JPWO2019044636A1 - リアソータントインフルエンザウイルスの段階的作出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.リアソータントインフルエンザウイルスの作出方法であって、以下に示す(1)〜(3)の少なくとも3種類のインフルエンザウイルスを用い、以下の工程(A)と工程(B)の少なくとも2段階のリアソート工程を含む事を特徴とする、抗原タンパク質(x)を含むインフルエンザウイルス(X)の作出方法:
(1)抗原タンパク質(x)を含む第1のインフルエンザウイルス;
(2)(1)のインフルエンザウイルスと類似する抗原性の抗原タンパク質(x')を有する第2のインフルエンザウイルス;
(3)(1)のインフルエンザウイルスと異なる抗原性の抗原タンパク質(y)を有する第3のインフルエンザウイルス:
工程(A)インフルエンザウイルス(2)と、インフルエンザウイルス(3)を宿主に感染させて共培養してリアソータントインフルエンザウイルスを作出し、該リアソータントインフルエンザウイルスから、抗原タンパク質(y)を有するインフルエンザウイルス(Y)を選択する工程;
工程(B)インフルエンザウイルス(1)と、前記工程(A)で作出したインフルエンザウイルス(Y)を宿主に感染させて共培養し、リアソータントインフルエンザウイルスを作出し、該リアソータントインフルエンザウイルスから抗原タンパク質(x)を有するインフルエンザウイルス(X)を選択する工程。
2.前記工程(A)のインフルエンザウイルス(2)と、インフルエンザウイルス(3)を共培養する前に、インフルエンザウイルス(3)に対して、初期感染能を有し、ウイルス増殖性が喪失又は低下する処理をする工程を含む、前項1に記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
3.前記工程(B)のインフルエンザウイルス(1)と、インフルエンザウイルス(Y)を共培養する前に、インフルエンザウイルス(1)に対して、初期感染能を有し、ウイルス増殖性が喪失又は低下する処理をする工程を含む、前項1又は2に記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
4.前記工程(A)における抗原タンパク質(y)を有するインフルエンザウイルス(Y)を選択する工程が、抗原タンパク質(x')に反応する抗体を接触させる工程を含む、前項1〜3のいずれかに記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
5.前記工程(B)における抗原タンパク質(x)を有するインフルエンザウイルス(X)を選択する工程が、抗原タンパク質(y)に反応する抗体を接触させる工程を含む、前項1〜4のいずれかに記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
6.前記工程(A)において、リアソータントインフルエンザウイルスから、抗原タンパク質(y)を有するインフルエンザウイルス(Y)を選択することを含む、前項1〜5のいずれかに記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
7.前記工程(B)において、リアソータントインフルエンザウイルスから、抗原タンパク質(x)を有するインフルエンザウイルス(X)を選択することを含む、前項1〜6のいずれかに記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
8.前項1〜7のいずれかに記載の作出方法により作出された、インフルエンザウイルス(X)。
9.抗原株インフルエンザウイルスとドナー株インフルエンザウイルスの少なくとも2種類のインフルエンザウイルス由来のタンパク質を含み、前記抗原株インフルエンザウイルスとドナー株インフルエンザウイルスが類似する抗原性を有することを特徴とする、リアソータントインフルエンザウイルス。
