CS241478B2

CS241478B2 - Carrier system's particles and method of their production

Info

Publication number: CS241478B2
Application number: CS809246A
Authority: CS
Inventors: Zoltan Riedl; Laslo Sztankov; Istvan Horvath
Original assignee: Human Oltoanyagtermelo
Priority date: 1979-12-27
Filing date: 1980-12-23
Publication date: 1986-03-13
Also published as: SU1487802A3; FR2472386A1; ES498048A0; DK552280A; CH655246A5; PT72261B; PT72261A; YU329080A; RO81371A; CA1165237A; FR2472386B1; NL8007041A; HU184141B; JPS57112334A; DD158738A5; IT1150073B; DK160288C; GB2066203A; IT8026950A0; BE886884A

Description

Vynález se tyká částic z látek rozpustných v· lipoidech, prostředku tvořených těmito částicemi a biologicky aktivními látkami vázanými na uvedené částice a způsobu jejich výroby.

Při pokusech in vitro se к přípravě biologicky aktivních látek používá například latexu, tvořeného polystyrénovou suspenzí s vhodnou velikostí suspendovaných částic. Takové polystyrénové suspenze jsou popsány v Am. J. Med. 21, 888—892 (1956). Tato latexová suspenze se vyrábí ze styrenu. Jelikož je známo, že molekuly styrenu mají sklon к samovolné polymeraci, je třeba podrobit styren před vlastní přípravou latexu destilaci к získání styrenového monomeru, který se teprve potom polymeruje. Avšaik vzhledem к chemické struktuře styrenových molekul má i takto připravená latexová suspenze sklon к samovolné polymeraci. Proto částice uvedené suspenze během jejího skladování stárnou a takto zestárlá suspenze už není vhodná jato činidlo pro provádění srážecích reakcí [J. A. M. A. 163 (2), 180—181 (1958)].

Kromě toho se činidla na bázi latexového nosičového systému připravují alespoň ve dvou stupních. V prvém stupni se nejdříve připraví samotný nosičový systém, na který se teprve potom ve druhém stupni naváže biologicky aktivní látka. К přípravě takového činidla je zapotřebí mnoho času, přičemž toto činidlo je navíc vhodné pouze pro provádění pokusu in vitro, protože styren je рш živé organismy silně škodlivý.

Jakožto adjuvant in vivo se v široké míře používá Freundových adjuvant (Molecular Biologie 13, Biochemistry and Biophysics 1973 New York). Tato adjuvanta mohou být vzhledem к vedlejším účinkům, které znemožňují jejich použití v humánní terapii, použita i za kontrolovaných podmínek jen v omezené míre? Částice připravené způsobem. podle vynálezu mohou být také výhodněji použity než v humání terapii používaná kov - obsahující adjuvanta. (Molecular Biology 13, Biochemistry nad Biophysics, 1973 New York) a imunostimulátory typu saponin, které mění krevní obraz [Acta vet. seanci. 19, 7—40 (1978)].

V současné době probíhají pokusy použít při parenterální aplikaci jako nosiče pro biologicky aktivní látky liposom [Proč. Nat. Acad. Se. 72, 88—92 (1975)]. Liposomové částice jsou vytvořeny z cholesterolu a povrchově aktivní látky. Tyto částice se připraví z chloroformového roztoku uvedených látek; vytvoření podmínek pro vznik částic se dosáhne přídavkem fosfatidylcholinu. Chloroformová fáze se potom· vysuší к suchu, přičemž se na stěnách nádoby vytvoří vrstva lipidu. Ve druhém stupni se к této vrstvě na stěnách nádoby přidá roztok biologicky aktivní látky (britský patentový spis č. 28 131/74). Příprava tohoto systému neprobíhá kontinuálně a v jed né šarži se získá pouze malé množství požadovaného produktu. Navíc se velikost částic získaných tímto způsobem pohybuje v širokém rozsahu.

