AT413701B - Strukturelle und funktionelle charakterisierung von cdw92 - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf eine strukturelle und funktionelle Charakterisierung von CDw92 und betrifft eine Nucleinsäuresequenz des CDw92-Antigens, eine Spleißvariante dieser Nuc-leinsäuresequenz sowie mit dieser gentechnisch transfizierte/transduzierte Zellen. 5 Einleitung

Die Cluster-Bezeichnung CDw92 wurde erstmals beim 5. Internationalen Workshop über Hu-manleukozyten-Differenzierungsantigene an zwei monoklonale Antikörper (mAks) mit den Bezeichnungen VIM15 und VIM15b vergeben. Beide Antikörper wurden nach der Immunisierung io von BALB/c-Mäusen mit Zellen der myeloischen Zelllinie MV4-11 produziert. Im Rahmen von Co-Modulationsstudien wurde eine reziproke Reduktion der Bindung des jeweils anderen Antikörpers nachgewiesen, was als Beleg dafür zu werten ist, dass beide Antikörper sich gegen dasselbe Molekül richten, nämlich das CDw92-Molekül, das mit Hilfe von Immunpräzipitationsstudien als ein Protein mit einer einzelnen AA-Kette und einem Molekulargewicht von 15 70 kDa identifiziert wurde. Kreuz-Inhibitionsstudien zeigten, dass die von VIM15 und VIM15b erkannten Epitope entweder überlappen oder zumindest eng benachbart sind. Bei der Anfärbung von Zellen mit den monoklonalen Antikörpern wurde die Expression des CDw92-Moleküls vorwiegend auf der Oberfläche von humanen peripheren Blutmonozyten, sowie auf Neutrophilen und mehreren myeloischen als auch T-Zelllinien nachgewiesen. Eine schwache Expression 20 wurde für periphere Blutlymphozyten, Fibroblasten, Endothel- und Epithelzellen beschrieben. Außerdem wurde die Expression von CDw92 auf Mastzellen nachgewiesen, während dies bei basophilen Zellen nicht der Fall war.

Die WO 01/32704 A1, Choline transporter like (CTL) membrane proteins involved in choöine 25 transport, befasst sich mit einer dritten Form der anmeldungsgemäßen Molekülfamilie, die aber in ihrem C-Terminus und der folgenden 3' Region völlig unterschiedlich zu den zwei anmeldungsgemäßen Formen ist. Wegen der potentiellen Cholintransportfunktion des in diesem Vorhalt beschriebenen Moleküls wird eine Beziehung zur Behandlung familiärer Dysautonomie --------und dem Tangier-Syndrom-diskutiertrDiesenrrMolekül wird allerdings keine Rölle im lmmunsys- 30 tem und Beteiligung an Immunregulation zugeschrieben.

Die WO 00/71710 A2, Expression products of genes involved in diseases related to Cholesterol metabolism, bezieht sich auf nicht näher definierte Sequenzen im Chromosomenlokus 9q31-34, die in Bezug zum Lipoprotein Metabolismus stehen. 35

Die in der WO 01/48190 A2, Therapeutic use of LNA-modified oligonucleotides, bezieht sich auf die Hemmung der Genexpression durch Modifizierung genspezifischer Oligonukleotide durch sogenannte Locked Nucleic Acids (LAN). In diesem Dokument werden eher unspezifisch eine Unmenge an Genen aufgelistet, deren Expressionsunterdrückung durch diese Methode die 40 Hemmung von Krebszellen oder Entzündungszellen hervorrufen könnte. Überdies ist die Effizienz der darin geoffenbarten Methode beschränkt und mit der derzeit effizientesten Technik der Genexpressionshemmung, siRNA, nicht vergleichbar.

Die Vorveröffentlichung Leuk. Res. 22: 537-47, 1998 Artikel: Changes in antigen expression..... 45 beschreibt neben einer Reihe anderer Moleküle die Expression von CDw92 während der Differenzierung von Zellen der Zelllinie HL-60 durch verschiedene Stimuli. Die primäre Expression von CDw92 ist seit längerem bekannt.

