、その特定のバックボーン株が使用されるすべての方法に関して同じ因子を使用することは可能であり、上記阻害因子が、上記使用されるワクチン株の上記ＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子と比較して、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させることを確認することのみが必要である。

適切な阻害因子は、当業者に公知であり、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または低分子干渉ＤＮＡ（ｓｉＤＮＡｓ）様の例えば、ホスホロチオエートオリゴマー（ＰＳＯ）もしくはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）が挙げられるが、これらに限定されない。

短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、本発明の方法における使用に特に適している。これは、それらが迅速にかつ安価に合成され得、かつ高い特異性で遺伝子の発現を抑制し得ることが理由である。上記標的配列とオフ標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）配列との間の単一ヌクレオチドの差異すら、上記標的配列の特異的サイレンシングを達成し得る［３］。卵におけるｓｉＲＮＡの使用は、例えば、参考文献４に記載された。

目的の遺伝子を特異的にサイレンシングするｓｉＲＮＡを設計するための方法は、当業者に公知である。例えば、遺伝子特異的ｓｉＲＮＡの設計を可能にする種々のプログラムが利用可能である［５，６］。本発明における使用のためのこのようなｓｉＲＮＡの例は、表１に示される。表１中のｓｉＲＮＡ配列ＨＡ１−ＨＡ２４およびＮＡ１−ＮＡ２４は、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９の存在下でＡ／ＰＲ／８／３４のＨＡおよびＮＡを差次的に阻害するように設計された。

本発明の方法におけるｓｉＤＮＡの使用もまた、好ましい。これらは、上記標的配列に対する匹敵する特異性を示すなお示すと同時に、合成しやすく、より安定で、かつ上記細胞によってより容易に取り込まれ、ｓｉＲＮＡより早く作用するという利点を有する［７］。

上記ｓｉＲＮＡおよびｓｉＤＮＡの使用は、上記バックボーン株および上記ワクチン株が、上記ＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子をコードするそれらのウイルスセグメントにおいて高い程度の同一性を有する場合に、例えば、それらが同じインフルエンザウイルスサブタイプに由来する場合に、特に有利である。なぜなら、これらインヒビターは、高い配列特異性を示すことが公知であるからである。上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質レベルと比較して、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質レベルの優先的な低下を達成するために、上記ｓｉＲＮＡおよび／もしくはｓｉＤＮＡは、これらが上記バックボーン株および上記ワクチン株に由来する上記ＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の間の配列バリエーションの領域を標的とするように、設計され得る。配列バリエーションの領域は、２つの株に由来する配列を整列させることによって決定され得る。

ｓｉＤＮＡの具体例は、ＰＭＯである。これらは、リボソーム開始複合体の、５’キャップから開始コドンへの進行を干渉し得る翻訳開始部位に結合するように通常は設計される合成アンチセンスオリゴマーである。上記ＰＭＯの利点は、これらがＲＮＡもしくはさらにはＤＮＡと比較して、より安定であることである［８］。ＰＭＯを設計するための方法は、当該分野で公知である［９］。

他の適切な阻害因子は、ＰＳＯである。これらは、酸素原子が、上記ＤＮＡのオリゴホスフェートバックボーンにおいて非架橋硫黄によって置換される合成オリゴマーである。ＰＳＯは、非改変ＤＮＡオリゴマーおよびＲＮＡオリゴマーと比較して、より安定であるので有利である。

ｓｈＲＮＡが使用される場合、これらは、通常、上記ｓｈＲＮＡを発現し得るＤＮＡ発現構築物として、上記培養宿主に導入される。これらｓｈＲＮＡ発現構築物は、代表的には、ｓｉＲＮＡ分子をコードする配列および同じＤＮＡ鎖上で短いリンカー配列によって分離された上記ｓｉＲＮＡ分子の逆相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。上記ｓｉＲＮＡ配列は、上記で記載されるように設計され得、いったん上記ｓｉＲＮＡ配列が既知になれば、逆相補配列を同定することは、当業者の手段内である。本発明における使用に適したｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の例は、表２に示される。この表中の配列は、例示的リンカー配列として「ＧＧＧＧＧＧＧ」を利用するが、当業者は、これを他の適切な配列で容易に置換し得る。

本発明の方法において１つより多い種の阻害因子を使用することもまた、想定される。

上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子に対して特異性を有する阻害因子に加えて、もしくはその代わりに、さらなる阻害因子を使用することもまた、本発明の範囲内である。例えば、上記ワクチン株のバックボーンセグメントのうちの１種以上の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させ得る１種以上の阻害因子を添加することは可能である。これは、所望のリアソータントウイルスを形成する可能性が、さらに増大されるという利点を有する。適切な阻害因子は、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子について、必要な変更を加えて上記と同じ手段によって同定され得る。

上記阻害因子は、当業者に公知の任意の手段によって、上記細胞培養物もしくは上記卵（尿膜腔液）中の個々の細胞に導入され得る。例えば、上記阻害因子は、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、マイクロインジェクション、もしくは微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって導入され得る。

上記リアソータントウイルスが細胞培養物中で生成される場合、上記阻害因子をコードする１つ以上の発現構築物で安定したトランスフェクトされた細胞を使用することは、可能である。これは、同じ細胞株が、特定のバックボーン株が使用されるたびに使用され得るという利点を有し、従って、本発明の方法が実施されるたびに阻害因子を別個に導入する必要性を排除する。

上記１種以上の阻害因子は、上記インフルエンザウイルスでの感染の前、その間もしくはその後に、上記宿主細胞もしくは尿膜腔液へと導入され得る。

（ウイルス再集合）
リアソータントインフルエンザウイルスは、培養宿主（通常は、細胞培養物もしくは卵）を、バックボーン株およびワクチン株に共感染させることによって頻繁に生成される。リアソータントウイルスは、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質を含むリアソータントウイルスを選択するために、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質に対して特異性を有する抗体を添加することによって、選択される。この処理の数回の継代にわたって、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含む、迅速に増殖するリアソータントウイルスが選択され得る。