Cílem vynálezu je odstranit nedostatky latexových systémů používaných in vitro a ostatních systémů používaných in vivo (Freundovy adjuvanta, adjuvanta typu saponin, kov - obsahující adjuvanta a liposom) vyvinutím nosičového systému, který by byl použitelný pro rozsáhlou škálu medicinálních aplikací, který by neměl sklon к samovolné polymeraci, který by nebyl škodlivý pro živý organismus, a který by tedy byl použitelný v imunologii, biologii, humánní terapii a veterinární medicíně.

Vzhledem к funkčnímu charakteru tohoto* nosičového systému je vzhledem к výše uvedenému nezbytně žádoucí, aby na tento nosičový systém mohly být vázány biologicky aktivní látky.

Dalším cílem vynálezu je, aby vytvoření uvedených částic nosičového systému a navázání biologicky aktivní látky na tento nosičový systém proběhlo* v jediném stupni a aby výroba takto vzniklé kompozice mohla být prováděna kontinuálně. Vzhledem к tomu bude možné získat větší množství požadovaného; produktu, což bude činit tento způsob hospodárnějším než jsou výše uvedené známé způsoby.

Nyní bylo nově zjištěno, že vytvoření částic nosičového systému a navázání částic biologicky aktivní látky na částice nosičového systému může proběhnout v jediném stupni. Toho se dosáhne následujícím způsobem. Rozpustí se cholesterol a povrchově aktivní látka, například vaječný lecitin, v absolutním alkoholu. Současně se připraví., směs biologicky aktivní látky, jakou jsou například bakterie, viry, jejich buněčné , frakce nebo produkty jejich látkové výměny, rozličné hormony, antibiotika a haťteny, které samy o, sobě vykazují jen velmi nedostatečný imunobiologický účinek, s vodným elektrolytickým roztokem. Potom se uvedený alkoholový roztok smísí s uvedenou vodnou fází. Při tom se dosáhne vytvoření nosičového* systému částic a navázání biologicky aktivní látky na tyto částice nosičového systému v jediném stupni.

Způsob podle vynálezu může být proveden také ve dvou stupních. V tomto případě se v alkoholu rozpustí částice - tvorná látka a takto vzniklý roztok se potom smísí s vodnou elektrolytickou fází. Tímto způsobem se získají „prázdné“ částice nosičového systému, na které může být teprve později navázána biologicky aktivní látka.

V obou výše uvedených případech se získaná suspenze odstředí, supernatant se dekantuje a na dně usazená sedlina se potom suspenduje ve vodě nebo ve vodném elektrolytickém roztoku a zpracuje ultrazvukem. Skladování vzniklé suspenze se

241473 provádí buď po předcházející lyofilizaci nebo za chlazení. Lyofilizovaná látka se ještě sterilizuje ozářením.

Vynález se týká částic nosičového systému na bázi látek rozpustných v lipoidech používaných к navázání biologicky aktivních látek. Částice jsou podle vynálezu tvářeny fo-sfolipidy, s výhodou vaječným lecitinem, nebo cholesterolem, a popřípadě povrchově aktivní látkou.

Způsob výroby těchto částic spočívá v tom, že se roztok částicetvorné fosfolipidní látky v rozpouštědle, s výhodou v alkoholu, smísí s vodou nebo vodným roztokem elektrolytu s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10 při objemovém poměru alkoholické a vodné fáze 0,1 až 900 : 100. Vyloučené částice se oddělí, s výhodou odstředěním, a popřípadě se suspendují ve vodě nebo ve vodném roztoku elektrolytu s hodnotou pH 2 až 10. Vzniklá suspenze se lyofilizuje.

