NL8104979A

NL8104979A - Werkwijze voor de bereiding van immunobiologische preparaten, toe te passen bij de diagnose , het voorkomen en/of het behandelen van candida guilliermondii infecties.

Info

Publication number: NL8104979A
Application number: NL8104979A
Authority: NL
Original assignee: Pal Sutka En Dr Klara Sutka Be
Priority date: 1981-11-03
Filing date: 1981-11-04
Publication date: 1983-06-01
Also published as: AU547928B2; FR2515518B1; GB2108384B; NL188185C; EP0082890A1; CH652032A5; CA1180291A; GB2108384A; NL188185B; AU7691081A; JPS58183627A; US4678748A; BE890954A; FR2515518A1; EP0082890B1

Description

v N/30.473—Kp/Pf/vdM. ' * - 1 -

Werkwijze voor de bereiding van immunobiologische preparaten, toe te passen bij de diagnose, het voorkomen en/of het behan-delen van Candida Guilliermondii infecties.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van nieuwe immunobiologische prepara-ten, toe te passen bij de diagnose, het voorkomen en/of het behandelen van Candida Guilliermondii infecties bij zoogdieren.

5 De nieuwe volgens de uitvinding bereide preparaten kunnen met bijzonder voordeel worden toegepast in de geneeskunde en vee-artsenijkunde voor de diagnose van Candida Guilliermondii infecties, immunisatie van mensen of dieren die hebben blootge-staan aan dergelijke infecties, alsmede bij de behandeling van 10 de ziekte.

Plaatselijke candidiasis, veroorzaakt door Candida Guilliermondii werd de eerste maal in 1959 onderkend bij herkauwers /Hauptman, B. en anderen: Med. Vet. 17, 22 (1961/7- Verder onderzoek heeft aan het licht gebracht, dat 15 bij vee Candida Guilliermondii in de eerste plaats het uroge-nitale kanaal aanvalt en de oorzaak is van verscheidene kwalen zoals abortus van koeien, infectieziekten van de urogenitale organen (baarmoeder, testikels, epididymis, uier, nier, enz.) en allerlei andere voortplantingskwalen. Het optreden van 20 Candida Guilliermondii infecties, de klinische, pathologische en histopathologische patronen van de infectie, de resultaten van de mircrobiologische onderzoeken uitgevoerd op dergelijke schimmels en de taxonomische klassificatie van uit de organen van besmet vee gexsoleerde schimmelstammen worden gedetailleerd 25 beschreven in de volgende literatuurplaatsen: Sutka, P. e.a.: Magyar Allatorvosok Lapja 3_3, 151; 155; 837 (1978); Decun, M.

e.a.: Revta Zootech. Vet. Med. 23, 39 (1973).

Op basis van de beschikbare literatuurgegevens verschijnen Candida Guilliermondii infecties in de eerste 30 plaats bij herkauwers, maar de schimmel is ook pathogeen voor mensen. Candida Guilliermondii schimmels werden ook waargeno-men in menselijk organisme in de meest uiteenlopende klinische beelden, zoals infecties van het urogenitale kanaal /Harding, S.A. e.a.: Clin. Mic. 2^, 222 (1975/7, ooginfecties /Segal e.a.: 8104979 r - .....

\ - 2 -

*V

Mycopath. Mycol. Appl. 54, 32 (l974)_7/ endocarditis /Utley, J.R. e.a.: Circulation 48, 42 (19732.7/ alsmede lichaams-candidiases /Kozinn, P.J. e.a.: Sab. 1_,98 (1969).7.

In de geneeskunde worden lichaamscandidiases, 5 in hoofdzaak die welke veroorzaakt worden door Candida albicans, in de eerste plaats gediagnostiseerd volgens methoden, die toepasbaar zijn voor de laboratoriumbepaling van antigenen in het lichaamsvocht, zoals agglutinatie, latexagglutinatie, indirecte fluorescentie, immunodiffusie, tegen-immuno-10 electroforese, enz. /Taschdjian, C.L. e.a.: Amer. J. Clin. Pathol. 57, 195 (1972)J. Deze diagnosemethoden vereisen een geoefende staf met een meer dan gemiddelde bekwaamheid. Tot op heden was geen specifiek Candida Guilliermondii antigeen bekend, dat het mogelijk zou maken direct in een routinematige 15 veterinaire test of zelfs aan het bed van de patient de infec-tie te diagnostiseren. De uitvinding heeft betrekking op de bereiding van antigenen, die hiervoor toe te passen zijn.