２種、３種もしくはそれより多い異なるインフルエンザ株の間のリアソータントインフルエンザウイルスが、生成され得る。上記生成されるリアソータントウイルスは、上記バックボーン株に由来する少なくとも１種（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）のバックボーンウイルスセグメントを含む。上記バックボーンウイルスセグメントは、ＨＡもＮＡもコードしないものである。従って、バックボーンセグメントは、代表的には、上記インフルエンザウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ_１、Ｍ_２、ＮＳ_１およびＮＳ_２ポリペプチドをコードする。上記リアソータントウイルスは、代表的には、たとえ、上記バックボーン株に由来する上記ＨＡもしくは上記ＮＡのいずれか（しかし両方ではない）を含むリアソータントウイルスがまた、想定されるとしても、上記バックボーン株に由来するＨＡおよびＮＡをコードするセグメントを含まない。

上記リアソータントウイルスが、２つのインフルエンザ株の間のリアソータントである場合、上記リアソータントウイルスは、一般に、１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２もしくは７：１の比において、上記バックボーン株および上記ワクチン株に由来するセグメントを含む。上記バックボーン株に由来する大部分のセグメントを、特に、６：２の比率で有することは、代表的である。本発明のリアソータントウイルスが、３つの株のリアソータントである場合、上記リアソータントウイルスは、一般に、１：１：６、１：２：５、１：３：４、１：４：３、１：５：２、１：６：１、２：１：５、２：２：４、２：３：３、２：４：２、２：５：１、３：１：２、３：２：１、４：１：３、４：２：２、４：３：１、５：１：２、５：２：１もしくは６：１：１の比率において、上記バックボーン株、上記ワクチン株および第３の株に由来するセグメントを含む。例えば、上記リアソータントインフルエンザ株は、１つより多くのバックボーン株および／もしくは１つより多くのワクチン株に由来するウイルスセグメントを含み得る。

本発明の方法において使用される上記「第２のインフルエンザ株」は、それらのウイルスセグメントのうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つ）が異なることを意味する上記第１のインフルエンザ株に対して異なる。

（逆遺伝学）
本発明は、通常、「伝統的な」再集合技術の状況において適用されるが、また、逆遺伝学（ＲＧ）システムにおいて、もしくは伝統的な再集合技術およびＲＧシステムの組み合わせにおいて、使用され得る。いくつかのＲＧシステムでの問題は、必要とされる発現構築物を培養宿主の中に導入しがたい可能性があることである（例えば、トランスフェクション効率の低さに起因する）。このことは、上記ＲＧシステムを非効率的にし得る。本発明は、上記リアソータントインフルエンザウイルスの上記ウイルスセグメントのうちのいくつかが、上記培養宿主をインフルエンザウイルスに感染させることによって提供される方法を提供すると同時に、他は、１種以上の発現構築物上で提供されることによって、この問題を克服する。

本発明の方法において、培養宿主は、８つのゲノムセグメント（そのうち、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ）が標的セグメントである）を有する第１のインフルエンザＡ型株もしくはＢ型株に感染させられる。上記第１のインフルエンザ株に由来する標的セグメントは、本発明の方法に従って生成されるリアソータントインフルエンザウイルスにおいて存在しないウイルスセグメントである。上記第２のインフルエンザウイルス株の標的セグメントは、１種以上の発現構築物に導入される。上記第２のインフルエンザ株の標的セグメントは、本発明の方法に従って生成されるリアソータントインフルエンザウイルスに存在するそれらのセグメントである。上記第１のインフルエンザ株の標的セグメントの転写および／もしくは翻訳は、上記阻害因子によって優先的に低下させられる。代表的には、上記第１のインフルエンザ株は、１つもしくは２つの標的セグメント（通常は、ＨＡおよび／もしくはＮＡ）を有し、よって、上記第２のインフルエンザ株に由来する１つもしくは２つの標的セグメントは、１種以上の発現構築物に導入される。上記阻害因子は、上記第２のインフルエンザ株のセグメントと同じ構築物もしくは異なる構築物上にコードされ得る。

例えば、上記ワクチン株のＨＡセグメントが上記培養宿主の中に発現構築物上で導入され、かつ上記培養宿主が上記バックボーン株に感染させられる場合、上記阻害因子は、上記バックボーン株のＨＡセグメントに対して特異的である。同様に、上記ワクチン株のＮＡが、上記１種以上の発現構築物上で導入される場合、上記阻害因子は、上記バックボーン株のＮＡセグメントに対して特異的である、上記ＨＡおよびＮＡセグメントがともに、上記１種以上の発現構築物上で導入される場合、上記阻害因子は、上記バックボーン株のＨＡおよびＮＡセグメントに対して特異的である。上記標的セグメントは、代表的には、ＨＡおよび／もしくはＮＡである。

上記１種以上の発現構築物上で導入されるウイルスセグメントは、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントであり得る一方で、上記バックボーンセグメントは、上記培養宿主を感染させるために使用されるインフルエンザウイルスによって提供される。この実施形態において、上記培養宿主は、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントの転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子と接触させられ得る。上記発現構築物上の１つ以上のバックボーンセグメントを提供することもまた可能である。

上記第１および上記第２のインフルエンザウイルスは、異なる。さらに、本発明の方法において、（ｉ）上記培養宿主を、ウイルスに感染させる工程、（ｉｉ）上記１種以上の発現構築物を上記培養宿主の中に導入する工程、および（ｉｉｉ）上記培養宿主と、阻害因子とを接触させる工程は、任意の順序において行われ得る。