Částice podle vynálezu a prostředky podle vynálezu se vyrábějí tak, že roztok částice - tvorné látky, rozpustné v lipoidech, v alkoholu nebo v jiném vhodném rozpouštědle, které také obsahuje povrchově aktivní látku,

a) a biologicky aktivní látka ve vodě nebo ve vodném elektrolytickém roztoku s hodnotou pH 2 až 10 se vloží do nádoby, vybavené míchadlem, přičemž objemový po'měr alkoholické a vodné fáze je v rozmezí 0,1 až 900 : 100, načež se získaná reakční směs míchá alespoň po dobu jedné minuty a nechá stát nejvýše sedm dní, načež se oddělí vyloučené částice, nebo

b) se roztok částice - tvorné látky, smísí s vodou nebo vodným elektrolytickým roztokem s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10 při dosažení objemového poměru alkoholické a vodné fáze 0,1 až 900 : 100, načež se vyloučené částice oddělí a případně suspendují ve vodě nebo ve vodném elektrolytickém roztoku s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10 a vzniklá suspenze se lyofilizuje, nebo

c) se roztok částice - tvorné látky smísí s vodou nebo vodným elektrolytickým roztokem s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10 při dosažení objemového poměru alkoholické a vodné fáze 0,1 až 900 : 100, vyloučené částice se oddělí, tyto částice se přidají к biologicky aktivní látce ve vodě nebo ve vodném elektrolytickém roztoku s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10 a takto získaná reakční směs se míchá alespoň jednu minutu a potom nechá stát nejvýše sedm dní, načež se vytvořené částice oddělí, nebo

d) se částice podle varianty b) přidají к biologicky aktivní látce ve vodě nebo vodném elektrolytickém roztoku s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10 a potom suspendují a produkt získaný podle variant a) a

c) se případně lyofilizuje a je-li to žádoucí také sterilizuje ozářením.

Způsobem podle vynálezu byl takto splněn požadavek, aby způsob přípravy uve- dené suspenze mohl být prováděn kontinuálně a aby tato suspenze mohla být získána ve větším množství.

Vynález přináší následující výhody:

1) při způsobu podle vynálezu dochází к vytvoření částic nosičového systému а к vázání biologicky aktivní látky na tyto částice v jediném stupni;

2. způsob podle vynálezu probíhá kontinuálně, takže mohou být částice nosičového systému z látky rozpustné v lipoidech připraveny ve velkém množství;

3) částice nosičového systému jsou pro živý organismus neškodné;

4) vzhledemi к bodům 1 a 2 je zřejmé, že způsob podle vynálezu je hospodárný;

5. způsobem podle vynálezu může být nový nosičový systém připraven ve velkém měřítku, přičemž tento nosičový systém je vhodný jako činidlo pro provádění rychlých imunodiagnostických vyšetření in vitro, například jako

a) diagnostikům pro rychlé kvantitativní stanovení revmatoidní arthritidy a

b) další činidla pro rychlá imunodiagnostická stanovení;

6) rychlé imunodiagnostické reakce mohou být s imunodiagnostickými činidly v souladu s bodem 5 prováděny jako kapkové reakce, přičemž požadovaný výsledek stanovení může být získán již během několika minut;

7) vzhledem к tomu, že částice nosičového systému podle vynálezu nejsou pro živý organismus škodlivé, je možné těchto částic použít к zavádění biologicky aktivních látek do živého organismu, přičemž

a) mohou při vyvolání imunity působením virů zvýšit účinnost živých nebo usmrcených virů při tvorbě protilátek;

b) nebo jsou vhodné při vyvolání imunity působením bakterií ke stimulaci imunobiologické odezvy na přítomnost živých nebo usmrcených bakterií, jejich buněčných frakcí, produktů jejich látkové výměny a jejich derivátů;

c) nebo jsou vhodné ke zvýšení imunity vyvolané plísňovými frakcemi;

8) na částice nosičového systému podle vynálezu mohou být vázány také takové biologicky aktivní látky, které samy o sobě indukují v organismu pouze nepatrnou imunologickou odezvu avšak ve spojení s částicemi nosičového systému podle vynálezu dochází ke zvýšení imunologické odezvy vyvolané těmito látkami. Použitím částic nosičového systému podle vynálezu může být tedy dosaženo adjuvančního účinku (například u haptenů, hormonů, enzymů a histaminu).