Rekening houdend met het feit dat herkauwers., in het bijzonder het vee dat van groot belang is in de voe-20 dingsIndustrie, bij Candida Guilliermondii infectie aan ernstige ziekten, urogenitale en voortplantingskwalen en ver-storing van de melkgift lijden, hetgeen aanzienlijke economi-sche verliezen en ernstige problemen betreffende de volksge-zondheid met zich meebrengt, bestaat er duidelijke behoefte 25 aan veterinaire preparaten voor de diagnose, profylaxis en behandeling van dergelijke infecties. Met het oog op de voor mensen pathogene aard van de schimmel, kunnen geschikte vormen van deze preparaten ook worden toegepast in de menselijke therapie. De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor 30 de bereiding van dergelijke preparaten.

De meerderheid van Candida-antigenen warden verkregen uit cellen van een 48-72 h kweek van de Candida-stam. Tot op heden werd weinig aandacht besteed aan de ver-anderingen die optreden in en de stoffen die worden geprodu-35 ceerd door Candida-cellen na langere kweek. Het besmette organisms bevat echter ook produkten van oudere Candida-cellen. Thans werd voor de eerste maal onderkend, dat nieuwe stoffen worden gevormd in Candida-cellen bij langere kweek, die kunnen 8104979 * < 1 - 3 -

N

worden toegepast als een direct diagnosemiddel ora vroege over-gevoeligheidsreactie op te wekken en in de buisprecipitatie-diagnosetechniek, en verder voor de immunobiologische behande-ling van het geinfecteerde organisme. Met gebruik van deze 5 stoffen kunnen Candida Guilliermondii infecties snel worden gediagnostiseerd, zelfs aan het bed van de patient of op de boerderij, door vroege overgevoeligheidsreactie of door serumbuisprecipitatie.

Immunobiologische preparaten voor de diagnose, 10 profylaxis en/of behandeling van Candida Guilliermondii infecties worden volgens de uitvinding als volgt bereid: a) een Candida Guilliermondii stam wordt onder aerobe omstandigheden bij 24-42°C gekweekt op een kweek-medium, dat op te nemen koolstof- en stikstofbronnen bevat, 15 de verkregen kweek of kweken wordt of worden onder identieke omstandigheden gedurende een langere periode bewaard, waarna de schimmelcellen van het kweekmedium worden gescheiden, ge-wassen, mechanisch verbroken, geextraheerd, het extract met een polair organisch oplosmiddel wordt behandeld en het ver-20 kregen neerslag in een immunobiologisch preparaat als zodanig of na verdere zuivering wordt omgezet, of b) wordt een Candida Guilliermondii stam gekweekt gedurende 48-72 h onder aerobe omstandigheden bij 24-42°C op een kweekmedium, dat op te nemen koolstof- en stik- 25 stofbronnen bevat, wordt de verkregen kweek eventueel verder gekweekt ter verkrijging van twee of drie nieuwe kweken, worden vervolgens de schimmelcellen gescheiden van de kweek, ge-wassen, mechanisch verbroken, geextraheerd en wordt daarop, indien gewenst, een polair organisch oplosmiddel toegevoegd 30 aan het extract en wordt het verkregen neerslag omgezet in een immunobiologisch preparaat als zodanig of na verdere zuivering, of c) wordt een Candida Guilliermondii stam gekweekt gedurende 48-72 h onder aerobe omstandigheden bij 24- 35 42°C op een kweekmedium, dat op te nemen koolstof- en stikstofbronnen bevat, wordt vervolgens de kweek gedood, worden de dode cellen afgescheiden en daarop omgezet in een immunobiologisch preparaat als zodanig of na zuivering.

8104979 A.

* «· - 4 - -· %

Het kweken van. de Candida Guilliermondii stammen wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 32-38°C.

Bij voorkeur wordt als middel voor het wassen van de afgescheiden cellen een fysiologische zoutoplossing 5 gebruikt.

De afgescheiden cellen kunnen worden verbro-ken met behulp van apparaten die doorgaans hiertoe worden gebruikt, bijv. met een X-persapparaat, of celverbreking kan worden uitgevoerd door ultrasone bestraling. De verkregen mas-10 sa wordt bij voorkeur met fysiologische zoutoplossing geextra-heerd.

Het volgens de werkwijze variant a) of b) verkregen extract wordt bij voorkeur behandeld met een C^_^ alcohol, in het bijzonder met ethanol.

15 Het volgens de werkwijze variant a) of b) verkregen neerslag kan indien gewenst worden gezuiverd volgens methoden, die bekend zijn van de zuivering van protelnen, zo-als chromatografie, ultrafiltratie, dialyse, electroforese, methoden onder toepassing van filtratiehulpmiddelen en/of 20 detergent!a, enz.

De immunobiologische preparaten, die zijn be-reid volgens de werkwijzen a), b) en c) van de uitvinding worden in het vervolg als preparaten Ggl, Cg2 resp. Cg3 aan-geduid.