さらに、大部分のＲＧシステムが、バックボーン株のセグメントの容易な省略を可能にするが、他のシステムにおいて、これは、それほど容易ではない。例えば、いくつかのＲＧシステムは、第１のプラスミド上で６つのウイルスセグメントを、加えて、第２のプラスミドの上で上記ＨＡおよびＮＡ遺伝子をコードする。従って、上記第１のプラスミドのセグメントのうちの１つが置換されるリアソータント株を作ることは、煩わしいことであり得るが、本発明は、この課題を克服する。例えば、第１の株をコードするＲＧシステムは、第２の株に由来するセグメントをコードし、また、上記第１の株に関する対応するセグメントを阻害するように改変され得、それによって、上記第２の株に関するこのセグメントが、上記第１の株のセグメントを置換するリアソータントを提供する。

従って、本発明は、発現構築物を含む細胞を提供し、上記発現構築物は、（ｉ）第１のインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザＢ型ウイルスのゲノムの８つすべてのゲノムセグメント；（ｉｉ）第２のインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザＢ型ウイルスのゲノムのうちの少なくとも１つの標的セグメントであって、ここで上記第２のインフルエンザ株の標的セグメントは、上記第１のインフルエンザ株の標的セグメントとは配列において異なる、少なくとも１つの標的セグメント；ならびに（ｉｉｉ）阻害因子であって、上記阻害因子は、上記第１のインフルエンザ株における標的セグメントの転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる、阻害因子、をコードする。

上記標的セグメントは、代表的には、ＨＡおよび／もしくはＮＡを含む。例えば、上記細胞は、発現構築物を含み得、上記発現構築物は、（ｉ）バックボーン株の８つすべてのセグメント；（ｉｉ）ワクチン株インフルエンザのうちの少なくともＨＡセグメントであって、ここで上記ワクチン株のＨＡセグメントは、上記バックボーン株のＨＡセグメントとは配列において異なる、少なくともＨＡセグメント；および（ｉｉｉ）阻害因子であって、ここで上記阻害因子は、上記バックボーン株のＨＡセグメントの転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる、阻害因子、をコードする。

上記細胞は、バックボーン株およびワクチン株のセグメントのリアソータント混合物を含むインフルエンザウイルスを生成し得る。上記細胞によって生成されるウイルスは、本明細書で記載されるように、ワクチン製造に使用され得る。

上記バックボーン株のセグメントは、代表的には、上記ワクチン株のセグメントとは異なる発現構築物上でコードされる。上記阻害因子は、上記ワクチン株のセグメントと同じ構築物もしくは異なる構築物上でコードされ得る。例えば、第１の構築物は、インフルエンザウイルスの８つすべてのセグメントをコードし得る。ワクチン株のＨＡおよびＮＡセグメントをコードしかつ上記バックボーン株のＨＡおよびＮＡセグメントのインヒビターもコードする第２の構築物が、添加され得る。

ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）分子は、例えば、ｐｏｌ Ｉプロモーター、細菌ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターなどの制御下で、構築物において発現され得る。特定のタンパク質が、感染性ウイルスを形成するために必要とされる場合に、上記ＲＧシステムは、これらタンパク質を提供し得る。例えば、上記システムは、ＤＮＡの両方のタイプの発現が、完全な感染性ウイルスのアセンブリをもたらすように、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子をさらに含む。

（培養宿主）
本発明の方法において使用するための培養宿主は、孵化鶏卵もしくは細胞であり得る。

インフルエンザウイルス増殖のための現在標準的な方法は、特定病原体除去（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）（ＳＰＦ）孵化鶏卵を使用し、ウイルスは、上記卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし、より最近になって、ウイルスは、速度および患者のアレルギーという理由から、動物細胞培養物中で増殖させられ、この増殖法が好ましい。卵ベースのウイルス増殖が使用される場合、１個以上のアミノ酸が、上記ウイルスと一緒に、上記卵の尿膜腔液の中に導入され得る［１０］。

細胞が使用される場合、本発明は、代表的には、細胞株を使用するが、例えば、初代細胞が、代替として使用されてもよい。上記細胞は、代表的には、哺乳動物のものである。適切な哺乳動物起源細胞としては、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）およびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。種々の細胞タイプが使用され得る（例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など）。適切なハムスター細胞の例は、名称ＢＨＫ２１もしくはＨＫＣＣを有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎臓細胞）である［１１〜１３］。適切なイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株のような腎臓細胞である。従って、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるための好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：メイディン・ダービー・イヌ腎臓由来に由来するＭＤＣＫ細胞［１４〜１７］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［１８〜２０］；もしくはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［２１］。これら細胞株は、広く入手可能である（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から［２２］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２３］から、もしくはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から）。例えば、上記ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で種々の異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ−３４の下でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。哺乳動物細胞株の余り好ましくない代替として、ウイルスは、トリ細胞株［例えば、参考文献２４〜２６］（アヒル（例えば、アヒル網膜）もしくはニワトリに由来する細胞株（例えば、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）など）が挙げられる）で増殖させられ得る。例としては、トリ胚性幹細胞［２４，２７］（ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４が挙げられる［２８］）が挙げられる。

本発明における使用に好ましい細胞は、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞に由来するＭＤＣＫ細胞［２９〜３１］である。元々のＭＤＣＫ細胞は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能である。ＭＤＣＫ細胞の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献１４は、懸濁培養における増殖に適合されたＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献３２は、無血清培養において懸濁物中で増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献３３は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）が挙げられる）を開示する。参考文献３４は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）が挙げられる）を開示する。これらＭＤＣＫ細胞株のうちのいずれかが、使用され得る。

細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞）での増殖のために、ウイルスは、懸濁物中［１４，３５，３６］もしくは接着培養において細胞で増殖させられ得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託）である。代替として、マイクロキャリア培養が使用され得る。

インフルエンザウイルス複製を支援する細胞株は、好ましくは、無血清培養培地および／もしくは無タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ）培地中で増殖させられる。培地は、ヒトもしくは動物起源の血清に由来する添加物が含まれなければ、本発明の状況において、無血清培地として言及される。無タンパク質は、上記細胞の増殖が、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して生じる培養物を意味することが理解されるが、必要に応じて、ウイルス増殖に必要であり得るタンパク質（例えば、トリプシンもしくは他のプロテアーゼ）を含み得る。このような培養において増殖している細胞は、天然には、タンパク質自体を含む。