Výhoda parenterálního očkování za použití částic nosičového systému podle vynálezu spočívá v tom, že v tomto případě nedochází к poškození organismu ani v místě očkování, ani v* žádném jiném místě. Lát241478 ka se plnou měrou vsaje a nezpůsobuje žádný vedlejší škodlivý účinek;

9) pomocí částic nosičové ho systému podle vynálezu mohou být vytvořeny také kompozice těchto částic s takovými biologicky aktivními látkami, které se z organismu rychle vylučují v důsledku jejich malých molekul; ve spojení s částicemi nosičového systému se uvedené molekuly ,^větší“ a lze předpokládat, že jejich vylučování z organismu v této zvětšené podobě bude probíhat pomaleji, čímž se vlastně dosáhne požadovaného prolongovaného' účinku léčiva.

V následující části popisu bude způsob podle vynálezu popsán detailněji. Při způsobu podle vynálezu se směšuje alkoholická fáze nebo jiná organicko-rozpouštědlová fáze s vodnou fází v objemovém poměru 0,1 až 900 : 100. Tím se získá optimální velikost částic nosičového systému a ideální adsorbcvatelnost biologicky aktivních látek na těchto’ částicích.

Varianta a)

Způsob podle vynálezu se při této variantě provádí v zařízení zobrazeném na připojeném obrázku 1. Do nádrže 1 se naplní roztok lecitinu a cholesterolu v absolutním alkoholu. Do nádrže 2 se předloží biologicky aktivní látka ve vodném elektrolytickém roztoku s hodnotou pH 2 až 10. Potom se spustí míchadlo 3 a do nádoby 4 s míchadlem 3 se nechá téci, kapat nebo rozstřikovat -obsah nádrží 1 a 2. Takto získaná reakční směs se míchá po dobu jedné minuty rychlostí 50 otáček za minutu, načež se nechá přetéci pomocí přetokového potrubí 5 do sběrného^ zásobníku 6. Zde se reakční směs míchá tak dlouho, až se získá dostatečné množství částic. Takto získaný produkt se potom inkubuje při teplotě 37 ^eC po dobu 5 až 10 minut, načež se odstřeďuje rychlostí 6 000 otáček za minutu po dobu 30 minut a supernatant nad získanou sedlinou se odlije.

V případě, že má být produkt bezprostředné použit, vyjme se sedlina fyziologickým roztokem chloridu sodného·, suspenze se homogenizuje a zpracuje ultrazvukem. V případě, že má být získaný produkt použit až později, vyjme se sedlina destilovanou vodou, suspenze se homogenizuje, dávkuje, lyofilizuje a nakonec sterilizuje ozářením.

Varianta b)

I tato varianta způsobu podle vynálezu se provádí v zařízení zobrazeném na připojeném obrázku 1. Do nádrže 1 se naplní roztok lecitinu a cholesterolu v absolutním alkoholu. Do nádrže 2 se naplní vodný elektrolytiícký roztok s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10. Potom se spustí míchadlo 3 a do nádoby 4 s míchadlem 3 se nechá té ci, kapat nebo rozstřikovat obsah nádrží 1 a 2. Po promísení přeteče získaná suspenze z nádoby 4 přetokovým potrubím 5 do sběrného zásobníku 6. Zde se reakční směs míchá tak dlouho, až se získá dostatečné množství suspenze částic.

Získaná suspenze se potom odstřeďuje po dobu 30 minut rychlostí 6 000 otáček za minutu (4 000—6 000 g), načež se supernatant nad sedlinou odlije. Získaná sedlina se rozmíchá v destilované vodě, homogenizuje a zpracuje ultrazvukem. Po dávkování se produkt sterilizuje ozářením. Takto získané prázdné částice v lyofilizované formě obsahují v jednotkovém množství (částicová jednotka) 11,2 mg sušiny, což odpovídá počtu částic 1,5 až 2,5 x 1Ó⁸.

