CN114487168A - 血乳酸标准物质的制备和定值方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的血乳酸标准物质的制备和定值方法包括：血乳酸标准物质的制备和保存；血乳酸标准物质均匀性和稳定性的检验；分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值的测定，本发明提供了一种血乳酸标准物质的制备与定值方法，该方法用于血乳酸检测试剂的开发及方法性能验证，以及用于血乳酸检测结果的量值溯源，保证临床血乳酸检测结果的准确性和可比性，保护大众健康、并有助于运动员的科学训练提高竞技体育成绩。
Description
技术领域
本发明涉及计量化学分析检测技术领域，特别是涉及一种血乳酸标准物质的制备和定值方法。
背景技术
血乳酸，即Blood Lactic Acid，是体内糖代谢的中间产物，主要由红细胞、横纹肌和脑组织产生，血液中的乳酸浓度主要取决于肝脏及肾脏的合成速度和代谢率。在某些病理情况下(如呼吸衰竭或循环衰竭时)，可引起组织缺氧，由于缺氧可引起体内乳酸升高。另外，体内葡萄糖代谢过程中，如糖酵解速度增加，剧烈运动、脱水时，也可引起体内乳酸升高。体内乳酸升高可引起乳酸中毒。检查血乳酸水平，可提示潜在疾病的严重程度。正常生理情况下，人体血乳酸的含量在(0.5～1.7)mmol/L。血乳酸的测定具有极其重要的临床意义，组织严重缺氧可导致三羧酸循环中丙酮酸需氧氧化的障碍，丙酮酸还原成乳酸的酵解作用增强，血中乳酸与丙酮酸比值增高及乳酸增加，甚至高达25mmol/L。这种极值的出现标志着细胞氧化过程的恶化，并与显著的呼吸增强、虚弱、疲劳、恍惚及最后昏迷相联系。即使酸中毒及低氧血症已得到处理，此种高乳酸血症常为不可逆的。见于休克的不可逆期、无酮中毒的糖尿病昏迷和各种疾病的终末期。在休克、心失代偿、血液病和肺功能不全时，常见的低氧血症同时有高乳酸血症，在低氧血症及原发条件处理后常是可逆的。在肝脏灌流量降低的病例，乳酸由肝的移除显著降低，会出现乳酸酸中毒。
此外，在竞技体育中，血乳酸的测定对于运动员的科学合理训练、提高竞技体育成绩也具有十分重要的意义。运动员的身体机能状态是指导科学训练的基础，也是决定运动员竞技水平发挥的关键因素。要制定科学合理的训练与竞技策略，必须准确、及时的了解运动员的身体机能状态。通过检测生化指标评价训练负荷的强度及运动员的身体机能状态，其中血乳酸是最常用的一个指标，运动中产生的乳酸被认为是有害的代谢产物，是导致运动能力下降和运动疲劳的原因之一。当肌肉运动强度逐渐加大时，在乳酸-运动强度关系曲线上出现两个拐点，第一拐点在血乳酸为2mmol/L左右出现，第二拐点在4mmol/L时出现。第二拐点通常作为实验室或运动现场测定时的乳酸无氧阈值。在训练时经常测定血乳酸可以了解体内乳酸生成和代谢变化的特点，作为训练中掌握运动强度的依据和评价运动员无氧代谢和有氧代谢的能力。在运动中还容易出现的低血糖，多发生在长跑、超长跑、长距离滑冰、滑雪和自行车等项目运动的比赛过程中或结束后。运动中发生的低血糖症，主要是由于长时间剧烈运动时体内血糖大量消耗和减少，皮质调节糖代谢的功能紊乱而造成的。运动性蛋白尿、血尿，指运动员在运动后出现一过性蛋白尿和血尿。运动性蛋白质尿生成的原因是由于运动时肾上腺素、去甲肾上腺素、肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶分泌增加，使肾血管收缩，肾血流量减少，肾小球毛细管压上升，滤过分数增加，肾小球膜电性和可滤过蛋白的电荷变化，使肾小球滤过较大分子量的蛋白质较多，在运动时肾小管的重吸收处于饱和状态，同时还会增加某些小分子量蛋白质的分泌。所以运动性蛋白尿是肾小球-肾小管混合型蛋白尿，但肾小球型是主要的。大运动负荷量、大训练强度到都可造成尿潜血，它表明机体对训练量不适应，或机体承受负荷量能力的下降。因此，运动尿蛋白质和尿潜血也可作为评定运动员身体机能状态、训练强度的指标。
计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，测量结果准确可比是依靠标准物质通过量值溯源传递实现的。要保证血乳酸检测结果的准确可比，就必须研制血乳酸的标准物质，将其作为量值传递载体，在血乳酸测定时作为校准标准或者用于方法的确认与验证。
发明内容
本申请的发明目的是提供了一种血乳酸标准物质的制备与定值方法，旨在填补相关技术的空白，保证血乳酸检测结果的准确有效。
为了完成本申请的发明目的，本申请采用以下技术方案：
本发明的一种血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：包括步骤：
(一)、血乳酸标准物质的制备和保存
(a)、血乳酸标准物质的制备
对健康普通人群或运动员志愿者捐献的血清分别进行检测，当上述血清中的HBV、HCV、HIV及新冠核酸检测均为阴性时，收集上述血清至需要数量，并在上述血清中加入0.1％～0.5％(v/v)Proclin300或叠氮钠作为防腐剂，加入后充分混匀，以保证血清的稳定性，然后采用生化分析仪、便携式乳酸分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或质谱仪对血清中的血乳酸浓度进行初步测定，当上述血清中的血乳酸初步测定浓度不低于要制备的血乳酸标准物质的血乳酸浓度的1％时，即将上述血清进行分装，得到血乳酸标准物质；当上述血清中的血乳酸初步测定浓度低于要制备的血清中血乳酸浓度的1％时，在上述血清中加入99％以上乳酸纯品标准物质，使得上述血清中的血乳酸浓度不低于要制备的血清血乳酸浓度1％，加入乳酸纯品标准物质的体积不得超过上述血清总体积的10％，加入后，上述血清在室温混匀(0.5～24)h，得到血乳酸标准物质；
(b)、血乳酸标准物质的分装和保存
将上述血乳酸标准物质分别装入无色或棕色安瓿瓶或塑料的冻存管中，将上述血乳酸标准物质在振荡条件下分装至上述安瓿瓶或冻存管中，并封口或密封，根据分装的顺序，对每个分装单元进行连续编号，分装单元数量为P，然后将分装单元置于-20℃以下的冰箱中冷冻保存；
(二)、血乳酸标准物质均匀性和稳定性的检验
(c)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸均匀性进行检验
用Excel中的randbetween函数对连续编号的分装单元进行随机抽取检验，当P≤200时，抽取分装单元数量m不少于11个；当200<P≤500时，抽取分装单元数量m不少于15个；当500<P≤1000时，抽取分装单元数量m不少于25个；当分装单元P>1000时，抽取分装单元数量m不少于30个，按照抽取的先后次序，对m个抽取分装单元进行依次重新编号和顺序排列，用生化分析仪法、葡萄糖乳酸盐分析仪法或同位素稀释质谱法对上述抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸含量进行均匀性检验，在检验时，首先按照上述顺序对每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行第一次检验，然后打乱上述顺序，再重复对上述每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸含量进行第二次检验，重复上述操作，直到对每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行第n次检验，n为大于等于3的整数，从而得到n次检验结果，按照下面的公式进行计算并统计出：分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸均匀性；
当抽取了m个样品，按照上述检验方法在重复性n次条件下，得到m组精密度测量数据如下：
编号1：x11,x12……………x1n,平均值
编号2：x21,x22……………x2n,平均值
……………
编号m：xm1,,xm2……………xmn,平均值
平均值
统计量N
N＝m·n 公式(2)
组间差平方和：
组内差平方和：
组间自由度：v1＝m-1；组内自由度：v2＝N-m
统计量F:
其中S1 2为组间方差，S2 2为组内方差，根据自由度(v1，v2)及给定的显著性水平α＝0.05，由表查得Fα的临界值
值，再与公式(7)计算得到的F值与Fα进行比较，若F<Fα则认为组内与组间无明显差异，分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸是均匀的，否则，分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸是不均匀的；
(d)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸的长期稳定性进行检验
长期稳定性检验的持续时间不少于6个月，在长期稳定性检验的时间段内，按照前密后疏的原则，选择不少于5个时间点k，在每个时间点上，抽取不少于步骤(b)中的-20℃以下的温度储存的至少2个分装单元中的血乳酸标准物质，用生化分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或同位素稀释质谱方法对每个分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸含量进行3次重复检验，然后计算这些测量结果的算术平均值，得到在每个时间点的测量结果的算术平均值Yi，将上述测量结果的算术平均值Yi与对应测量时间按照下面的线性模型进行拟合：
Yi＝b0+bX 公式(8)
在公式(8)中：
b0—截距，b—回归系数(斜率)；X—检验时间，单位(月)；Yi—在每个时间点的血乳酸标准物质中血乳酸含量的测定结果的算术平均值；
根据公式(9)和公式(10)计算出回归系数(斜率)和截距：
在公式(9)中：
Xi—第i个时间点的检测时间，单位为月；
Yi—在第i个时间点上，上述分装单元中血乳酸标准物质的乳酸测定结果的算术平均值；
k—时间点的数量；
根据公式(11)计算s值：
公式(11)中的各个符号的含义与公式(8)、公式(9)和公式(10)中的符号含义相同，
根据公式(12)计算s(b)的值：
查t分布表，得到t0.95,k-2的值；
若|b|＜t0.95,k-2·s(b)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性，说明血乳酸标准物质是
长期稳定的；否则说明血乳酸标准物质是不稳定的；
(e)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸的短期稳定性进行检验
