CN1511164A - 细胞呈递的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及把蛋白质加到细胞中后测定呈递在哺乳动物细胞表面的肽的方法。本发明也涉及基于此肽的测定的诊断试验或由这些肽的测定导致的修饰分子，这些修饰分子例如药物实体优选具有特定的生物学活性并且与相应的未加修饰的分子相比具有降低的或增加的免疫原性。根据本发明的方法优选以利用质谱分析(MS)的工具来建立。

Description

细胞呈递的肽
本发明涉及把蛋白质加到细胞中后测定呈递在哺乳动物细胞表面的肽的方法。本发明也涉及基于此肽的测定的诊断试验或由这些肽的测定导致的修饰分子，这些修饰分子例如药物实体优选具有特定的生物学活性并且与相应的未加修饰的分子相比具有降低的或增加的免疫原性。根据本发明的方法优选以利用质谱分析(MS)的工具来建立。
哺乳动物细胞摄取蛋白质(或细胞内产生特异蛋白质)之后，蛋白质将随后被降解，而且通常这些蛋白质的肽段(常与其它蛋白结合在一起)会出现在细胞表面。具体地，可以降解蛋白肽段，随后某些肽与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，在许多情况下，它们能被T细胞识别以启动免疫应答。这样的免疫应答可以是有益的，例如当免疫系统对导出该肽段的特异蛋白的产生细胞实施消除时；也可以是有害的，例如当免疫系统产生与特异蛋白(例如药物蛋白质)结合并限制其活性的抗体时。
迄今为止，对于一个给定的蛋白，还不可能准确地预测出降解将发生在蛋白质的哪个位置，以致也不能可靠地预测出展示在细胞表面的确切肽段。对于MHC分子，在预测与MHC结合的肽基序方面已取得了一些成功，但实际上，其中一些肽在接触MHC分子之前就被降解并且目前尚不能可靠地预测哪些肽会被降解。因此，检测细胞表面肽的标准方法是把这些肽洗脱下来并随后对其测序。这些方法不属于常规方法，而且在需要分析多个细胞类型或多个MHC分子上的细胞表面肽时也是不切实际的。
本发明的一个目的是提供检测细胞表面肽，尤其是多种MHC分子所呈递的肽的方法。此外，本发明的另一个目的是将这些信息用于设计药物分子或者疫苗分子，或者用于诊断试验。
对于药物分子，本发明的一个具体目的是鉴定细胞摄取或产生蛋白质之后由MHC分子呈递的肽，并用这些信息来改变该蛋白质以便这些肽不再被呈递。
对于疫苗分子，本发明的一个具体目的是鉴定细胞摄取或产生蛋白质之后由MHC分子呈递的肽，并将一个或多个这样的肽用在疫苗分子中以便刺激免疫系统。
对于药物和疫苗分子两者而言，本发明的一个具体目的是鉴定由多种不同MHC分子呈递的肽以便包括不同群体中的不同同种异型和基因型变体。
对于诊断试验，本发明的一个具体目的是测定细胞摄取或产生蛋白质之后由MHC分子呈递的肽，并利用此测定作为检测生物学或生理学事件的试验(例如感染的检测试验)的基础。
对于诊断试验，本发明的一个具体目的是鉴定由测试个体的细胞呈递的肽。
本发明为精确而全面地分析细胞表面肽，尤其是与MHC分子结合的肽提供了条件。细胞表面上的肽谱或肽的身份特别可以用质谱分析(MS)来确定。
先前MHC/肽复合体已被纯化用于特定目的。事实上，对于MHC I类和II类分子，它们的免疫富集和纯化方法一直是阐明肽-MHC结合相互作用以及阐明MHC结合基序的有用工具。有关的实例包括US 5,989,565和US 6,077,519，其中提供了通过酸洗脱患者肿瘤细胞或树突细胞群表面的肽来鉴定自体T-细胞表位的方法。洗脱下来的肽的序列对于设计用于制备疫苗的合成肽是有用的。
相似地，Salter等[US 5,487,982]提供了遗传工程温度敏感型MHC I类分子，从而使得可以容易地从体外生长的工程细胞上除下与此突变的MHC I类分子结合的肽。
本领域的其它例子包括Langlade-Demoyen等[WO9744667]，他们将纯化的MHC-肽复合体作为亲和试剂用于富集可在体内和体外肿瘤免疫疗法中和其它用途中使用的肿瘤特异性T-细胞。相似地，US 5,763,585，US5,734,023以及另外的一些提供了纯化特定MHC肽复合体的方法，其中所述复合体可以作为治疗实体用于比如自身免疫疾病的治疗中；Deshpande等[WO9740852]公开了与MHC II类蛋白有增强的结合作用的修饰肽，而且当该复合体作为重组融合蛋白提供时，还预期用于治疗与自身反应性T-细胞有关的疾病。
WO9734143和US5,792,604提供了鉴定由细胞分泌途径内源性加工的MHC I类限制性抗原的方法。这个生物学试验需要接触过抗原的细胞毒性T细胞和作用“指示剂”的靶细胞源，其中分泌到培养基中的经加工的肽将指导所述靶细胞发生溶胞作用。这个方案可用于鉴定能影响供体细胞的内源性加工途径的物质。用于鉴定MHC I类和MHC II类限制性T细胞表位的另外一些复杂的以生物学为基础的方案包括WO 00/67761，它提供了利用遗传疫苗接种以及树突细胞和脾细胞的分离进行体外生物学T细胞激活试验的方法。
本发明人认识到基于MS的仪器可以用于分析完整细胞或细胞抽提物，并且可以把数据应用于治疗性分子或诊断试验的合理开发途径中。
生物来源的复杂大分子只有在被电离后，它们才易于接受质谱分析(MS)。在对用于MS的生物分子进行电离时，有两个方法可供选择，即电喷射离子化(ESI)和基质辅助激光解析离子化(MALDI)，它们已成为本领域的公认技术。在ESI中，将样品泵过带电荷的窄毛细管，通过平行气流使之雾化，直到最终静电排斥使分析物离子解吸进入质谱仪。ESI是一项连续的流式技术，因此易于连接上游样品分离技术例如液相层析(LC)或毛细管电泳(CE)[Cao & Moini(1998)Am.Soc.Mass Specrom.9：1081-1088]。这些特征与MALDI-MS技术有明显差别，后者是把样品埋在仪器样品板上的结晶基质材料中。通过激光激发基质实现电离作用，解吸附的分析物离子被加速进入质量分析仪。因此MALDI是一个不连续的过程，使用多重激光脉冲产生离子，数据累积地收集在质量分析仪中。