リアソータントインフルエンザウイルスの作出前において、インフルエンザウイルス(3)に対し、ウイルス初期感染能を有し、かつウイルス増殖性が喪失又は低下する処理を行う。具体的には、インフルエンザウイルス(3)に紫外線を照射し、インフルエンザウイルスを不活化する。紫外線の照射量は、紫外線照射後のインフルエンザウイルスが宿主への初期感染能は有しているが、感染後のウイルス増殖性が喪失又は低下している程度であることが好ましい。感染後のウイルス増殖性の喪失又は低下とは、第1のインフルエンザウイルスを単独で宿主に感染させた際に、宿主内でのウイルスの増殖性が確認されない、又は紫外線照射を行っていない第1のインフルエンザウイルスと比較してウイルス増殖性が低下していることを意味する。ウイルス増殖性は、ウイルス感染価、PFU(Plaque Forming Unit)等の公知の指標を用いて評価することができる。また、紫外線照射を行った後、第1のインフルエンザウイルスを宿主に感染させる場合は、宿主への感染能、すなわち初期感染能を有している必要がある。初期感染能がある状態とは、宿主が培養細胞である場合、紫外線照射したウイルスによるCPE(cytopathic effect)が観察されることを意味する。本工程では、Spectrolinker XL−1000(Spectronics Corporation)のTime Modeにおいて1〜60秒間、好ましくは5〜50秒間、更に好ましくは10〜40秒間、最も好ましくは10〜30秒間、紫外線照射を行った場合と同等の紫外線照射量を第1のインフルエンザウイルスに照射することが好ましい。かかるUV照射のために用いる装置(UV強度、光源からの距離等は以下実施例記載)及び照射時間等の照射条件は一例であり、当該照射条件と同程度の紫外線照射量となるのであれば、これらの条件は適宜調整・変更が可能である。上記条件の紫外線照射量であれば、宿主への初期感染能を有しているが、ウイルス増殖性が喪失又は低下しているインフルエンザウイルスを効率良く得ることができるため好ましい。本発明においては、宿主への初期感染能を有したまま、第1のインフルエンザウイルスのウイルス増殖性を喪失又は低下させることにより、宿主内での遺伝子組換え効率を向上させ得る。
インフルエンザウイルス(2)とインフルエンザウイルス(3)のリアソータントインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス(2)と前記紫外線照射したインフルエンザウイルス(3)とを宿主に感染させて共培養することにより作出することができる。
工程(A)−2で作出したリアソータントインフルエンザウイルスから抗原タンパク質(y)を有するインフルエンザウイルス(Y)の選択は、培養物中のリアソータントインフルエンザウイルスから抗原タンパク質(x')を含むインフルエンザウイルスを失活することより達成される。抗原タンパク質(x')を含むインフルエンザウイルスの失活は、物理的手法、化学的手法、その他のいかなる手法を用いて達成してもよいが、好ましくは工程(A)−2で作出したリアソータントインフルエンザウイルスを、抗原タンパク質(x')に反応する抗体で処理する事で達成される。上記得られた培養物そのものに、抗体で処理してもよい。
工程(A)−1と同様に、リアソータントインフルエンザウイルスの作出前において、インフルエンザウイルス(1)に対し、ウイルス初期感染能を有し、かつウイルス増殖性が喪失又は低下する処理を行う。紫外線を照射し、インフルエンザウイルスを不活化する。ウイルス増殖性が喪失又は低下する処理条件は、工程(A)−1の条件を参照することができる。
インフルエンザウイルス(1)とインフルエンザウイルス(Y)のリアソータントインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス(Y)と前記紫外線照射したインフルエンザウイルス(1)とを宿主に感染させて共培養することにより作出することができる。共培養条件は、工程(A)−2の条件を参照することができる。
工程(B)−2で作出したリアソータントインフルエンザウイルスから抗原タンパク質(x)を有するインフルエンザウイルス(X)の選択は、培養物中のリアソータントインフルエンザウイルスから抗原タンパク質(y)を含むインフルエンザウイルスを失活することより達成される。抗原タンパク質(y)を含むインフルエンザウイルスの失活は、具体的には工程(B)−2で作出したリアソータントインフルエンザウイルスを、抗原タンパク質(y)に反応する抗体で処理する事で達成される。上記得られた培養物そのものに、抗体で処理してもよい。抗体は、抗原タンパク質(y)と反応するものであればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗体として、インフルエンザウイルス(Y)に対する抗血清を用いてもよい。抗血清は最終希釈倍率として、好ましくは2〜1000倍、更に好ましくは4〜10倍となる濃度で、培養物に添加することが好ましい。かかる濃度の範囲内であれば、インフルエンザウイルス(Y)の抗原タンパク質と好適に反応し、当該抗原タンパク質を有するリアソータントインフルエンザウイルスを効率的に失活できる。なお、インフルエンザウイルス(Y)に対する抗血清はインフルエンザウイルス(2)に対する抗血清と同様の手法により作成し、入手することができる。
