CN101619306A - 乙型流感病毒Vero细胞高产适应株及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种乙型流感病毒Vero细胞高产适应株及其制备和应用。所述乙型流感病毒Vero细胞高产适应株命名为：B/Yunnan/2/2005va(B)，该毒株保藏号为：CGMCCNo.2931。该毒株能在Vero细胞上连续传代培养，并且血凝效价可保持在1∶512以上。经检测，该毒株为乙型流感病毒，Yamagata谱系。该毒株含有乙型流感病毒的八个基因片段，且具有Vero细胞上持续高产的特性。一方面，将该毒株接种于Vero细胞，收集培养物上清，即得乙型流感病毒疫苗，实验证实，该疫苗具有良好的免疫原性和保护效力。另一方面，该毒株也可作为供体毒株，通过自然选择压力重配或反向遗传学重配，得到流行株在Vero细胞上的适应株，从而制备出流行株Vero细胞流感疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种在Vero细胞上持续高产的乙型流感病毒高产适应株，还涉及由其制得的疫苗和重配Vero细胞适应株的制备方法，属于生物制品技术领域。
背景技术
乙型流行性感冒(流感)病毒是流感的主要病原之一。乙型流感病毒只有一个亚型，宿主特异性较强，至今只发现感染人和海豹。它和甲型流感病毒一样，也是依靠病毒外膜蛋白，特别是血凝素(hemagglutinin)的重链区(HA1)的变异，改变抗原特性来逃避机体已有的免疫保护，从而不断导致流感的流行。所以乙型流感病毒抗原是三价流感疫苗的重要组成部分。1990年就已经报道了世界范围内流行的乙型流感病毒，根据其抗原特性和HA1区的核苷酸序列，可以分为两大谱系(lineage)，代表的毒株分别为B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87(这两大谱系分别简称为Yamagata系和Victoria系)。
流感病毒(influenza virus)是一种能引起急性呼吸道疾病的病毒，具有高度传染性，主要经空气飞沫传播，因此它能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，乙型流感病毒一般引起地区性流感疫情的爆发，例如1994年我国北方流行的主要是Yamagata谱系，而南方流行的主要是Victoria谱系。两谱系间的抗原性存在一定差异。乙型流感病毒很少产生世界性大流行，但是乙型流感病毒的两个谱系间的基因和抗原性差别较大，所以需要对各谱系针对性较强的乙型流感疫苗。并且乙型流感病毒引起的发病率高并伴有一定的死亡率，是目前人类尚不能有效控制的传染病。
乙型流感病毒属于正粘病毒科，其病毒颗粒呈球形或丝状，核衣壳呈螺旋对称，病毒基因组为单股负链分节段的RNA，外有包膜，含有8个RNA片段。
乙型流感病毒表面抗原的变异是其流行的主要原因，常常发生抗原漂移，主要是通过在HA和NA基因上的点突变和多种氨基酸选择性突变，逃过机体的免疫作用和以前感染病毒后获得的抗体对病毒的抑制作用。抗原的漂移可以发生在各谱系内部，也可以发生在两个谱系之间。从而产生新的流行株，造成乙型流感的流行。
接种流感疫苗是预防乙型流感及其并发症的主要手段。1941年鸡胚制备的流感灭活疫苗在美国首次获得批准后，在全世界得到广泛应用。目前使用的流感疫苗主要是用鸡胚制备的灭活的流感三价裂解疫苗，包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒毒株。疫苗株的组分是由WHO根据每年全球流感病毒的变化规律推荐的用于下一年度疫苗生产用流感病毒流行株的表面抗原来确定的。经长期使用，灭活流感疫苗安全有效。但是，鸡胚作为培养基质生产流感疫苗需要复杂的纯化过程，以降低人们对鸡胚蛋白产生的变态反应；而且流感病毒在鸡胚中传代后病毒的血凝素抗原易产生变化使疫苗效力降低；另外乙型流感病毒在鸡胚上产量较低，同时鸡胚难于大规模生产以满足流感大部分地区流行突发性的需求；尤其是2003年以来全世界范围内高致病性禽流感的流行，使采用鸡胚生产流感病毒疫苗风险性增加。研究出能规模化培养的细胞流感疫苗已经成为流感疫苗重要研究方向，世界卫生组织敦促世界各国研究新的流感疫苗生产基质。