Nachstehend wird die molekulare Klonierung des CDw92-Moleküls mit Hilfe der mAks VIM15 so und VIM15b und einer auf einem Retrovirusvektor beruhenden Expressions-Klonierungsmethode beschrieben, die vor kurzem im Labor eingeführt wurde. Außerdem wird dargestellt, dass das CDw92-Protein bei der Reifung und Differenzierung von dendritischen Zellen (DCs) einer spezifischen Regulation unterliegt und es werden Belege für eine Beteiligung von CDw92 an der Regulation der Expression von IL-10 durch DCs vorgelegt. 55 3

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Nachstehend werden die folgenden Abkürzungen verwendet: DC, dendritische Zelle; dHMVEC, mikrovaskuläre Endothelzelle der menschlichen Haut; EST, expressed-sequence tag (expri-miertes Sequenzstück); GES, Hydrophobizitätsskala nach Goldman, Engelman und Steitz; hCTL1, Human-Cholintransporter-ähnliches Protein 1; ITIM, auf Immunrezeptortyrosin-5 basierendes Inhibitionsmotif; KD, Hydrophobizitätsskala nach Kyte-Doolittle; MAFA, Mastzell-funktions-assoziiertes Antigen; Mo-DC, von Monozyten abgeleitete dendritische Zelle; PB, peripheres Blut; TMD, Transmembrandomäne.

Material und Methoden 10

Antikörper

Die beiden monoklonalen CDw92-Antikörper VIM15 (Isotyp lgG1) und VIM15b (Isotyp lgG2b) wurden am Institut mittels Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit Zellen der myeloischen 15 Zelllinie MV4-11 erzeugt (1). Der CD4-mAk VIT4, der CD8-mAk VIT8, der CD14-mAk VIM13, der CD15-mAk VIM16, der gegen MHC-Klasse II gerichtete mAk VID1 sowie der als Negativkontrolle dienende mAk VIAP (gegen Alkalische Phosphatase des Kälberdarms gerichtet) wurden ebenfalls im Labor hergestellt. Der CD14-mAk MEM-18 wurde käuflich erworben (Fa. An der Grub/Scandic, Wien, Österreich). Die Hybridomas, die den CD16-mAk 3G8 und den 2o CD19-mAk BU-12 hersteilen, wurden von der Fa. American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) angekauft. Der negative Kontroll-mAk AFP-01, der sich gegen Human-a-Fetoprotein richtet, wurde freundlicherweise von V. Horejsi zur Verfügung gestellt.

In den Funktionsassays wurden die mAks in einer Konzentration von 10 pg/ml eingesetzt. Die 25 Arbeitsverdünnungen der mAk-Präparationen enthielten weniger als 10 pg LPS/ml. Bei diesen niedrigen LPS-Konzentrationen waren in vorliegenden Assaysystemen keine biologischen Wirkungen nachweisbar.

Zelllinien und Zellpräparationen _______________________ -30------------------------------------------

Die Zelllinien, einschließlich myeloische KG1a-Zellen vom Menschen, Sp2/6-Mausmyelom-zellen, P815-Mausmastozytomzellen, EL-4-Mauslymphomzellen, CPII-Mausmastzellen und BW5147-Mausthymomzellen, wurden in mit 10% FCS (Kälberfötenserum) angereichertem RPMI-1640-Medium in einer feuchtigkeitsgesättigten 5% C02-Atmosphäre bei 37°C in Kultur 35 gehalten. Die Phoenix-Viruspackzellen wurden in DMEM mit 10% FCS in Kultur gehalten. Die Endothelzellkulturen enthielten DMEM, 20% FCS, 1% basischen Fibroblastenwachstumsfaktor und 10 pg/ml Heparin.

Die Isolation der peripheren Blutmonozyten aus heparinisiertem Vollblut normaler gesunder 40 Spender erfolgte mit Hilfe einer Standard-Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Zur Untersuchung der Expression von CDw92 auf der Oberfläche von aktivierten Lymphozyten aus dem peripheren Blut wurden periphere Blutmonozyten in 96-Well-Zellkulturplatten ausgesät (105 Zellen/Well) und zwei Tage mit oder ohne lonomycin (1 pM, Sigma, St. Louis, USA) oder PHA (5 pg/ml, Abbot Ges.m.b.H., Wien, Österreich) in mit 45 5% humanem AB-Serum (PAA Laboratories, München, Deutschland) angereichertem RPMI- 1640-Medium in Kultur gehalten. Die Abtrennung der Monozyten aus den frisch isolierten peripheren Blutmonozytenpräparationen erfolgte durch magnetische Sortierung mit Hilfe des bioti-nylierten CD14-mAks VIM13 in Verbindung mit der MACS Magnetkügelchentechnologie von Milteny Biotec GmbH (Bergisch-Gladbach, Deutschland). Von Monozyten abgeleitete dendriti-50 sehe Zellen (Mo-DCs) wurden durch Kultur von aufgereinigten peripheren Blutmonozyten in RPMI-1640-Medium plus 10% FCS, rhGM-CSF (50 ng/ml) und rhlL-4 (100 U/ml, beide Substanzen wurden freundlicherweise vom Novartis Research Institute, Wien, Österreich zur Verfügung gestellt) für eine Dauer von 7 Tagen erhalten. Bei einigen Experimenten wurden unreife Mo-DCs und periphere Blutmonozyten einer eintägigen Weiterbehandlung mit IFN-a (100 U/ml, 55 freundlicherweise von Dr. Günter Adolf, Bender, Wien, Österreich zur Verfügung gestellt), IFN-y 4