短期稳定性检验的持续时间不少于7天，在短期稳定性检验的时间段内，按照前密后疏的原则，选择不少于5个时间点k，在每个时间点上，从步骤(b)中取出至少二个分装单元，将它们置于-20℃到40℃的温度范围下进行考察，提取上述分装单元中的血乳酸标准物质，用生化分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或同位素稀释质谱方法对每个分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行3次重复检验，计算这些测量结果的算术平均值，得到每个时间点的测量结果的算术平均值Yi，将上述测量结果的算术平均值与对应测量时间按照下面的线性模型进行拟合：
Yi＝b0+bX 公式(8)
在公式(8)中：
b0—截距，b—回归系数(斜率)；X—检验时间，单位(月)；Yi—在每个时间点的血乳酸标准物质中血乳酸含量的测定结果的算术平均值；
根据公式(9)和公式(10)计算出回归系数(斜率)和截距：
在公式(9)中：
Xi—第i个时间点的检测时间，单位为月；
Yi—在第i个时间点上，上述分装单元中血乳酸标准物质的乳酸测定结果的算术平均值；
k—时间点的数量；
根据公式(11)计算s值：
公式(11)中的各个符号的含义与公式(8)、公式(9)和公式(10)中的符号含义相同。
根据公式(12)计算s(b)的值：
查t分布表，得到t0.95,k-2的值，
若|b|＜t0.95,k-2·s(b)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性，说明血乳酸标准物质是
短期稳定的；否则说明血乳酸标准物质是不稳定的；
(三)、分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值的测定
(f)、用高效液相色谱-同位素稀释质谱测定分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值
首先，任取步骤(b)中的至少5个分装单元中的血乳酸标准物质作为样本，用水或甲醇或乙腈作为溶剂，将上述溶剂中加入99％以上的乳酸纯品标准物质制成与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度溶液即为标准品，在相同体积的样本和标准品中加入相同数量的内标品，其中内标品为含有与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度的13C标记乳酸的溶液，加入内标品的体积与样本或标准品的体积比在1:100～10:1之间，用高效液相色谱-同位素稀释质谱仪的MRM或SIM模式分别检测上述样本和标准品，在样本的色谱图中，用积分法得到血乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，在标准品的色谱图中，用积分法得到乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，(样本的血乳酸峰面积：样本13C标记乳酸的峰面积)/(标准品乳酸峰面积：标准品13C标记乳酸的峰面积)＝(样本的血乳酸含量：样本13C标记乳酸含量)/(标准品的乳酸含量:标准品的13C标记乳酸含量)，即得到样本的血乳酸含量，用高效液相色谱-同位素稀释质谱法重复检测3次，得到的测量结果按照K-S单样本正态性检验，并采用格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验，通过上述统计检验后，取所有结果的算术平均值作为高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定结果的标准值；未通过统计K-S单样本正态性检验、格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验的样本，增加样本数量，重复步骤(f)，直到通过为止；
(g)、用气相色谱-同位素稀释质谱测定分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值
首先，任取步骤(b)中的至少5个分装单元中的血乳酸标准物质作为样本，用水或甲醇或乙腈作为溶剂，将上述溶剂中加入99％以上的乳酸纯品标准物质制成与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度溶液即为标准品，在相同体积的样本和标准品中加入相同数量的内标品，其中内标品为含有与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度的13C标记乳酸的溶液，加入内标品的体积与样本或标准品的体积比在1:100～10:1之间，用气相色谱-同位素稀释质谱仪分别检测上述样本和标准品，在样本的色谱图中，用积分法得到血乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，在标准品的色谱图中，用积分法得到乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，(样本的血乳酸峰面积：样本13C标记乳酸的峰面积)/(标准品乳酸峰面积：标准品13C标记乳酸的峰面积)＝(样本的血乳酸含量：样本13C标记乳酸含量)/(标准品的乳酸含量:标准品的13C标记乳酸含量)，即得到样本的血乳酸含量，用气相色谱-同位素稀释质谱仪重复检测3次，得到的测量结果按照K-S单样本正态性检验，并采用格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验，通过上述统计检验后，取所有结果的算术平均值作为气相色谱-同位素稀释质谱方法测定结果的标准值；未通过统计K-S单样本正态性检验、格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验的样本，增加样本数量，重复步骤(g)，直到通过为止；
(h)、对步骤(f)和步骤(g)得到的血乳酸标准值进行确定
对高效液相色谱-同位素稀释质谱测定得到的至少15个血乳酸含量数据，和气相色谱-同位素稀释质谱测定得到的至少15个血乳酸含量数据进行独立样本t检验,若由公式(13)算出的|t|值小于
其中
通过查GB/T 4086.3-1983《统计分布数值表t分布》得到，则认为t检验结果通过，说明两种方法定值结果之间没有系统性偏倚，取两种方法的算术平均值作为认定值x，当t检验结果未通过时，重复步骤(a)；
在公式(13)中：
s1 2—第一个样本的方差，
s2 2—第二个样本的方差，
n1—第一个样本的容量，即用高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定的数量；
n2—第二个样本的容量，即用气相色谱-同位素稀释质谱方法测定的数量；
血清中血乳酸标准物定值结果的不确定度U来源于定值过程中引入的不确定度uchar、标准物质均匀性引入的不确定度ubb、短期稳定性引入的不确定度usts和长期稳定性引入的不确定度ults，按照公式(14)进行合成
式中，k'为包含因子，通常取k'＝2；
其中uchar包括了来自高效液相色谱-同位素稀释质谱的不确定度uchar,HPLC-IDMS和来自气相色谱-同位素稀释质谱的不确定度uchar，GC-IDMS；
uchar,HPLC-IDMS则包括了来自高效液相色谱-同位素稀释质谱测量结果重复性引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,A(公式15)、以及由多次天平称量引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,wi(公式16)和乳酸纯度标准物质引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,P(公式17)，各个不确定度分量按照公式(17)进行合成，
在公式(15)中，s为标准偏差,即
为某一数据与样本平均值之间的偏差，n为测量次数；
在公式(16)中，MPE为天平检定证书的最大允许误差
在公式(17)中，U为乳酸纯度标准物质证书中的不确定度，k'为包含因子,通常取k'＝2；
在公式(18)中，q为天平称量的次数，ci为第i次称量时的灵敏系数，cp为标准物质纯度的灵敏系数，它依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》进行计算；
气相色谱-同位素稀释质谱测定结果的uchar,GC-IDMS根据公式(19)进行计算：
在公式(19)中，q为天平称量的次数，ci为第i次称量时的灵敏系数，cp为标准物质纯度的灵敏系数,uchar,GC-IDMS,A、uchar,GC-IDMS,wi和uchar,GC-IDMS,P的计算公式与高效液相色谱-同位素稀释质谱中的相同；
根据公式(20)计算uchar：
当组间均方大于等于组内均方时，根据公式(21)计算均匀性引入的不确定度；
当组间均方小于组内均方时，根据公式(22)进行计算均匀性引入的不确定度；
公式(21)和公式(22)中符号含义与步骤(c)中符号含义相同，
标准物质短期稳定性引入的不确定度和长期稳定性引入的不确定度，根据公式(23)和公式(24)进行计算：
usts＝sk,sts·tsts 公式(23)
ults＝sk,lts·tlts 公式(24)
式中，
sk,sts为由公式(12)得到的短期稳定性检验时的s(b),tts为短期稳定性检验的持续时间；
sk,lts为由公式(12)得到的长期稳定性检验时的s(b),tlts为长期稳定性检验的持续时间；
将以上结果按照公式(14)进行合成，得到标准物质认定值的扩展不确定度U，因此血乳酸标准物质的定值结果可以表示为：
x±U
式中，x是认定值，U为认定值的扩展不确定度；
最终得到：步骤(b)制备的分装单元中血乳酸标准物质的均匀性、稳定性和血乳酸标准物质的定值结果。
本发明的一种血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：在所述的步骤(f)中，样本加入上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的甲醇或乙醇或乙腈或丙酮，加入的蛋白沉淀剂与样品的体积比为0.1:1～10:1，加入沉淀剂后充分震荡混合，然后用(500～13000)r/min的转速进行离心分离(1～60)min，离心后取上清液150μL，用0.22μm滤膜过滤后，进入高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器进行分析，标准品加入上述内标品后直接进入高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器进行分析，高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器使用色谱柱为C4或C8或C18色谱柱，所用流动相A为含有(0.1％～1％)甲酸的水或含有(0.1％～1％)三氟乙酸的水或含有(5～100)mmol/L的甲酸铵的甲醇或乙腈溶液或含有(5～100)mmol/L的乙酸铵的甲醇或乙腈溶液，其中甲醇或乙腈溶液含有(5％～50％)的甲醇或乙腈，所用流动相B为含有(0.1％～1％)甲酸的乙腈或甲醇，或含有(0.1％～1％)三氟乙酸的乙腈或甲醇，所用流动相梯度在(5～60)min时间内，经一个或多个线性或非线性变换，流动相A:B的比例由(100:0～50:50)变为(50:50～0:100)，流动相的流速为(100～2000)μL/min，进样量为(1～100)μL，采用MRM模式或SIM模式检测时，分别检测样本中的血乳酸和13C标记乳酸的信号；及标准品中的乳酸和13C标记乳酸的信号。