目前用于制备流感疫苗的哺乳动物细胞主要是MDCK细胞和Vero细胞，虽然MDCK细胞是培养和分离流感病毒的较好的哺乳动物细胞系，但其存在潜在的致瘤性，不适合作为疫苗生产基质。非洲绿猴肾细胞(Vero)是世界卫生组织推荐的疫苗生产细胞系，现在采用Vero细胞生产的疫苗已批准上市的有脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗、乙型脑炎疫苗等。其安全性通过验证。1998年奥地利科学家用Vero细胞研制纯化的流感全病毒灭活疫苗，免疫BALB/c小鼠后激发产生了较高的血凝抑制抗体。但Vero细胞并不是乙型流感病毒的敏感培养基质，产量较低且多数病毒不能在Vero细胞上连续增殖，从第二个代次后就很难得到较高的血凝效价。因此如何快速培育流感病毒Vero细胞高产适应株，且能够连续高产，成为了Vero细胞流感疫苗研发的难题。
综上所述，流感仍是人类尚不能有效控制的世界性传染病，接种流感疫苗是预防流感主要手段。目前使用鸡胚作为制备流感疫苗的基质，存在很多不足之处，如难以规模化生产、工艺复杂、还有外源因子污染的可能等缺点。因此，使用传代细胞如Vero细胞制备流感疫苗成为流感疫苗发展的重要方向，而如何快速培育流感病毒Vero细胞高产适应株是Vero细胞流感疫苗和地区流行流感疫苗研发的难题。
发明内容
本发明目的之一是克服现有技术的不足，提供一种乙型流感病毒Vero细胞高产适应株，该毒株在Vero细胞上传代培养，血凝效价可保持1∶512以上，由该毒株制备的灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性，且可作为三价细胞流感疫苗的一个组分。
本发明通过以下技术途径来实现：一种乙型流感病毒Vero细胞高产适应株，命名为正黏病毒科B型流感病毒B/Yunnan/2/2005va(B)，该毒株保藏号为CGMCC No.2931，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年3月4日。
本发明的目的之二是：提供制备保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株的方法。
本发明提供的保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株，是将采集得到的数十个野生乙型流感病毒毒株在Vero细胞上连续传代培养，培育25代之后得到的，它具有乙型流感病毒Yamagata谱系的特性和在Vero细胞上高产的性状。
本发明提供的保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株的基本特性是：
a：透射电镜观察到所得的流感病毒直径约为80-120nm，具有囊膜的较为典型的乙型流感病毒形态；
b：基因序列分析表明在连续传代培养过程中，该病毒基因组稳定，未发生变异；
c：该病毒在Vero细胞上连续传代，血凝效价能够维持在较高水平1∶512，且没有降低的趋势；
d：HI(血凝抑制实验)实验表明该毒株的HA抗原可被抗B型Yamagata谱系高免疫血清特异性识别；
e：该病毒自然感染SPF鸡，豚鼠，家兔，BALB/c小鼠，感染后无任何发病和死亡；
f：由B/Yunnan/2/2005va(B)病毒制备的灭活疫苗免疫豚鼠血清能够完全抑制B/Yunnan/2/2005va(B)和B型Yamagata谱系的其他毒株的血凝活性，同时能够部分抑制B型Victoria谱系毒株的血凝活性。
本发明所述保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株，经过下列方法获得：
1)将临床样本中分离获得的野毒株接种到已长成致密单层的Vero细胞上，以DMEM/F12或者MEM作为基础培养基，其中再添加TPCK-胰酶至浓度为0.2-1.5ug/ml、牛血清白蛋白至浓度为0.1-2ug/ml，调节培养液pH值为7-8；于33±1℃培养48-96h后，收获病毒液，完成第1次传代培养；
2)将上述第1代收获的病毒液再次接种到Vero细胞上，按1)步骤的方法培养后，收获病毒液；如此连续传代至25代时，收获病毒液，即得保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株。
所述1)步骤的培养液pH值7-8是用NaHCO3加以调节的。
本发明目的之三是提供保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株在制备乙型流感流行株的Vero细胞适应株中的应用。
本发明的目的之四是提供保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株在制备乙型流感灭活疫苗中的应用。