AT 413 701 B (300 U/ml, Bender), LPS (1 pg/ml, E. coli-Serotyp 0127-B8, Sigma), lonomycin (1 μΜ, Sigma) oder Calciumionophor (100 ng/ml, Sigma) unterzogen. Zur IL-10-Stimulation (10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) wurden lonomycin- oder Calciumionophor-behandelte Mo-DCs und periphere Blutmonozyten 1 Tag in Gegenwart dieses Interleukins in Kultur gehal-5 ten.

Immunfluoreszenzanalyse

Zur Bestimmung der mAk-Bindung wurden die Techniken der direkten und der indirekten Im-io munfluoreszenz eingesetzt. Als Sekundärreagenzien dienten bei der indirekten Immunfluoreszenz markierte anti-Maus-lgG+lgM (H+L)-F(ab')2-Antikörperfragmente (entweder Oregon Green-markierte F(ab')2 von der Ziege (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) oder FITC-markierte F(ab')2 vom Schaf (An der Grub/Scandic)). Die Anfärbung der Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie verfolgt. 15

Konstruktion der Retrovirus-cDNA-Library

Aus humanen myeloischen Zellen der Zelllinie KG 1a wurde die Gesamt-RNA nach der Guani-dinthiocyanatmethode von Chomczynski und Sacchi extrahiert. Die Poly A+-mRNA wurde mit 20 einem Oligotex mRNA Midikit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) nach Vorschrift des Herstellers isoliert. Mit dem cDNA-Synthesis-Kit von Pharmacia Biotech wurde aus 5 pg Poly A+-mRNA doppelsträngige cDNA hergestellt. An die Doppelstrang-cDNA wurden 5’-phosphorylierte Adapter ligiert. Nach der chromatografischen Entfernung des Überschusses an Adapter wurde die cDNA-Library in den Retrovirus-Expressionsvektor pBabeMN-lacZ ligiert, der freundlicherweise 25 von G. Nolan zur Verfügung gestellt wurde. Anschließend wurde die cDNA-Library zur Transformation von E. coli DH5a-Zellen verwendet und die Zellen anschließend auf LB-Agar-Platten ausplattiert, die 100 pg/ml Ampicillin (Sigma) enthielten. Zur Bakterienemte wurden die Platten in LB-Medium abgekratzt und die Plasmid-cDNA mit Hilfe eines Maxi Plasmid Kit (Qiagen) extrahiert. Die so erhaltene Retrovirus-Library enthieltjmgefähr 2J_0<Lunabhängige-Bakterien-— 30__klone_und die-Größe-der -eingefügten cDNA^Stücke (DNA-Inserts) lag im Bereich von 0,8 bis 4 kb.

Transfektions- und Infektionsverfahren 35 Einen Tag vor der Transfektion wurden 3-106 Zellen der ecotropen Retrovirusverpackungszelllinie Phoenix (freundlicherweise von G. Nolan zur Verfügung gestellt) in 6 cm-Gewebe-kulturplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) ausgesät. Die Zellen konnten über Nacht wachsen und wurden anschließend mit dem Reagenz „Superfect Transfection Reagent“ (Qiagen) und 5 pg Plasmid-cDNA der Library nach Vorschrift des Herstellers transfiziert. Nach 2 Tagen wurde 40 der Kulturüberstand mit den die Library repräsentierenden sezernierten Viren abfiltriert und

