CN1994463A - 一种免疫制剂的制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备一种从肿瘤组织或肿瘤细胞中提取肿瘤相关蛋白的组分并将其用于对肿瘤患者的免疫生物治疗。使用硫酸铵将肿瘤组织匀浆液或肿瘤细胞裂解液中的蛋白组分沉淀出来，沉淀物中含有热休克蛋白家族中的各类成员蛋白及其它肿瘤相关抗原物，沉淀物经脱盐、浓缩、冷冻干燥后的提取物可直接制备成注射针剂或用于体外刺激免疫细胞回输给肿瘤患者，激发肿瘤患者的免疫系统对肿瘤细胞的特异性识别和杀伤。

Description

一种免疫制剂的制备和用途

技术领域

本发明属于生物医药和生物技术领域。

技术背景

人体之所以能够在复杂的环境中生存是因为机体具有抵御外源入侵的病原体和消除体内变异细胞的能力。人体的免疫系统具有体液免疫和细胞免疫的两套机制。体液免疫一种是以B淋巴细胞介导的免疫反应，B淋巴细胞在脾脏和骨髓中发育成熟，B淋巴细胞产生的抗体能特异性地识别和结合外源性生物大分子，阻断外源体对机体的侵害。抗原-抗体形成的复合物能够激发机体的补体反应和细胞反应，对携带该外源生物大分子的病原体产生吞噬和降解以排除入侵的病原体。细胞免疫是基于T淋巴细胞为介导的免疫反应。抗原递呈细胞将外源性病原体或内源性变异细胞所携带的异类分子经MHCI类和MHCII类途径将抗原信息递呈给CD8+和CD4+T淋巴细胞，激发T淋巴细胞转变成细胞毒T细胞(CTLs)。经过MHC刺激转化而成的细胞毒杀伤细胞能够特异性地攻击和消除携带抗原的外源性细胞。T淋巴细胞还能分泌产生多种细胞因子，刺激巨噬细胞非特异性地吞噬外源病原细胞。

肿瘤细胞虽然能够刺激机体产生抗体反应但很难刺激CTLs激活启动细胞免疫，这是肿瘤细胞能够逃避机体免疫监视的原因之一。如果能够将体液免疫和细胞免疫同时调动起来就会极大地提高机体对消除外源性病原体和自身变异细胞的能力，使机体能够战胜和排除外源病原体或自身变异细胞使疾病消除恢复健康。

随着现代生物技术的发展，实验证明肿瘤细胞内含有肿瘤特异性抗原分子，它们有别于机体的正常蛋白，它们的存在赋予了肿瘤细胞靶向性，激发和引导机体的免疫系统特异性地识别和消除肿瘤细胞。肿瘤细胞的胞质内还存在有大量的热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)家族的各类成员，如HSP-27、HSP-40、HSP-60、HSP-70、HSP-90、HSP-gp96、HSP-110等，HSP中的HSP-70，HSP gp-96等成员已经证明具有识别、捕捉、加工外源性分子的能力并与其特异性分子的小肽片段结合形成热休克蛋白复合物(Heat Shock Protein Peptide Complexes，HSPPC)。HSPPC参与抗原的加工和作为抗原递呈分子直接将抗原递呈给T淋巴细胞，激发T淋巴细胞介导的特异性细胞免疫。因此HSPPC不仅能激发机体对外源病原体产生体液免疫，同时还能产生细胞免疫反应，恢复和提高了机体的免疫监视功能。热休克蛋白的这一重要特性奠定了对肿瘤免疫的个性化治疗和预防的理论和应用的基础。用加入硫酸铵从肿瘤组织匀浆液或肿瘤细胞裂解液中沉淀蛋白几乎包含了所有肿瘤细胞的特异性抗原和HSP家族成员，为肿瘤免疫治疗提供了所需的抗原物质。

发明内容

各类肿瘤之间存在着不同的肿瘤相关抗原，而同一类型的肿瘤因患者的个体背景的差异也存在着不同的肿瘤相关抗原。从肿瘤病人的瘤组织中提取其肿瘤特异性的相关抗原用于对该患者的免疫治疗，激发病人免疫系统对自身肿瘤细胞的靶向性识别和杀灭是近年来开展的一种肿瘤治疗新方式，即肿瘤的个性化治疗。

在肿瘤组织匀浆液或肿瘤细胞裂解液中含有目前一些已知和未知的肿瘤细胞特异性抗原及大量的热休克蛋白家族各类成员。通过向肿瘤组织匀浆液或肿瘤细胞裂解液中加入饱和硫酸铵溶液，可将匀浆液或裂解液中的部分蛋白组分沉淀下来，经过溶解、脱盐、浓缩、冷冻干燥等过程得到的沉淀产物可用于对肿瘤患者的免疫生物治疗。