如上所述，保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株B/Yunnan/2/2005va(B)在Vero细胞上能够复制，无需通过鸡胚或MDCK细胞来生产疫苗，且产生高效价的流感病毒，其病毒基因组在连续传代过程中保持稳定。
以保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株B/Yunnan/2/2005va(B)为工作种子，利用现有技术的常规细胞疫苗制备方法制得的乙型流感灭活疫苗具有下列免疫保护作用：由该毒株感染Vero细胞培养物上清制备的灭活苗，以0.5ml剂量腹部皮下免疫接种体重为360-400克的豚鼠，同时做阴性对照组，在以乙型流感病毒Yamagata谱系活病毒做半数致死剂量的滴鼻途径感染的致死性攻击实验中，疫苗组的豚鼠存活率为100％，而阴性对照组豚鼠的存活率为0％。实验表明B/Yunnan/2/2005va(B)疫苗免疫接种后，对乙型流感病毒Yamagata谱系的致死性攻击具有很好的免疫保护效果。
本发明所得疫苗加上药物学上可接受的佐剂后，采用常规疫苗制备方法可制成乙型流感疫苗。
试验证明：接种B/Yunnan/2/2005va(B)疫苗，能够诱导豚鼠产生高效价的HI抗体。豚鼠皮下接种0.5ml疫苗，以血凝抑制试验检测HI抗体效价。接种后一周可诱导产生具有保护作用的特异的HI抗体，抗体效价在4-5周可达1∶128左右。
本发明的乙型流感疫苗具有以下优点：1)该疫苗对乙型流感病毒Yamagata谱系的毒株具有很好的保护效果。2)该疫苗来源于Vero细胞培养物，克服了来源鸡胚或MDCK等存在的众多缺陷因素。3)该疫苗对SPF鸡，豚鼠，家兔，BALB/c小鼠无致病性，使用安全。4)该疫苗株在Vero细胞上的产量，血凝效价可达1∶512，而在鸡胚中的效价仅为：1∶64，产量大大提高。5)疫苗免疫后能够诱导产生高效价的HI抗体。
本发明的目的之五是提供一种制备乙型流感流行株的Vero细胞适应株的方法，以使用这一适应株制备Vero细胞流感疫苗。
即以保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株作为供体株，与乙型流感流行株重配后，获得乙型流感流行株的Vero细胞适应株，最终使用这一适应株制备Vero细胞流感疫苗或Vero细胞区域流行流感疫苗。
本发明提供的保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株与流行株用传统方法重配制备乙型流感病毒Vero细胞适应株的方法，包括以下步骤：
1)以保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株作为供体株，并与流行的乙型流感病毒Victoria谱系的毒株进行混合；
2)将上述混合物接种于9～10日龄SPF鸡胚或者Vero细胞或者MDCK细胞上，其中：接种SPF鸡胚时，每胚接种0.1-0.3ml，于33±1℃孵育12-48h，2-8℃过夜冷胚，收集鸡胚尿囊液即为病毒收获液；接种Vero细胞时，每个小方瓶接种量为0.05-0.2ml，置于33±1℃培养48-96h，收获病毒液；接种MDCK细胞时，每个小方瓶接种量为0.05-0.2ml，置于33±1℃培养48-96h，收获病毒液；
3)在2)步骤收获的病毒液中加入抗B/Yunnan/2/2005va(B)的抗血清至浓度为1％-85％，具体浓度由抗体血凝抑制效价和病毒的血凝效价而定，接种在Vero细胞上传代培养1次；或者将2)步骤收获的病毒液不加抗血清直接接种在Vero细胞上传代培养1次；
4)重复3)步骤至能够产生较高效价(效价水平在1∶128以上)的病毒液，并能够在Vero细胞上连续传代3代以上，同时通过“血凝抑制实验”判定为是流行株的流感病毒，从而选育出流行株的Vero细胞适应株；
5)将4)步骤所得适应株用现有技术的常规方法制备Vero细胞乙型流感疫苗或Vero细胞区域流行流感疫苗。
所述1)步骤的以保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株作为供体株，与流行的乙型流感病毒Victoria谱系的毒株是按比例进行混合的，具体比例由病毒血凝效价和不同毒株生长特性而决定。
本发明提供的保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株与流行株用反向遗传学技术重配制备流感病毒Vero细胞适应株的方法，包括以下步骤：