本実施例では、インフルエンザウイルス(1)〜(3)を用いた、2段階リアソート法によるインフルエンザウイルス(X)の作出方法を説明する。まず初めに、ドナー株としてインフルエンザウイルス(2)を用い、抗原株としてインフルエンザウイルス(3)を用いてリアソータントインフルエンザウイルスを作出し、再集合ドナー株としてインフルエンザウイルス(Y)を選択した。次に、前記再集合ドナー株を用い、抗原株としてインフルエンザウイルス(1)を用いてインフルエンザウイルス(X)を作出した。以下、各インフルエンザウイルスについて、株(1)、株(2)、株(3)、株(Y)及び株(X)のように記載する。
a)使用ウイルス
株(1)〜(3)及び株(Y)の使用ウイルスを表1に示す。株(Y)は、ドナー株として株(2)、抗原株として株(3)を用いてリアソータントインフルエンザウイルスを作出し、選択した株である。
炭酸水素ナトリウム(20mM)、0.1×TrypLE Selectを含有するイーグルMEM培地を用いた。
1)まず初めに株(X)を作出する前の一段階目のリアソータント法により、株(Y)を作出した。株(Y)作出のためのドナー株として株(2)、抗原株として株(3)を用いた。ウイルス培養用培地を用いて、107TCID50/mLのドナー株(2)溶液を調製するとともに、107TCID50/mLの抗原株(3)溶液をそれぞれ調製した。インフルエンザウイルス濃度(感染価:TCID50/mL)は、参考文献1に開示される方法に従って確認した。
2)抗原株(3)溶液を3.5cmディッシュに2mLずつ分注した。Spectrolinker XL−1000(Spectronics Corporation、UV管は254nm、8W×5本)の中に、1)のディッシュを入れ、ディッシュの蓋を外して、500J/m2のUV照射を行った。
3)25cm2フラスコで、MDCK細胞をコンフルエント(約5×106細胞/フラスコ)になるまで培養し、培地を取り除いて2)にてUV照射した抗原株200μLを接種して34℃、5%CO2にて30分間培養した。その後、10mLのウイルス培養用培地を添加し、ドナー株(2)溶液200μLを接種した。
4)34℃、5%CO2にて2日間培養した。
5)得られた混合培養液100μLと、抗株(2)血清100μLを混合し、34℃にて1時間静置した。
6)新たな25cm2フラスコでMDCK細胞を培養し、培地を10mLのウイルス培養用培地で交換し、上記5)にて抗株(2)血清にて処理した培養液200μL全量を接種した。
7)34℃、5%CO2にて2日間培養した。
8)得られた培養液を遠心分離(約8000×g、5分間)し、上清を回収した。
9)遠心上清をウイルス培養用培地で103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍に希釈し、MDCK細胞をコンフルエントまで培養した6−wellプレートに100μL/wellで接種した。接種は2枚のプレートに対して行った。
10)34℃、5%CO2にて30分間培養した。
11)0.8%アガロース含有MEM培地(グルタミン(4mM)、0.1×TrypLE Select含有)を3mL/well重層した。安全キャビネット内で乾燥させた後、インキュベーター内での培養を開始した。
12)34℃、5%CO2にて3日間培養した。
13)1.0%アガロース含有MEM培地(ニュートラルレッド含有)を2mL/well重層し、安全キャビネット内で乾燥した。
14)新たな6−wellプレートでMDCK細胞を培養し、2mL/wellのウイルス培養用培地で培地を交換し、各wellにプラークを単離し、株(Y)とした。
15)34℃、5%CO2にて3日間培養した。
16)単離したプラークの培養液を遠心分離(約8000×g、5分間)し、上清を−80℃にて保存した。得られたプラークの培養上清を株(Y)培養液とし、ウイルスRNAを抽出して遺伝子解析を行った。
実施例1で作出した2段階リアソータント法によるインフルエンザウイルス(X)について、各々遺伝子解析を行った。表1のA〜Dの4種類の組合せで作出したインフルエンザウイルス(X)について、各々3クローンを遺伝子解析対象とした。遺伝子解析は、単離した各プラークの培養上清からRNAを抽出し、逆転写をしてcDNAを合成し、定法に従ってPCRによりウイルスの全ゲノム分節を増幅して簡易精製した。これを検体として遺伝子配列解析を行い、各ゲノム分節がドナー株と抗原株のどちらに由来するかを判定した。