インフルエンザウイルス複製を支持する細胞株は、好ましくは、例えば、ウイルス複製の間に、３７℃未満［３７］（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃において）増殖させられる。

ウイルスが細胞株で増殖させられる場合、増殖培養物、同様に、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／もしくはパルボウイルスが存在しない（すなわち、これらによる夾雑について試験されたか、これらによる夾雑についてネガティブな結果を与えない）［３８］。

ウイルスが哺乳動物細胞株で増殖させられる場合、上記組成物は、有利には、卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによって、アレルギー性が低下させられる。アレルゲンの回避は、Ｔｈ２応答を最小化するために有用である。

（ウイルス調製）
さらなる局面において、本発明は、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供する。

細胞が、本発明の方法において培養宿主として使用される場合、細胞培養条件（例えば、温度、細胞密度、ｐＨ値など）が、使用される上記細胞株および上記インフルエンザウイルス株に依存する広い範囲にわたって変動性であり、本願の要件に適合され得ることは公知である。従って、以下の情報は、ガイドラインを表すに過ぎない。

細胞は、好ましくは、無血清培地もしくは無タンパク質培地中で培養される。

上記細胞の増殖は、当業者に公知の方法に従って行われ得る。例えば、上記細胞は、遠心分離もしくは濾過のような通常の補助的方法を使用する灌流システムにおいて培養され得る。さらに、上記細胞は、感染前に、流加システム（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｓｙｓｔｅｍ）で、本発明に従って増殖させられ得る。本発明の状況において、培養システムは、上記細胞が最初にバッチシステムで培養され、培地中の栄養分（もしくは栄養分の一部）の枯渇が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補償される流加システムに関して言及される。感染前の細胞の増殖の間に上記培地のｐＨ値を、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の値に、および特に、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の間の値に調節することは、有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは、３０℃〜４０℃の間の温度で行われる。上記インフルエンザウイルスでの感染後、上記細胞は、好ましくは、３０℃〜３６℃の間の温度もしくは３２℃〜３４℃の間の温度、または約３３℃で培養される。これは、特に好ましい。なぜなら、この温度範囲での感染細胞のインキュベーションが、ワクチンへと処方される場合に改善された効率を生じるウイルスの生成を生じることが示されたからである［３９］。

酸素分圧は、感染前の培養の間に、好ましくは、２５％〜９５％の間の値において、および特には、３５％〜６０％の間の値において調節され得る。本発明の状況において示される酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約８〜２５×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度で、もしくは灌流システムにおいては、好ましくは、約５〜２０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で行われる。上記細胞は、１０^−８〜１０の間、好ましくは、０．０００１〜０．５の間のウイルス用量（ＭＯＩ値（「感染多重度」；感染時の細胞あたりのウイルス単位の数に対応する）で感染させられ得る。

ウイルスは、接着培養もしくは懸濁物中で、細胞において増殖させられ得る。マイクロキャリア培養が使用され得る。上記細胞はまた、懸濁物中での増殖に適合され得る。

本発明に従う方法は、ウイルスの採取および単離、またはウイルスによって生成されるタンパク質の採取および単離を含み得る。ウイルスもしくはタンパク質の単離の間に、上記細胞は、分離、濾過もしくは限外濾過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。次いで、上記ウイルスもしくは上記タンパク質は、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィーなどの当業者に十分公知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。上記ウイルスが精製の間もしくは精製後に不活性化されることは好ましい。ウイルス不活性化は、上記精製プロセス内のいずれかの時点で、例えば、β−プロピオラクトンもしくはホルムアルデヒドによって行われ得る。

（ワクチン）
本発明は、上記方法に従って生成されるウイルスを利用して、ワクチンを生成する。

インフルエンザワクチンは、一般に、生のウイルスもしくは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。抗原はまた、ビロソームの形態で提示され得る。本発明は、これらタイプのワクチンのうちのいずれかを製造するために使用され得る。

不活性化インフルエンザウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原（ヘマグルチニンを含み、通常はまた、ノイラミニダーゼを含む）を含み得る。ウイルスを不活性化するための化学的手段としては、以下の薬剤のうちの１つ以上の有効量での処理が挙げられる：洗剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、もしくはこれらの組み合わせ。ウイルス不活性化の非化学的方法は、当該分野で公知である（例えば、ＵＶ光もしくはγ線照射）。

ビリオンは、ウイルス含有流体（例えば、尿膜腔液もしくは細胞培養上清）から、種々の方法によって採取され得る。例えば、精製プロセスは、（必要に応じて、上記ビリオンを破壊するために洗剤を含む）線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離またはアフィニティクロマトグラフィー法を含み得る。次いで、抗原は、ダイアフィルトレーションによって、必要に応じた希釈の後に精製され得る。

スプリットビリオンは、精製されたビリオンを洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート ８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）で処理して、サブビリオン調製物を生成する（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットプロセスを含む）ことによって得られる。インフルエンザウイルスをスプリットするための方法は、例えば、当該分野で周知である（例えば、参考文献４０〜４５などを参照のこと）。上記ウイルスのスプリットは、代表的には、感染性であろうと非感染性であろうと、破壊濃度のスプリット薬剤で全ウイルスを破壊するかもしくはフラグメント化することによって行われる。上記破壊は、上記ウイルスタンパク質の完全なもしくは部分的な可溶化を生じ、上記ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット薬剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ）、オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１））、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ ｅｓｔｅｒ）などである。１つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、スプリットは、最初のビリオン精製の間に起こり得る（例えば、スクロース密度勾配溶液において）。よって、スプリットプロセスは、上記ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するために）、上記採取したビリオンの濃縮（例えば、吸着法（例えば、ＣａＨＰＯ_４吸着）を使用して）、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程においてスプリット薬剤を使用する（例えば、デオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット薬剤を含むスクロース勾配を使用する）ビリオンのスプリット、次いで、望ましくない物質を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁され得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ^ＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸ^ＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥ^ＴＭおよびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ^ＴＭ製品である。

