CN111363045A

CN111363045A - 一种流感、hiv嵌合蛋白及嵌合病毒疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN111363045A
Application number: CN202010098738.1A
Authority: CN
Inventors: 刘刚; 张鹏飞
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2020-02-18
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-02-18
Also published as: CN111363045B

Abstract

本发明公开了一种流感、HIV嵌合蛋白及流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，具体步骤包括以下：利用活的流感病毒来进一步感染可以稳定表达融合蛋白(gp120‑HA2)的哺乳动物细胞系，最终获得能够在病毒囊膜上定向展示gp120‑HA2融合蛋白的流感、艾滋(HIV)嵌合病毒，用作灭活疫苗，以同时抵抗流感病毒和艾滋病毒对机体的侵染。

Description

一种流感、HIV嵌合蛋白及嵌合病毒疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种流感、HIV嵌合病毒疫苗的制备方法以及(gp120-HA2)融合蛋白的设计，属于一种新型的嵌合疫苗，属于疫苗生产技术领域。

背景技术

流感病毒的传播和不断变异严重威胁到国家的公共卫生安全。尤其是最近几年，禽流感病毒的不断变异以及在人群中的爆发，导致了极高的死亡率，禽流感病毒可能会在未来进一步地获得人与人之间传播与扩散的能力，这将成为了未来人类社会的最大可能的威胁。目前我国大多数流感疫苗生产厂家还是以鸡胚为主要的繁殖病毒的基质。该工艺对健康、无菌的鸡胚存在很大的依赖性，鸡胚的供应量可能无法满足大规模疫情爆发时所需要的生产条件，进而可能导致流感病毒疫苗的产量不足，无法保障能快速地为全社会提供充足的疫苗供给。因此，开发出以哺乳动物细胞发酵为基础的疫苗生产体系，能够极大地弥补鸡胚供应不足的限制，有效地提高了流感疫苗生产的产量。

为了能够利用细胞发酵技术以工业化生产优质的流感疫苗，研究人员研发并采用优化的微载体细胞悬浮培养、无血清培养、优化细胞培养密度或工程化改造细胞系等方法，以进一步地提高基于细胞培养的流感疫苗产量。流感病毒血凝素HA蛋白，由球状区HA1结构域和茎部区HA2结构域组成，HA1约有320个氨基酸,由一些不平行的折叠构成球状头部；HA2约有240个氨基酸,和部分HA1区一同组成茎部三聚体区域,含有多股螺旋结构,其C端含有细胞膜锚定序列以及膜融合多肽等功能单位。

人类免疫缺陷病毒(HIV)目前仍在全球大规模的传播，并每年导致大量感染者的死亡与发病，艾滋病人已经成为了各个国家沉重的负担，每年投入在艾滋病预防、治疗的经费，仍然不断增加。然而，艾滋病的治疗甚至艾滋病疫苗仍然还是处于研发阶段。虽然疫苗被认为是预防病毒性传染病的最有效的武器。不幸的是，HIV属于逆转录病毒，极容易产生突变，能够发生快速的抗原转变并形成不同血清型的各种复杂毒株。如何生产出针对各种血清型的HIV毒株都具有交叉保护效果的HIV疫苗，已经成为了疫苗研发领域中的最严峻的挑战。传统的制备化学灭活以及减毒疫苗的生产方法已经被证明无法生产出具备广谱保护效力的HIV-1疫苗。使用新的疫苗抗原展示平台，开发出有效的HIV疫苗，是未来重要的研究方向之一。基于以上背景，生产出能够同时抵抗流感病毒与艾滋病毒的新型疫苗载体具有良好的市场发展潜力。

发明内容

本发明的主要目的，在于制备能够在流感病毒囊膜上定向展示gp120-HA2融合蛋白的流感、艾滋(HIV)嵌合病毒，用作灭活疫苗，以同时抵抗流感病毒和艾滋病毒对机体的侵染。

本发明的另一目的，在于提供gp120-HA2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供所述的gp120-HA2融合蛋白在制备流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗中的用途。

本发明所述的流感、HIV嵌合蛋白(gp120-HA2融合蛋白)是由流感病毒血凝素蛋白(HA蛋白)的HA2区结构域与HIV病毒囊膜蛋白gp120相融合而得到的。血凝素蛋白的HA2区结构域可以保证融合蛋白(gp120-HA2)自发地嵌入到流感病毒的囊膜上，并形成三聚体结构，从而以三聚体的形式正确展示HIV的gp120蛋白。