25 Preparaat Cgl is een protelnehoudend celex- tract, dat is geisoleerd uit Candida Guilliermondii cellen die gedurende langere tijd aan kweekomstandigheden zijn blootge-steld. De belangrijkste bestanddelen van dit celextract zijn de toxinen van Candida Guilliermondii. Preparaat Cgl kan in de 30 eerste plaats worden toegepast voor de diagnose van Candida Guilliermondii infecties door een vroege overgevoeligheids-reactie bij intradermische toediening op te wekken en het kan ook worden gebruikt voor de bepaling van antilichamen in de bloedsomloop met behulp van Durham-buis- of capillairbuis-35 precipitatiemethoden. Wanneer het in het levende organisme wordt gebracht zet bovendien preparaat Cgl de vorming van antilichamen aan, die in staat zijn een reeds opgetreden Candida Guilliermondii infectie te beeindigen.

8104979 ^ t - 5 -

Preparaat Cg2, dat is afgescheiden van Candida Guilliermondii cellen die aan een korte kweekbehandeling zijn onderworpen, bevat veel meer proteinen dan preparaat Cgl, terwijl het toxinegehalte ervan laag is. Dit preparaat kan in 5 de eerste plaats worden toegepast voor de immunisatie van levende organismen, die zijn blootgesteld aan het risico van infectie. Preparaat Cg2 kan ook worden gebruikt als een diag-nosemiddel om late overgevoeligheidsreactie bij intradermische toediening op te wekken, terwijl het verder kan worden toege-10 past als een antigeen voor de diagnose van de infectie in latexagglutinatie-, immunodiffusie- en tegen-immunoelectro-foresemethoden.

Preparaat Cg3 bestaat uit gedode hele cellen van Candida Guilliermondii en kan in de eerste plaats worden 15 toegepast voor de diagnose van de vroege stadia van Candida Guilliermondii infecties in laboratoriumproeven (zoals agglu-tinatie, indirecte fluorescentieproeven, enz.) en verder ter bereiding van besmette antigenen, die toe te passen zijn in ABR (Abortus-Bang-Ring)-proeven (Hutyra, F. e.a.: Spezielle 20 Pathologie und Therapie der Haustiere, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 1959).

Candida Guilliermondii stammen, die uit ge-infecteerde organismen zijn afgescheiden, kunnen met groot voordeel als microorganismen worden toegepast voor de berei-25 ding van de drie bovenstaande soorten immunobiologische prepa-raten. Echter kunnen bekende Internationale standaard Candida Guilliermondii stammen, zoals een in het Centrale Bureau voor schimmelculturen (Delft, Nederland) onder nr. CBS-566, gedepo-neerde stam alsmede de in de American Type Culture Collection 30 gedeponeerde Candida Guilliermondii stammen, ook worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding.

Het verdient de voorkeur een voorkweek, die door een Candida Guilliermondii stam gedurende 48-72 h onder aerobe omstandigheden bij 24-42°C te kweken op een kweekmedium 35 dat op te nemen koolstof- en stikstofbronnen bevat, is ver-kregen, toe te passen als uitgangsstof voor de bereiding van de immunobiologische preparaten. De volgende stoffen kunnen worden toegepast als koolstofbronnen in zowel de voorkweek als 8104979 + -5· -fide daarop volgende kweektrappen: glucose, sucrose, maltose, cellobiose, melibiose, melecytose, inuline, arbutine, galactose, sorbose, trehalose, ribose, xylose, L-arabinose, D-arabinose, glycerol, ribitol, D-mannitol, D-dulcitol, L-5 methyl-D-glycoside, salicine, wijnsteenzuur, citroenzuur en soortgelijke stoffen. De voor de voorkweek en daarop volgende kweektrappen gebruikte kweekmedia kunnen als op te nemen stikstofbron bijv. bevatten sera, proteosepepton (met Difeo-garantie, Difco Laboratories, Detroit, USA) en andere prote-10 osen, stoffen die pepton en/of aminozuren bevatten, enz.