精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原であるヘマグルチニン、および代表的には、同様にノイラミニダーゼを含む。精製形態でこれらタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野で周知である。上記ＦＬＵＶＩＲＩＮ^ＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬ^ＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣ^ＴＭ製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。

別の形態の不活性化抗原は、ビロソーム［４６］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、洗剤でのウイルスの可溶化、続いて、ヌクレオキャプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって、調製され得る。ビロソームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、それらの膜中においてリポソームにウイルスタンパク質を与えることを含む。

本発明の方法はまた、生ワクチンを精製するために使用され得る。このようなワクチンは、通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、上記流体は、遠心分離によって清澄化され得、緩衝液（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含む）で安定化され得る。インフルエンザウイルスワクチンの種々の形態が、現在利用可能である（例えば、参考文献４７の第１７章および第１８章を参照のこと）。生ウイルスワクチンとしては、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴ^ＴＭ製品（三価生ウイルスワクチン）が挙げられる。

上記ウイルスは、弱毒化され得る。上記ウイルスは、温度感受性であり得る。上記ウイルスは、低温適合（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）され得る。これら３つの特徴は、生のウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。

ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＨＡレベルを参照することによって標準化されている（代表的には、ＳＲＩＤによって測定される）。既存のワクチンは、代表的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量が、使用され得る（例えば、小児に関して、もしくは汎流行的状況において、またはアジュバントを使用する場合）。分割量（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ ＨＡ／株）、１／４および１／８）が使用されてきたことと同様に、より高い用量も使用されてきた（例えば、３×もしくは９×用量［４８、４９］）。従って、ワクチンは、０．１〜１５０μｇの間のＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは、０．１〜５０μｇの間（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど）を含み得る。特定の用量としては、１株あたり、例えば、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが挙げられる。

生ワクチンに関して、投与は、ＨＡ含有量よりむしろ、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ_５０）によって測定され、１株あたり１０^６〜１０^８の間の（好ましくは、１０^６．５〜１０^７．５の間の）ＴＣＩＤ_５０が、代表的である。

本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされる天然のＨＡ、もしくは改変ＨＡを有し得る。例えば、ＨＡを改変して、ウイルスをトリ種において非常に病原性にさせる決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りの非常に塩基性の領域）を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。

本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされる天然のＨＡ、もしくは改変ＨＡを有し得る。例えば、ＨＡを改変して、ウイルスをトリ種において非常に病原性にさせる決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りの非常に塩基性の領域）を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。

汎流行性間期の株に対して免疫化するために適しているのに加えて、本発明の組成物は、汎流行性もしくは潜在的に汎流行性の株に対して免疫化するために特に有用である。本発明は、ヒトおよび非ヒト動物にワクチン接種するのに適している。

抗原が上記組成物中に有用に含まれ得る他の株は、抗ウイルス治療に抵抗性である（例えば、オセルタミビル［５０］および／もしくはザナミビルに抵抗性である）株である（耐性汎流行性株を含む［５１］）。

本発明の組成物は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つもしくはこれ以上の）インフルエンザウイルス株（インフルエンザＡ型ウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢ型ウイルスを含む）に由来する抗原を含み得る。ワクチンが１より多くのインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、代表的には、別個に増殖させられ、上記ウイルスが採取された後に混合され、抗原が調製されてきた。従って、本発明のプロセスは、１より多くのインフルエンザ株に由来する抗原を混合する工程を包含し得る。三価ワクチンは、代表的である（２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。四価ワクチンもまた有用である［５２］（２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および２つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含むか、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。

（薬学的組成物）
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、１種以上の薬学的キャリアおよび／もしくは賦形剤を含む（このような成分の詳細な議論は、参考文献５３で入手される）。以下に記載されるように、アジュバントもまた含まれ得る。

ワクチン組成物は、一般に、水性形態にある。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形態、例えば、注射可能な固体、またはパッチ上の、乾燥したかもしくは重合した調製物の形態にあり得る。

ワクチン組成物は、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは、実質的に水銀物質を実質的に含まないべきである（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）ことが好ましい（例えば、チオメルサールを含まない［４４、５４］）。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、水銀化合物の代替として含まれ得る［４４］。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。

張度を制御するために、組成物は、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含み得ることは好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。

ワクチン組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間（好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間）の重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有さない重量オスモル濃度が以前に報告されている［５５］が、この範囲において重量オスモル濃度を維持することは好ましい。

ワクチン組成物は、１種以上の緩衝剤を含み得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントで）；またはクエン酸塩緩衝剤。緩衝剤は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。

ワクチン組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間（例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間）である。本発明のプロセスは、従って、バルクワクチンのｐＨを、パッケージ前に調節する工程を包含し得る。

上記ワクチン組成物は、好ましくは、無菌である。上記ワクチン組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）、好ましくは、＜０．１ ＥＵ／用量を含む）。上記ワクチン組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。

本発明のワクチン組成物は、洗剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム（特に、スプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために））を含み得る。上記洗剤は、微量においてのみ存在し得る。従って、上記ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々について１ｍｇ／ｍｌ未満で含み得る。他の残りの微量の成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。

ワクチン組成物は、１回の免疫化のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫化のための物質を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において好ましい。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。

インフルエンザワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与体積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。

組成物およびキットは、好ましくは、２℃〜８℃の間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、遮光して保持されるべきである。

（宿主細胞ＤＮＡ）
ウイルスが単離され、そして／または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株ＤＮＡのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記ＤＮＡの量を最小限にすることは、標準的な実施である。

従って、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ（好ましくは、１ｎｇ未満、より好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。

あらゆる残留宿主細胞ＤＮＡの平均長が５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることは、好ましい。