对于MALDI，最通常的是通过飞行时间(TOF)检测器来实现质量分析，这种仪器测量从致电离激光脉冲到实现检测之间的飞行时间，从而使得可以计算质量电荷比(m/z)。在不同的商业仪器中，对这些检测器进行了多种技术改进。一些型号能够分析源后衰变(post-source decay)离子碎片用于肽序列推导和其他结构测定。尽管可以利用其他仪器样式，但基于ESI的仪器的连续流式本质使扫描分析仪得到应用(例如四极或扇形磁场(magnetic sector)质量分析仪)。一个典型样式是串联MS系统，借此两个质量分析仪串联排列并通过一个含有惰性气体的“碰撞室”相互连接。后一个特征使得能够产生由碰撞引起的衰变离子和测定给定输入样品的肽序列。可以安排多重杂合的仪器样式用于分析细胞表面(MHC)结合的肽。
在分析从MHC分子(尤其是MHC I类分子)上洗脱的肽时已经应用到MS，参见Cox等的综述[Cox，A.L.等(1997)，pp 141-160，《MHC1：APractical Approach》Fernadez N.& Butcher G.编，Oxford UniversityPress，Oxford，英国]。De Jong给出了本领域的更为新近的综述[De Jong，A.(1998)Mass Spectrometry Reviews 17：第311-335页]。因此，在用麻疹病毒疫苗处理细胞后，分析从MHC II类等位基因DRB1*0401上酸洗脱下来的自身肽时，Ovysyannikova等利用了MALDI-TOF方法[Ovysyannikova等(2001)J.Immunol.Methods 246：第1-12页]。相似地，在鉴定小鼠朗氏细胞上与MHC II类结合的肽时，Sickman等使用了LC和MALDI-MS技术的联合[Sickman，A.等(2000)Analyst 125：第569-573页]。
然而，本发明吸收和发展了所有这些现有技术，使用基于MS的仪器，第一次提出了一个通用方案用于阐明与MHC I类和MHC II类分子结合的肽的类型。在第一个实施方案中，本发明提供了通过肽序列内的氨基酸替代除去结合相互作用以开发治疗性蛋白质的方法，其中所述治疗性蛋白质当对测试对象(最优选地人类对象)给药时，不具有或具有降低的引起MHC介导的免疫应答的能力。本发明的一个目的是提供用于开发治疗性分子的方法，当对测试对象给药时，这种治疗分子具有降低的引起免疫应答的能力。
本发明的一个目的是提供检测细胞表面肽的方法，尤其是在所述肽与MHC分子结合时。
本发明的一个目的是提供检测呈递在细胞表面、形式上与MHC分子结合的肽的方法。
本发明的一个目的是提供检测呈递在细胞表面、与多种不同的MHC分子结合的肽的方法。
本发明的一个目的是提供检测来自外源蛋白由此与MHC分子结合的肽的方法。
本发明的一个目的是提供检测来自内源蛋白由此与MHC分子结合的肽的方法。
本发明的一个目的是提供在经过如下过程后检测细胞表面上的肽的方法，所述过程是：使目的细胞接触外源蛋白或外源微生物，以致这些细胞的表面肽库不同于参考细胞(除了没有接触过外源蛋白外与上述细胞相同的细胞)表面展示的肽库。
这些外源蛋白可以是抽提自哺乳动物源(例如细胞系或离体组织)的纯化制品，或者可以是从工程化后表达所述蛋白的任何生物源中纯化得到的重组制品。该蛋白可以是天然存在的蛋白或一个或多个天然蛋白的融合物。该蛋白可以是体外来源的，即是天然元件的组装，或者是完全合成的或设计的，在自然界中无对应物存在。
这些外源蛋白可以是例如一类蛋白，例如抗体分子及其衍生物、细胞因子、生长因子、白三烯、止血因子(haemostatic factor)，或者可以是细胞毒素或者具有酶的能力或功能。最优选的蛋白是治疗性蛋白质。
应认识到，针对治疗性蛋白质所诱导产生的不利免疫应答已经限制了几种治疗性蛋白质的效能。实施包括单克隆抗体[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.第45卷：第879-885页；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.第135卷：第1530-1535页]以及一些人源蛋白例如尤其是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等(1999)Clin.Cancer Res.第5卷：第1353-1361页]和干扰素α2[Russo，D.等(1996)Bri.J.Haem.第94卷：第300-305页；Stein，R.等(1988)New Engl.J.Med.第318卷：第1409-1413页]。因此，十分需要建立能够鉴定参与诱导针对治疗性蛋白质的免疫应答的决定簇的方法。
诱导免疫应答产生的一个主要因素是蛋白质中存在通过呈递在MHCII类分子上能够刺激T细胞活性的肽，即所谓的T细胞表位。为了消除或降低免疫原性，所期望的是鉴定和除去蛋白质上的T细胞表位。本发明的一个目的是提供能够检测和鉴定T细胞表位的方法。
外源蛋白被吞噬和加工后，与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合进行呈递。MHC II类分子由专业抗原呈递细胞(APCs)，例如尤其是巨噬细胞、树突细胞表达。肽与特定的MHC II类分子结合以便呈递在APC表面的能力取决于许多因素，其中最值得注意的是肽的一级序列。这不但影响到它接受蛋白酶剪切的倾向，而且影响到它与MHC II类分子的肽结合裂隙的结合亲和力。APC表面上的MHC II类分子/肽复合体呈递给特定T细胞受体(TCR)一个结合面，所述TCR能够识别由肽和MHC II类分子的暴露残基共同提供的决定簇。本领域有一些方法可以用来鉴定能够与MHC II类分子结合的合成肽。由于加工途径或其他现象，这些合成肽并非在所有情况下(尤其在体内)都可以起到T细胞表位的作用。本领域还有一些计算机方法可以用来预测潜在的T细胞表位或者识别实验测定的T细胞表位中的序列基序。方案包括WO98/52976提供的预测MHC II类分子结合肽的技术，它是用计算机穿线法来鉴定只与可能的人MHC II类DR同种异型亚群有潜在结合能力的肽序列。