Varianta c)

Rovněž tato varianta způsobu podle vynálezu se provádí v zařízení zobrazeném na připojeném obrázku 1. Do nádrže 1 se naplní roztok lecitinu a cholesterolu v absolutním alkoholu. Do’ nádrže 2 se naplní vodný elektrolytický roztok s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10. Potom se spustí míchadlo 3 a dO’ nádoby 4 se nechá téci, kapat nebo rozstřikovat obsah nádrží 1 a 2, Po promíšení přeteče reakční směs z nádoby 4 přetokovým potrubím 5 do sběrného zásobníku 6. Zde se reakční směs míchá tak dlouho, až se získá požadované množství suspenze částic.

Suspenze se potom odstřeďuje po dobu 30 minut rychlostí 6 000 otáček za minutu, načež se supernatant nad vzniklou sedlinou odlije. V případě okamžitého použití se biologicky aktivní látka převede do fyziologického roztoku chloridu sodného a v takto získaném roztoku se suspenduje výše uvedeným způsobem získaná sedlina částic nosičového systému podle vynálezu. Suspenze se potom homogenizuje a zpracuje ultrazvukem. V případě, že má být nosič ového systému použito až později, přidá se к sedlině biologicky aktivní látka v destilované vodě nebo ve vodném elektrolytickém roztoku s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10. Získaná reakční směs se dokonale homogenizuje a zpracuje ultrazvukem, načež se inkubuje po dobu 5 až 10 minut při teplotě 37 °C, dávkuje a sterilizuje ozářením.

Varianta d)

Částice vyrobené podle varianty b) mo·hou být použity u biologicky aktivních látek jako adjuvanta.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn formou příkladů provedení.

Příklad 1

Příprava séra proti hepatitidě

Živé a usmrcené viry hepatitidy se naváží na částice nosičového systému podle vynálezu tak, že se k částicové jednotce lyofilizovaných částic (vyrobených podle varianty b) způsobu podle vynálezu] přidá 10° virových částic. Použitím takto získaného; sé.ra se dosáhne vyvolání vyššího· stupně imunity, než jaký je dosud popsán v literatuře.

Příklad 2

Ochranný účinek vyvolaný inaktivovanými myxomatózovými vakcínami

Ve veterinárním lékařství se k vyvolání imunity vůči virům myxomatózy s úspěchem používá pouze takové očkovací látky, která byla připravena z živých virů. Při prokázání výše uvedeného; účinku se skupina zajíců očkuje inaktivovanoou myxomatózovou vakcínou, přičemž koncentrace virových tělísek činí 10⁸ virových tělísek na 1 mililitr injekčního roztoku. Králíci byli očkováni vždy 1 . ml uvedené vakcíny, ke které byla přidána jedna částicová jednotka (viz varianta b] způsobu podle vynálezu částic nosičového systému podle vynálezu. Z kontroly infekce, která byla provedena třicátý den po očkování, vyplývá, že takto připravená a použitá vakcína poskytuje dokonalou ochranu i proti 100 infekčním dávkám živých virů.

V případě, že se použije částic nosičovéЬю systému, připravených podle varianty a) způsobu podle vynálezu, potom získaná vakcína poskytuje za jinak stejných očkovacích podmínek ochranu proti 10 infekčním dávkám.

P říkla.d 3

Imunita proti treponematóze

Z rozrušených buněk mikroorganismů kmene Treponema pallidum Budapest (107 /ml.) byl pomocí ultrazvuku získán antigen. Takto získaný antigen byl vázán na lyolifilizované. .částice nosičového systému podle vynálezu, přičemž bylo· použito na dvě lyofilizované částicové jednotky částic nosičového systému podle vynálezu 1 ml antigenu. Získanou očkovací látkou byla potom očkována pokusná zvířata- každý týden celkem šestkrát, přičemž bylo použito 1 ml antigenu a intramuskulární, intravenózní a subkutánní injikace. U očkovaných zvířat bylo tímto způsobem dosaženo vyššího stupně imunity, než jaký byl dosud popsán v literatuře.