夾雑するＤＮＡは、標準的精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用するワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって）増強され得る。宿主細胞ＤＮＡ夾雑物を減らすための便利な方法は、２工程処理（第１は、ＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（これは、ウイルス増殖の間に使用され得る）を、次いで、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）（これは、ビリオン破壊の間に使用され得る）使用する）を含む参考文献５６および５７において開示される。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）での処理はまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、有利なことには、ビリオンを不活性化するためにも使用され得る［５８］。

（アジュバント）
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答（液性および／もしくは細胞性）を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径５μｍ未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）で達成されて、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。

前記エマルジョンは、動物（例えば魚類）供給源または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀類の穀粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。別の好ましい油は、α―トコフェロール（下記参照）である。

油の混合物を使用することができる。

界面活性剤をそれらの「ＨＬＢ」（親水親油バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸ^ＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートを含む（しかしこれらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ
８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、およびオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％および特に０．１％から１％または約０．５％である。

上記ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、上記ワクチンは、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、上記遊離界面活性剤が、上記抗原に対して「スプリット効果」を発揮し得、それによって、他の状態で存在し得る任意の非スプリットビリオンおよび／もしくはビリオン凝集物を破壊するので、有利である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る［５９］。

好ましいエマルジョンは、＜１μｍの平均液滴サイズ（例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、もしくはこれより小さい）を有し得る。これら液滴サイズは、便利なことには、微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）のような技術によって達成され得る。

本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。

・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの体積での組成は、約５％ スクアレン、約０．５％ ポリソルベート８０および約０．５％ Ｓｐａｎ ８５であり得る。重量では、これらの比は、４．３％
スクアレン、０．５％ ポリソルベート８０および０．４８％ Ｓｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、引用文献６３の第１０章および引用文献６４の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［６０〜６２］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。

・スクアレン、ＤＬ−α−トコフェロール、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これはまた、Ｓｐａｎ８５（たとえば、１％）および／またはレシチンを含み得る。これらエマルジョンは、２〜１０％ スクアレン、２〜１０％ トコフェロールおよび０．３〜３％
Ｔｗｅｅｎ ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供するからである。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の体積比もしくは約１１：５の重量比で存在し得る。１種のこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌ スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物を微小流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。上記エマルジョンはまた、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３−ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、０．５〜１０ｍｇ スクアレン、０．５〜１１ｍｇ トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ ポリソルベート８０を含み得る［６５］。

・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。

・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌ ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ α−トコフェロールスクシネート）の質量比でこれら３種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。

・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［６６］（０．０５〜１％ Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％ スクアラン、２．５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバントでのように［６７］（５％ スクアラン、１．２５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。微小流動化が好ましい。

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴のうちの少なくとも９０％（体積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［６８］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［６９］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。

・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［７０］。アジュバント添加ワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％ スクアレン、４％ ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％ Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ
８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル／カプリントリグリセリド）である。

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献７１に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。

・非代謝性の油（例えば、軽油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ））および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０もしくはＳｐａｎ ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献７２に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に添加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。

・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン［７３］。

・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［７４］。

・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［７４］。

いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即座に混合され得、従って、上記アジュバントおよび抗原は、パッケージされたもしくは配布されたワクチン（使用時に最終処方物の準備ができている）では別個に保持され得る。他の実施形態において、エマルジョンは、製造の間に抗原と混合され、従って、上記組成物は、液体アジュバント添加形態（ｌｉｑｕｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｆｏｒｍ）においてパッケージされる。上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、２種の液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための上記２種の液体の体積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般に、約１：１である。成分濃度が、上記の特定のエマルジョンの説明において与えられる場合、これら濃度は、代表的には、非希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。

（ワクチン組成物のパッケージング）
本発明の組成物（もしくはキット成分）に適した容器としては、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）、鼻スプレーなどが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。

組成物／成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、好ましくは、ガラス材料もしくはプラスチック材料から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでいてもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスから作製される。

バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルへと排出され得（例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために）、上記バイアルの内容物は、取り出されて上記シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジを取り出した後、次いで、ニードルが取り付けられ得、上記組成物が、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。

成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。安全ニードル（ｓａｆｅｔｙ ｎｅｅｄｌｅ）が好ましい。１インチ ２３ゲージ、１インチ ２５ゲージおよび５／８インチ ２５ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、記録保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期、および内容物の使用期限がプリントされ得るピールオフラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」^ＴＭの下で市販されるものである。

容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量の体積を示すために印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ体積を示す印を有し得る。

ガラス容器（例えば、シリンジもしくはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。

キットもしくは組成物は、（例えば、同じボックスの中に）上記ワクチンの詳細（例えば、投与の説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など）を含むリーフレットとともにパッケージされ得る。上記説明書はまた、警告（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持することなど）を含み得る。

（処置方法、および上記ワクチンの投与）
本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらワクチン組成物は、ヒト被験体もしくはヒト以外の動物被験体（例えば、ブタ）への投与に適しており、本発明は、上記被験体に本発明の組成物を投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用を提供する。

これら方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒトでの研究から、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関する（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集阻害力価が、同種のウイルスによる感染から約５０％防御を与える）ことが示された［７５］。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和によって、単一放射免疫拡散（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）（ＳＲＩＤ）によって、および／もしくは単一放射溶血（ＳＲＨ）によって、測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。

本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕もしくは脚への）によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内［７６〜７８］、経口［７９］、皮内［８０、８１］、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［８２］などが挙げられる。

本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、６ヶ月齢からの小児および成人での免疫化における使用に関して現在推奨されている。従って、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年齢（例えば、≦５歳）、入院している被験体、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍職員、妊婦、慢性疾患の、免疫不全の被験体、上記ワクチンを受ける７日前までに抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよびザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している被験体、卵アレルギーがある人々、および外国に旅行する人々である。上記ワクチンは、これらの群に適しているのみではないが、一般に、集団においてより多く使用され得る。汎流行性株については、すべての年齢群への投与が好ましい。