Polybren (Sigma) bis zu einer Konzentration von 10 pg/ml zugegeben. 500 pl dieses virushaltigen Überstands dienten anschließend zur Infektion von 5Ί06 Mauszielzellen (u.a. Sp2/6-Mausmyelomzellen, P815-Mausmastozytomzellen, EL-4-Mauslymphomzellen und BW5147-Mausthymomzellen) in 500 pl RPMI-1640-Medium + 10% FCS in 6-Well-Kulturplatten (Nunc). 45 Nach 6 h Inkubation bei 32°C in einer 5% C02 enthaltenden Atmosphäre wurden 2 ml frisches RPMI-1640-Medium + 10% FCS zugesetzt und die Zellen über Nacht bei 37°C aufgezogen. Anschließend wurden die infizierten Zellen gewaschen und weitere 2 Tage in frischem Medium bei 37°C aufgezogen. so Screening-Verfahren

Die infizierten Mauszielzellen (2-107) wurden zweimal mit PBS/1% BSA gewaschen und anschließend für 20 Minuten auf Eis mit den CDw92-mAks VIM15 und VIM15b inkubiert. Danach wurden die Zellen nach Vorschrift des Herstellers mit MACS-Mikrokügelchen (goat anti-mouse 55 IgG, Milteny Biotec) inkubiert. Die Zellen wurden sodann mit PBS/1% BSA gewaschen, in 5

AT 413 701 B 500 μΙ MACS-Sortierpuffer (PBS/0,5% BSA/2 mM EDTA) resuspendiert und auf eine MACS RS+-Selektionssäule (Milteny Biotec) zur positiven Selektion der CDw92-transduzierten Zellen aufgetragen. Die auf diese Weise heraussortierten Zellen wurden in RPMI-1640-Medium + 10% FCS in Kultur gehalten und bis zu einer Zellzahl von 2-107 expandiert und anschließend einem s erneuten MACS-Sortierdurchgang unterworfen. Nach insgesamt vier Sortierdurchgängen zeigten 60-90% der Zellen (je nachdem, welche Mauszelllinie verwendet wurde) eine Reaktion mit den CDw92-mAks VIM15 und VIM15b. Ein einzelner positiver Zellklon wurde durch limitierende Verdünnung isoliert und diente zur Isolierung der CDw92-cDNA.

io Isolierung der CDw92-cDNA mittels RT-PCR

Der einzelne CDw92-Zellklon wurde expandiert und die Gesamt-RNA extrahiert. Das CDw92-cDNA-lnsert wurde mit Hilfe der RT-PCR-Technik [Superscript II RT (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) isoliert, wobei das Advantage-GC Polymerase System (Clontech, Palo Alto, CA, 15 USA)] und flankierende Primer für die Multiple Klonierungsstelle des Retrovirusvektors pBabeMN-lacZ verwendet wurden. Mit einem Perkin Elmer/Cetus DNA Thermal Cycler wurden 32 PCR-Reaktionszyklen durchgeführt (1 Min bei 94°C, 1 Min bei 58°C und 6 Min bei 68°C). Das amplifizierte PCR-Fragment mit einer Größe von 3 kb wurde mittels Gelelektrophorese aufgereinigt und in pBabeMN-lacZ subkloniert. Phoenix-Virusverpackungszellen wurden an-20 schließend mit dem so erhaltenen Vektor (mit der Bezeichnung CDw92A6) gemäß einer Modifikation der bereits früher beschriebenen DEAE-Dextran-Transfektionsmethode transfiziert. Zu diesem Zweck wurden 1,5-10® Phoenix-Verpackungszellen in 4 ml DMEM suspendiert, wobei das Medium außerdem 1% NuSerum (Collaborative Research Inc., Bedford, MA, USA), 200 pg/ml DEAE-Dextran, 100 μΜ Chloroquindiphosphat und 4 μg DNA des Plasmids CDw92A6 25 enthielt. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Phoenix-Zellen mit DMEM + 10% FCS gewaschen und in 6-Well-Kulturplatten überführt (Nunc). Nach weiterer Inkubation über Nacht bei 37°C wurde das Kulturmedium gewechselt und 1 ml frisches DMEM + 10% FCS zugegeben. Anschließend wurden die Zellen 2 weitere Tage in Kultur gehalten und anschlie- ____ßend der Kulturüberstand zur lnfektion der Mauszielzellen verwendet. FÜr j3eide^CDw92^mAks 30 wurde die Reaktionsfähigkeit mit diesen Zellen am 3. Tag nach der Infektion mit Hilfe einer Immunfluoreszenzanalyse untersucht.

