CS223975B2 - Method of making the virus vaccines of the spring-summer meningoencephtalitide - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby virových vakcín jaro-letní meningoencefalitidy kultivací viru ve tkáňových kulturách nebo v suspenzích ptačích embryonálních buněk, zejména v suspenzích kuřecích embryonálních buněk, oddělením buněk a jejich úlomků odstředěním, inaktivaeí, koncentrací a čištěním viru a zpracováním vyčištěných suspenzí na preparáty určené к podávání·

Podle jedné takové známé metody pro výrobu virových vakcín jaro-letní meningoencefalitidy, popsané v brit· patentovém spisu č. 1 453 035, se po odstředění suspenze získá suspenze obsahující virus, ve které jsou ještě přítomny nežádoucí znečištěniny, které při aplikaci vakcíny mohou mít za následek vedlejší reakce· Proto je žádoucí podrobit suspenzi, obsahující virus, čištění, například chromatografií za použití hydroxylapatitu. Tento známý způsob pracuje se značnými ztrátami· Přesto se nepodařilo dosáhnout požadovaného stupně čistoty·

Účelem vynálezu je odstranění vylíčených nedostatků a obtíží; byl vytýčen úkol získat virovou vakcínu jaro-letní meningoencefalitidy o lepší čistotě a v lepším výtěžku, při jejímž použití je silně snížen vznik vedlejších reakcí.

Tento úkol je u způsobu podle vynálezu vyřešen tím, Že se pro čištění podrobí suspenze, obsahující virus, kontinuální měrně hmotnostní gradientově ultracentrifugaci gradientový obsah se rozloží ve frakce, a frakce, vykazující při 260 nm zvýšenou extinkci, které obsahují částice se sedimentační konstantou v oblasti 200 s, se shromažďují.

Podle výhodného provedení způsobu se ze suspenze obsahující virus, oddělí před kontinuální měrně hmotnostní gradientovou ultracentrifugaci přidáním protaminsulfátu podíly, sedimentující rychleji než virus jaro-letní meningoencefalitidy. S výhodou se suspenze, obsahující virus, před kontinuální měrně hmotnostní ultracentrifugací inaktivuje, s výhodou formaldehydem nebo beta-propiolaktonem. Výhodně se může suspenze koncentrovat ultrafiltrací.

Podmínky pro spolehlivou inaktivaci jsou následující:

К suspenzi viru, vyrobené způsobem podle vynálezu, se přidává formaldehyd v takových množstvích, aby konečné zředění činilo 1 : 2 000, načež se inkubuje po dobu 30 hodin při teplotě 37 °C a dalěích 48 hodin při teplotě místnosti. Nepřítomnost infekčního viru se prokazuje intracerebrálním očkováním na myších o hmotnosti 10 g. Po 14denní pozorovací době nesmějí být zjištěny žádné symptony FSME.

Jako měrně hmotnostní gradient se s výhodou používá roztok sacharózy o 0 až 50

Při použití takovéhoto roztoku sacharózy odpovídá frakce, vykazující při 260 nm zřetelně zvýšenou extinkci, měrné hmotnosti asi 40 % roztoku sacharózy. Mohou se ale používat i jiné gradienty měrné hmotnosti, jako roztok vívanu draselného, roztok chloridu céžného nebo roztok glycerinu. Frakce, odpovídající měrné hmotnosti viru obsahují částice viru se sedimentační konstantou v oblasti 200 S a vykazují proto zvýšenou extinkci při 260 nm.

Podle výhodné formy provedení způsobu se frakce zóny viru, získané po vysokorychlostním odstředění s gradienty měrné hmotnosti, zředí pufrem, obsahujícím lidský albumin, čímž se dosáhne zvýšené selektivity antigenu viru.

Kontinuální vysokorychlostní odstřeóování s gradienty měrné hmotnosti je v poslední době vyvinutá metoda čištění a koncentrování nejmenších částic na základě jejich měrné hmotnosti a jejich sedimentačních vlastností. Spočívá v tom, že se v kontinuálním vysokorychlostním procesu odstřeSování oddělí ze suspenze partikulární podíly, tím že v důsledku na ně působící odstředivé síly vniknou do gradientů měrné hmotnosti, zatímco podíly, které za těchto podmínek nesedimentují, zůstanou v suspenzi (afluentu). Částice vniknuvší do gradientů měrné hmotnosti putují během procesu odstřeóování až na to místo, které odpovídá jejich vlastní měrné hmotnosti, čímž zde dochází ke koncentraci těchto částic. Tento způsob byl poprvé použit к čištění chřipkového viru, který má sedimentační konstantu asi okolo 800 S. Byl podrobně popsán v Journal of Virology, prosinec 1967, str. 1 207 až 1 216, Artikel Purifikation of Large Quantities of Influenza Virus by Density Gradient Centrifugation autorů С. B. Reimer, R. S. Baker, R. M. van Frank, T. E. Newlin, С. B. Cline a N. C. Anderson.