该融合蛋白(gp120-HA2)属于一型跨膜蛋白，从N端到C端分别由流感病毒HA蛋白的信号肽、HIV的囊膜蛋白gp120、流感病毒HA蛋白的HA2区构成。此外HA2结构域还包含了流感HA蛋白的跨膜区(TMD)以及和胞质区(CPD)。gp120-HA2的具体结构如实施例中的图1的样本。此融合蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明公开一种流感、HIV嵌合病毒，此新型嵌合病毒能够在天然流感病毒的囊膜上进一步地展示gp120-HA2融合蛋白，该融合蛋白是通过流感病毒HA2的跨膜区和胞质尾，从而特异性地嵌入到病毒囊膜的磷脂双分子层膜中，并且可以自发地形成三聚体的gp120-HA2膜蛋白，将gp120展示在天然流感病毒的外表面，最终获得高滴度的流感、HIV嵌合病毒。

本发明公开一种流感、HIV嵌合病毒疫苗的制备方法，其制备过程包括以下三个步骤：

S1:使用携带外源基因质粒(PLV-gp120-HA2)慢病毒感染哺乳动物细胞系，在一定浓度的嘌呤霉素的筛选下，获得可以在细胞质膜上稳定地表达流感、艾滋(HIV)囊膜融合蛋白(gp120-HA2)的细胞株；

S2:将活的流感病毒接种在此基因工程改造的稳转细胞株，并加入TPCK-胰酶培养48至72h，利用流感病毒从细胞质膜出芽的机理，最终使得重组的囊膜融合蛋白(gp120-HA2)展示在该流感病毒的囊膜上，从而获得高滴度的流感HIV嵌合病毒；

S3:超速离心获得流感HIV嵌合病毒，并灭活该嵌合病毒，用作能够同时抵抗流感病毒以及艾滋病毒的双价疫苗。

本发明嵌合病毒的灭活操作可以使用去氧胆酸钠、Triton-X100或吐温80等化学表面活化剂，对嵌合病毒进行裂解作用；或直接向此嵌合病毒悬液加入甲醛溶液对嵌合病毒进行灭活处理，处理后的病毒可以通过透析、过滤或者离心的方式进一步被分离纯化。

本发明涉及到一种在流感、HIV嵌合病毒的制备过程中所使用的稳定表达细胞株，该哺乳动物细胞株不仅可以用于流感病毒的繁殖和大规模工业化生产，而且还能够定向表达gp120-HA2融合蛋白到哺乳动物细胞的质膜上。通过构建可以稳定地表达流感、艾滋(HIV)囊膜融合蛋白(gp120-HA2)的细胞株，再利用活的流感病毒对此稳转细胞系的感染，当流感病毒从细胞质膜出芽的过程中，最终使得重组表达的囊膜融合蛋白(gp120-HA2)嵌入在该流感病毒的囊膜上，从而产生可以展示gp120-HA2膜蛋白的嵌合病毒。该基因工程改造后的哺乳动物细胞系包括常用的流感病毒生产细胞系，如VERO细胞、MDCK细胞、CHO细胞以及HEK293T细胞系等。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为gp120-HA融合蛋白的结构设计示意图；

图2为稳转MDCK细胞株的免疫荧光实验；

图3嵌合病毒中的GP120的WB检测；

图4为小鼠抗血清对H1N1流感病毒的中和实验；

图5为小鼠抗血清对HIV的中和实验。

具体实施方式

本发明一种流感、HIV嵌合病毒灭活疫苗的制备方法包括以下具体步骤：

(1)流感病毒在哺乳动物细胞中的体外培养与保存：先把欲培养病毒标本用PBS缓冲液稀释到合适浓度后,加入抗生素,然后用移液器将流感H1N1病毒接种入含有细胞液的细胞,放置37℃培养48-72h后,收集上清并4000rpm/min离心5min后，再将上清液转移到新的离心管中，分装后并放置于负80℃的冰箱中保存。哺乳动物细胞一般选择常用的流感病毒生产细胞系，如VERO细胞、MDCK细胞、CHO细胞。

(2)携带外源基因质粒(PLV-gp120-HA2)的慢病毒的包装：质粒转染前，将HEK293T细胞接种到一个直径10cm的细胞培养皿中，接种细胞数量应以转染当天的细胞生长达到90％左右的汇合度为佳。gp120-HA2基因的构建如图1所示。