本发明的一种血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：在所述的步骤(f)中，样本加入上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的甲醇或乙醇或乙腈或丙酮，加入的蛋白沉淀剂与样品的比例为4:1，加入蛋白沉淀剂后充分震荡混合，然后用5000r/min转速进行离心分离10min，离心后取上清液150μL，用0.22μm滤膜过滤后进行高效液相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，用型号为Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm)色谱柱，流动相A为含有0.1％甲酸的水，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈，流动相梯度为：
| Total Time(min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 90.0 | 10.0 |
| 7.00 | 90.0 | 10.0 |
| 12.00 | 10.0 | 90.0 |
| 13.50 | 10.0 | 90.0 |
| 14.00 | 90.0 | 10.0 |
| 20.00 | 90.0 | 10.0 |
所用的流速为300μL/min，所用的进样量为3μL。
本发明的一种血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：在所述的步骤(g)中，样本加入上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的甲醇或乙醇或乙腈或丙酮，加入的蛋白沉淀剂与样品的体积比为0.1:1～10:1，加入沉淀剂后充分震荡混合，然后用(500～13000)r/min的转速进行离心分离(1～60)min，离心后取上清液150μL进行离心浓缩，待全部水分去除后，加入(10～290)μL的氯甲酸乙酯(ECF)或三氟乙酰丙酮(FAA)或五氟丙酸酐(PFPA)或三氟乙酸酐(TFAA)或N－叔丁基二甲基甲硅烷基－N－甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)或N－甲基－N－(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTTFA)衍生化试剂，再加入(100～2000)μL的吡啶溶液，使其总体积为300μL，衍生化温度为(20～100)℃，衍生化时间为(10～100)min，衍生化完成后，用0.22μm滤膜过滤后，进入气相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，标准品加入上述内标品后直接进入气相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，所用色谱柱为弱极性或中等极性或强极性色谱柱，所用的载气为氦气，柱前压力为3kPa，进样口温度为(150～300)℃，进样方式选用分流或不分流的方式，所用的进样量为(1～10)μL，所用的升温程序为线性程序升温或非线性程序升温，在初始温度40℃下保持5min；然后以20℃/min的速度升至120℃，保持10min；再以20℃/min的速度升至250℃，恒温15min，质谱检测采用SIM模式进行检测，分别检测衍生后样本中的血乳酸和13C标记乳酸的信号，及标准品中的乳酸和13C标记乳酸的信号；所用的离子源温度为200℃～300℃，所用的传输线温度为200℃～300℃，所用的电离源为电子轰击电离源或化学电离源。
本发明的一种血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：在所述的步骤(g)中，1体积的样本加入1体积的上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的乙腈，乙腈与样本的体积比为2:1，加入后充分震荡混合，然后以5000r/min的转速离心10min后，取上清液150μL离心浓缩，待全部水分去除后，加入150μL的N－叔丁基二甲基甲硅烷基－N－甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)作为衍生化试剂，再加入150μL的吡啶溶液，衍生化温度为60℃，衍生化时间为30min，衍生化完成后用0.22μm滤膜过滤后，进入气相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，所用色谱柱型号为Agilent DB-17MS(30m×0.250mm，0.25μm)色谱柱，所用的载气为氦气，柱前压力为3kPa，进样口温度为250℃，进样方式为分流进样，其中分流比为1:30，所用的进样量5μL，所用的升温程序为线性程序升温，升温条件为初始温度40℃，保持5min；以20℃/min的速度升至120℃，保持10min；再以20℃/min的速度升至250℃，恒温15min，质谱检测采用SIM模式进行检测，分别检测衍生后样本中的血乳酸和13C标记标记乳酸的信号，及标准品中的乳酸和13C标记乳酸的信号，所用的离子源温度为270℃，所用的传输线温度为270℃，所用的电离源为电子轰击电离源。
本发明的一种血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：在步骤(f)和步骤(g)中，所选用的13C标记乳酸的原子数量不少于3个，同位素丰度不低于99％。
本发明的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：在步骤(a)中，防腐剂为Proclin 300，其浓度为0.1％。
本发明的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：在步骤(b)中，所述安瓿瓶为棕色安瓿瓶，在分装前，将上述安瓿瓶浸泡在(0.1～0.5)mol/L的稀盐酸溶液中(0.5～24)h；然后将装有安瓿瓶和稀盐酸放置在100％功率超声波清洗机中清洗(0.5～60)min后；用自来水充分冲洗安瓿瓶，洗去稀盐酸；再用电阻率18.2MΩ·cm的超纯水充分洗涤安瓿瓶，洗去自来水；将洗涤好的安瓿瓶放置在温度为160℃的烘箱中，烘干24h；烘好的安瓿瓶取出后放置在保干器内，用于血清的分装。
本发明的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其中：在步骤(a)中，通过酶联免疫分析、化学发光免疫分析、和/或实时荧光定量PCR和/或数字PCR方法对健康普通人群或运动员志愿捐献的血清分别进行检测。
本发明针对了目前没有血乳酸标准物质造成血乳酸检测结果不准确、不可比的问题，提供了一种可以血乳酸标准物质的制备与定值方法，从而用于血乳酸检测试剂的开发及方法性能验证，以及用于血乳酸检测结果的量值溯源，保证临床血乳酸检测结果的准确可比，保护大众健康、并有助于运动员的科学训练提高竞技体育成绩。
附图说明
图1是血乳酸标准物质色谱离子流图。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
本发明的血乳酸标准物质的制备和定值方法包括以下步骤：
(一)、血乳酸标准物质的制备和保存
(a)、血乳酸标准物质的制备
对健康普通人群或运动员志愿者捐献的血清分别进行检测，通过酶联免疫分析、化学发光免疫分析、和/或实时荧光定量PCR和/或数字PCR方法对健康普通人群或运动员志愿捐献的血清分别进行检测，当上述血清中的HBV、HCV、HIV及新冠核酸检测均为阴性时，收集上述血清至需要数量，并在上述血清中加入0.1％～0.5％(v/v)Proclin300或叠氮钠作为防腐剂，最好防腐剂为Proclin 300的浓度为0.1％，加入后充分混匀，以保证血清的稳定性，然后采用生化分析仪、便携式乳酸分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或质谱仪对血清中的血乳酸浓度进行初步测定，当上述血清中的血乳酸初步测定浓度不低于要制备的血乳酸标准物质的血乳酸浓度的1％时，即将上述血清进行分装，得到血乳酸标准物质；当上述血清中的血乳酸初步测定浓度低于要制备的血清中血乳酸浓度的1％时，在上述血清中加入99％以上乳酸纯品标准物质，使得上述血清中的血乳酸浓度不低于要制备的血清血乳酸浓度1％，加入乳酸纯品标准物质的体积不得超过上述血清总体积的10％，加入后，上述血清在室温混匀(0.5～24)h，得到血乳酸标准物质；
(b)、血乳酸标准物质的分装和保存
将上述血乳酸标准物质分别装入无色或棕色安瓿瓶或塑料的冻存管中，将上述血乳酸标准物质在振荡条件下分装至安瓿瓶或冻存管中，并封口或密封，根据分装的顺序，对每个分装单元进行连续编号，分装单元数量为P，然后将分装单元置于-20℃以下的冰箱中冷冻保存；例如：血乳酸标准物质直接采用人血清进行分装，共计200个抽取单元，每个单元500μL。分别在冻存管及冻存盒上标记设计浓度、样品编号及分装日期，放置在-70℃冰箱中保存；
若使用安瓿瓶为棕色安瓿瓶时，在分装前，将上述安瓿瓶浸泡在(0.1～0.5)mol/L的稀盐酸溶液中(0.5～24)h；然后将装有安瓿瓶和稀盐酸放置在100％功率超声波清洗机中清洗(0.5～60)min后；用自来水充分冲洗安瓿瓶，洗去稀盐酸；再用电阻率18.2MΩ·cm的超纯水充分洗涤安瓿瓶，洗去自来水；将洗涤好的安瓿瓶放置在温度为160℃的烘箱中，烘干24h；烘好的安瓿瓶取出后放置在保干器内，用于血清的分装。
(二)、血乳酸标准物质均匀性和稳定性的检验
(c)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸均匀性进行检验