1)以保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株的6个内部基因(分别为：PB1，PB2，PA，NP，M，NS)分别克隆于双向转录载体中，分别获得6个内部基因的重组质粒；
2)将流行株的HA和NA表面蛋白基因同样克隆于双向转录载体中，获得HA和NA表面蛋白基因的重组质粒；
3)将上述1)和2)的8个质粒混合，共转染在哺乳动物细胞293T或者COS或者MDCK上，或者转染在MDCK与293T的混合细胞上、或者MDCK与COS的混合细胞上，培养18-24h，取细胞培养物上清，即获得流行株的Vero细胞适应株；
4)将3)步骤所得适应株用现有技术的常规方法制备Vero细胞乙型流感疫苗或Vero细胞区域流行流感疫苗。
所述双向转录载体为流感病毒基因双向转录载体pHW2000。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1)Vero细胞高产株B/Yunnan/2/2005va(B)可以采用Vero细胞作为培养病毒的基质。制备流感疫苗和地区流行流感疫苗。此较目前以鸡胚作为培养基质生产流感疫苗具有以下优点：①可以同微载体发酵罐大规模培养Vero细胞相结合起来。可以大规模培养乙型流感病毒，生产工艺易于标准化；②采用标准化的Vero细胞，不含外源生物因子污染；③不含易于引起人体过敏的鸡胚蛋白；④避免了流感病毒在鸡胚培养后病毒的血凝素抗原易产生变化使疫苗效力降低；⑤在流感大流行突发性时，不受鸡胚来源的影响，能够生产出足够的疫苗满足需求。
2)Vero细胞培养流感病毒制备流感疫苗最大制约因素是直接将生产用毒种接种Vero细胞其产毒量低或产量不稳定。我们从临床样本中分离获得流感病毒，并将病毒在Vero细胞进行连续传代培养培育了一株乙型流感病毒Vero细胞稳定高产株B/Yunnan/2/2005va(B)。将其作为母株与流行株流感病毒通过自然选择压力重配或反向遗传学重配来获得Vero细胞流感疫苗生产用毒种，突破了乙型流感病毒对Vero细胞不适应这一制约因素。或者以该毒株的基因序列为模板对流行株进行基因改造来获得Vero细胞疫苗生产用毒种，促进Vero细胞流感疫苗的开发与应用。
附图说明
图1为B/Yunnan/2/2005va(B)在Vero细胞上连续传代的血凝效价图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明方法，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例1
保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株的制备方法：
1)将临床样本中分离获得的乙型流感病毒接种到已长成致密单层的Vero细胞上，以DMEM/F12作为基础培养基，其中再添加TPCK-胰酶至浓度为1ug/ml，牛血清白蛋白至浓度为1ug/ml，以NaHCO3调节培养基pH值为7.5；于33±1℃培养72h后，收获病毒液，完成第1次传代培养；
2)将第1次传代培养收获的病毒液再次接种到Vero细胞上，用与1)步骤相同的方法及条件进行培养后，收获病毒液；如此在Vero细胞上连续传代，传代至25代时，收获病毒液即得流感病毒Vero细胞高产适应株，血凝效价保持在1∶512以上，该毒株命名为：B/Yunnan/2/2005va(B)，该毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
乙型流感病毒Vero细胞适应毒株B/Yunnan/2/2005va(B)的相关试验数据见图1。证明B/Yunnan/2/2005va(B)毒株具有在Vero细胞上高效稳定增殖的特性。动物试验已证明B/Yunnan/2/2005va(B)毒株具有良好的免疫原性。以此株作为供体株，与其它流行株重配后获得流行株的Vero细胞适应株，以用于Vero细胞流感疫苗和Vero细胞地区流行流感疫苗的开发与应用。
实施例2
流感病毒B/Yunnan/2/2005va(B)在无血清培养Vero细胞上连续传代保持稳定高产。
1)将实施例1所得的流感病毒Vero细胞适应株B/Yunnan/2/2005va(B)接种到无血清培养的已长成致密单层的Vero细胞上，接种量为每小方瓶0.2ml，维持母液成分为：SFM(Hyclone)，TPCK-胰酶0.5ug/ml，牛血清白蛋白1.5ug/ml，用NaHCO3调整pH值至7.2，置于33±1℃培养72h，收获病毒液，即完成第1代培养；