好ましい本発明の組成物は、効力についてＣＰＭＰ基準のうちの１つ、２つもしくは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧７０％血清保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２．５倍。高齢者（＞６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧６０％血清保有率；（２）≧３０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２倍。これら基準は、少なくとも５０名の患者でのオープンラベル研究に基づく。

処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび／もしくは追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて上記種々の用量は、同じ経路もしくは異なる経路によって与えられ得る（例えば、非経口の初回免疫（ｐｒｉｍｅ）および粘膜の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫など）。１より多くの用量の投与（代表的には、２用量）は、免疫学的に経験したことがない患者（例えば、これまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人に関して）において、または新たなＨＡサブタイプ（汎流行性アウトブレイクにおけるような）に対するワクチン接種のために、特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。

本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、ムンプス・ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間に）に患者に投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／もしくは髄膜炎菌ワクチンと実施的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。

同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／もしくはザナミビル）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間に）に、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸もしくは５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（ｅｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（そのエステル（例えば、そのエチルエステル）およびその塩（例えば、そのリン酸塩）を含む）が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート（１：１）（オセルタミビルホスフェート（ＴＡＭＩＦＬＵ^ＴＭ）としても公知）である。

（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

数値ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

別段示されなければ、２種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わせられ得るなど。

動物（および特にウシ）の物質が、細胞培養において使用される場合、それら物質は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。

化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置換され得る。

２つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列された場合、アミノ酸のパーセンテージが、上記２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献８３の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、アフィンギャップ検索と、キャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献８４に教示される。

２つの核酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列された場合、塩基のパーセンテージが、上記２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献８３の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントプログラムは、好ましくは、デフォルトパラメーター（これは、以下のとおりである：オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１）を使用する、ＧＣＧ Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｓｕｉｔｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１）である。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法であって、該方法は：
（ｉ）培養宿主を、第１のインフルエンザ株および第２のインフルエンザ株に感染させる工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の該培養宿主と、阻害因子とを、接触させる工程であって、ここで該阻害因子は、（ｉ）の該インフルエンザ株のうちの少なくとも一方のヘマグルチニン遺伝子および／もしくはノイラミニダーゼ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる、工程；
（ｉｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程、を包含する、方法。
（項目２）
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られた上記ウイルスを精製する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法であって、該方法は：
（ｉ）培養宿主を、少なくとも１つの標的セグメントを有する第１のインフルエンザウイルス株に感染させる工程；
（ｉｉ）該培養宿主に、第２のインフルエンザウイルス株に由来する標的セグメントをコードする１つ以上の発現構築物を導入する工程；
（ｉｉｉ）該培養宿主と、該第１のインフルエンザ株の標的セグメントの転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子とを、接触させる工程；
（ｉｖ）リアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程；ならびに必要に応じて、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた該ウイルスを精製する工程、を包含する、方法。（項目４）
（ａ）培養宿主を、項目１に記載の工程（ｉｉｉ）、項目２に記載の工程（ｉｖ）、または項目３に記載の工程（ｉｖ）もしくは工程（ｖ）において得られた上記ウイルスに感染させる工程；（ｂ）工程（ａ）からの該宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程；および（ｃ）工程（ｂ）において得られた該ウイルスを精製する工程、をさらに包含する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
インフルエンザウイルスを生成するための方法であって、該方法は：
（ａ）培養宿主を、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法によって得られたリアソータントインフルエンザウイルスに感染させる工程；
（ｂ）工程（ａ）からの該宿主を培養して、該ウイルスを生成する工程；および必要に応じて、
（ｃ）工程（ｂ）において得られた該ウイルスを精製する工程、を包含する、方法。
（項目６）
ワクチンを調製する方法であって、該方法は、（ａ）前述の項目のいずれかに記載の方法によってリアソータントウイルスを調製する工程、および（ｂ）該ウイルスからワクチンを調製する工程、を包含する、方法。
（項目７）
上記培養宿主は、孵化鶏卵である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
上記培養宿主は、哺乳動物細胞である、項目１〜４に記載の方法。
（項目９）
上記細胞は、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞もしくはＰｅｒＣ６細胞である、項目６に記載の方法。
（項目１０）
上記細胞は、付着して増殖する、項目７に記載の方法。
（項目１１）
上記細胞は、懸濁物中で増殖する、項目７に記載の方法。
（項目１２）
上記ＭＤＣＫ細胞は、細胞株ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
工程（ｂ）は、上記ウイルスを不活性化する工程を包含する、項目４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
上記ワクチンは、全ビリオンワクチンである、項目４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
上記ワクチンは、スプリットビリオンワクチンである、項目４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
上記ワクチンは、表面抗原ワクチンである、項目４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
上記ワクチンは、ビロソームワクチンである、項目４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
上記ワクチンは、１用量あたり、１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む、項目１〜４または６〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
上記インフルエンザ株のうちの少なくとも１つは、Ｈ１サブタイプ、Ｈ２サブタイプ、Ｈ５サブタイプ、Ｈ７サブタイプもしくはＨ９サブタイプである、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
上記株のうちの少なくとも１つは、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ３株、Ｈ９Ｎ２株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ７Ｎ１株もしくはＨ７Ｎ７株である、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
上記インフルエンザ株のうちの１つは、高増殖株である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
上記インフルエンザ株は、Ａ／ＰＲ／８／３４、ＡＡ／６／６０、ＡＡ／１／６６、Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／８３およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
発現構築物を含む細胞であって、該発現構築物は：
（ｉ）第１のインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザＢ型ウイルスのゲノムの８個のウイルスセグメントすべて；
（ｉｉ）第２のインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザＢ型ウイルスのゲノムのうちの少なくとも１つの標的セグメントであって、ここで該第２のインフルエンザ株の標的セグメントは、該第１のインフルエンザ株の標的セグメントとは配列において異なる、少なくとも１つの標的セグメント；ならびに
（ｉｉｉ）阻害因子であって、ここで該阻害因子は、該第１のインフルエンザ株における標的セグメントの転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる、阻害因子、
をコードする、細胞。