正如WO98/52976和WO00/34317中认识到的，鉴定T细胞表位是消除表位的第一步。在这些文献中，通过在治疗性蛋白质一级序列内应用合理的氨基酸替代来除去预测的T细胞表位。本发明的一个目的是提供开发修饰蛋白质的方法，其中通过减少潜在T细胞表位的数目来改变免疫特征。本发明所鉴定的序列是在经历存在于任何具备能力的APC或类似细胞中的天然胞内加工事件之后呈递在携带MHC的细胞表面或者与MHC制品结合的肽序列。而且，根据本发明方案鉴定的肽可以检测自任一种MHC同种异型或同种异型的混合物(包括，对于MHC II类分子而言，具有DR、DQ或DP特异性的那些)。
虽然本发明为检测展示在细胞表面、尤其是与命名为I类和II类的MHC分子结合的肽提供了可能，但并不旨在被限制于完整细胞，而是还包括对胞吐小体(exosome)表面的肽的分析。在来源于正常表达MHC II类分子的细胞的胞吐小泡(exosomal vesicle)的表面存在高密度的肽-MHC复合体。在某些情况下从APC表面产生的胞吐小体的量可以增加，而且有一些公知的方法可以用来富集或分离胞吐小体[Raposo，G.等(1996)J.Exp.Med.第183卷：第1161-1172页；Clayon，A.等(2001)J.Immunol.Methods第247卷：第163-174页]。因此，对APC制品和来自APC的胞吐小体颗粒制品的分析同等地属于本发明的范围。
总之，本发明涉及以下方面：
·用于开发具有特定的生物学活性且与具有相同生物学活性的任何未修饰的蛋白质或多肽相比具有降低的或增加的免疫原性的药物蛋白质或多肽或疫苗抗原的方法，该方法通过如下步骤实施：
(i)使所述蛋白或多肽与细胞接触，在该细胞或其胞吐小泡上产生一个表面肽库，该表面肽库与未进行接触的参考细胞上展示的表面肽库不同，
(ii)针对结合于所述细胞或其胞吐小泡表面的肽，分析所述细胞或其胞吐小泡，和
(iii)根据标准方法，确定归属于该药物蛋白质或多肽或疫苗抗原序列中的所述肽。
·还包括如下步骤的相应方法：
(iv)修饰所述肽，以期改变它们与MHC分子的结合，和
(v)根据标准方法，通过将一个或多个修饰肽序列并入所述蛋白或多肽分子的序列中，构建编码最终的药物蛋白质或多肽的序列变体。
·相应的方法，其中步骤(ii)对所述细胞或其胞吐小泡的分析通过质谱(MS)，优选MALDI-MS和ESI-MS来完成。
·相应的方法，其中药物蛋白质或多肽经修饰，以致在所述蛋白质或多肽与细胞接触后所述肽中的一个或多个不再与MHC分子结合。
·相应的方法，其中根据步骤(i)结合在细胞或胞吐小泡表面的肽是与MHC分子相结合的形式，并且其中根据步骤(ii)对所述细胞或其胞吐小泡的分析采用MS来完成。
·相应的方法，其中根据步骤(i)结合在细胞或胞吐小泡表面的肽是胞内肽酶和运输途径的产物。
·用于开发具有降低的免疫原性的药物蛋白质或多肽的相应方法，其中通过消除或降低免疫原性肽与MHC分子的结合，并任选地如权利要求1所述测试修饰肽与细胞表面的结合，完成对免疫原性肽的修饰。
·相应的方法，其中通过在所述药物蛋白质或多肽内的所述肽的序列区域中替代、插入、缺失一个或多个氨基酸残基来消除或降低所述肽与MHC分子的结合。
·用于开发具有增强的免疫原性的药物蛋白质或多肽的方法，其中通过增强所述肽与MHC分子的结合，并任选地如权利要求1所述测试修饰肽与细胞表面的结合，实现对所述肽的修饰。
·相应的方法，其中通过在所述肽的序列域中替代、插入、缺失一个或多个氨基酸残基以提高该肽作为T细胞表位的活性、和/或扩大限制该T细胞表位的MHC类型的范围、和/或把几个完全不同的表位组合成单一的实体来加强所述肽与MHC的结合。
·开发疫苗的方法，按如下步骤实施：
(i)使具有免疫原活性的蛋白质或多肽或微生物与细胞接触，在所述细胞或其胞吐小泡上产生一个表面肽库，此库不同于未进行接触的参考细胞上展示的表面肽库，
(ii)分析表面结合有肽的所述细胞或其胞吐小泡，
(iii)根据标准方法确定归属于该蛋白质或多肽的序列中的所述肽，和
(iv)根据标准方法，通过把一个或多个所述肽并入疫苗分子的序列中，构建编码最终药物疫苗的序列变体，其中对所述细胞或其胞吐小泡的分析是采用MS进行的。
·相应的方法，其中使用经工程化产生MHC分子的人细胞系。
·相应的方法，其中亲本(未经工程化的)细胞系不产生MHC分子。
·相应的方法，其中亲本细胞系不产生MHC I类分子。
·相应的方法，其中亲本细胞系不产生MHC II类分子。
·相应的方法，其中对不产生自身MHC分子的非人源细胞进行工程化以使其产生MHC分子，并按所述使用这些细胞。
·相应的方法，其中MHC分子来自MHC II类。
·相应的方法，其中MHC分子是HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。
·相应的方法，其中MHC分子来自MHC I类。
·相应的方法，其中使用细胞系或细胞样品的组合，所述组合提供了全面地包括不同MHC同种异型和基因型的混合物。
·相应的方法，其中所述肽来源于外源蛋白质或微生物。
·相应的方法，其中所述肽来源于内源蛋白质。
·相应的方法，其中使用加入蛋白质或多肽或微生物之后会在MHC分子上呈递肽的人树突细胞或其胞吐小泡。
·相应的方法，其中使用加入蛋白质或多肽或微生物之后会在MHC分子上呈递肽的人抗原呈递细胞或其胞吐小泡。
·相应的方法，其中在分析肽之前先富集MHC分子。
·相应的方法，其中在分析之前先将肽从细胞表面洗脱下来。
·相应的方法，其中在分析之前先将肽从MHC分子上洗脱下来。
·相应的方法，其中使用MALDI-MS。
·相应的方法，其中使用ESI-MS。
·开发诊断试验的方法，通过如下步骤实施：