用Excel中的randbetween函数对连续编号的分装单元进行随机抽取检验，当P≤200时，抽取分装单元数量m不少于11个；当200<P≤500时，抽取分装单元数量m不少于15个；当500<P≤1000时，抽取分装单元数量m不少于25个；当分装单元P>1000时，抽取分装单元数量m不少于30个，按照抽取的先后次序，对m个抽取分装单元进行依次重新编号和顺序排列，用生化分析仪法、葡萄糖乳酸盐分析仪法或同位素稀释质谱法对上述抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行均匀性检验，在检验时，首先按照上述顺序对每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行第一次检验，然后打乱上述顺序，再重复对上述每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行第二次检验，重复上述操作，直到对每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行第n次检验，n为大于等于3的整数，从而得到n次检验结果，按照下面的公式进行计算并统计出：分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸均匀性；
当抽取了m个样品，按照上述检验方法在重复性n次条件下，得到m组精密度测量数据如下：
编号1：x11,x12……………x1n,平均值
编号2：x21,x22……………x2n,平均值
……………
编号m：xm1,,xm2……………xmn,平均值
平均值
统计量N
N＝m·n 公式(2)
组间差平方和：
组内差平方和：
组间自由度：v1＝m-1；组内自由度：v2＝N-m
统计量F:
其中S1 2为组间方差，S2 2为组内方差，根据自由度(v1，v2)及给定的显著性水平α＝0.05，由表查得Fα的临界值
值，再与公式(7)计算得到的F值与Fα进行比较，若F<Fα则认为组内与组间无明显差异，分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸是均匀的，否则，分装单元中血乳酸标准物质的乳酸是不均匀的；
例如：采用基于酶膜法的YSI 2300D葡萄糖乳酸盐分析仪对标准物质的均匀性进行检验。根据JJF 1343-2012的要求，当总体单元数200<P≤500时，抽取分装单元数量不少于15个。因此利用Excel软件randbetween函数，每个水平标准物质对应随机生成15个随机数，依照随机数每个水平的侯选物分别取出15个抽取单元，采用YSI 2300D葡萄糖乳酸盐分析仪对每个抽取单元的侯选物重复测定3次，每次取样量为25μL。为了消除测定过程中仪器漂移引起的误差，三次按照1→15，15→1，奇偶穿插的顺序对样品进行分析。
血乳酸标准物质均匀性检验数据见表1所示，检验方法的精密度(CV)小于1.5％。
表1血乳酸标准物质均匀性检验数据(mmol/L)
利用Excel软件对血乳酸标准物质进行单因素方差分析，结果如表2所示，表中血乳酸标准物质的F<Fα，因此认为组内与组间无明显差异，样品是均匀的。
表2血乳酸标准物质均匀性数据单因素方差分析结果
(d)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸的长期稳定性进行检验
长期稳定性检验的持续时间不少于6个月，在长期稳定性检验的时间段内，按照前密后疏的原则，选择不少于5个时间点k，在每个时间点上，抽取不少于步骤(b)中的-20℃以下的温度储存的至少2个分装单元中的血乳酸标准物质，用生化分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或同位素稀释质谱方法对每个分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行3次重复检验，然后计算这些测量结果的算术平均值，得到在每个时间点的测量结果的算术平均值Yi，将上述测量结果的算术平均值与对应测量时间按照下面的线性模型进行拟合：
Yi＝b0+bX 公式(8)
在公式(8)中：
b0—截距，b—回归系数(斜率)；X—检验时间，单位(月)；Yi—在每个时间点的血乳酸标准物质中血乳酸含量的测定结果的算术平均值；
根据公式(9)和公式(10)计算出回归系数(斜率)和截距：
在公式(9)中：
Xi—第i个时间点的检测时间，单位为月；
Yi—在第i个时间点上，上述分装单元中血乳酸标准物质的乳酸测定结果的算术平均值；
k—时间点的数量；
根据公式(11)计算s值：
公式(11)中的各个符号的含义与公式(8)、公式(9)和公式(10)中的符号含义相同，
根据公式(12)计算s(b)的值：
查t分布表，得到t0.95,k-2的值；
若|b|＜t0.95,k-2·s(b)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性，说明血乳酸标准物质是长期稳定的；否则说明血乳酸标准物质是不稳定的；
例如：采用基于酶膜法的YSI 2300D葡萄糖乳酸盐分析仪对6个月时间内、温度在-70℃的标准物质稳定性进行考察，每次取出3个标准物质样品进行稳定性考察的平均结果，稳定性考察结果如表3所示。
表3血乳酸标准物质长期稳定性考察平均结果(mmol/L)
利用Excel软件对上述数据进行线性回归分析，计算回归参数，并对斜率β进行t-检验，结果列于表4中。
表4血乳酸标准物质稳定性统计分析
血乳酸标准物质稳定性数据均满足，说明-70℃条件下人血清中葡萄糖标准物质可稳定保存6个月。
(e)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸的短期稳定性进行检验
短期稳定性检验的持续时间不少于7天，在短期稳定性检验的时间段内，按照前密后疏的原则，选择不少于5个时间点k，在每个时间点上，从步骤(b)中取出至少二个分装单元，将它们置于-20℃到40℃的温度范围下进行考察，提取上述分装单元中的血乳酸标准物质，用生化分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或同位素稀释质谱方法对每个分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行3次重复检验，计算这些测量结果的算术平均值，得到每个时间点的测量结果的算术平均值Yi，将上述测量结果的算术平均值与对应测量时间按照下面的线性模型进行拟合：
Yi＝b0+bX 公式(8)
在公式(8)中：
b0—截距，b—回归系数(斜率)；X—检验时间，单位(月)；Yi—在每个时间点的血乳酸标准物质中血乳酸含量的测定结果的算术平均值；
根据公式(9)和公式(10)计算出回归系数(斜率)和截距：
在公式(9)中：
Xi—第i个时间点的检测时间，单位为月；
Yi—在第i个时间点上，上述分装单元中血乳酸标准物质的乳酸测定结果的算术平均值；
k—时间点的数量；
根据公式(11)计算s值：
公式(11)中的各个符号的含义与公式(8)、公式(9)和公式(10)中的符号含义相同。
根据公式(12)计算s(b)的值：
查t分布表，得到t0.95,k-2的值，
若|b|＜t0.95,k-2·s(b)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性，说明血乳酸标准物质是短期稳定的；否则说明血乳酸标准物质是短期不稳定的；
例如：采用基于酶膜法的YSI 2300D葡萄糖乳酸盐分析仪对标准物质的短期稳定性进行了检验，短期稳定性检验温度分别为-20℃、4℃、25℃和40℃；在各个温度下的考察时间均为7天，表5～8列出了不同间隔时间每次取出3个样品进行稳定性考察的平均结果。首次放置样品时取出1个样品保存在-70℃作为参考。
表5在-20℃条件下血乳酸标准物质短期稳定性考察结果(mmol/L)
表6在4℃条件下血乳酸标准物质短期稳定性考察结果(mmol/L)
表7在25℃条件下血乳酸标准物质短期稳定性考察结果(mmol/L)
表8在40℃条件下血乳酸标准物质短期稳定性考察结果(mmol/L)
表9血乳酸标准物质短期稳定性检验结果(mmol/L)
根据表9样品短期稳定性检验结果，血乳酸标准物质在-20℃、4℃、25℃和40℃下均可以稳定保存7天。
(三)、分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值的测定
(f)、用高效液相色谱-同位素稀释质谱测定分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值
首先，任取步骤(b)中的至少5个分装单元中的血乳酸标准物质作为样本，用水或甲醇或乙腈作为溶剂，将上述溶剂中加入99％以上的乳酸纯品标准物质制成与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度溶液即为标准品，在相同体积的样本和标准品中加入相同数量的内标品，其中内标品为含有与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度的13C标记乳酸的溶液，加入内标品的体积与样本或标准品的体积比在1:100～10:1之间，用高效液相色谱-同位素稀释质谱仪的MRM或SIM模式分别检测上述样本和标准品。
样本加入上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的甲醇或乙醇或乙腈或丙酮，加入的蛋白沉淀剂与样品的体积比为4:1，加入沉淀剂后充分震荡混合，然后用5000r/min转速进行离心分离10min，离心后取上清液150μL，用0.22μm滤膜过滤后进行高效液相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，进入高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器进行分析，标准品加入上述内标品后直接进入高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器进行分析，高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器使用色谱柱为C4或C8或C18色谱柱，例如：用型号为Kromasil 100-5 C18(250mm×4.6mm)色谱柱。所用流动相A为含有(0.1％～1％)甲酸的水或含有(0.1％～1％)三氟乙酸的水或含有(5～100)mmol/L的甲酸铵的甲醇或乙腈溶液或含有(5～100)mmol/L的乙酸铵的甲醇或乙腈溶液，其中甲醇或乙腈溶液含有(5％～50％)的甲醇或乙腈，所用流动相B为含有(0.1％～1％)甲酸的乙腈或甲醇，或含有(0.1％～1％)三氟乙酸的乙腈或甲醇。例如：流动相A为含有0.1％甲酸的水，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈。所用流动相梯度在(5～60)min时间内，经一个或多个线性或非线性变换，流动相A:B的比例由(100:0～50:50)变为(50:50～0:100)，流动相的流速为(300)μL/min，进样量为3μL，采用MRM模式或SIM模式检测时，分别检测样本中的血乳酸和13C标记乳酸的信号；及标准品中的乳酸和13C标记乳酸的信号。