Sequenzanalyse 35 Die Sequenzierung des cDNA-lnserts im Plasmid CDw92A6 erfolgte mit einer automatischen Sequenzieranlage auf der Grundlage eines Applied Biosystems 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Die mutmaßlichen Membran-Domänen (Transmembrandomänen, TMDs) von CDw92 und die Topographie wurden mit dem Programm TopPred II 1.3 als Schätzung ermittelt. Beim Einsatz des Programms wurden die Voreinstellungen für Eukaryon-40 tenproteine und die Hydrophobizitätsskala nach Kyte-Doolittle (KD) mit einem oberen Grenzwert von 1,5 für sicher identifizierte TMDs und einem unteren Grenzwert von 1,1 für mutmaßliche TMDs verwendet. Außerdem wurde auch die Hydrophobizitätsskala von Goldman, Engelman und Steitz mit den zugehörigen Voreinstellungen angewandt. Die Sequenztopologie wurde außerdem mit dem PHDTopography System analysiert (http://www.EMBL-Heidelberg.DE/pre-45 dictprotein).

Oberflächenmarkierung der Zellen und Immunpräzipitationsanalyse

Zur Biotinylierung der Zelloberflächen dienten 0,5 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Rock-50 ford, IL, USA) in PBS (pH 8,5). Nach 50-minütiger Inkubation bei 4°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 mM Tris-HCI (pH 8,2) beendet. Die Lyse der Zellen (2-107) erfolgte in Lysepuffer (20 mM Tris-HCI, pH 8,2, 140 mM NaCI)(40 Minuten, 4°C), der mit den Detergenzien 1% NP40 (Pierce) und 0,2% Desoxycholinsäure (Sigma) sowie mit einer Mischung von Proteaseinhibitoren (1 mM PMSF, 10 pg/ml Aprotinin und 10 pg/ml Leupeptin) angereichert war. Die Zelllysate 55 wurden abzentrifugiert (12.000 U/Min, 20 Min, 4°C) und anschließend mit Hilfe eines irrelevan- 6

AT 413 701 B ten, an CNBr-Sepharose gekoppelten mAks vorgeklärt (1 Stunde). Danach wurden die Lysate einer Immunpräzipitation nach der an anderer Stelle beschriebenen Vorschrift für die „Festpha-sen-lmmunisolierungs“-Technik unterzogen. Die Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE auf 10%-Gelen unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und anschließend auf 5 Immobilen P Polyvinylidendifluorid-Membranen (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) transferiert. Die Membranen wurden mit 5% BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,9) blockiert und die biotinylierten Proteine auf dem Blot mittels eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugats (Amersham, Aylesbury, GB) und dem Chemolumineszenz-Nachweissystem von Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Deutschland) nachgewiesen. 10

Bestimmung der Zytokinproduktion

Mo-DCs (1-106/ml) wurden mit oder ohne LPS-Zugabe (1 pg/ml, Sigma) und in An- oder Abwesenheit der CDw92-mAks VIM15 oder VIM15b, des anti-MHC-Klasse ll-mAks VID1 oder des 15 (gegen alkalische Phosphatase aus dem Kälbermagen gerichteten) Kontroll-mAks VIAP in 24-Well-Platten (Costar Cambridge, MA, USA) in Kultur gehalten. Nach 48 Stunden wurden die Zellüberstände geerntet und die Zytokinspiegel mittels eines Sandwich-ELISA-Assays mit zueinander passenden Antikörperpaaren bestimmt. Die Fang- (Capture) und Nachweisantikörper für Human-IL-1ß stammten von Genzyme (Cambridge, MA, USA), die Antikörper für die IL-10-20 und IL-12-p40-Bestimmung stammten von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) und die Antikörper für die TNF-a-Bestimmung wurden von PharMingen (San Diego, CA, USA) erworben. Als Standards wurden rekombinante Humanzytokine von R&D Systems verwendet. Sämtliche Bestimmungen wurden in doppelter Ausführung nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt. Die untere Nachweisgrenze lag bei 10 pg/ml für IL-1ß und bei 20 pg/ml für IL-10, IL-12-25 p40 und TNF-a.