(i)分析适当人细胞的表面肽，和
(ii)(a)制备出现在该细胞表面上的肽谱，和任选地，与其它谱进行比较以鉴定与该人细胞有关的异常或疾病，或，(b)测定该细胞表面上的特定肽的序列，作为一种手段以确定可以用于鉴定与该人细胞有关的异常或疾病的特定肽。
·通过上述任一种方法获得的蛋白质或多肽作为药物治疗实体的用途。
·通过上述任一种方法获得的蛋白质或多肽作为疫苗的用途。
·通过上述任一种方法获得的蛋白质或多肽作为具有降低的免疫原性的药物治疗实体的用途。
·检测细胞或其胞吐小泡表面上来源于蛋白质或多肽的肽的方法，按如下步骤实施：
(i)使细胞与所述蛋白质或多肽或编码该蛋白质或多肽的基因接触，在该细胞或其胞吐小泡上产生一个表面肽库，该库不同于未进行接触的参考细胞上展示的表面肽库，
(ii)分析表面上结合有所述肽的所述细胞或细胞中的胞吐小泡，和
(iii)根据标准方法确定归属于该蛋白质或多肽的序列中的所述肽，其中对细胞或胞吐小泡的分析通过MS，优选MALDI-MS进行。
因此，根据本发明第一主要实施方案的路线的程序在于应用本文的方法：
1.鉴定目标蛋白氨基酸序列内的一个或多个可被加工的T细胞表位。
2.设计目标蛋白的新序列变体，使所鉴定的潜在T细胞表位中的一个或多个氨基酸被修饰，以实质性地降低或消除T细胞表位活性，这可以通过肽与MHC分子或完整细胞的结合或其他方式来测定。重要的是，通过一定的方式制备这些序列变体，以避免该序列变体产生新的潜在T细胞表位；否则再次修饰这些新的潜在T细胞表位，以便实质性地降低或消除T细胞表位活性。
3.构建这些序列变体，测试所述变体以鉴定一个或多个具有期望性质的变体。
根据此路线，可以产生和测试大量变体蛋白，最优选的实现手段是重组DNA技术，但也可以考虑其他方法包括化学合成法。预期，可以在给定的潜在T细胞表位内进行多个单氨基酸替代以消除表位。可以考虑在单个表位中进行氨基酸替代组合。
在本发明的一个主要方面，使哺乳动物细胞群与测试蛋白一起温育，或者用编码测试蛋白的基因转染这些细胞，在蛋白被摄取或表达并被降解后，确定细胞表面上的肽谱或肽身份。具体地，MHC分子，尤其是多种MHC分子，可以呈递这些肽。作为本实施方案的一个方面，分析呈递在许多不同MHC分子上的肽是重要的；因此，优选在多种细胞群上进行此分析，而所述细胞群包括了在全球群体中发现的MHC同种异型和基因型的极大部分。这样的细胞群可以通过从全球群体中采取多种细胞群来获得，也可以通过应用经构建产生多种MHC类型的细胞来获得。尤其有用的是那些不产生内源MHC分子并且其细胞表面展示低的肽背景的细胞系。
由于人类MHC同种异型和基因型的数量巨大，而且每一个都有与来自任一给定蛋白的不同肽谱结合的能力，故之前用于全面鉴定T细胞表位的方法(如上所述)主要包括预测方法而非生化方法(测试肽与许多类型的MHC的结合)或生物学方法(主要测试肽对T细胞的激活或刺激)。对于结合MHC II类的肽，这些预测方法包括基序和人工神经网络技术，籍此可以分析大量的T细胞表位序列以确定出这些表位共有的氨基酸特异组合，以便用于随后对其他肽的预测分析。但对于MHC II类，这些预测方法有局限性，它们常漏掉一部分T细胞表位(假阴性)或者把事实上没有T细胞表位活性的一些肽定位为T细胞表位(假阳性)。预测方法的另一个主要限制(在应用合成肽的生化和生物学方法中也存在)是未能考虑到给定蛋白的加工，而这种加工会影响到哪些肽可被MHC分子呈递。因此，需要不会产生明显的假阴性和假阳性、可以精确而全面地鉴定T细胞表位的改进方法，在这一点上，本发明为实现这样的改进提供了条件。
对于根据本发明第一个实施方案的人药物蛋白开发，一个具体的应用是制备其上能激活和(或)刺激T辅助细胞的表位已被去除的蛋白。在这种情况下主要感兴趣的是被MHC II类呈递的肽。为了开发在大部分人中都有效的药物蛋白，有必要鉴定蛋白内部能被众多MHC同种异型中的一种或多种呈递的肽，然后改变这些肽以除去其与MHC结合的能力。以前，由于难于精确预测由MHC II类呈递的肽以及难于预测能与大量不同同种异型和基因型人MHC II类分子中的一种或多种结合的肽，故限制了对MHC II类呈递的肽的全面鉴定。对与MHC I类结合的肽的预测更为可靠，与这些肽相比，结合MHC II类的肽在长度上的变化更大，并且在主要结合口袋以外有一些更显著影响肽结合的氨基酸。因此，对MHC II类，为了全面鉴定潜在的T细胞表位，有必要建立比现有可获得的方法更加精确和全面的方法，用于预测或检测与众多MHC II类同种异型和基因型中的一种或多种结合的肽。获得这样一个方法的主要好处是可以产生全部主要(或全部)T细胞表位都得以鉴定然后除去的药物。
应用本发明开发药物的优选方法包括以下步骤：
1.对于可能用作药物的测试蛋白，把其加入到选择的人源细胞系或人源细胞样品中。
2.经过一段适当时间后，分析细胞的表面肽，尤其是在细胞上直接应用MALDI-MS、或者在细胞组分(尤其是MHC组分)上应用MALDI-MS、或者在将肽从细胞表面洗脱下来后应用尤其是MALDI-MS或ESI-MS进行分析。
3.从给定的蛋白出发，确定出展示于细胞表面上属于测试蛋白的肽。
4.修饰在(2)中展示在细胞表面的肽，以消除其与MHC分子的结合，在某些情况下，测试修饰肽与细胞表面的结合情况(见上)。
5.把适当修饰并入蛋白序列的一个或多个肽中以消除其与MHC分子的结合，产生最终的药物蛋白分子。
根据本发明的第二个主要实施方案，提供了可供开发疫苗分子或能作为疫苗起作用的分子的路线。尽管本路线可以同样地应用于开发疫苗分子来治疗或预防非人物种的疾病；但最优选开发用于人的疫苗。对于使用本发明进行的疫苗开发，一个具体的应用是制备如下肽或蛋白，它们具有激活和/或刺激T-细胞的主要表位，主要是T辅助细胞表位但对需要杀伤细胞的应用还有细胞毒性T细胞表位(主要是MHC I类限制的)。为了开发在大部分人中都有效的疫苗，有必要鉴定蛋白质中能被众多MHC同种异型和基因型中的一种或多种呈递的肽，然后从这些肽中选择一个或多个表位包括在最终疫苗分子里。这些表位可以包含被MHC I类限制或被MHC II类限制或被二者限制的肽。本发明为鉴定MHC I类和MHC II类呈递的肽的提供了条件，因此构成开发更有效疫苗的基础。