2)将上述1)步骤所得的第1代收获的病毒液再次接种到无血清培养的Vero细胞上，采用与1)相同的方法及条件进行培养后，收获病毒液；如此在Vero细胞上连续种毒传代，每代收获液反复冻融三次后测其血凝效价，血凝效价维持在1∶512以上，表明毒株B/Yunnan/2/2005va(B)具有Vero细胞高产稳定特性。
实施例3
以实施例1所得的流感病毒Vero细胞高产适应株B/Yunnan/2/2005va(B)作为供体株，并与B/xinjian/1/2006重配获得乙型流感病毒Victoria谱系毒株的Vero细胞适应株的方法：
1)流感病毒重配
将Vero细胞非适应株B/xinjian/1/2006(Victoria谱系)与流感病毒Vero细胞适应株B/Yunnan/2/2005va(B)按9∶1体积比混合，接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚接种0.2ml，33±1℃孵育24h，2℃过夜冷胚，收集鸡胚尿囊液即为病毒收获液；
2)重配后流感病毒B/xinjian/1/2006(Victoria谱系)Vero细胞适应株的选育
将1)步骤收获的病毒液与抗体血凝抑制效价为1∶640的抗B/Yunnan/2/2005va(B)的抗血清按2∶1的体积比混合，37℃中和2小时后，接种到Vero细胞上培养48h，收获病毒液；再将收获的病毒液同比例加入相同抗血清混合，37℃中和2小时后，接种到Vero细胞上培养48h，收获病毒液；再将收获的病毒液不加抗血清，在Vero细胞上再连续传10代，最终获得第12代细胞种毒收获液；
3)血清学鉴定病毒型别
取第12代收获的病毒液，测其血凝效价并配置成4个血凝单位抗原，用H3N2阳性血清、H1N1阳性血清、B型(Victoria谱系)阳性血清、B型(Yamagata谱系)阳性血清与病毒液以半加敏法进行血凝抑制试验(HI)。经鉴定：B型(Victoria谱系)阳性血清对重配后的毒株血凝抑制效价为1∶512，所以该重配后的毒株为乙型流感病毒且为Victoria谱系，以此株可用于Vero细胞流感疫苗的制备，或者以此株再次作为供体株与其他流行株重配，从而获得流行株的Vero细胞适应株。
实施例4
将实施例1所得的流感病毒Vero细胞高产适应株B/Yunnan/2/2005va(B)，用反向遗传学技术重配获得B/xinjian/1/2006(Victoria谱系)流感病毒Vero细胞适应株的方法：
1)将实施例1所得的流感病毒Vero细胞高产适应株B/Yunnan/2/2005va(B)的6个内部基因(分别为：PB1，PB2，PA，NP，M，NS)克隆于双向转录载体PHW2000；
2)将非流感病毒Vero细胞适应株B/xinjian/1/2006(Victoria谱系)的HA和NA表面蛋白基因克隆于双向表达载体PHW2000；
3)将流感病毒B/Yunnan/2/2005va(B)的6个内部基因质粒与B/xinjian/1/2006的HA和NA表面蛋白基因质粒共8个混合，每个质粒含量为2μg，与脂质体8ul混匀后，共转染生长18～24小时，于致密单层的COS细胞，培养24h，收获培养物上清，测其血凝效价为1∶64，获得具有B/xinjian/1/2006的HA的流感病毒Vero细胞适应株，此株用于Vero细胞流感疫苗的制备及地区流行流感疫苗的制备。
实施例5
本发明疫苗免疫原性试验
体重为360-400克的豚鼠皮下接种B/Yunnan/2/2005va(B)感染Vero细胞培养上清制备的灭活疫苗。免疫4周后做血凝抑制试验。以血凝抑制(HI)试验检测血清中的HI抗体效价。效果如表1.结果表明以B/Yunnan/2/2005va(B)感染Vero细胞培养上清制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性。
表1：B/Yunnan/2/2005va(B)免疫豚鼠4周后HI抗体水平
实施例6
本发明疫苗保护效力试验
体重为360-400克的豚鼠腹部皮下免疫接种B/Yunnan/2/2005va(B)感染Vero细胞培养病毒悬液制备的灭活疫苗。免疫方案为第1天接种一次疫苗。实验组豚鼠和对照组豚鼠在接种后的第三周进行病毒攻击实验，攻击实验用100个单位的半数致死剂量的乙型流感病毒B/huaiyin/1/2006活病毒进行。在14天的观察期后计算死亡/存活率，结果见表2.