肿瘤病人手术取出的肿瘤组织首先要满足病理检验的需求，余下可用于制备瘤苗的肿瘤组织往往非常有限。本发明采用硫酸铵沉淀肿瘤组织匀浆液或肿瘤细胞裂解液中的蛋白组分作为瘤苗，它的优点在于：

1.硫酸铵原料易得，价格低廉。

2.用于沉淀蛋白组分的操作方法简单易行。

3.硫酸铵不会使蛋白变性并具有保护和稳定蛋白质结构的特性。

4.从有限的肿瘤组织资源中可提取大量的肿瘤抗原，沉淀产物易于保存，用其可制备成抗肿瘤免疫制剂用于肿瘤的个性化免疫治疗。

具体实施方式

实施要求：

肿瘤组织提取的全部过程须在符合国家GMP(Good Manufactory Practice)标准的万级洁净实验室内进行。有些操作须在洁净室内的百级超净台中完成。所使用的化学试剂和原料均须符合《中国药典(1995)》及《中国生物制品主要原材料试行标准(1993)》。溶液和试剂均须高压灭菌消毒。实验耗材须为通过美国FDA认证的无菌、无毒、无热源的一次性耗材。非一次性使用器具须在使用后高压灭菌消毒。

样品处理过程：

手术中切下的肿瘤组织立即放入容器中盛放在冰浴保温桶内运送回实验室。如当时不及处理需立即放进-80℃冰箱中可保存1个月。肿瘤组织先用冰凉的生理盐水清洗除去血水，再用剪刀修剪除掉脂肪组织、坏死组织，结缔组织和正常组织。将肿瘤组织放入50ml离心管内，加入少量低渗缓冲液(10mM NaHCO₃)和0.5mg/ml Pefabloc SC(Roche)帮助细胞破裂并抑制蛋白酶对蛋白的降解。用剪刀将肿瘤组织剪碎后再用电动匀浆机将肿瘤组织打碎成均质状。将匀浆液装进离心管中在4℃100,000g离心90分钟取上清液。将等体积的饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到上清液中，边加入边搅拌。加完后需静置在4℃至少2小时或过夜。在4℃，6000rpm离心30分钟。弃去上清液，将沉淀物用蒸馏水溶解，用50Kd分子滤过蛋白浓缩管进行脱盐和浓缩，当浓缩管内的浓缩液减少时再加入蒸馏水，往复多次。滤出液经滴入10％M氯化钡后目测无白色沉淀物出现为止。将浓缩液合并收集并测定蛋白含量。经无菌过滤后可分装在灭菌消毒的西林瓶中进行冷冻干燥并封口包装。制备完成的瘤苗可存放在-20℃保存1年。

实施例1：

取得的肾癌患者的肿瘤组织按照以上方式提取沉淀产物，1克肿瘤组织大约可得到3毫克以上的沉淀产物。沉淀产物经脱盐、浓缩、测定蛋白含量后，经无菌过滤分装成100ug/瓶放置在-20℃保存，有效期可达1年。

在该肿瘤切除病人的术后恢复期间，或放、化疗后恢复期可开始进行免疫治疗。使用300ul注射用水将瓶中的内容物溶解，在病人的淋巴结附近做2-3点皮内注射，每点给予约100ul的注射剂量。2周后给予第二次免疫，方法同上。3次免疫之后，间隔1个月免疫1次，然后每隔半年免疫1次直至制备的瘤苗用完。在免疫治疗的期间可同时给予免疫增强剂、细胞因子等药物以协同提高免疫效果。

Claims (6)

1.一种沉淀物，它是利用向肿瘤组织匀浆液或肿瘤细胞裂解液中加入硫酸铵使溶液中的蛋白组分以沉淀物的形式沉淀下来而取得。

2.沉淀物经过溶解、脱盐并去除小分子组分，浓缩、冷冻干燥后的沉淀产物可用于对肿瘤患者的生物治疗。

3.沉淀产物可制备成冻干粉针用于向体内注射，或用于在体外刺激免疫细胞再回输到肿瘤患者体内及其它多种可能激发机体免疫应答的方式。

4.可将沉淀物再经过层析的方式以去除组分中的杂蛋白，富集目标蛋白，达到再次纯化的目的。层析方式包括离子层析、分子筛层析、亲和层析及其它用于纯化目的各种层析方式。

5.在此沉淀物的基础之上纯化取得的产物用于在肿瘤生物治疗，包括制备成注射针剂向体内注射，体外刺激免疫细胞再回输体内及其它多种可能激发机体免疫应答的方式。

6.用沉淀产物制备而成的免疫治疗剂可与佐剂、免疫增强剂，细胞因子，白介素类等药物联合使用以提高免疫疗效。