Preparaten Cgl en Cg2 worden bij voorkeur als volgt bereid: aan het eind van de kweekperiode wordt de kweek-vloeistof gecontroleerd op de aanwezigheid van bacterien en worden de schimmelcellen daarop afgescheiden van de bacterie-15 vrije gistingsvloeistof, bij voorkeur door centrifugering. De afgescheiden cellen worden gewassen met water of een waterige zoutoplossing, bij voorkeur fysiologische zoutoplossing,en daarop onderworpen aan mechanische verbreking. Men kan bijv. zodanig te werk gaan dat het celneerslag wordt gedroogd, ver-20 malen in een steriele molen, van de vermalen stof. periodiek een monster wordt getrokken en de mate van verbreking door microscopische bestudering wordt gevolgd. Daarna worden de verbroken cellen. geextraheerd met fysiologische zoutoplossing. Volgens een andere werkwijze worden de afgescheiden Candida 25 Guilliermondii cellen gemengd met water of een waterige zoutoplossing, bij voorkeur fysiologische zoutoplossing, en wordt de verkregen suspensie onderworpen aan ultrasone bestraling. Van de suspensie worden met regelmatige tussenpozen monsters getrokken en de mate van verbreking wordt door microscopische 30 bestudering gevolgd. In dit geval vindt de mechanische verbreking tegelijk met de extractie van de verbroken cellen plaats. Daarna worden de vaste stoffen (d.w.z. de verbroken celmate-rialen) afgescheiden door centrifugering, wordt de boven-staande vloeistof gefiltreerd en wordt een polair organisch 35 oplosmiddel, bij voorkeur ethanol, toegevoegd aan het filtraat. Indien gewenst, kan het verkregen neerslag worden gezuiverd volgens een der bekende methoden,. die worden toegepast bij de zuivering van protelnen (d.w.z. chromatografie, ultrafiltratie, 8104979 i % - 7 - dialyse, electroforese, enz.)· Indien het immunobiologische preparaat moet worden toegepast voor diagnose, is het niet ab-soluut noodzakelijk het neerslag te zuiveren. Zoals boven reeds vermeld kan het extract van de verbroken cellen, dat is 5 verkregen volgens methode b) ook direct voor diagnosedoelein-den worden toegepast. Daarom strekt de uitdrukking "immuno-biologisch preparaat" telkens wanneer deze wordt gebruikt in verband met preparaat Cg2 zich ook uit tot dergelijke extrac-ten. In andere gevallen wordt het verkregen neerslag omgezet 10 in immunobiologische preparaten volgens algemeen bekende methoden, waarbij gebruik wordt gemaakt van gewone verdun-ningsmiddelen (bijv. fysiologische zoutoplossing, enz.) en ge-bruikelijke technieken (bijv. oplossen, vriezen, vriesdrogen, enz.).

15 Preparaat Cg3 wordt volgens de uitvinding bij voorkeur als volgt bereid: aan het eind van de gistingstrap worden de Candida Guilliermondii cellen gedood met een cyto-toxisch middel, zoals formaldehyde. Men kan bijv. zodanig te werk gaan, dat een waterige oplossing van formaldehyde wordt 20 toegevoegd aan de kweek in een hoeveelheid die voldoende is om het formaldehydegehalte van de kweekvloeistof te brengen op 0,5 % en daarop wordt de kweekvloeistof geincubeerd gedurende 6 h bij 37°C. De dode cellen kunnen worden gezuiverd door ze bij voorkeur te wassen met fysiologische zoutoplossing. Daarna 25 worden de dode cellen omgezet in immunobiologische preparaten voor laboratoriumdiagnose volgens op zich bekende methoden (bijv. suspendering in waterig medium, vriezen, enz.).

Preparaten Cgl, Cg2 en Cg3 in de vorm van bijv. over ampullen verdeelde poeders, kunnen worden gebruikt 30 bij de diagnose van Candida Guilliermondii infecties van le-vende organismen op de volgende manier:

Preparaten Cgl en Cg2 kunnen zowel onder in-vivo-als in-vitro-omstandigheden worden gebruikt, terwijl preparaat Cg3 slechts voor in-vitro-onderzoeken kan worden 35 gebruikt.

Wanneer levende organismen worden getest op Candida Guilliermondii infectie onder in-vivo-omstandigheden, wordt preparaat Cgl of Cg2 aan de proefpersoon of het proefdier 8104979 - 8 —' --- ' " toegediend in de vorm van een intradermische injectie. Wanneer preparaat Cgl wordt toegediend/ wordt de aan- of afwezigheid van infectie bepaald op· basis van de door het preparaat opge-wekte vroege overgevoeligheidsreactie, welke 1-12 h na injec-5 tie wordt bepaald. Een duidelijk zichtbaar groeiend gezwel verschijnt bij geinfecteerde patienten op de plaats van de injectie, welk gezwel niet meer kan worden waargenomen 24 h na opwekking. Wanneer preparaat Cg2 wordt toegepast, wordt de aan- of afwezigheid van Candida Guilliermondii infectie be-10 paald op basis van de late overgevoeligheidsreactie van het tuberculinetype, welke 36-48 h na opwekking kan worden waargenomen .

Preparaten Cgl, Cg2 en Cg3 kunnen voor onder in-vitro-omstandigheden uitgevoerde diagnoseproeven als volgt 15 worden gebruikt:

De waarnemingsgrond is altijd een neerslag-vormende immunobiologische reactie, waarin negatief serum, serum met hoog.precipitinegehalte en. serum met hoog agglutini-negehalte als reagentia worden gebruikt. De bereiding van sera 20 met hoog agglutinine- of precipitinegehalte vallen ook onder de gevraagde beschermingsomvang.

"Negatief serum” is het serum dat is verkre-gen uit vee of laboratoriumdieren, welke een negatieve reactie bij beproeving met preparaat Cgl, Cg2 of Cg3 geven.