在样本的色谱图中，用积分法得到血乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，在标准品的色谱图中，用积分法得到乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，(样本的血乳酸峰面积：样本13C标记乳酸的峰面积)/(标准品乳酸峰面积：标准品13C标记乳酸的峰面积)＝(样本的血乳酸含量：样本13C标记乳酸含量)/(标准品的乳酸含量:标准品的13C标记乳酸含量)，即得到样本的血乳酸含量，即得到样本的血乳酸含量，用高效液相色谱-同位素稀释质谱法重复检测3次，得到的测量结果按照K-S单样本正态性检验，并采用格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验，通过上述统计检验后，取所有结果的算术平均值作为高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定结果的标准值；未通过统计K-S单样本正态性检验、格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验的样本，增加样本数量，重复步骤(f)，直到通过为止；
例如：血乳酸标准物质的高效液相色谱-同位素稀释质谱联用具体如下方法测定标准值；
①标准溶液的配制
为满足所有待测样品测定，故而选择配制0.2mg/g的标准品和内标品溶液，
使用乳酸纯度标准物质，使用重量法配制成大约10mg/g，然后用水稀释至约0.2mg/g的标准品溶液。
使用13C标记乳酸(3个碳原子标记)，使用重量法配制成大约10mg/g，然后用水稀释至约0.2mg/g的内标品溶液。
②标准品溶液与内标品溶液的混合
高标：标准品溶液110μL+内标品溶液100μL
低标：标准品溶液90μL+内标品溶液100μL
③血清样品与内标的混合
血清中乳酸与13C同位素标记乳酸的比例近似为l：1，即：
稀释后的待测样本100μL+内标品溶液100μL，得到混合后样品0.2mL
④去蛋白
混合后样品中加入400μL乙腈，5000rpm离心10min，取上清液150μL，经0.22μm滤膜过滤后上机测定。
采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱对乳酸进行测定。
液相及质谱条件如下：
液相条件：进样量3μL；色谱柱Kromasil 100-5 C18(250mm×4.6mm)；流速为300μL/min，时间为20min。流动相A为0.1％甲酸的水,流动相B为0.1％甲酸的乙腈，梯度如表10所示。
表10流动相的梯度
| Total Time(min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 90.0 | 10.0 |
| 7.00 | 90.0 | 10.0 |
| 12.00 | 10.0 | 90.0 |
| 13.50 | 10.0 | 90.0 |
| 14.00 | 90.0 | 10.0 |
| 20.00 | 90.0 | 10.0 |
质谱条件：采用多反应监测(MRM)模式，离子对质荷比：89->43(乳酸)和92->45(13C3同位素标记乳酸)质谱参数设置如表11所示。
表11质谱参数设置
根据以下公式25计算出样品中乳酸浓度：
式中：msample——样本中13C标记乳酸；
A1——样本中血乳酸与其13C标记乳酸峰面积比；
A2——标准品中乳酸与其13C标记乳酸峰面积比；
m1/m2——标准品中乳酸与同位素标记乳酸的质量比；
mstd——标准品中加入的对应13C标记乳酸的质量；
典型的色谱图如图1所示。
血乳酸标准物质取5个单元，每个单元重复测定3次，测定结果见表12。
表12 ID LC-MS/MS方法定值原始数据(mmol/L)
利用IBM SPSS 26软件对血乳酸标准物质的测定数据进行正态性检验，所有测定结果均符合正态分布假设，分析结果见表13。
表13 ID LC-MS/MS方法定值数据Kolmogorov-Smirnov检验
分别用Dixon和Grubbs异常值检验方法对表12中的原始数据进行异常值检验，均未发现异常值，结果如表14所示。
表14 ID LC-MS/MS方法定值数据异常值检验
因此，取测定结果的平均值作为高效液相色谱-同位素稀释质谱联用方法的定值结果。即2.28mmol/L。
(g)、用气相色谱-同位素稀释质谱测定分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值
首先，任取步骤(b)中的至少5个分装单元中的血乳酸标准物质作为样本，用水或甲醇或乙腈作为溶剂，将上述溶剂中加入99％以上的乳酸纯品标准物质制成与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度溶液即为标准品，在相同体积的样本和标准品中加入相同数量的内标品，其中内标品为含有与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度的13C标记乳酸的溶液，加入内标品的体积与样本或标准品的体积比在1:100～10:1之间，用气相色谱-同位素稀释质谱仪分别检测上述样本和标准品。
1体积的样本加入1体积的上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的乙腈，乙腈与样本的体积比为2:1，加入后充分震荡混合，然后以5000r/min的转速离心10min后，取上清液150μL离心浓缩，待全部水分去除后，加入150μL的N－叔丁基二甲基甲硅烷基－N－甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)作为衍生化试剂，再加入150μL的吡啶溶液，衍生化温度为60℃，衍生化时间为30min，衍生化完成后用0.22μm滤膜过滤后，进入气相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，标准品加入上述内标品后直接进入气相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，所用色谱柱型号为Agilent DB-17MS(30m×0.250mm，0.25μm)色谱柱，所用的载气为氦气，柱前压力为3kPa，进样口温度为250℃，进样方式为分流进样，其中分流比为1:30，所用的进样量5μL，所用的升温程序为线性程序升温，升温条件为初始温度40℃，保持5min；以20℃/min的速度升至120℃，保持10min；再以20℃/min的速度升至250℃，恒温15min，质谱检测采用SIM模式进行检测，分别检测衍生后样本中的血乳酸和13C标记标记乳酸的信号，及标准品中的乳酸和13C标记乳酸的信号，所用的离子源温度为270℃，所用的传输线温度为270℃，所用的电离源为电子轰击电离源。
在样本的色谱图中，用积分法得到血乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，在标准品的色谱图中，用积分法得到乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，(样本的血乳酸峰面积：样本13C标记乳酸的峰面积)/(标准品乳酸峰面积：标准品13C标记乳酸的峰面积)＝(样本的血乳酸含量：样本13C标记乳酸含量)/(标准品的乳酸含量:标准品的13C标记乳酸含量)，即得到样本的血乳酸含量，用气相色谱-同位素稀释质谱仪重复检测3次，得到的测量结果按照K-S单样本正态性检验，并采用格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验，通过上述统计检验后，取所有结果的算术平均值作为气相色谱-同位素稀释质谱方法测定结果的标准值；未通过统计K-S单样本正态性检验、格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验的样本，增加样本数量，重复步骤(g)，直到通过为止。
例如：血乳酸标准物质的气相色谱-同位素稀释质谱联用具体如下方法测定标准值：
①标准溶液的配制
为满足所有待测样品测定，故而选择配制0.1mg/g的标准溶液；
使用乳酸纯度标准物质，使用重量法配制成大约10mg/g，然后用水稀释至约0.1mg/g的标准品溶液；
使用标记乳酸，使用重量法配制成大约10mg/g，然后用水稀释至约0.1mg/g的内标品溶液；
②标准品溶液与内标品溶液的混合
高标：标准品溶液110μL+内标品溶液100μL；
低标：标准品溶液90μL+内标品溶液100μL；
平标：标准品溶液100μL+内标品溶液100μL；
③血清样本与内标品溶液的混合
血清中乳酸与标记乳酸的比例近似为l:1，即：稀释后的待测样本100μL+内标品溶液100μL，得到混合后样品0.2mL
④去蛋白
混合后样品中加入200μL乙腈，5000rpm离心10min，取上清液150μL离心浓缩
⑤衍生化
将高标、低标、平标溶液及上述样品中加入150μL衍生化试剂(衍生化试剂为N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺)，再加入对应体积的吡啶溶液使其总体积为300μL。60℃反应30min后上机测定。
采用气相色谱-串联质谱系统(GC-MS)[GC部分为7890A(美国Agilent公司)，MS部分为5975C(美国Agilent公司)]对乳酸进行测定。
气相色谱条件为：进样口温度：250℃；进样方式：分流进样，分流比为1:30；进样量：5μL；柱温程序：初始温度40℃，保持5min；20℃/min升至120℃，保持10min；20℃/min升至250℃，恒温15min；载气：He气；柱前压：3kPa。
质谱条件为：离子源温度：270℃；传输线温度:270℃；电离方式:70eV EI；发射电流:0.2mA；采集方式：SIM选择离子监测；扫描时间为：200ms，双通道m/z＝261和264。
血清中标准物质取5个单元，每个单元重复测定3次，测定结果见表15。
表15 ID GC-MS方法定值原始数据(mmol/L)
利用IBM SPSS 26软件对血乳酸标准物质的测定数据进行正态性检验，所有测定结果均符合正态分布假设，分析结果见表16。
表16 ID GC-MS方法定值数据Kolmogorov-Smirnov检验
分别用Dixon和Grubbs异常值检验方法对表15中每个水平的原始数据进行异常值检验，均未发现异常值，结果如表17所示。
表17 ID GC-MS方法定值数据异常值检验
因此，取测定结果的平均值作为气相色谱-同位素稀释质谱联用方法的定值结果，即2.30mmol/L。
(h)、对步骤(f)和步骤(g)得到的血乳酸标准值进行确定