该融合蛋白(gp120-HA2)属于一型跨膜蛋白，从N端到C端分别由流感病毒HA蛋白的信号肽、HIV的囊膜蛋白gp120、流感病毒HA蛋白的HA2区构成.此外HA2结构域还包含了流感HA蛋白的跨膜区(TMD)以及和胞质区(CPD)。其具体结构如图1所示。此融合蛋白的具体氨基酸序列如下：

(gp120-HA蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：1)：

根据SEQ ID NO：2合成DNA序列，由和元生物技术(上海)股份有限合成。

编码gp120-HA蛋白的DNA序列(SEQ ID NO：2)：

质粒转染方法如下：使用无血清Opti-MEM培养液溶解包装质粒混合物，其中质粒溶液中含有的PLV-gp120-HA2、VSVG、Rev以及Gag四种质粒的比例为1:2:2:1。将质粒混合溶液与Lipofectamine2000转染试剂按照说明书进行混合，最终静置半小时后，形成DNA-Lipofectamine2000转染复合物。然后，再将此转染复合物滴加到HEK 293T细胞中，将细胞放置37℃培养48-72h后，收集含有病毒的培养液。4℃、3000rpm离心15分钟，低速离心病毒上清，以去除细胞碎片，回收上清。将48小时上清液，并用0.45微米的滤器过滤此上清液，并分装后并放置于负80℃的冰箱中保存。

(3)稳定表达gp120-HA2融合蛋白的MDCK细胞系的构建：向MDCK细胞加入4mL的DMEM培养基(含有10％的FBS),并再向此细胞再加入4ml病毒上清液(病毒上清液中需要提前加入3μg/mL的ployprene),MDCK细胞培养24h后，可以补加3mL的新鲜DMEM培养液，以保证MDCK细胞处于良好的生长状态；细胞转染后56h，为细胞更换新鲜培养基约10mL，并加入3-5μg/mL的嘌呤霉素，培养2周后可以获得稳定表达gp120-HA2融合蛋白的MDCK细胞系。图2中的免疫荧光实验(抗GP120抗体)表明稳转细胞系MDCK能够表达融合蛋白(gp120-HA)在细胞的质膜上。

(4)流感、HIV嵌合病毒的体外生产：将来源于鸡胚培养的H1N1流感病毒或其他型别的流感病毒(104TCID50),直接接种于改造后的、稳定表达gp120-HA2融合蛋白的MDCK细胞系(109个细胞)，并加入TPCK-胰酶(3-5μg/mL)，在无血清的DMEM培养基中进行培养。当流感病毒从细胞质膜出芽时，能够保障融合蛋白(gp120-HA2)自发地嵌入到流感病毒的囊膜上，并形成三聚体结构，从而以三聚体的形式正确地展示HIV的gp120蛋白展示在该流感病毒的囊膜上，最终收集细胞感染后56-72h后的上清液，4℃，30,000-40,000g超速离心后以获得高滴度的流感、HIV嵌合病毒。

(5)流感、HIV嵌合病毒的纯化：将离心后的病毒重新使用PBS进行悬浮(4℃)，先使用5000rpm/min离心10min,去除细胞碎片和杂质。然后收集上清并且利用尺寸排阻层析柱，对嵌合病毒进一步地分离纯化。嵌合病毒裂解后，对其裂解液使用WB检测其GP120蛋白是否展示在嵌合病毒上。图3显示嵌合病毒上确实展示着gp120-HA2融合蛋白。

(6)流感、HIV嵌合病毒的灭活处理：将获得的嵌合病毒加入到0.03％的甲醛溶液中，并在4℃条件下混匀处理至少48h；或者可以使用去氧胆酸钠、Triton-X100或吐温80(不低于0.1％(w/v))等化学表面活化剂，对嵌合病毒进行裂解作用,处理后的病毒可以通过透析、过滤或者离心的方式进一步被分离纯化。

(7)流感、HIV嵌合病毒的小鼠免疫接种：将灭活后的嵌合病毒与氢氧化铝佐剂混合后，接种到小鼠的后腿肌肉，每两周免疫小鼠一次，一共接种两次，最后一次小鼠免疫后14天，从小鼠眼眶处取血，获得抗血清，并利用ELISA法检测小鼠抗血清的抗流感病毒或抗HIV病毒的中和抗体滴度。图4和图5表明灭活的嵌合病毒对小鼠的免疫接种，能够有效地诱导出抗流感病毒以及抗HIV的、较高水平的中和抗体滴度。

本发明所涉及嵌合病毒还可展示其它更多蛋白包括并不限于SARS-COV-2的S蛋白等，制备方法类似。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种流感、HIV嵌合蛋白及嵌合病毒疫苗的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 755