Příklad 4

Vyvolání imunity proti tetanu

a) Na jednu částicovou jednotku (viz varianta b) způsobu podle ' vynálezu) částic nosičového systému podle vynálezu se naváže jednotkové množství tetanového toxoidu a takto získaná kompozice se potom zlyoiilizuje. Před vlastním použitím se lyofilizovaný produkt opětovně suspenduje ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, přičemž objem použitého- fyziologického roztoku kuchyňské soli odpovídá objemu kompozice před ziyo'filizováním. Účinnost získaného séra byla stanovena pokusy s morčaty, popsanými v americké, britské a maďarské lékařské literatuře (United States Pharmacopeae, British Pharmacopeae, Ph.armacopea Hungaricae).

Ze získaných výsledků vyplývá, že takto· připravené sérum za použití částic nosičového systému podle vynálezu vyvolává vyšší stupeň specifické imunity proti tetanu, než jaký byl dosud popsán v literatuře. Byl rovněž zkoumán imunologický účinek . sér, připravených použitím částic nosičového· systému podle vynálezu, připravených podle variant a) a c) způsobu podle vynálezu, přičemž bylo zjištěno, že i v· těchto- případech se dosahuje stojných výsledků jako při použití částic, připravených podle varianty b) způsobu podle vynálezu.

b) K jedné částicové jednotce (varianta b způsobu podle vynálezu) částic nosičového· systému podle vynálezu se přidají rozličná množství tetanového toxoidu a takto získané materiály se zlyofilizují. Po- lyofilizaci se lyofilizované materiály opětovně suspendují ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, přičemž objem fyziologického roztoku chloridu sodného odpovídá objemu suspenze částic s vázaným tetanovým toxoidem před lyofilizací. Účinnost získaných sér se potom stanoví pokusy s morčaty stejným způsobem, jaký byl popsán v předcházejícím příkladu 3, přičemž bylozjištěno, že byl vyvolán vyšší stupeň imunity, než jaký byl dosud popsán, a že vyvolaná protilátková odezva organismu je úměrná použité antigenové dávce.

c) K rozličným množstvím částic (varianta b) způsobu podle vynálezu) nosičového systému, podle vynálezu se přidá vždy stejné množství tetanového toxoidu. Po zlyofilizování se lyofilizovaný materiál opětovně resuspenduje ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, přičemž tento objem fyziologického· roztoku odpovídá objemu suspenze částic s vázaným-· -tetanovým toxoidem před lyofilizací. Účinnost takto získaných sér byla stanovena způsobem, popsaným ve výše uvedeném příkladu 3, přičemž bylo zajištěno, že protilátková odezva organismu na injikovaný antigen v každém případě převyšuje dosud popsané odezvy.

Příklad 5

Vyvolání imunity kombinovaným bakteriálním antigenem

Na jednu částicovou jednotku (varianta bj způsobu podle vynálezu] částic nosičovéh-o- systému podle vynálezu ' se naváže kombinace difteriálního a bakteriálního antigenu. Po zlyofilizování této suspenze- se lyofilizovaný produkt opětovně suspenduje ve fyziologickém· roztoku chloridu sodného, přičemž objem tohoto fyziologického roztoku -odpovídá- objemu uvedené suspenze před lyofilizací. Účinnost takto získaného antigenového přípravku se potom stanoví způsobem, popsaným ve výše uvedeném příkladu 3. Stanovení se provádí s morčaty, přičemž získaný stupeň imunity přesahuje stupeň imunity, který byl dosud popsán v lékařské literatuře.