MHC I类表位和MHC II类表位的一个主要区别是通常产生MHC-肽复合体中的肽的蛋白质的主要来源不同。据认为，外源蛋白主要导致产生与MHC II类结合的肽，而在细胞内表达的内源性蛋白由不同的肽酶和胞内运输途径加工，主要导致在细胞表面与MHC I类分子结合的肽。对于外源或内源蛋白，在一连串加工步骤过程中，来自蛋白的、可能正常与MHC结合的某些肽序列可以被破坏，以致于体内无法产生某些T细胞表位。对于这些肽，预测(或生化/生物学)方法在鉴定T细胞表位时不能考虑到加工过程。本发明的一个特征是从细胞表面鉴定到的肽是那些能够经过胞内加工和运输途径被APC(或其他细胞)选择的肽。因为本发明集中于鉴定加工事件的真实产物，所以与使用预测或体外表位鉴定方法时相比，本发明降低了鉴定到假阳性和假阴性表位的比率。
因此，根据本发明第二个主要实施方案的路线的程序在于将本文方法应用于：
1.鉴定目标蛋白氨基酸序列中的一个或多个T-细胞表位。
2.设计目标蛋白的新序列变体，其中对一个或多个氨基酸进行修饰以便a增加T-细胞表位活性；和/或b.扩大限制T细胞表位的MHC类型的范围，这可通过肽与MHC分子或完整细胞的结合或其他方式来测定；和/或c.把几个完全不同的表位组合成单一(更小)实体。
3.构建这些序列变体并测试所述变体以鉴定具有期望性质的一个或多个变体。
根据此路线，可以产生和测试大量变体蛋白，尽管可以考虑其他方法如化学合成法，但最优选用重组DNA技术来进行。
因此，应用本发明来开发疫苗的优选方法包括以下步骤：
1.对于可能用作疫苗的蛋白，把其加入到选择的人源细胞系或人细胞样品中。
2.经过一段适当时间后，分析细胞的表面肽，尤其是在细胞上直接应用MALDI-MS、或者在细胞组分(尤其是MHC组分)上应用MALDI-MS、或者在将肽从细胞表面洗脱下来后应用尤其是MALDI-MS或ESI-MS进行分析。
3.从给定的蛋白出发，确定展示于细胞表面上属于测试蛋白的肽。
4.选择在(2)中展示于细胞表面的一个或多个肽，用在最终疫苗分子中。
可以理解，为了分析细胞表面肽用于药物或疫苗用途，可以使用能提供全面地包括不同MHC同种异型和基因型的混合物的细胞系组合或人细胞样品组合，这些天然细胞样品将提供全面地包括了MHC I类和/或MHCII类限制性表位的混合物。尤其有用的是人树突细胞(或胞吐小体)，加入测试蛋白后其可被激活，有效地在MHC分子上呈递肽。作为一种可选择方案，可以对人细胞系进行工程化以扩大其MHC库，这主要通过把编码一或多种MHC类型的基因转染入人源细胞系来实现，由此产生具有多种MHC类型的细胞用于细胞表面肽分析。尤其有用的是不产生自身MHC分子的非人源细胞，例如其中鼠源MHC基因已被缺失或失活的鼠细胞。分析细胞表面肽还可以在分析肽之前包括富集MHC分子这一可选择步骤，例如用免疫亲和柱进行富集。对于MHC II类，本发明用于细胞表面肽分析的方法有特殊的优势，即它为分析肽与非DR的同种异型的结合提供了条件。分析同种异型如DQ和DP所呈递的肽非常困难，因为目前还没有可以使用的预测方法，特别是对DQ；据认为，MHC分子DQ的两条链都对结合有贡献(与DR中仅涉及S链不同)。
根据本发明的第三个主要方面，提供了应用本发明开发诊断试验的路线。本实施方案的一个具体应用是制备呈递在细胞表面的肽谱，用以鉴定可能指示特定疾病或细胞受损的肽的异常存在、缺失或者式样。
因此，本发明的一个目的是提供经如下过程后检测细胞表面肽的方法，所述过程为：使感兴趣的细胞与外源蛋白或生物体或其他试剂接触，以致于它们的表面肽库不同于没有接触过外源蛋白或生物体的相同细胞的表面肽库。在本发明的实际应用中，可以通过把指示肽的质量登记入MS仪器的质谱中，或者把指示肽的序列记入CID(或类似)谱中，分解出“诊断肽”或“指示肽”的存在。同样的，可以参考来自未接触外源蛋白或试剂的参考样品的质谱来显示指示肽的存在。在指示肽的质量未知或者无法用任何手段预测的情况下，此比较分析尤其有价值。可以利用in silico方式通过减去一致的质量峰，进行比较分析，当失去特定质量峰可作为诊断指示时，此比较分析尤其具有价值。其他人也曾在生物样品的比较分析中利用MS技术。但是，就Liotta等[WO0049410]而言，此比较分析集中于通过激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection)获得的各个细胞的蛋白质内容。这是与本发明不同的，本发明在于根据从细胞表面上检测到的肽，尤其是细胞表面上与MHC分子结合的肽来进行诊断(比较、扣除或其他)。
应用MS技术的其他诊断方法包括Little等[US，6,207,370]，他们开发了一个基于MS的诊断方法用于鉴定遗传疾病(即，个体的天生体质特征，而不是后天的情况和状态)。这个方法可以鉴定目标蛋白的质量，基于个体的遗传构成不同，群体中这个蛋白的质量是可变的。Geng等[Geng，M.(2000)J.ChromatographyA.第870卷：第295-313页]公开了另外一种诊断方案，他们分析从血清蛋白样品的胰蛋白酶消化物获得的MALDI-TOF谱。他们的方法是探测“信号肽”，由此“信号肽”可以在复杂混合物中诊断出分析物蛋白的存在。这也是与本发明不同的，本发明在于根据从细胞表面上探测到的肽，尤其是在细胞表面与MHC分子结合的肽来进行诊断(比较、扣除或其他)。
因此，根据本发明的此路线，用于开发诊断试验的优选方法包括以下步骤：
1.分析适当人细胞的表面肽，尤其是在细胞上直接应用MALDI-MS、或者在细胞组分(尤其是MHC组分)上应用MALDI-MS、或者在将肽从细胞表面洗脱下来后应用尤其是MALDI-MS或ESI-MS进行分析。