Vzhledem к tomu, že vir jarně-letní meningoencefalitidy má mnohem nižší sedimentační konstantu, totiž jen 200 S, udrží se podle vynálezu relativně nízká průtoková rychlost.

V podrobnostech se způsob provede následovně:

Slepičí embryonální buňky se suspendují v kultivačním médiu buněk (TCM 199)’(Tissue Culture Medium 199), infikují virem a za aerobních podmínek se při teplotách mezi 25 až 38 °C udržují v suspenzi jeden až pět dní. Potom se buňky a zlomky buněk odstraní odstředěním; získaná suspenze viru se inaktivuje formalinem nebo beta-propiolaktonem a potom koncentruje ultrafiltrací. Kroky postupu tj. inaktivace a koncentrování se mohou provádět i v obráceném pořadí. Suspenze obsahuje vedle viru jarně-letní meningoencefalitidy různé znečištěniny, které zčásti rychleji popřípadě pomaleji sedimentují než vir jarně-letní meningoencefalitidy. S výhodou se rychleji sedimentující podíly oddělí vysrážením protaminsulfátem, dříve než se provede vlastní kontinuální vysokorychlostní odstřeSování s gradienty měrné hmotnosti.

Uvedený způsob se v podrobnostech provádí například tak, že se ve vysokorychlostní odstředivce s rotorem naplněným pufračním roztokem, například fosforečnenovým pufračním roztokem, při otáčkách 3 000 ot./minutu protlačí pufrační roztok 50% roztokem sacharózy a tím se vytvoří gradient měrné hmoonooti sacharózy v rozmezí 0 až 50 %· Potom se suspenze, obssarnUící vir nechá protékat rotorem při počtu otáček rotoru 35 000 · otáček za minutu průtokovou rychlostí s výhodou 3 1/h. Za zvolených podmínek vnikne velká část částic viru do gradientů měrné h^oot^nsst.. Poté co se veškerý matri^i^l protlačí zařízením odstreóuje . se ještě hodinu, zatímco se nechá·současně protékat fosforečnamový pufrační roztok. Potom se rotor opatrně zastaví a obsah rotoru se rozdděí na jednotlivé frakce. Potom se u každé frakce zjistí extinkce při 260 nm a současně se stanoví obsah sacharózy ve frakci. LokaUzace viru v gradientech měrné hmotnotti se u^c^o^r^jí jeho ^tinta! při 260 nm· Vir se váže ; v oblasti okolo 40 % sacharózy a vyvolává zde zřetelné zvýšení extinkce při 260 nm.

V přiožennám diagrimu je znázorněn tento vztah, z něhož je zřejmá oxtiikce vých frakcí v relaci ke gradientu měrné hmottotSt· Gradient měrné hmoonc>oti roztoku sacharózy se pt]hybvu□r mezi 0 až 50 %.

Cerchovaná Čára reprodukuje rozdělení extinkce při 260 nm v jednotlivých frakcích.

V oblasti okolo 40 % sacharózy mědí frakce 10, 11 a 12 zvýšenou a frakce 11 maairnmání extinkci. V těchto frakcích se nachází téměř výlučně částice viru se sedimentační konstantou 200 S bez zřetelně rychheji nebo poimleei než vir sedimerOuUících zneččštěnin. Pík odpovídá ^ηοο^^ο! sacharózy 39 %· DqIší pík u frakce číslo 25, který odpovídá konce^nci sacharózy nižší než 10 %, vykazuje zneččštěniny, které se zahaauuí. V diagrimu je také znázorněna relativní prot^Uvní účinnost (zjištěná v · přímém pokusu ochrany marši) ícdnotlivých frakcí pomocní různě vysokých sloupců. Frakce 11 má podle toho nejvyšší relativní ochranný účinek.

Shromážděné frakce, tbstαuUící vir, se s výhodou zředí nyní pufrem, obsahujícím lidský albumin, aby se zlepšila stabliitl antigenu viru, i potom se dále ·zpracuuí obvyklým způsobem na vakcíny.

Získané vakcíny ooIÍ vyšší stupeň čistoty·a jsou lddmi podstatně lépe snášeny než preparáty vyrobené obvyklým způsobem. Toto je vyjádřeno v násseduuící tabulce, přičemž jsou v první koloně vyčleněny - procentuálně vyhodnocené - reakce s vakcínami vyrobenými obvyklým způsobem a ve druhé koloně s vakcínami vyrobenými způsobem podle vynálezu. Při opakovaných očkováních vagínami, vyrobenými podle vynálezu nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce, a to ani lokální ani systemické.