Příklad 6

Příprava anti-HCG-séra

Pro výrobu antihormonů se provádí pokusy s lidským- choriogonadotropinem (HCG). V současné době je obecně známá nedostatečná stimulace uvedené látky použitím olejového Freundova adjuvans.

Za použití stimulace podle vynálezu se 3 000 jednotek/mg lidského- choriogonadotropinu naváže na jednu částicovou jednotku (varianta b způsobu podle vynálezu).

Takto získanou očkovací látkou se očkuje skupina NZW-králí.ků s průměrnou tělesnou hmotností 2,5 kg každé dva týdny, a to subkutánně. Stupeň vyvolání tvorby protilátek se stanoví po sedmé injekci, přičemž bylo- zjištěno, že vyvolaná imunita je vyšší než u- kontrolní skupiny.

Očkování kontrolní skupiny králíků bylo provedeno za použití stejného* množství lidského -choriogonadotropinu, který však byl stimulován použitím Freundova adjuvans. Zatím-co u této· -kontrolní -skupiny byly pozorovány nežádoucí vedlejší účinky, nebyly tyto vedlejší účinky pozorovány u skupiny králíků, očkovaných za použití částic nosičového systému podle vynálezu. Po uplynutí výše uvedené -očkovací periody byli pokusní králíci usmrceni, přičemž při mikroskopickém a histologickém vyšetření nebyly -u těchto- králíků shledány žádné pathologické změny ledvin, jater a plic.

Příklad - 7

Příprava antihistaminového séra

2,7 mg detoxikovaného histaminu (p-aminobenzoazohystamin) se naváže na dvě částicové jednotky lyofilizovaných částic -nosičového systému podle vynálezu- (varianta b) způsobu podle vynálezu a takto získaným sérem se -očkuje skupina králíků každý druhý den. Po 20. injekci lze pozorovat vysokou odezvu -organismu při tvorbě protilátek proti histaminu.

Příklad 8

Příprava gama-globulinového činidla, ve kterém je gama-globulin vázán na částice látky rozpustné v lipoidech

Podle varianty a) způsobu podle vynálezu se smísí 2,5 ml 0,25% gama-globulinového roztoku -v pufru s hodnotou pH 6 a roztok látky rozpustné v lipoidech v absolutním - alkoholu, který obsahuje 0,01 až 0,6 - % vaječného lecitinu a 0,1 až 2 - % cholesterolu. Získaná sedlina se suspenduje v 5 1 fyziologického' elektrolytického roztoku (obvyklého pro zřeďování krevního séra), promísí se a zpracuje ultrazvukem.

Příklad 9

Použití gama-globulinového činidla, připraveného- způsobem podle vynálezu, ke kvantitativnímu stanovení revmatoidní arthritidy

Při onemocnění revmatoidní arthritidou jsou v organismu přítomny imunokomplexy, které reagují s normálním lidským imunoglobulinem. Na této skutečnosti je založeno- stanovení uvedených- specifických imunokomplexů a rozpoznání a identifikace tohoto- typu onemocnění. Stanovení uvedených specifických imunokomplexů se může provést rozličnými reakcemi, jako* například reakcí za použití latexových částic nebo citlivou Waaler-Rosovou reakcí.

Latexový nosičový systém byl již popsán v předcházejícím- textu.

Waaler-Rosova reakce je pasivní hemaglutinační metodou, k jejímuž provedení je zapotřebí hodně času.

Krevní sérum vyšetřovaného¹ člověka -se při těmito stanovení zahřívá na teplotu 56 stupňů Celsia po dobu 30 minut -a potom se skladuje až doi okamžiku provedení vlastního- testu při teplotě- 4 °C.

Pracuje se pokud možno s čerstvým -krevním sérem, jehož stáří by nemělo přesáhnout dobu jednoho- týdne.