2.制备展示于细胞表面的肽谱，如果需要的话，与其他谱进行比较以鉴定与此人细胞相关的异常或疾病；或者，对细胞表面特异肽的序列进行确定，作为一种手段来确定可用以鉴定与此人细胞相关的异常或疾病的特异肽。
对于本发明的所有实施方案，得到完整序列对于确定肽的身份不是至关重要的，因为有容易得到的、内容不断增加的各种蛋白序列数据库。少量内部序列信息(可以少到2-3个残基)与母体离子的已知质量联系到一起，可足以表征一个肽的种类。已知目前有一些算法可用于检索未中断碎片离子数据集的数据库。其中有影响的实例包括ProteinLynx GlobalServer检索算法(Micromass，Wythenshawe，英国)、来自Matrix Science[www.matrix.Com]的Mascot、或者Protein Prospector软件包(http：//prospector.ucsf.edu)或类似的算法。这些程序根据目的肽的质量来模拟数据库内序列条目的片段化。
我们将用以下非限制性实施例来进一步阐释本发明。
实施例1
使用MALDI-TOF检测与细胞表面HLA-DR结合的肽的方法
从ECACC(Porton Down，英国)获得EBV转化的人B细胞系JESTHOM和BSM。B细胞系JESTHOM是HLA-DR1*0101的纯合体，细胞系BSM是DRB1*0401的纯合体。用供应商推荐的条件体外培养细胞系。在供应商推荐的条件下培养的鼠NSO细胞(ECACC 851 10503)用作阴性对照细胞系。
从Zeneca(Zeneca LSM，Northwich，英国)得到合成肽。肽HA1是13肽，与流感病毒血凝素蛋白的第307-319位残基对应(Rothbard，J.B.等(1988)Cell 52：515)。肽MP1是13肽，与流感病毒基质蛋白的第17-29位残基对应[Rothbard，J.B.等(1988)同上]。虽然这两个肽都已知可以与大量不同的HLA-DR特异性结合，但观察到与DR4同种异型有不同的结合。MP1与DR4结合而MP1没有表现出与DR4特异性的显著结合[Busch R.等(1990)Inf.Immunol.2：443]。
在一些实验中，使用含有不稳定的生物素接头部分的类似肽。在这些实验中，接头生物素-HPDP(Pierce，Chester，英国)与N-端半胱氨酸残基偶联产生肽HA1 B和MP1 B。这些序列与HA1和MP1相比除了此附加的半胱氨酸残基外均是一致的。除了偶联肽的纯化使用HPLC和标准洗脱分布图之外，使用与生物素-HPDP(Pierce，Chester，英国)一起提供的方案实现偶联。用纯化的单克隆抗体LB3.1[ATCC号HB-298]进行抑制实验。该抗体使用蛋白质A sepharose(Millipore，Conset，英国)亲和层析和供应商推荐的方法从杂交瘤LB3.1条件培养基中纯化得到。杂交瘤用标准条件维持。LB3.1在最大浓度10μg/ml下与肽和细胞共温育。
在测试与对照实验中，在用不同的合成肽处理之前，细胞在多聚甲醛中固定。在50μl完全培养基中用3×106个细胞进行实验，此培养基中添加有150μl含终浓度为50μM的肽的肽结合缓冲液(50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液，pH4.0；0.1％NP40)。在37℃温育24小时。为进行分析，离心收获肽处理过的细胞并用PBS洗3次。把细胞加入0.5ml微型离心管内，管中含有50％乙腈-0.1％三氟乙酸的10μl等分试样。随后，在将样品点加在MALDI仪器样品盘上之前，剧烈混合每个样品5秒钟。在点加样品时使用两层法，其中，使1μl酸基质溶液(在1∶1∶1乙腈、甲醇和水的混合物中的0.1M芥子酸)在MS样品盘上变干。在这之后干燥1μl细胞和另外1μl芥子酸基质溶液。
在使用含有不稳定的接头质量标签的合成肽进行的实验中，通过在含有100mM β-巯基乙醇(BME)的PBS中温育细胞来去除接头。与BME的温育在37℃下进行30分钟；然后象之前一样，在将细胞加到MALDI样品盘上之前，用PBS洗细胞3次。
以阳离子模式使用Voyager DE质谱仪(Perseptive Biosystems，Foster City，CA，美国)。用马心脏apomyglobin和牛血清白蛋白(Sigma，Poole，英国)的混合物来校准仪器，在每次分析之前不足30分钟时进行检查，以便对于每一个标准品均在0.1％质量精度范围内。样品点在空气中干燥并在阳离子模式下分析。延迟萃取(delayed extraction)设定为25kV下150ns，低质量阈值设定为600Da。对于每个样品累积总共125次激光照射。
在JESTHOM细胞产生的谱中鉴定到肽HA1和MP1的预测质量峰。与之不同，从表达HLA DR4的BSM细胞中只能鉴定到肽HA1。在实验中使用标记的肽时，在BME处理过的细胞的谱中鉴定到肽峰的质量迁移。虽然在用肽、标记的肽和LB1.1抗体的3-方面竞争分析中可以发现相对离子丰度降低的一些迹象，但来自LB1.1温育过的细胞(抑制实验)的谱显示出抗体处理不能破坏肽的结合。来自用肽或肽组合物处理的鼠NSO细胞的谱显示出非常低丰度的目标离子峰，这提示细胞处理过程中有非特异的相互作用和/或洗涤不充分。
实施例2
使用MALDI-TOF分析与MHC DR结合的肽的方法
通过免疫亲和层析从JESTHOM细胞膜上纯化出HLA-DR1*0101。从BSM细胞中纯化出HLA DRB1*0401。用以前描述的方法制备和处理溶解的细胞膜[Gorga等(1987)J.Biol.Chem.第262卷：第16087-16094页；Sette等(1989)J.Immunol.第42卷：第35-40页]。抗-DR单克隆抗体LB3.1[ATCC号HB-298]用作免疫亲和试剂。该抗体用蛋白A sepharose(Millipore，Conset，英国)亲和层析和供应商提供的方法从杂交瘤LB3.1条件培养基中纯化得到。杂交瘤在标准条件下维持。用InVitrogen(InVitrogen，Groningen NL)提供的Linx系统和供应商推荐的条件，使LB3.1抗体与sepharose 4B(Pharmacia Biotech，St.Albans，英国)偶联。