表2：B/Yunnan/2/2005va(B)疫苗免疫接种豚鼠攻击实验的免疫保护性
实验证实，由B/Yunnan/2/2005va(B)制备的乙型流感灭活疫苗对乙型流感病毒Yamagata谱系具有良好的保护效力。
Claims (7)
1、一种乙型流感病毒Vero细胞高产适应株，该毒株保藏号为CGMCC No.2931。
2、一种制备如权利要求1所述的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株的方法，其特征在于经过下列步骤：
1)将临床样本中分离获得的野毒株接种到已长成致密单层的Vero细胞上，以DMEM/F12或者MEM作为基础培养基，其中再添加TPCK-胰酶至浓度为0.2-1.5ug/ml、牛血清白蛋白至浓度为0.1-2ug/ml，调节培养液pH值为7-8；于33±1℃培养48-96h后，收获病毒液，完成第1次传代培养；
2)将上述第1代收获的病毒液再次接种到Vero细胞上，按1)步骤的方法培养后，收获病毒液；如此连续传代至25代时，收获病毒液，即得保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株。
3、如权利要求1所述乙型流感病毒Vero细胞高产适应株在制备乙型流感流行株的Vero细胞适应株中的应用。
4、如权利要求1所述乙型流感病毒Vero细胞高产适应株在制备乙型流感灭活疫苗中的应用。
5、一种用权利要求1所述乙型流感病毒Vero细胞高产适应株制备乙型流感病毒Vero细胞适应株的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株作为供体株，并与流行的乙型流感病毒Victoria谱系的毒株进行混合；
2)将上述混合物接种于9～10日龄SPF鸡胚或者Vero细胞或者MDCK细胞上，其中：接种SPF鸡胚时，每胚接种0.1-0.3ml，于33±1℃孵育12-48h，2-8℃过夜冷胚，收集鸡胚尿囊液即为病毒收获液；接种Vero细胞时，每个小方瓶接种量为0.05-0.2ml，置于33±1℃培养48-96h，收获病毒液；接种MDCK细胞时，每个小方瓶接种量为0.05-0.2ml，置于33±1℃培养48-96h，收获病毒液；
3)在2)步骤收获的病毒液中加入抗B/Yunnan/2/2005va(B)的抗血清至浓度为1％-85％，接种在Vero细胞上传代培养一次；或者将2)步骤收获的病毒液不加抗血清直接接种在Vero细胞上传代培养一次；
4)重复3)步骤至能够产生较高效价，即效价水平在1∶128以上的病毒液，并能够在Vero细胞上连续传代3代以上，同时判定其是流行株的流感病毒，从而选育出流行株的Vero细胞适应株；
5)将4)步骤所得适应株用现有技术的常规方法制备Vero细胞乙型流感疫苗或Vero细胞区域流行流感疫苗。
6、一种用权利要求1所述乙型流感病毒Vero细胞高产适应株制备乙型流感病毒Vero细胞适应株的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以保藏号为CGMCC No.2931的乙型流感病毒Vero细胞高产适应株的6个内部基因，即：PB1，PB2，PA，NP，M，NS分别克隆于双向转录载体中，分别获得6个内部基因的重组质粒；
2)将流行株的HA和NA表面蛋白基因同样克隆于双向转录载体中，获得HA和NA表面蛋白基因的重组质粒；
3)将上述1)和2)的8个质粒混合，共转染在哺乳动物细胞293T或者COS上，或者转染在MDCK与293T的混合细胞上、或者MDCK与COS的混合细胞上，培养18-24h，取细胞培养物上清，即获得流行株的Vero细胞适应株；
4)将3)步骤所得适应株用现有技术的常规方法制备Vero细胞乙型流感疫苗或Vero细胞区域流行流感疫苗。
7、如权利要求6所述用乙型流感病毒Vero细胞高产适应株制备乙型流感病毒Vero细胞适应株的方法，其特征在于所述双向转录载体为流感病毒基因双向转录载体pHW2000。
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