Na podložní sklíčko, které se obvykle používá pro aglutinační reakce bakterií, se nakapou kapky (0,5 ml) zkoumaného krevního séra zředěného - fyziologickým roztokem chloridu -sodného v rozličných koncentracích. K těmto zředěným krevním sérům se potom přidá po- 0,01 ml gamaglobulinového- činidla, připraveného- způsobem podle vynálezu. Od okamžiku přidání činidla- ke krevnímu séru se měří průběh aglutinační reakce. Činidlo se- přikape ke krevnímu séru v době pokud možno, co -nejkratší. Pohybováním podložního sklíčka a mícháním skleněnou - tyčinkou se obě složky promísí. Vyhodnocení aglutinační reakce se děje- za použití lupy pozorováním· okem. 'Stupeň aglutinace se hodnotí klasifikační stupnicí

4 1 4 7 8 od 0 do ++O znamená, že během 5 minut nedošlo к aglutinaci. Pozitivní aglutinační reakce se označuje křížky a je tím výraznější, čím větším počtem křížků je označena. Označení ++++ znamená, že vznikly veliké agregáty, okolo kterých je čistá tekutina. Jakožto kontrolní vzorek slouží kapka fyziologického roztoku chloridu sodného, použitého při stanovení ke zředění krevního séra, ke kterému se přidá 0,01 ml výše uvedeného gama-globulinového činidla. V tomto případě nedošlo během zkušebního času 5 minut к žádné aglutinaci.

Tvorba makroagregátů může být také pozorována mikroskopem. V tomto případě se reakce provádí přímo na podložním sklíčku mikroskopu. Pozorování se provádí za použití 40 x zvětšujícího objektivu a 7x zvětšujícího okuláru.

V případě, že při stanovení jde pouze oto určit, zda uvedená reakce je pozitivní nebo negativní, potom se toto stanovení provádí s nezředěným krevním sérem. Tato· reakce se provede výše popsaným způsobem a je pozitivní, jestliže к aglutinaci dojde během jedné minuty, nebo negativní, jestliže к aglutinaci během tohoto času nedojde.

Z výsledků uvedených v následující tabulce 1 zřejmé, že prostředek podle vynálezu je vhodný к provádění rychlých sériových vyšetření.

Tabulka 1

Titr činidla (GLT) připraveného z částic rozpustných v lipoidech a gama-globulinu vázaného na tyto částice.

Zředění krevního Titr Waaler-Rosovy reakce (WRT)

séra	0	32	64	128	256	512	1024
Koncentrované	+	++++	++++	+ +++	++++	++++	++++
2	—	+^;++	++++	++++	++++	++++	++++
4	—	:+	++	+++	++++	++++	++++
8	—	±	+i	++	+++	Ί—НН—H	+'+'++
16	—	—	+	+	+++	4—H+	+'+++
32	—	—	—	±	++	+++	+++
64	—	—	—	—	+	+	++’+
128	—	—		—	—	+	+

pRedmEt vynalezu

Claims

pRedmEt vynalezu

1. Částice nosičového systému na bázi látek rozpustných v lipoidech к navázání biologicky aktivních látek, vyznačující se tím, že jsou tvořeny fosfolipidy, s výhodou vaječným lecitinem nebo cholesterolem, a popřípadě povrchově aktivní látkou.
2. Způsob výroby částic podle bodu 1, vyznačující se tím;, že se roztok částicetvorné fosfolipidní látky v rozpouštědle, výhodně v alkoholu, který přídavně obsahuje povrchově aktivní látku, smísí s vodou nebo vodným roztokem elektrolytu s hodnotou pH v rozmezí 2 až 10 při objemovém poměru alkoholické a vodné fáze 0,1 až 900 : 100, načež se vyloučené částice oddělí a popřípadě suspendují ve vodě nebo ve vodném roztoku elektrolytu s hodnotou pH 2 až 10 a vzniklá suspenze se lyofilizuje.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se jako částicetvorn-á látka použije vaječný lecitin, nebo cholesterol.
4. Způsob podle bodů 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se částice oddělí odstředěním.