図１は、示されたｓｉＲＮＡとインキュベートした後のウイルス力価を示す。図１は、Ａ／ＰＲ８／３４のウイルス力価を示す。 図２は、示されたｓｉＲＮＡとインキュベートした後のウイルス力価を示す。図２は、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（Ｈ３Ｎ２）のウイルス力価を示す。

（発明を実施するための態様）
（実施例１）
リアソータントインフルエンザウイルスを、バックボーン株としてＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザ株を、およびワクチン株としてＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７様またはＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９様インフルエンザ株を使用して生成する。阻害因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＰＳＯもしくはＰＭＯ）を、これらが上記Ａ／ＰＲ／８／３４株のＨＡおよび／もしくはＮＡ遺伝子の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させるように、設計する。

上記阻害因子の適切性を、上記阻害因子を培養宿主に導入し、その後、上記培養宿主を、上記バックボーン株および上記ワクチン株に共感染させることによって試験する。タンパク質を、上記感染細胞から抽出し、上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質レベルの優先的な低下を、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質のタンパク質レベル、ならびに上記バックボーン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質のタンパク質レベルを定量的ウェスタンブロット分析で比較することによって評価する。

リアソータントインフルエンザウイルスを、上記阻害因子を上記培養宿主に導入し、上記培養宿主を、上記バックボーン株および上記ワクチン株に感染させることによって生成する。上記培養宿主を、上記リアソータントインフルエンザウイルスを生成するのに適した条件下で培養する。

（実施例２）
本発明の阻害因子を、上記バックボーン株の増殖に対するそれらの効果と、上記ワクチン株の増殖に対するそれらの効果とを比較することによって選択した。

以下のウイルス株を試験した：
・Ａ／ＰＲ／８／３４（バックボーン株）；および
・Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ （Ｈ３Ｎ２）（ワクチン株）。

それらを、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９の存在下でＡ／ＰＲ／８／３４を阻害するために設計したが、以下のｓｉＲＮＡを試験した：
・表１から、ＨＡ２、ＨＡ７−ＨＡ１２およびＨＡ１９（ＨＡを標的とする）；および
・表１から、ＮＡ４、ＮＡ６−ＮＡ９、ＮＡ１１、ＮＡ１２およびＮＡ２２（ＮＡを標的とする）。

実験コントロールは、処理なし（ＴＦなし、ｓｉＲＮＡなし）、トランスフェクションのみ（すなわち、ｓｉＲＮＡなし；ＴＦ、ｓｉＲＮＡなし）および上記ウイルスを標的としないコントロールｓｉＲＮＡ（Ｋ１、Ｋ２）。

上記ｓｉＲＮＡを、並行実験においてＭＤＣＫ細胞に導入した。その後、上記ＭＤＣＫ細胞を上記ウイルスに感染させ、上記ウイルス力価を測定した。

その結果を、図１および図２に示す。ＨＡを標的とするすべての試験したｓｉＲＮＡは、Ａ／ＰＲ／８／３４増殖の低下を示す。ｓｉＲＮＡであるＮＡ４、ＮＡ６、ＮＡ７、ＮＡ１２およびＮＡ２２は、Ａ／ＰＲ／８／３４増殖の低下を示す。ｓｉＲＮＡであるＨＡ７、ＨＡ８、ＨＡ１０、ＮＡ７、ＮＡ９、ＮＡ１１およびＮＡ１２は、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ増殖を有意に阻害しない。本発明の適切な阻害因子は、バックボーン株複製をブロックするが、上記ワクチン株の増殖を可能にする。従って、ｓｉＲＮＡであるＨＡ７、ＨＡ８、ＨＡ１０、ＮＡ７およびＮＡ９は、Ａ／ＰＲ／８／３４およびＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａを使用する場合に、本発明の適切な阻害因子である。

本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、改変が行われ得る一方で、本発明の範囲および趣旨内にとどまっていることが理解される。

＊以下の配列は、ＤＮＡ形式で提供され、各ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のみが示される。実験に関しては、本発明者らは、以下の配列に基づいて、二本鎖ＲＮＡ（すなわち、Ｇ、Ａ、ＣおよびＵリボヌクレオチド）を使用した。そして両方のｓｉＲＮＡ鎖は、それらの３’末端に、オーバーハングとして２個のさらなるＵヌクレオチドを含んだ。

（参考文献）

Claims (11)

1. 第１のウイルス株および第２のウイルス株に感染させた宿主細胞を含む培養物であって、該宿主細胞は、該第１のウイルス株または該第２のウイルス株の１つまたは複数の表面抗原の転写および／もしくは翻訳を優先的に低下させる核酸阻害因子と接触させられており、該第１のウイルス株および該第２のウイルス株がインフルエンザウイルス株である、培養物。
2. 前記培養物が、動物由来の生成物を含まない、請求項１に記載の培養物。
3. 前記培養物が、前記１つまたは複数の表面抗原に対する添加された抗体を含まない、請求項１に記載の培養物。
4. 前記核酸阻害因子が、合成アンチセンスオリゴマーである、請求項１に記載の培養物。
5. 前記核酸阻害因子が、ホスホロチオエートオリゴマー（ＰＳＯ）である、請求項１に記載の培養物。
6. 前記核酸阻害因子が、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である、請求項１に記載の培養物。
7. 前記核酸阻害因子が、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および低分子干渉ＤＮＡ（ｓｉＤＮＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の培養物。
8. 前記培養物が、孵化鶏卵である、請求項１に記載の培養物。
9. 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞またはトリ細胞である、請求項１に記載の培養物。
10. 前記１つまたは複数の表面抗原が、インフルエンザ表面抗原である、請求項１に記載の培養物。
11. 前記インフルエンザ表面抗原が、ＨＡおよび／もしくはＮＡである、請求項１０に記載の培養物。