25 Serum met hoog agglutininegehalte wordt be- reid door konijnen te immuniseren met preparaat Cg2 of Cg3 in een standaardprocedure, en daarna de dieren te doden en het serum uit hun bloed op een op zich bekende wijze af te schei-den.

30 Serum met hoog precipitinegehalte wordt be- reid door konijnen te immuniseren met preparaat Cgl. in een standaardprocedure, daarna de dieren te doden en het serum uit hun bloed op een op zich bekende wijze af te scheiden. Serum met hoog precipitinegehalte kan ook worden verkregen uit het 35 bloed van vee, dat onder natuurlijke omstandigheden is besmet geraakt. Het serum van dergelijke dieren wordt onderzocht met Cgl-allergeen, bijv. volgens de Durham-buis- of capillair-buismethode, waarna de dieren met sera met hoge precipitine- 8104979 - 9 - factor worden gedood en het serum uit hun bloed op een op zich bekende wijze wordt afgescheiden.

De volgende laboratoriumonderzoeken kunnen met preparaten Cgl, Cg2 en Cg3 onder toepassing van de hierbo-5 ven genoemde reagentia worden uitgevoerd: 1. Durham-buis- of capillairbuisprecipitatie-proef, uitgevoerd met preparaat Cgl:

Negatief serum wordt met behulp van een pipet gebracht in een Durham-buis op een zodanige manier, dat geen 10 luchtbel zich bevindt aan het oppervlak van het serum. De buis wordt gevuld tot aan ongeveer de helft van zijn volume. Op eendere wijze wordt het serum met hoog precipitinegehalte in een andere Durham-buis gebracht en het te testen serum wordt in twee Durham-buizen gebracht. Preparaat Cgl wordt in deze 15 proef in de vorm van een oplossing in fysiologische zoutoplos-sing gebruikt. De oplossing van het immunobiologische preparaat wordt voorzichtig in een laag aangebracht op drie van de serummonsters (negatief serum, serum met hoog precipitinegehalte en een van de te onderzoeken serummonsters), terwijl het 20 andere te beproeven serummonster wordt behandeld met fysiologische zoutoplossing. De buizen worden gedurende 1 h bij omge-vingstemperatuur gehouden en daarop gedurende 24 h bij +5°C. Het grensvlak van de twee fasen wordt visueel onderzocht na 10-15 min, 1 h en 25 h staan en de waarnemingen worden vastge-25 legd. Wanneer het proefserum antilichamen tegen Candida

Guilliermondii-antigeen (preparaat Cgl) bevat, verschijnt een neerslagring aan het grensvlak van de twee fasen.

2. Preparaat Cg2 kan worden toegepast als antigeen in immunodiffusie-, latexagglutinatie- en tegen- 30 immunoelectroforeseproeven. Deze proeven worden volgens alge-meen bekende methoden uitgevoerd (zie bijv. Palmer, D.F. e.a.: Serodiagnosis of mycotic diseases, Charles C. Thomas, Illinois, USA, 1977).

3. Preparaat Cg3 kan worden toegepast als 35 antigeen in de agglutinatie- en indirecte fluorescentiemetho-den (zie bijv. Palmer, D.F. e.a.: Serodiagnosis of mycotic diseases, Charles C. Thomas, Illinois, USA, 1977), alsmede voor de bereiding van besmette antigenen, die te gebruiken 8104979 * < · - 10 - zijn in ABR-proeven (zie bijv. Hutyra, F. e.a.: Spezielle .....

Pathologie und Therapie der Haustiere, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 1959).

Preparaat Cg2 kan ook worden toegepast voor 5 de preventieve imraunisatie van mensen en dieren, die zijn blootgesteld aan het risico van Candida Guilliermondii infec-tie. Preparaat Cg2 neemt voor dit doel de vorm aan van vaccins.

Deze vaccins kunnen naast het actieve middel en het verdun-ningsmiddel ook een drager (zoals aluminiumhydroxidegel) be-10 vatten, welke het langzame geleidelijke vrijgeven van het actieve middel verzekert. Het vaccin kan aan het te behandelen organisme worden toegediend in de vorm van een intradermische, intramusculaire of subcutane injectie. Volgens een voorkeurs-immunisatiewerkwijze worden de patienten nog eens twee weken 15 na de eerste maal gevaccineerd, waarbij een grotere hoeveel-heid antigeen aan het organisme wordt toegediend met deze tweede vaccinatie dan met de eerste. De voor immunisatie ver-eiste dosis hangt van talloze factoren af, zoals de leeftij.d en de algemene gezondheid van de patient, leeftijd en ras van 20 het dier, vroegere immunisatiebehandelingen, mate van bestaand gevaar, enz.