得られたリアソータントインフルエンザウイルス(X)のうち幾つかと、親株として用いたインフルエンザウイルス(1)を、75cm2フラスコでコンフルエントになるまで培養したMDCK細胞に接種した。ウイルス接種は、moi=0.001程度で行い、34℃、5%CO2にて3日間培養した後、培養上清を採取して感染価の測定を行った。
Claims (9)
- リアソータントインフルエンザウイルスの作出方法であって、以下に示す(1)〜(3)の少なくとも3種類のインフルエンザウイルスを用い、以下の工程(A)と工程(B)の少なくとも2段階のリアソート工程を含む事を特徴とする、抗原タンパク質(x)を含むインフルエンザウイルス(X)の作出方法:
(1)抗原タンパク質(x)を含む第1のインフルエンザウイルス;
(2)(1)のインフルエンザウイルスと類似する抗原性の抗原タンパク質(x')を有する第2のインフルエンザウイルス;
(3)(1)のインフルエンザウイルスと異なる抗原性の抗原タンパク質(y)を有する第3のインフルエンザウイルス:
工程(A)インフルエンザウイルス(2)と、インフルエンザウイルス(3)を宿主に感染させて共培養してリアソータントインフルエンザウイルスを作出し、該リアソータントインフルエンザウイルスから、抗原タンパク質(y)を有するインフルエンザウイルス(Y)を選択する工程;
工程(B)インフルエンザウイルス(1)と、前記工程(A)で作出したインフルエンザウイルス(Y)を宿主に感染させて共培養し、リアソータントインフルエンザウイルスを作出し、該リアソータントインフルエンザウイルスから抗原タンパク質(x)を有するインフルエンザウイルス(X)を選択する工程。 - 前記工程(A)のインフルエンザウイルス(2)と、インフルエンザウイルス(3)を共培養する前に、インフルエンザウイルス(3)に対して、初期感染能を有し、ウイルス増殖性が喪失又は低下する処理をする工程を含む、請求項1に記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
- 前記工程(B)のインフルエンザウイルス(1)と、インフルエンザウイルス(Y)を共培養する前に、インフルエンザウイルス(1)に対して、初期感染能を有し、ウイルス増殖性が喪失又は低下する処理をする工程を含む、請求項1又は2に記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
- 前記工程(A)における抗原タンパク質(y)を有するインフルエンザウイルス(Y)を選択する工程が、抗原タンパク質(x')に反応する抗体を接触させる工程を含む、請求項1〜3のいずれかに記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
- 前記工程(B)における抗原タンパク質(x)を有するインフルエンザウイルス(X)を選択する工程が、抗原タンパク質(y)に反応する抗体を接触させる工程を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
- 前記工程(A)において、リアソータントインフルエンザウイルスから、抗原タンパク質(y)を有するインフルエンザウイルス(Y)を選択することを含む、請求項1〜5のいずれかに記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
- 前記工程(B)において、リアソータントインフルエンザウイルスから、抗原タンパク質(x)を有するインフルエンザウイルス(X)を選択することを含む、請求項1〜6のいずれかに記載のインフルエンザウイルス(X)の作出方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の作出方法により作出された、インフルエンザウイルス(X)。
- 抗原株インフルエンザウイルスとドナー株インフルエンザウイルスの少なくとも2種類のインフルエンザウイルス由来のタンパク質を含み、前記抗原株インフルエンザウイルスとドナー株インフルエンザウイルスが類似する抗原性を有することを特徴とする、リアソータントインフルエンザウイルス。
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