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn

1 5 10 15

Ala Asp Thr Leu Cys Ile Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro

20 25 30

Val Trp Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys

35 40 45

Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val

50 55 60

Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu

65 70 75 80

Asn Phe Asn Met Trp Lys Asp Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp

85 90 95

Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr

100 105 110

Pro Leu Cys Val Ser Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn

115 120 125

Thr Asn Ser Ser Ser Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys

130 135 140

Asn Cys Ser Phe Asn Ile Ser Thr Ser Ile Arg Asp Lys Val Gln Lys

145 150 155 160

Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr Lys Leu Asp Ile Val Pro Ile Asp Asn Thr

165 170 175

Ser Tyr Arg Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys

180 185 190

Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala

195 200 205

Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly

210 215 220

Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro

225 230 235 240

Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Asp

245 250 255

Val Val Ile Arg Ser Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile

260 265 270

Val Gln Leu Asn Thr Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn

275 280 285

Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe

290 295 300

Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile

305 310 315 320

Ser Arg Ala Lys Trp Asn Ala Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu

325 330 335

Arg Glu Gln Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser

340 345 350

Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu

355 360 365

Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn

370 375 380

Ser Thr Trp Ser Thr Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr

385 390 395 400

Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Phe Ile Asn Met Trp Gln Glu

405 410 415

Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys

420 425 430

Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Asn

435 440 445

Asn Asn Gly Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp

450 455 460

Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro

465 470 475 480

Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu

485 490 495

Lys Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Pro Lys Tyr

500 505 510

Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro

515 520 525

Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu

530 535 540

Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln

545 550 555 560

Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn

565 570 575

Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met

580 585 590

Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys

595 600 605

Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile

610 615 620

Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr

625 630 635 640

Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg

645 650 655

Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu

660 665 670

Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly

675 680 685

Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu

690 695 700

Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu

705 710 715 720

Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu

725 730 735

Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg

740 745 750

Ile Cys Ile

755

<210> 2

<211> 2274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaggcca tcctggtggt gctgctgtac accttcgcca ccgccaacgc cgacaccctg 60