将实施例1中所述的合成肽HA1和MP1与HLA-DR1*0101制品的50μl等分试样一起温育。肽以终浓度50μM在肽结合缓冲液(50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液，pH4.0；0.1％NP40)中37℃下实施此温育26小时。使用微量离心过滤器(Millipore，美国)进行超滤并用PBS进行多轮(最少4轮)洗涤，去除未结合的肽。将终体积减少到20μl。在一些实验中，在MALDI-TOF分析之前把肽从MHC上洗脱下来。在这种情况下，通过用0.1％TFA水溶液抽提来进行洗脱。将洗脱物蒸干并直接用实施例1中的MALDI基质溶液重悬。在另外一些实验中，将MHC-肽复合体加载在仪器样品盘上，在基质溶液中重悬。
在HLA-DR1*0101制品产生的谱中鉴定到肽HA1和MP1的预测质量峰。与之不同，在来自DRB1*0401制品的谱中只能鉴定出HA1的质量峰。
实施例3  用完整蛋白处理细胞后分析细胞表面肽的方法
从获自健康捐献者的40ml外周血样品富集人树突细胞。用肝素使血液抗凝，并用histopaque 1077(Sigma，Poole，英国)密度梯度介质和供应商推荐的条件制备单核细胞组分。使用免疫磁性分离法通过负筛选获得树突细胞，其中所有试剂和条件由Mitenyi Biotec(Bisely，英国)提供。把树突细胞洗脱至多孔组织培养盘中，用于进行蛋白抗原处理。在实验过程中，细胞维持在添加有10％(v/v)胎牛血清和标准抗生素的RPMI培养基中。所有试剂来自Life Technologies(Paisley，英国)。
在这些研究中使用了重组链激酶制品。此野生型链激酶基因通过合同由Genosys Biotechnologies Ltd(Cambridge，英国)合成。使用重叠的合成引物和Collen等[Collen D.(1996)Circulation第94卷：第197-206页]提供的序列，通过聚合酶链式反应构建这个基因。以453bp的EcoRI-HinDIII限制性片段，把此合成基团克隆到细菌表达载体pMEX(MoBiTec，Gottingen，德国)上。用标准技术把pMEX/链激酶基因转化入感受态大肠杆菌细胞株TG1中，并用纤维蛋白平板试验[Astrup，T.等(1952)Arch.Biochem.Biophys.第40卷：第346-351页；Collen，D.等(1992)Fibrinolysis第6卷：第203-213页]选择分泌活性链激酶的单个转化克隆。培养最好的表达克隆并用顺序柱层析及以前描述的方法[Collen，D.等(1992)ibid；Schott，B.等(1994)Biotechnology第12卷：第185-189页]从培养上清液中纯化出重组蛋白。
用浓度100μg/ml的纯化链激酶温育树突细胞并过夜。在一些实验中，通过在培养基中加入抑制剂混合物来阻断抗原加工。在加入测试蛋白之前1小时加入抑制剂，其浓度如下：氯化铵50mM、叠氮化钠1mg/ml、氯奎和秋水仙素500μM。所有化合物来自Sigma(Sigma，Poole，英国)。
蛋白处理过后，细胞从培养盘中移出并经3轮离心和PBS处理进行洗涤，以除去所有培养基和外部蛋白。用实施例1中给出的方法处理细胞用于MALDI-TOF分析。为了确定归属于测试蛋白的肽的存在，收集和分析质谱。通过与从未经链激酶处理的对照细胞获得的谱相比，鉴定这些肽。
在从链激酶处理的细胞获得的谱中鉴定到属于链激酶的离子峰，而在用代谢抑制剂处理的细胞或未经链激酶处理的对照细胞的谱中未看到此离子峰。
实施例4  测定用完整蛋白处理细胞后产生的肽序列的方法
根据实施例3的方法，用目的蛋白处理细胞。用含有5％乙腈、0.1％甲酸的溶液进行多次(4-6)抽提，从细胞上洗脱肽。用ESI-MS/MS确定属于测试蛋白的序列的存在。
干燥洗脱下来的样品并用0.1％甲酸溶液重悬。通过直接与质谱仪的Z-Spay源相连接的组合式CapLC系统(Micromass，Wythenshawe，英国)分离整个粗洗脱物。以每分钟30μl的流速把样品加载到C18前置柱中，并用0.1％甲酸溶液脱盐3分钟。流速减小到每分钟1μl并再次将样品加至C18 180mm pepmep柱上。用从含有95％H2O、5％乙腈、0.1％甲酸的溶剂溶液到含有5％H2O、95％乙腈、0.1％甲酸的溶剂溶液的标准洗脱梯度来洗脱柱子。
在装有Z-Spay nanoflow电喷雾离子源的Micromass Q-Tof 2仪器(Micromass，Wythenshawe，英国)上获得电喷雾MS和MS/MS数据。在源温度为80℃、逆向气体流速为40L/小时、以及将2800V电压应用于nanospray连续LC探测器时以阳离子模式运转仪器。以自动数据依赖性切换模式操作仪器，获得所有数据。
用选择的碎片离子(碰撞诱导glufibrinopeptide b分解产生的)以两点校正来校准仪器。所有数据用ProteinLynx软件自动处理，用ProteinLynx Global Server检索算法(Micromass，Wythenshawe，英国)进行分析来实现蛋白鉴定。
通过硼硅酸盐针把粗样品注射入仪器中以实现手工数据采集。把样品浓度调整到大约1μM。在注射之前用C18 Zip Tip一次性微型柱(Millipore，美国)对样品脱盐。
为了确定属于测试蛋白的肽质量的存在，收集和分析谱图。通过与来自对照细胞(包括抗原加工被阻断的细胞)的谱进行比较，鉴定这些肽。链激酶处理之后，鉴定到属于链激酶的肽质量。在未经链激酶处理的细胞和代谢抑制剂处理的细胞中，相应的离子峰并不明显。

Claims (34)

1.用于开发具有特定的生物学活性且与具有相同生物学活性的任何未经修饰的蛋白质或多肽相比具有降低的或增加的免疫原性的药物蛋白质或多肽或疫苗抗原的方法，所述方法通过如下步骤实施：