Preparaat Cgl kan ook worden gebruikt voor de behandeling van mensen en dieren, die lijden aan Candida Guilliermondii infectie. In zulke gevallen wordt de te behan-25 delen patient allereerst ongevoelig gemaakt met het preparaat en wordt vervolgens preparaat Cgl toegediend in de vorm van een intradermische, intramusculaire of subcutane injectie.

Voor dit doel gebruikte preparaten kunnen ook een drager, zoals aluminiumhydroxidegel bevatten, welke, de langzame geleide-30 lijke vrijgave van het actieve middel verzekert. De behandeling wordt iedere twee weken herhaald op een zodanige wijze, dat de hoeveelheid aan het organisme toegediend antigeen con-tinu wordt verhoogd, van behandeling tot behandeling. De voor de behandeling vereiste dosis hangt af van talloze factoren, 35 zoals de leeftijd van de patient, de mate en hevigheid van de ziekte, het ras van het dier, de methode en frekwentie van be-handelingen, enz.

De uitvinding wordt toegelicht in detail met 8104979 ' « - 11 - behulp van de volgende niet beperkende voorbeelden.

VOORBEELD I

Bereiding van immunologisch preparaat Cgl 250 ml van een standaard vloeibaar dextrose/ 5 pepton/gistkweekmedium /zie Palmer, D.F. e.a.: Serodiagnosis of mycotic diseases, biz. 49 (Charles C. Thomas, Illinois, USA, 1977 ).7 wordt gebracht in een kolf met een capaciteit van 500 ml. Het kweekmedium wordt gexnoculeerd met een in voorraad gehouden kweek van Candida Guilliermondii en vervolgens gedu-10 rende 48 h bij 37°C onder schudden met een snelheid van 130 rpm gexncubeerd. De verkregen kweek wordt in de volgende trap-pen als entstof gebruikt.

10 1 van het boven beschreven kweekmedium wordt gebracht in een laboratoriumgistvat met een capaciteit 15 van 20 1 en het medium wordt gexnoculeerd met boven genoemde kweek. Het kweken vindt plaats bij 37°C onder beluchting en roeren. Na 72 h kweken neemt de vermeerdering van de schimmel continu af en stopt uiteindelijk. Het kweken wordt gedurende nog eens 15 d onder dezelfde omstandigheden (langere kweek) 20 voortgezet. Daarna wordt een monster uit de kweek genomen voor

Gram-besmetting. Wanneer het monster besmet raakt, hetgeen de aanwezigheid van bacterieverontreinigingen aangeeft, kan de kweek niet worden gebruikt voor de bereiding van immunobiolo- gische preparaten. De van bacterieverontreinigingen vrije 25 kweek wordt als volgt bewerkt: de inhoud van het gistvat wordt gebracht in een centrifuge en de cellen worden van de vloei- stof afgescheiden door gedurende 10 min met een snelheid van 1000 rpm te centrifugeren. De verkregen celmassa wordt drie maal met fysiologische zoutoplossing gewassen, nogmaals gedu- 30 rende IQ min bij een snelheid van 1000 rpm gecentrifugeerd en vervolgens gesuspendeerd in een fysiologische zoutoplossing en de gesuspendeerde cellen worden verbroken in een X-persinrich- 2 ting onder een druk van ca. 10.000 kg/cm . De vaste stoffen worden afgescheiden door centrifugering (30 min, 3000 rpm), de 35 bovenstaande vloeistof wordt gefiltreerd door een Seits-in-steekfilter en 4 volumedelen ethanol worden aan het filtraat toegevoegd. Het zich afscheidende neerslag wordt afgefiltreerd, opgelost in fysiologische zoutoplossing en de oplossing wordt 8104979 ' - 12 - gevriesdroogd bij -20°C. Afhankelijk van de gist- en verbre-kingsomstandigheden wordt ca. 500 mg poederachtige stof ver-kregen. Dit produkt wordt in ampullen gebracht en als een allergeen in intradermische proeven op basis van vroege over-5 gevoeligheidsreacties gebruikt.

VOORBEELD II

B'ereidin'g v'an immunobiologisch preparaat Cg2 250 ml van een standaard vloeibaar dextrose/ pepton/gist-kweekmedium wordt gebracht in een kolf met een 10 capaciteit van 500 ml. Het kweekmedium wordt geinoculeerd met een in voorraad gehouden kweek van Candida Guilliermondii en vervolgens gedurende 48 h bij 37°C onder schudden met een snelheid van 130 rpm gexncubeerd. De verkregen kweek wordt in de volgende trap als entstof gebruikt.