tgcatcctgt gggtgaccgt gtactacggc gtgcccgtgt ggaaggaggc caccaccacc 120

ctgttctgcg ccagcgacgc caaggcctac gacaccgagg tgcacaacgt gtgggccacc 180

cacgcctgcg tgcccaccga ccccaacccc caggaggtgg tgctggtgaa cgtgaccgag 240

aacttcaaca tgtggaagga cgacatggtg gagcagatgc acgaggacat catcagcctg 300

tgggaccaga gcctgaagcc ctgcgtgaag ctgacccccc tgtgcgtgag cctgaagtgc 360

accgacctga agaacgacac caacaccaac agcagcagcg gccgcatgat catggagaag 420

ggcgagatca agaactgcag cttcaacatc agcaccagca tccgcgacaa ggtgcagaag 480

gagtacgcct tcttctacaa gctggacatc gtgcccatcg acaacaccag ctaccgcctg 540

atcagctgca acaccagcgt gatcacccag gcctgcccca aggtgagctt cgagcccatc 600

cccatccact actgcgcccc cgccggcttc gccatcctga agtgcaacaa caagaccttc 660

aacggcaccg gcccctgcac caacgtgagc accgtgcagt gcacccacgg catccgcccc 720

gtggtgagca cccagctgct gctgaacggc agcctggccg aggaggacgt ggtgatccgc 780

agcgccaact tcaccgacaa cgccaagacc atcatcgtgc agctgaacac cagcgtggag 840

atcaactgca cccgccccaa caacaacacc cgcaagagca tccgcatcca gcgcggcccc 900

ggccgcgcct tcgtgaccat cggcaagatc ggcaacatgc gccaggccca ctgcaacatc 960

agccgcgcca agtggaacgc caccctgaag cagatcgcca gcaagctgcg cgagcagttc 1020

ggcaacaaca agaccatcat cttcaagcag agcagcggcg gcgaccccga gatcgtgacc 1080

cacagcttca actgcggcgg cgagttcttc tactgcaaca gcacccagct gttcaacagc 1140

acctggttca acagcacctg gagcaccgag ggcagcaaca acaccgaggg cagcgacacc 1200

atcaccctgc cctgccgcat caagcagttc atcaacatgt ggcaggaggt gggcaaggcc 1260

atgtacgccc cccccatcag cggccagatc cgctgcagca gcaacatcac cggcctgctg 1320

ctgacccgcg acggcggcaa caacaacaac ggcagcgaga tcttccgccc cggcggcggc 1380

gacatgcgcg acaactggcg cagcgagctg tacaagtaca aggtggtgaa gatcgagccc 1440

ctgggcgtgg cccccaccaa ggccaagcgc cgcgtggtgc agcgcgagaa gcgcgccgtg 1500

ggcatcggcg ccctgttcct gggcttcccc aagtacgtga agagcaccaa gctgcgcctg 1560

gccaccggcc tgcgcaacat ccccagcatc cagagccgcg gcctgttcgg cgccatcgcc 1620

ggcttcatcg agggcggctg gaccggcatg gtggacggct ggtacggcta ccaccaccag 1680

aacgagcagg gcagcggcta cgccgccgac ctgaagagca cccagaacgc catcgacgag 1740

atcaccaaca aggtgaacag cgtgatcgag aagatgaaca cccagttcac cgccgtgggc 1800

aaggagttca accacctgga gaagcgcatc gagaacctga acaagaaggt ggacgacggc 1860

ttcctggaca tctggaccta caacgccgag ctgctggtgc tgctggagaa cgagcgcacc 1920

ctggactacc acgacagcaa cgtgaagaac ctgtacgaga aggtgcgcag ccagctgaag 1980

aacaacgcca aggagatcgg caacggctgc ttcgagttct accacaagtg cgacaacacc 2040

tgcatggaga gcgtgaagaa cggcacctac gactacccca agtacagcga ggaggccaag 2100

ctgaaccgcg aggagatcga cggcgtgaag ctggagagca cccgcatcta ccagatcctg 2160

gccatctaca gcaccgtggc cagcagcctg gtgctggtgg tgagcctggg cgccatcagc 2220

ttctggatgt gcagcaacgg cagcctgcag tgccgcatct gcatctaata gtga 2274

Claims

1.gp120-HA2融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的gp120-HA2融合蛋白在制备流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗中的用途。

3.编码权利要求1所述的gp120-HA2融合蛋白的碱基序列,其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

4.流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：利用活的流感病毒来进一步感染可以稳定表达权利要求1所述的融合蛋白gp120-HA2的哺乳动物细胞系，最终获得能够在病毒囊膜上展示gp120-HA2融合蛋白的流感、艾滋HIV嵌合病毒，作用灭活疫苗，以同时抵抗流感病毒和艾滋病毒对机体的侵染，方法包括以下三个步骤：

S1:使用携带外源基因质粒PLV-gp120-HA2慢病毒感染哺乳动物细胞系，在一定浓度的嘌呤霉素的筛选下，获得可以在细胞质膜上稳定地表达流感、艾滋HIV囊膜融合蛋白gp120-HA2的细胞株；

S2:将活的流感病毒接种在此基因工程改造的稳转细胞株，并加入TPCK-胰酶培养48至72h，利用流感病毒从细胞质膜出芽，最终使得重组的囊膜融合蛋白gp120-HA2展示在该流感病毒的囊膜上，从而获得高滴度的流感HIV嵌合病毒；

5.根据权利要求4所述的一种流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S2所述的流感HIV嵌合病毒是由流感病毒和病毒囊膜上定向表达的gp120-HA2嵌合膜蛋白构成的。

6.根据权利要求4所述的一种流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：在细胞质膜上被稳定地表达的gp120-HA2融合蛋白是由流感病毒血凝素蛋白-HA蛋白的HA2区结构域与HIV病毒囊膜蛋白gp120相融合而得到的，血凝素蛋白的HA2区结构域使其自发地嵌入流感病毒的囊膜上，并形成三聚体结构，从而以三聚体的形式正确展示HIV的gp120蛋白。

7.根据权利要求4所述的一种流感、艾滋嵌合病毒疫苗的制备方法，其特征在于：活的流感病毒来源于鸡胚或者哺乳动物细胞的体外培养，且流感病毒包括人流感病毒和禽流感病毒中的至少一种。

8.根据权利要求4所述的一种流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S1所述的被慢病毒感染的哺乳动物细胞系包括VERO细胞、MDCK细胞、CHO细胞以及HEK293T细胞系中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的一种流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述的灭活是向该嵌合病毒加入甲醛，进行灭活；或者向嵌合病毒加入表面活化剂，使得病毒被裂解灭活。

10.根据权利要求9所述的一种流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的裂解灭活为使用包括去氧胆酸钠、Triton-X100或吐温80在内的化学表面活化剂，对嵌合病毒进行裂解作用。