对高效液相色谱-同位素稀释质谱测定得到的至少15个血乳酸含量数据，和气相色谱-同位素稀释质谱测定得到的至少15个血乳酸含量数据进行独立样本t检验,若由公式(13)算出的|t|值小于
即
通过查GB/T 4086.3-1983《统计分布数值表t分布》得到，则认为t检验结果通过，说明两种方法定值结果之间没有系统性偏倚，取两种方法的算术平均值作为认定值x，当t检验结果未通过时，重复步骤(a)；
在公式(13)中：
s1 2—第一个样本的方差，
s2 2—第二个样本的方差，
n1—第一个样本的容量，即用高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定的数量；
n2—第二个样本的容量，即用气相色谱-同位素稀释质谱方法测定的数量；
血清中血乳酸标准物定值结果的不确定度U来源于定值过程中引入的不确定度uchar、标准物质均匀性引入的不确定度ubb、短期稳定性引入的不确定度usts(本实例在低温下运输，评定时可以忽略该分量)和长期稳定性引入的不确定度ults，按照公式(14)进行合成
式中，k'为包含因子，通常取k'＝2；
其中uchar包括了来自高效液相色谱-同位素稀释质谱的不确定度uchar,HPLC-IDMS和来自气相色谱-同位素稀释质谱的不确定度uchar，GC-IDMS；
uchar,HPLC-IDMS则包括了来自高效液相色谱-同位素稀释质谱测量结果重复性引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,A(公式15)、以及由多次天平称量引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,wi(公式16)和乳酸纯度标准物质引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,P(公式17)，各个不确定度分量按照公式(17)进行合成，
在公式(15)中，s为标准偏差,即
为某一数据与样本平均值之间的偏差，n为测量次数；
在公式(16)中，MPE为天平检定证书的最大允许误差
在公式(17)中，U为乳酸纯度标准物质证书中的不确定度，k'为包含因子,通常取k'＝2；
在公式(18)中，q为天平称量的次数，ci为第i次称量时的灵敏系数，cp为标准物质纯度的灵敏系数，它依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》进行计算；
气相色谱-同位素稀释质谱测定结果的uchar,GC-IDMS根据公式(19)进行计算：
在公式(19)中，q为天平称量的次数，ci为第i次称量时的灵敏系数，cp为标准物质纯度的灵敏系数,uchar,GC-IDMS,A、uchar,GC-IDMS,wi和uchar,GC-IDMS,P的计算公式与高效液相色谱-同位素稀释质谱中的相同；
根据公式(20)计算uchar：
当组间均方大于等于组内均方时，根据公式(21)计算均匀性引入的不确定度；
当组间均方小于组内均方时，根据公式(22)进行计算均匀性引入的不确定度；
公式(21)和公式(22)中符号含义与步骤(c)中符号含义相同，
标准物质短期稳定性引入的不确定度和长期稳定性引入的不确定度，根据公式(23)和公式(24)进行计算：
usts＝sk,sts·tsts 公式(23)
ults＝sk,lts·tlts 公式(24)
在公式(23)和公式(24)中，
sk,sts为由公式(12)得到的短期稳定性检验时的s(b),tts为短期稳定性检验的持续时间；
sk,lts为由公式(12)得到的长期稳定性检验时的s(b),tlts为长期稳定性检验的持续时间；
将以上结果按照公式(14)进行合成，得到标准物质认定值的扩展不确定度U，因此血乳酸标准物质的定值结果可以表示为：
x±U
式中，x是认定值，U为认定值的扩展不确定度；
最终得到：步骤(b)制备的分装单元中血乳酸标准物质的均匀性、稳定性和血乳酸标准物质的定值结果。
例如：利用IBM SPSS 26软件对两种方法测定数据进行独立样本t-检验。经分析，对于血乳酸标准物质，两种定值方法之间的显著性大于0.05，即两种方法间的定值结果在统计学上没有显著性差异。上述方差齐性检验及独立样本t-检验结果详见表18。
表18两种定值方法方差齐性检验及独立样本t-检验结果
根据JJF1006-1994《一级标准物质技术规范》，对于等精度、平均值一致的定值数据，可将全部数据视为一组新的测量数据，计算全部原始数据的总评均值和标准偏差。因此将ID LC-MS/MS、ID GC-MS两种方法的测定数据合并，利用IBM SPSS 26软件对血乳酸标准物质的合并测定数据进行正态性检验，分析结果见表19。分别用Dixon和Grubbs异常值检验方法对每个水平的原始数据进行异常值检验，如表20所示，均未发现异常值。最终计算平均值作为血乳酸标准物质的定值结果。即：
表19两种定值方法合并数据正态性检验
虽然正态检验未通过，但是两种方法的测定数据合并后CV值为1.32％，可见精密度良好，因此两种方法合并后的数据参与到后面的定值过程中。
表20两种定值方法合并数据定值数据异常值检验
血清中乳酸标准物定值结果的不确定度来源于定值过程中引入的不确定度、标准物质均匀性引入的不确定度、短期稳定性和长期稳定性引入的不确定度。
(1)、定值结果的不确定度评定
①高效液相色谱-同位素稀释质谱法的不确定度uchar,HPLC-IDMS
由测量重复性引入的不确定度根据公式(15)进行计算：
在公式(15)中，s为标准偏差,即
为某一数据与样本平均值之间的偏差，n为测量次数；
在公式(16)中，MPE为天平检定证书的最大允许误差
在公式(17)中，U为乳酸纯度标准物质证书中的不确定度，k'为包含因子,通常取k'＝2；
在公式(18)中，q为天平称量的次数，ci为第i次称量时的灵敏系数，cp为标准物质纯度的灵敏系数，它依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》进行计算。计算结果如表21所示
表21高效液相色谱-同位素稀释质谱法的不确定度uchar,HPLC-IDMS
②气相色谱-同位素稀释质谱法的不确定度uchar,GC-IDMS
由测量重复性引入的不确定度根据公式(19)进行计算：
在公式(19)中，s为标准偏差,即
为某一数据与样本平均值之间的偏差，n为测量次数；
在公式(20)中，MPE为天平检定证书的最大允许误差
在公式(21)中，U为乳酸纯度标准物质证书中的不确定度，k'为包含因子,通常取k'＝2；
气相色谱-同位素稀释质谱测定结果的uchar,GC-IDMS根据公式(22)进行计算：
在公式(22)中，q为天平称量的次数，ci为第i次称量时的灵敏系数，cp为标准物质纯度的灵敏系数,uchar,GC-IDMS,A、uchar,GC-IDMS,wi和uchar,GC-IDMS,P的计算公式实际与高效液相色谱-同位素稀释质谱中的相同。计算结果如表22所示。
表22高效液相色谱-同位素稀释质谱法的不确定度uchar,HPLC-IDMS
根据公式(23)计算uchar：
(2)、均匀性与稳定性的不确定度评定
①样品均匀性引入的不确定度
根据JJF1343-2012，标准物质均匀性引入的不确定度等于瓶间均匀性的标准偏差。当组间均方大于组内均方根据公式(24)进行计算。
当组间均方小于组内均方根据公式(25)进行计算。
②样品稳定性引入的不确定度
标准物质长期稳定性引入根据公式(26)进行计算：
ults＝sk,lts·t 公式(26)
计算结果如表23所示。
表23均匀性和稳定性引入的不确定度
| 不确定度来源 | 不确定度大小 |
| 均匀性引入的不确定度/(mmol/L) | 0.00723348 |
| 长期稳定性引入的不确定度/(mmol/L) | 0.007873527 |
(3)、不确定度评定结果
将上述不确定度分量按照公式(27)进行合成，
最终计算结果如表24所示：
表24血清中乳酸标准物质不确定度评定结果
| 不确定度来源 | 不确定度大小 |
| 定值过程引入的标准不确定度/(mmol/L) | 0.022 |
| 均匀性引入的不确定度/(mmol/L) | 0.00723348 |
| 长期稳定性引入的不确定度/(mmol/L) | 0.007873527 |
| 合成标准不确定度/(mmol/L) | 0.024 |
| 扩展不确定度U/(mmol/L) | 0.05 |
| 定值结果/(mmol/L) | 2.29 |
因此，血清中乳酸标准物质的定值结果可以表示为：(2.29±0.05)mmol/L。
在步骤(f)和步骤(g)中，所选用的乳酸同位素标记物13C的原子数量不少于3个，同位素丰度不低于99％。
以上所述实施例仅仅是对本发明专利优选实施方式进行描述，并非对本发明专利范围进行限定，在不脱离本发明专利设计精神前提下，本领域普通技术人员对本发明专利技术方案做出各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定保护范围内。
Claims (9)
1.一种血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：包括步骤：
(一)、血乳酸标准物质的制备和保存
(a)、血乳酸标准物质的制备
对健康普通人群或运动员志愿者捐献的血清分别进行检测，当上述血清中的HBV、HCV、HIV及新冠核酸检测均为阴性时，收集上述血清至需要数量，并在上述血清中加入0.1％～0.5％(v/v)Proclin300或叠氮钠作为防腐剂，加入后充分混匀，以保证血清的稳定性，然后采用生化分析仪、便携式乳酸分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或质谱仪对血清中的血乳酸浓度进行初步测定，当上述血清中的血乳酸初步测定浓度不低于要制备的血乳酸标准物质的血乳酸浓度的1％时，即将上述血清进行分装，得到血乳酸标准物质；当上述血清中的血乳酸初步测定浓度低于要制备的血清中血乳酸浓度的1％时，在上述血清中加入99％以上乳酸纯品标准物质，使得上述血清中的血乳酸浓度不低于要制备的血清血乳酸浓度1％，加入乳酸纯品标准物质的体积不得超过上述血清总体积的10％，加入后，上述血清在室温混匀(0.5～24)h，得到血乳酸标准物质；
(b)、血乳酸标准物质的分装和保存
将上述血乳酸标准物质分别装入无色或棕色安瓿瓶或塑料的冻存管中，将上述血乳酸标准物质在振荡条件下分装至上述安瓿瓶或冻存管中，并封口或密封，根据分装的顺序，对每个分装单元进行连续编号，分装单元数量为P，然后将分装单元置于-20℃以下的冰箱中冷冻保存；
(二)、血乳酸标准物质均匀性和稳定性的检验
(c)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸均匀性进行检验