15 10 1 van het boven genoemde kweekmedium wordt gebracht in een laboratoriumgistvat met een capaciteit van 20 1 en het medium wordt gexnoculeerd met boven genoemde kweek. Het kweken vindt gedurende .72 h bij 37°C onder beluchting en roeren plaats. Daarna wordt een 30-40 % waterige formaldehyde-20 oplossing toegevoegd aan de kweek in een hoeveelheid, die een uiteindelijke formaldehydeconcentratie van 0,5 % oplevert en incubatie wordt gedurende 6 h bij 37° voortgeset. Een monster wordt getrokken uit de kweek en de levensvatbaarheid van de schimmel wordt gecontroleerd door deze te inoculeren op een 25 Sabouraud-dextrose-agarplaat en de plaat gedurende 48 h bij 37°C te incuberen. Een volgend monster wordt uit de kweek getrokken voor Gram-besmetting. Wanneer het monster besmet raakt, hetgeen de aanwezigheid van bacterieverontreinigingen aangeeft, kan de kweek niet worden gebruikt voor de bereiding 30 van immunobiologische preparaten. De van bacterieverontreinigingen vrije kweek wordt als volgt bewerkt: de inhoud van het gistvat wordt gebracht in een centrifuge en de vaste stoffen worden gescheiden van de kweekvloeistof door gedurende 10 min met een snelheid van 1000 rpm te centrifugeren. De vaste stof-35 fen worden afgescheiden, drie maal gewassen met een 0,85 % waterige natriumchloride-oplossing en de cellen worden opnieuw gedurende 10 min gecentrifugeerd bij een snelheid van 1000 rpm. Daarop worden de vaste stoffen gesuspendeerd in een 0,85 % 8104979 •Ί* ^ - 13 - « waterige natriumchloride-oplossing en worden de cellen verbro- ken in een X-persinrichting onder een druk van ca. 10.000 kg/ 2 cm . De verkregen homogene celmassa wordt gedurende 30 min bij een snelheid van 3000 rpm gecentrifugeerd, de bovenstaande 5 vloeistof wordt afgescheiden, gefiltreerd door een Seitz-insteekfilter en 4 volumedelen ethanol worden aan het filtraat toegevoegd. Het zich afscheidende neerslag wordt afgefiltreerd, opgelost in fysiologische zoutoplossing en de oplossing wordt gevriesdroogd bij -20°C. Afhankelijk van de gist- en celver-10 brekingsomstandigheden wordt ca. 1500 mg poederige stof verkregen. Dit produkt wordt verdeeld over ampullen en gebruikt als een allergeen bij intradermische proeven op basis van late overgevoeligheidsreacties, verder als een antigeen in latex-agglutinatie-, immunodiffusie- en tegen-immunoelectroforese-15 proeven.

VOORBEELD III

Bereiding van immunobiologisch preparaat Cg3

Een hellende Sabouraud-dextrose-agar wordt met een in voorraad gehouden kweek van Candida Guilliermondii ge-20 inoculeerd en vervolgens gedurende 48 h bij 37°C gexncubeerd.

De op de hellende kweek ontwikkelde schimmel wordt gesuspen-deerd in een dextrose/pepton/gistkweekvloeistof en de verkregen suspensie wordt als entstof in de volgende trap gebruikt.

250 ml van een vloeibaar dextrose/pepton/ 25 gistkweekmedium wordt gebracht in een conische kolf met een ca-paciteit van 500 ml en de boven genoemde entstof wordt toegevoegd aan het medium. Het verkregen mengsel wordt bij 37°C gedurende 48 h onder schudden met een snelheid van 130 rpm ge-incubeerd. Daarna wordt een 30-40 % waterige formaldehyde-30 oplossing toegevoegd aan de kweek in een hoeveelheid voldoende om een uiteindelijke formaldehydeconcentratie van 0,5 % te verkrijgen. De kolf wordt vervolgens weer in de schudmachine gezet en met een snelheid van 130 rpm gedurende 6 h bij 37°C geschud. Een monster wordt getrokken uit de verkregen kweek en 35 de levensvatbaarheid van de schimmel wordt gecontroleerd door deze te inoculeren op Sabouraud-dextrose-agarplaatjes en de plaatjes bij 37°C gedurende 48 h te incuberen. Een volgend monster wordt getrokken uit de kweek voor Gram-besmetting.

8104979 ♦ * N.

- 14 -

Wanneer het monster besmet raakt , hetgeen de aanwezigheid van bacterieverontreinigingen aangeeft, kan de kweek niet worden gebruikt voor de bereiding van immunobiologische preparaten.

De van bacterieverontreinigingen vrije kweek wordt als volgt 5 bewerkt: de kweek wordt gecentrifugeerd gedurende 10 min met een snelheid van 1000 rpm, de vaste fase, bestaande nit hele cellen, wordt afgescheiden, drie maal gewassen met steriele fysiologische zoutoplossing en vervolgens opnieuw gecentrifugeerd gedurende 10 min met een snelheid van 1000 rpm. Een nat-10 te celmassa met een gewicht van ca. 2,5 g wordt verkregen.