	Ob^kle	Podle vynálezu vyrobené preparáty
lokální bolest	až 72 %	36 %
všeobecné reakce bolest hlavy, únava	až ' 64 %	25 %
horečka (celkem)	až 68 %	19 %
37,3 až 38 °C	až 36 %	14 %
38 až 39 °C	až 27 %	4 %
více než 39 °C	až 9 %	1 %

Vakcíny, vyrobené způsobem podle vynálezu se vyznaačuí, nepřihlížeje k přidniému lidskému album.nu, nízký obsah proteinu. Tento obsah proteinu je při stejné antigenní účinnosti o mnohonásobek, nejméně desetinásobně nižší než u preparátů až dosud používaných. Také speccfický obsah proteinů / = obsah proteinů (nepo^taje lidský albumin) v mikrogramech na

223975 4 immiizační dávku/ je u vakcín podle vynálezu zřetelně nižší, jak vyplývá z následujících srovnán:

šarže získané podle vynálezu

SpeeCfický obsah proteinu v/ig na imiuinzační dávku

Nappoti tomu se tyto hodnoty u obvyklých preparátů pohyb^í v rozm^z^Jí mezi 250 500 je proteinu na imunizační dávku.

až

Důkaz imirnogennty a ochranné (protektivní) účinnosSi vakcíny se provádí přímou nou zkouškou na mších, která se v jednotlivostech provádí následujícím postupem.

ochranZkoušený přípravek se zřeSuje po trojnásobcích (1:3, 1:9, 1:27, 1:81,' ·1:243) a vá se k němu jako pomocná látka hydroxid hlinitý AKOH)^. Vždy po dessei m^ch (o hmotnoesi po asi 10 g) se imunnzuje 0,2 mililitry těchto zředění dvakrát v Časovém odstupu jednoho týdne sublnitáimě. Po dalších dvou týdnech se m^í iitгaepritoiιeálně infikují 100 až 1 000 LDjq uvedeného viru; odeečtání protekt^rní dávky^g se provádí metodou, kterou popsaai Reed a Muench (L. J. Reed, H. A. Muench. A simple method of estimating 50 % pndeoint, Anmeičan Journal Hygiene, 193Q, sv. 27, str. 493), po tříýýdenní pozorovací době.

přidáV následnicí tabulce jsou uvedeny výsledky ochranné zkoušky na myších provedené s 5 vakcínami vyrobenými podle popsaného způsobu.

Vakcina číslo

Protekti^í dávka ^aPDgO epD^O = reciproká hodnota takového zředění, které chrání 50 % m^i před smrtnou infekcí.

Konečná vakcína se upravuje na hodnotu 20 PD^q.

of highly purified vaccine against tick-borne 1980 (v tisku), činily sérokonverze po druhém

Imшioteeita u člověka byla zjišťována stanovením sérokonverze v hemmggutinačním inhibičním testu, popřípadě v enzymovém imunoostanoveni·* Jak bylo v jednotlivostech popsáno v článku ^,,ImmuuitenicCty and reactogeencity a^<^€^ppa]^j.iiLs, JoujrniOL of Meeical Virology, a třetím dílčím očkování 93 % a 100 %.

Claims (6)

1· Způsob výroby virových vakcín jaro-letní meeiIi;etncefplitiiy kultivaci viru ve tkáňových kulturách nebo suspenzích ptačích embryonnáních buněk, s výhodou v suspenzích kuřecích pmmryonááníca buněk, oddělením buněk a úlomků buněk c^i^nt^ifug^c^íí, inOctivací, koncentrací a čištěním viiu a zpracováním vyčištěných suspenzí na vakcíny» vyznač^ící se tím, že se suspenze, tЪ8saarící virus pro čištění podrobí kontinuální měrně hmoonoosní gradientově ultracentrifugaci, gradientový obsah se rozloží na frskce a frakce, vyk^aauuící při

260 nm zvýšenou extinkci, které obsahují částice se sedimentační konstantou v oblasti

200 S, se shromažSují.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se suspenze obsahující virus podrobí kontinuální měrné hmotnostní gradientově ultracentrifugaci, při které se podíly sedimentující rychleji než virus jaro-letní meningoencefalitidy, oddělí předem.přidáním protaminsulfátu.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, Že se suspenze, obsahující virus podrobí kontinuální měrně hmotnostní gradientově ultracentrifugaci, při které byl virus předem inaktivován, s výhodou formaldehydem nebo beta-propiolaktonem.

4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se suspenze, obsahující virus podrobí kontinuální měrně hmotnostní gradientově ultracentrifugaci, při které se virus předem inaktivuje a provádí se koncentrování ultrafiltrací.

5. Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že jako měrně hmotnostní gradient používá roztok sacharózy o koncentraci 0 až 50 %.

6. Způsob podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se vrcholové virové frakce, získané po kontinuální měrně hmotnostní gradientově ultracentrifugaci, se zředí ústrojným roztokem, obsahujícím lidský albumin.