(i)使细胞与所述蛋白或多肽接触，在细胞或其胞吐小泡上产生一个表面肽库，该库不同于未进行接触的参考细胞上展示的表面肽库，
(ii)就结合于所述细胞或其胞吐小泡表面的肽，分析所述细胞或其胞吐小泡，
(iii)根据标准方法确定归属于该药物蛋白或多肽或疫苗抗原的序列中的所述肽。
2.权利要求1的方法，还包括以下步骤：
(iv)修饰所述肽，以改变它们与MHC分子的结合，和
(v)根据标准方法，通过把一个或多个修饰的肽序列并入所述蛋白或多肽分子的序列中，构建编码最终的药物蛋白或多肽的序列变体。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(ii)对所述细胞或其胞吐小泡的分析采用质谱(MS)来完成。
4.根据权利要求3的方法，其中应用MALDI-MS。
5.根据权利要求3的方法，其中应用ESI-MS。
6.根据所述权利要求之任一项的方法，其中药物蛋白或多肽经修饰，以致于在细胞与所述蛋白或多肽接触之后，所述肽中的一个或多个不再发生结合。
7.根据权利要求1到6之任一项的方法，其中根据步骤(i)结合于细胞或胞吐小泡表面上的肽是与MHC分子相结合的形式，并且其中根据步骤(ii)对所述细胞或其胞吐小泡的分析采用MS来完成。
8.根据权利要求1到6之任一项的方法，其中根据步骤(i)结合于细胞或胞吐小泡表面上的肽是胞内肽酶和运输途径的产物。
9.根据权利要求1到8之任一项的方法，其用于开发具有降低的免疫原性的药物蛋白或多肽，其中通过消除或降低免疫原性肽与MHC分子的结合，并任选地如权利要求1所述测试修饰肽与细胞表面的结合，完成对免疫原性肽的修饰。
10.根据权利要求9的方法，其中通过在药物蛋白或多肽内的所述肽的序列区域中替代、插入或缺失一个或多个氨基酸残基来消除或降低所述肽与MHC分子的结合。
11.根据权利要求1到8之任一项的方法，其用于开发具有增强的免疫原性的药物蛋白和多肽，其中通过增强所述肽与MHC分子的结合，并任选地如权利要求1所述测试修饰肽与细胞表面的结合，完成对所述肽的修饰。
12.根据权利要求11的方法，其中通过在所述肽的序列区域中替代、插入或缺失一个或多个氨基酸残基以提高该肽作为T细胞表位的活性、和/或扩大限制该T细胞表位的MHC类型的范围、和/或把几个完全不同的表位组合成单一的实体来加强所述肽与MHC的结合。
13.开发疫苗的方法，按如下步骤实施：
(i)使具有免疫原活性的蛋白质或多肽或微生物与细胞接触，在所述细胞或其胞吐小泡上产生一个表面肽库，此库不同于未进行接触的参考细胞上展示的表面肽库，
(ii)分析表面结合有肽的所述细胞或其胞吐小泡，
(iii)根据标准方法确定归属于该蛋白或多肽的序列中的所述肽，和
(iv)根据标准方法，通过把一个或多个所述肽并入疫苗分子的序列中，构建编码最终药物疫苗的序列变体，其中对所述细胞或其胞吐小泡的分析采用MS进行。
14.根据权利要求1到13之任一项的方法，其中使用经工程化产生MHC分子的人细胞系。
15.根据权利要求14的方法，其中未经工程化的亲本细胞系不产生MHC分子。
16.根据权利要求14的方法，其中亲本细胞系不产生MHC I类分子。
17.根据权利要求14的方法，其中亲本细胞系不产生MHC II类分子。
18.根据权利要求1到13的方法，其中对不产生自身MHC分子的非人源细胞进行工程化以使其产生MHC分子，并按所述使用这些细胞。
19.根据权利要求1到18之任一项的方法，其中MHC分子来自MHC II类。
20.根据权利要求19的方法，其中MHC分子是HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。
21.根据权利要求1到18之任一项的方法，其中MHC分子来自MHC I类。
22.根据权利要求19的方法，其中使用提供全面包括了不同MHC同种异型和基因型的混合物的细胞系或细胞样品组合。
23.根据权利要求1到22之任一项的方法，其中所述肽来源于外源蛋白质或微生物。
24.根据权利要求1到22之任一项的方法，其中所述肽来源于内源蛋白质。
25.根据权利要求1到24之任一项的方法，其中使用加入蛋白质或多肽或微生物之后在MHC分子上呈递肽的人树突细胞或其胞吐小泡。
26.根据权利要求1到24之任一项的方法，其中使用加入蛋白质或多肽之后在MHC分子上呈递肽的人抗原呈递细胞或其胞吐小泡。
27.根据权利要求1到26之任一项的方法，其中在分析肽之前富集MHC分子。
28.根据权利要求1到27之任一项的方法，其中在分析之前将肽从细胞表面洗脱下来。
29.根据权利要求1到27之任一项的方法，其中在分析之前将肽从MHC分子上洗脱下来。
30.开发诊断试验的方法，通过如下步骤实施：
(i)分析适当人细胞的表面肽，和
(ii)(a)制备出现在该细胞表面上的肽谱，和任选地，与其它谱进行比较以鉴定与该人细胞有关的异常或疾病，或，(b)测定该细胞表面上特定肽的序列，作为一种手段以确定可以用于鉴定与该人细胞有关的异常或疾病的特定肽。
31.通过权利要求1到8之任一项的方法获得的蛋白质或多肽作为药物治疗实体的用途。
32.通过权利要求11到13之任一项的方法获得的蛋白质或多肽作为疫苗的用途。
33.通过权利要求9或10的方法获得的蛋白质或多肽作为具有降低的免疫原性的药物治疗实体的用途。
34.检测细胞或其胞吐小泡表面上来源于蛋白质或多肽的肽的方法，通过如下步骤实施：
(i)使细胞与所述蛋白质或多肽或编码该蛋白质或多肽的基因接触，在该细胞或其胞吐小泡上产生一个表面肽库，该库不同于未进行接触的参考细胞上展示的表面肽库，
(ii)分析表面上结合有所述肽的所述细胞或其中的胞吐小泡，和
(iii)根据标准方法确定归属于该蛋白或多肽的序列中的所述肽，其中对细胞或胞吐小泡的分析通过MS，优选MALDI-MS进行。
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