用Excel中的randbetween函数对连续编号的分装单元进行随机抽取检验，当P≤200时，抽取分装单元数量m不少于11个；当200<P≤500时，抽取分装单元数量m不少于15个；当500<P≤1000时，抽取分装单元数量m不少于25个；当分装单元P>1000时，抽取分装单元数量m不少于30个，按照抽取的先后次序，对m个抽取分装单元进行依次重新编号和顺序排列，用生化分析仪法、葡萄糖乳酸盐分析仪法或同位素稀释质谱法对上述抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸含量进行均匀性检验，在检验时，首先按照上述顺序对每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行第一次检验，然后打乱上述顺序，再重复对上述每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸含量进行第二次检验，重复上述操作，直到对每个抽取分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行第n次检验，n为大于等于3的整数，从而得到n次检验结果，按照下面的公式进行计算并统计出：分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸均匀性；
当抽取了m个样品，按照上述检验方法在重复性n次条件下，得到m组精密度测量数据如下：
编号1：x11,x12……………x1n,平均值
编号2：x21,x22……………x2n,平均值
……………
编号m：xm1,,xm2……………xmn,平均值
平均值
统计量N
N＝m·n 公式(2)
组间差平方和：
组内差平方和：
组间自由度：v1＝m-1；组内自由度：v2＝N-m
统计量F:
其中S1 2为组间方差，S2 2为组内方差，根据自由度(v1，v2)及给定的显著性水平α＝0.05，由表查得Fα的临界值
值，再与公式(7)计算得到的F值与Fα进行比较，若F<Fα则认为组内与组间无明显差异，分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸是均匀的，否则，分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸是不均匀的；
(d)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸的长期稳定性进行检验
长期稳定性检验的持续时间不少于6个月，在长期稳定性检验的时间段内，按照前密后疏的原则，选择不少于5个时间点k，在每个时间点上，抽取不少于步骤(b)中的-20℃以下的温度储存的至少2个分装单元中的血乳酸标准物质，用生化分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或同位素稀释质谱方法对每个分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸含量进行3次重复检验，然后计算这些测量结果的算术平均值，得到在每个时间点的测量结果的算术平均值Yi，将上述测量结果的算术平均值Yi与对应测量时间按照下面的线性模型进行拟合：
Yi＝b0+bX 公式(8)
在公式(8)中：
b0—截距，b—回归系数(斜率)；X—检验时间，单位(月)；Yi—在每个时间点的血乳酸标准物质中血乳酸含量的测定结果的算术平均值；
根据公式(9)和公式(10)计算出回归系数(斜率)和截距：
在公式(9)中：
Xi—第i个时间点的检测时间，单位为月；
Yi—在第i个时间点上，上述分装单元中血乳酸标准物质的乳酸测定结果的算术平均值；
k—时间点的数量；
根据公式(11)计算s值：
公式(11)中的各个符号的含义与公式(8)、公式(9)和公式(10)中的符号含义相同，
根据公式(12)计算s(b)的值：
查t分布表，得到t0.95,k-2的值；
若|b|＜t0.95,k-2·s(b)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性，说明血乳酸标准物质是长期稳定的；否则说明血乳酸标准物质是不稳定的；
(e)、对分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸的短期稳定性进行检验
短期稳定性检验的持续时间不少于7天，在短期稳定性检验的时间段内，按照前密后疏的原则，选择不少于5个时间点k，在每个时间点上，从步骤(b)中取出至少二个分装单元，将它们置于-20℃到40℃的温度范围下进行考察，提取上述分装单元中的血乳酸标准物质，用生化分析仪、葡萄糖乳酸盐分析仪或同位素稀释质谱方法对每个分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸进行3次重复检验，计算这些测量结果的算术平均值，得到每个时间点的测量结果的算术平均值Yi，将上述测量结果的算术平均值与对应测量时间按照下面的线性模型进行拟合：
Yi＝b0+bX 公式(8)
在公式(8)中：
b0—截距，b—回归系数(斜率)；X—检验时间，单位(月)；Yi—在每个时间点的血乳酸标准物质中血乳酸含量的测定结果的算术平均值；
根据公式(9)和公式(10)计算出回归系数(斜率)和截距：
在公式(9)中：
Xi—第i个时间点的检测时间，单位为月；
Yi—在第i个时间点上，上述分装单元中血乳酸标准物质的乳酸测定结果的算术平均值；
k—时间点的数量；
根据公式(11)计算s值：
公式(11)中的各个符号的含义与公式(8)、公式(9)和公式(10)中的符号含义相同。
根据公式(12)计算s(b)的值：
查t分布表，得到t0.95,k-2的值，
若|b|＜t0.95,k-2·s(b)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性，说明血乳酸标准物质是短期稳定的；否则说明血乳酸标准物质是不稳定的；
(三)、分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值的测定
(f)、用高效液相色谱-同位素稀释质谱测定分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值
首先，任取步骤(b)中的至少5个分装单元中的血乳酸标准物质作为样本，用水或甲醇或乙腈作为溶剂，将上述溶剂中加入99％以上的乳酸纯品标准物质制成与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度溶液即为标准品，在相同体积的样本和标准品中加入相同数量的内标品，其中内标品为含有与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度的13C标记乳酸的溶液，加入内标品的体积与样本或标准品的体积比在1:100～10:1之间，用高效液相色谱-同位素稀释质谱仪的MRM或SIM模式分别检测上述样本和标准品，在样本的色谱图中，用积分法得到血乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，在标准品的色谱图中，用积分法得到乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，(样本的血乳酸峰面积：样本13C标记乳酸的峰面积)/(标准品乳酸峰面积：标准品13C标记乳酸的峰面积)＝(样本的血乳酸含量：样本13C标记乳酸含量)/(标准品的乳酸含量:标准品的13C标记乳酸含量)，即得到样本的血乳酸含量，用高效液相色谱-同位素稀释质谱法重复检测3次，得到的测量结果按照K-S单样本正态性检验，并采用格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验，通过上述统计检验后，取所有结果的算术平均值作为高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定结果的标准值；未通过统计K-S单样本正态性检验、格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验的样本，增加样本数量，重复步骤(f)，直到通过为止；
(g)、用气相色谱-同位素稀释质谱测定分装单元中血乳酸标准物质的血乳酸标准值
首先，任取步骤(b)中的至少5个分装单元中的血乳酸标准物质作为样本，用水或甲醇或乙腈作为溶剂，将上述溶剂中加入99％以上的乳酸纯品标准物质制成与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度溶液即为标准品，在相同体积的样本和标准品中加入相同数量的内标品，其中内标品为含有与样本中初步测定血乳酸含量相同浓度的13C标记乳酸的溶液，加入内标品的体积与样本或标准品的体积比在1:100～10:1之间，用气相色谱-同位素稀释质谱仪分别检测上述样本和标准品，在样本的色谱图中，用积分法得到血乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，在标准品的色谱图中，用积分法得到乳酸峰面积和13C标记乳酸的峰面积，(样本的血乳酸峰面积：样本13C标记乳酸的峰面积)/(标准品乳酸峰面积：标准品13C标记乳酸的峰面积)＝(样本的血乳酸含量：样本的13C标记乳酸含量)/(标准品的乳酸含量:标准品的13C标记乳酸含量)，即得到样本的血乳酸含量，用气相色谱-同位素稀释质谱仪重复检测3次，得到的测量结果按照K-S单样本正态性检验，并采用格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验，通过上述统计检验后，取所有结果的算术平均值作为气相色谱-同位素稀释质谱方法测定结果的标准值；未通过统计K-S单样本正态性检验、格拉布斯法和/或Dixon法进行异常值检验的样本，增加样本数量，重复步骤(g)，直到通过为止；
(h)、对步骤(f)和步骤(g)得到的血乳酸标准值进行确定
对高效液相色谱-同位素稀释质谱测定得到的至少15个血乳酸含量数据，和气相色谱-同位素稀释质谱测定得到的至少15个血乳酸含量数据进行独立样本t检验,若由公式(13)算出的|t|值小于
其中
通过查GB/T 4086.3-1983《统计分布数值表t分布》得到，则认为t检验结果通过，说明两种方法定值结果之间没有系统性偏倚，取两种方法的算术平均值作为认定值x，当t检验结果未通过时，重复步骤(a)；
在公式(13)中：
s1 2—第一个样本的方差，
s2 2—第二个样本的方差，
n1—第一个样本的容量，即用高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定的数量；
n2—第二个样本的容量，即用气相色谱-同位素稀释质谱方法测定的数量；
血清中血乳酸标准物定值结果的不确定度U来源于定值过程中引入的不确定度uchar、标准物质均匀性引入的不确定度ubb、短期稳定性引入的不确定度usts和长期稳定性引入的不确定度ults，按照公式(14)进行合成