Een volumedeel van de verkregen natte celmassa wordt gesuspendeerd in 3 volumedelen fysiologische zoutoplossing, een commercieel verkrijgbare merthiolaatoplossing (natriumethylmercurithiosalicylaat) wordt toegevoegd aan de 15 suspensie in een hoeveelheid voldoende voor een uiteindelijke concentratie van 1 : 10.000 en de celsuspensie wordt bij +4°C bewaard. Dit immunobiologische preparaat kan worden toegepast in de laboratoriumdiagnose voor buisagglutinatie- en indirecte fluorescentieproeven, verder voor de bereiding van besmette 20.antigenen, die te gebruiken zijn in ABR-proeven.

De volgens de uitvinding bereide immuhobiolo-gische preparaten maken het mogelijk Candida Guilliermondii infecties te diagnostiseren en een regelmatige preventieve selectie en immunisatie van vee, dat blootstaat aan dergelijke 25 ziektes, uit te voeren. Dit brengt aanzienlijke voordelen met zich mee, in de eerste plaats bij de veefokkerij, aangezien verliezen vanwege Candida Guilliermondii infecties aanzienlijk kunnen worden gereduceerd. In aanmerking genomen dat mensen ook bevattelijk zijn voor Candida Guilliermondii infecties, zijn 30 de diagnostische proeven van groot belang met betrekking tot de volksgezondheid. Bovendien kunnen enkele van de volgens de uitvinding bereide immunobiologische preparaten doelmatig worden gebruikt bij de behandeling van Candida Guilliermondii infecties, die tot nu toe niet konden worden behandeld volgens 35 immunobiologische methoden.

8104979

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van immunobio-logische preparaten voor de diagnose, profylaxis en/of behan-deling van Candida Guilliermondii infecties, met h e t 5kenmerk , dat a) een Candida Guilliermondii stam wordt ver-meerderd onder aerobe omstandigheden bij 24-42°C op een kweek-medium dat op te nemen koolstof- en stikstofbronnen bevat, de verkregen kweek of kweken onder identieke omstandigheden wordt 10 of worden bewaard gedurende een langere periode, daarna de schimmelcellen worden afgescheiden van de kweek, gewassen, mechanisch verbroken en geextraheerd, het extract wordt behan-deld met een polair organisch oplosmiddel en het resulterende neerslag wordt omgezet in een immunobiologisch preparaat als 15 zodanig, of na verdere zuivering, of b) een Candida Guilliermondii stam wordt ge-kweekt gedurende 48-72 h onder aerobe omstandigheden bij 24-42°C op een kweekmedium, dat op te nemen koolstof- en stikstofbronnen bevat, de resulterende kweek eventueel verder 20 wordt vermeerderd onder vorming van twee of drie nieuwe kweken, vervolgens de schimmelcellen worden afgescheiden van de kweek, gewassen, mechanisch verbroken en geextraheerd, en daarop in-dien gewenst, een polair organisch oplosmiddel wordt toege-voegd aan het extract en het resulterende neerslag wordt omge- 25 zet in een immunobiologisch preparaat als zodanig of na verdere zuivering, of c) een Candida Guilliermondii stam wordt ge-kweekt gedurende 48-72 h onder aerobe omstandigheden bij 24-42°C op een kweekmedium, dat op te nemen koolstof- en stik- 30 stofbronnen bevat, vervolgens de kweek wordt gedood, de dode cellen worden afgescheiden en daarop omgezet in een immunobiologisch preparaat als zodanig of na zuivering.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de Candida Guilliermondii stam 35 wordt gekweekt bij 32-38°C.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een alcohol wordt toegepast als polair organisch oplosmiddel.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met 8104979 - 16 - * het kenmerk, dat ethanol wordt toegepast als polair organisch oplosmiddel.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het immunobiologische preparaat 5 wordt gebracht in een vorm, die geschikt voor toepassing in de geneeskunde of veeartsenijkunde is,

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het volgens methode a) of b) be-reide immunobiologische preparaat in de vorm wordt gebracht 10 van een allergeen, een oplosbaar antigeen of een vaccin.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het volgens methode c) bereide immunobiologische preparaat in de vorm wordt gebracht van een corpusculair antigeen.

8. Werkwijze voor de bereiding van een serum met hoog precipitinegehalte, geschikt als reagens bij de labo-ratoriumdiagnose van Candida Guilliermondii infecties, met het kenmerk., dat konijnen worden geimmuniseerd met een immunobiologisch preparaat bereid volgens methode a) van 20 conclusie 1, de dieren worden gedood en het serum uit het bloed wordt afgescheiden.

9. Werkwijze voor de bereiding van een serum met hoog agglutininegehalte, geschikt als reagens voor de la-boratoriumdiagnose van Candida Guilliermondii infecties, met 25 het kenmerk, dat konijnen worden geimmuniseerd met een immunobiologisch preparaat, bereid volgens methode b) of c) van conclusie 1, de dieren worden gedood en het serum uit het bloed wordt afgescheiden. 30 8104979