式中，k'为包含因子，通常取k'＝2；
其中uchar包括了来自高效液相色谱-同位素稀释质谱的不确定度uchar,HPLC-IDMS和来自气相色谱-同位素稀释质谱的不确定度uchar，GC-IDMS；
uchar,HPLC-IDMS则包括了来自高效液相色谱-同位素稀释质谱测量结果重复性引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,A(公式15)、以及由多次天平称量引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,wi(公式16)和乳酸纯度标准物质引入的不确定度分量uchar,HPLC-IDMS,P(公式17)，各个不确定度分量按照公式(17)进行合成，
在公式(15)中，s为标准偏差,即
为某一数据与样本平均值之间的偏差，n为测量次数；
在公式(16)中，MPE为天平检定证书的最大允许误差
在公式(17)中，U为乳酸纯度标准物质证书中的不确定度，k'为包含因子,通常取k'＝2；
在公式(18)中，q为天平称量的次数，ci为第i次称量时的灵敏系数，cp为标准物质纯度的灵敏系数，它依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》进行计算；
气相色谱-同位素稀释质谱测定结果的uchar,GC-IDMS根据公式(19)进行计算：
在公式(19)中，q为天平称量的次数，ci为第i次称量时的灵敏系数，cp为标准物质纯度的灵敏系数,uchar,GC-IDMS,A、uchar,GC-IDMS,wi和uchar,GC-IDMS,P的计算公式与高效液相色谱-同位素稀释质谱中的相同；
根据公式(20)计算uchar：
当组间均方大于等于组内均方时，根据公式(21)计算均匀性引入的不确定度；
当组间均方小于组内均方时，根据公式(22)进行计算均匀性引入的不确定度；
公式(21)和公式(22)中符号含义与步骤(c)中符号含义相同，
标准物质短期稳定性引入的不确定度和长期稳定性引入的不确定度，根据公式(23)和公式(24)进行计算：
usts＝sk,sts·tsts 公式(23)
ults＝sk,lts·tlts 公式(24)
式中，
sk,sts为由公式(12)得到的短期稳定性检验时的s(b),tts为短期稳定性检验的持续时间；
sk,lts为由公式(12)得到的长期稳定性检验时的s(b),tlts为长期稳定性检验的持续时间；
将以上结果按照公式(14)进行合成，得到标准物质认定值的扩展不确定度U，因此血乳酸标准物质的定值结果可以表示为：
x±U
式中，x是认定值，U为认定值的扩展不确定度；
最终得到：制备的分装单元中血乳酸标准物质的均匀性、稳定性和血乳酸标准物质的定值结果。
2.如权利要求1所述的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：在所述的步骤(f)中，样本加入上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的甲醇或乙醇或乙腈或丙酮，加入的蛋白沉淀剂与样品的体积比为0.1:1～10:1，加入沉淀剂后充分震荡混合，然后用(500～13000)r/min的转速进行离心分离(1～60)min，离心后取上清液150μL，用0.22μm滤膜过滤后，进入高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器进行分析，标准品加入上述内标品后直接进入高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器进行分析，高效液相色谱-同位素稀释质谱仪器使用色谱柱为C4或C8或C18色谱柱，所用流动相A为含有(0.1％～1％)甲酸的水或含有(0.1％～1％)三氟乙酸的水或含有(5～100)mmol/L的甲酸铵的甲醇或乙腈溶液或含有(5～100)mmol/L的乙酸铵的甲醇或乙腈溶液，其中甲醇或乙腈溶液含有(5％～50％)的甲醇或乙腈，所用流动相B为含有(0.1％～1％)甲酸的乙腈或甲醇，或含有(0.1％～1％)三氟乙酸的乙腈或甲醇，所用流动相梯度在(5～60)min时间内，经一个或多个线性或非线性变换，流动相A:B的比例由(100:0～50:50)变为(50:50～0:100)，流动相的流速为(100～2000)μL/min，进样量为(1～100)μL，采用MRM模式或SIM模式检测时，分别检测样本中的血乳酸和13C标记乳酸的信号；及标准品中的乳酸和13C标记乳酸的信号。
3.如权利要求2所述的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：在所述的步骤(f)中，样本加入上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的甲醇或乙醇或乙腈或丙酮，加入的蛋白沉淀剂与样品的比例为4:1，加入蛋白沉淀剂后充分震荡混合，然后用5000r/min转速进行离心分离10min，离心后取上清液150μL，用0.22μm滤膜过滤后进行高效液相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，用型号为Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm)色谱柱，流动相A为含有0.1％甲酸的水，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈，流动相梯度为：
所用的流速为300μL/min，所用的进样量为3μL。
4.如权利要求1所述的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：在所述的步骤(g)中，样本加入上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的甲醇或乙醇或乙腈或丙酮，加入的蛋白沉淀剂与样品的体积比为0.1:1～10:1，加入沉淀剂后充分震荡混合，然后用(500～13000)r/min的转速进行离心分离(1～60)min，离心后取上清液150μL进行离心浓缩，待全部水分去除后，加入(10～290)μL的氯甲酸乙酯(ECF)或三氟乙酰丙酮(FAA)或五氟丙酸酐(PFPA)或三氟乙酸酐(TFAA)或N－叔丁基二甲基甲硅烷基－N－甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)或N－甲基－N－(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTTFA)衍生化试剂，再加入(100～2000)μL的吡啶溶液，使其总体积为300μL，衍生化温度为(20～100)℃，衍生化时间为(10～100)min，衍生化完成后，用0.22μm滤膜过滤后，进入气相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，标准品加入上述内标品后直接进入气相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，所用色谱柱为弱极性或中等极性或强极性色谱柱，所用的载气为氦气，柱前压力为3kPa，进样口温度为(150～300)℃，进样方式选用分流或不分流的方式，所用的进样量为(1～10)μL，所用的升温程序为线性程序升温或非线性程序升温，在初始温度40℃下保持5min；然后以20℃/min的速度升至120℃，保持10min；再以20℃/min的速度升至250℃，恒温15min，质谱检测采用SIM模式进行检测，分别检测衍生后样本中的血乳酸和13C标记乳酸的信号，及标准品中的乳酸和13C标记乳酸的信号；所用的离子源温度为200℃～300℃，所用的传输线温度为200℃～300℃，所用的电离源为电子轰击电离源或化学电离源。
5.如权利要求4所述的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：
在所述的步骤(g)中，1体积的样本加入1体积的上述内标品后，再加入作为蛋白沉淀剂的乙腈，乙腈与样本的体积比为2:1，加入后充分震荡混合，然后以5000r/min的转速离心10min后，取上清液150μL离心浓缩，待全部水分去除后，加入150μL的N－叔丁基二甲基甲硅烷基－N－甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)作为衍生化试剂，再加入150μL的吡啶溶液，衍生化温度为60℃，衍生化时间为30min，衍生化完成后用0.22μm滤膜过滤后，进入气相色谱-同位素稀释质谱仪进行分析，所用色谱柱型号为Agilent DB-17MS(30m×0.250mm，0.25μm)色谱柱，所用的载气为氦气，柱前压力为3kPa，进样口温度为250℃，进样方式为分流进样，其中分流比为1:30，所用的进样量5μL，所用的升温程序为线性程序升温，升温条件为初始温度40℃，保持5min；以20℃/min的速度升至120℃，保持10min；再以20℃/min的速度升至250℃，恒温15min，质谱检测采用SIM模式进行检测，分别检测衍生后样本中的血乳酸和13C标记标记乳酸的信号，及标准品中的乳酸和13C标记乳酸的信号，所用的离子源温度为270℃，所用的传输线温度为270℃，所用的电离源为电子轰击电离源。
6.如权利要求1所述的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：在步骤(f)和步骤(g)中，所选用的13C标记乳酸的原子数量不少于3个，同位素丰度不低于99％。
7.如权利要求1所述的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：在步骤(a)中，防腐剂为Proclin 300，其浓度为0.1％。
8.如权利要求1所述的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：在步骤(b中，所述安瓿瓶为棕色安瓿瓶，在分装前，将上述安瓿瓶浸泡在(0.1～0.5)mol/L的稀盐酸溶液中(0.5～24)h；然后将装有安瓿瓶和稀盐酸放置在100％功率超声波清洗机中清洗(0.5～60)min后；用自来水充分冲洗安瓿瓶，洗去稀盐酸；再用电阻率18.2MΩ·cm的超纯水充分洗涤安瓿瓶，洗去自来水；将洗涤好的安瓿瓶放置在温度为160℃的烘箱中，烘干24h；烘好的安瓿瓶取出后放置在保干器内，用于血清的分装。
9.如权利要求1所述的血乳酸标准物质的制备和定值方法，其特征在于：在步骤(a)中，通过酶联免疫分析、化学发光免疫分析、和/或实时荧光定量PCR和/或数字PCR方法对健康普通人群或运动员志愿捐献的血清分别进行检测。
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