Messung des Cholineinbaus ------Zur Messung des -Cholineinbaus wurden die Zellen (1-106) 10, 30 od_ejr_60 Minuten lang be[ 30 37°C in 1 ml RPMI-1640-Medium/10% FCS unter Zusatz von 0,5 pCi 1*C-Cholinchlorid (Ämers- ham) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Proben aufgeteilt und 1/10 davon zum Zwecke der Normalisierung einer Proteingehaltsbestimmung durch den Bradford-Assay (Pierce) unterworfen. Die restlichen 90% der Proben wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 500 pl PBS resuspendiert. Nach Zugabe 35 von 5 ml Szintillationscocktail wurde die in den Proben enthaltene Radioaktivität mit einem ß-Zähler bestimmt (Zähldauer 2 Min.).

Ergebnisse und Diskussion 40 Zelluläre Reaktivität der CDw92-mAks

Die Primärreaktionen der CDw92-mAks VIM15 und VIM15b mit Zellen wurden bereits an anderer Stelle beschrieben (1). Allerdings wurden dabei keine detaillierten Bindungsanalysen an einzelnen Untergruppen von Lymphozyten durchgeführt. Daher wurde die Verteilung von 45 CDw92 auf Leukozytenuntergruppen im humanen peripheren Blut mit Hilfe einer Doppelfär-bungs-lmmunfluoreszenzanalyse und spezifischen Markern für einzelne Leukozytenuntergruppen untersucht.

In der Fig. 1 ist ein Expressionsmuster des CDw92-Moleküls auf Leukozyten aus menschlichem so peripheren Blut dargestellt. Zur Doppelanfärbung von Vollblutproben wurde der PE-markierte CDw92-mAk VIM15 in Kombination mit FITC-markierten mAks gegen Marker für bestimmte Leukozytenuntergruppen verwendet (CD15 - Granulozyten, CDM - Monozyten, CD19 -B-Zellen, CD16 - NK-Zellen, CD4/CD8 - Untergruppen von T-Zellen). Lymphozyten wurden durch ihre Seiten- und Vorwärtsstreuungseigenschaften aussortiert. Die Immunfluoreszenz 55 wurde mit einem FACScan Durchflusszytometer beurteilt. Die Daten geben die Ergebnisse von 7

AT 413 701 B drei separaten Experimenten wieder.

Wie Fig. 1 zu entnehmen ist, war die stärkste Expression von CDw92 auf CD14-positiven Monozyten festzustellen. Eine weniger intensive Anfärbung war bei CD15-positiven Granulozyten 5 zu verzeichnen. Zur Untersuchung der Verteilung von VIM15 bei verschiedenen PBL-Untergruppen wurde VIM-15-PE in Kombination mit FITC-markierten Markern für B-Zellen (CD19), NK-Zellen (CD16) und Untergruppen von T-Zellen (CD4 und CD8) verwendet und in allen Einzelexperimenten ein Gating entsprechend den Seiten- und Vorwärtsstreuungseigenschaften der verschiedenen PBLs vorgenommen. Nahezu alle B-Lymphozyten (97%±2%) er-io wiesen sich als VIM15-positiv. Bei den T-Lymphozyten konnte eine VIM15-positive und eine VIM15-negative Population unterschieden werden: 80% der CD4-positiven Zellen und 60%±9% der CD8-positiven T-Lymphozyten erwiesen sich auch als VIM15 positiv. Nur bei einem kleinen Anteil (23%±9%) der CD16-positiven Zellen war ein schwaches Signal festzustellen. 15 Der mAk VIM15 reagierte außerdem mit mehreren myeloischen und lymphoiden Zelllinien, u.a. den myeloischen Zelllinien HL-60, KG1a, U937, THP-1, RC2a, MV4-11, MonoMacI, Mono-Mac6, den B-Zelllinien Daudi und Nalm-6, der Myelomzelllinie U266 und den T-Zelllinien HUT-78 und Jurkat. Das Reaktionsmuster des zweiten mAks VIM15b war dem des mAks VIM15 zwar ähnlich, aber im allgemeinen mit geringerer Intensität. Bei Erythrozyten zeigte weder VIM15 20 noch VIM15b eine Reaktion (Daten nicht dargestellt).

Isolierung der CDw92-cDNA

Zur Untersuchung von Struktur und Funktion des CDw92-Moleküls wurde die cDNA von CDw92 25 mit Hilfe eines Retroviren-Klonierungssystems, das kurz zuvor im Labor etabliert worden war, isoliert. Dieses System basiert auf dem Retrovirenvektor pBabeMN-lacZ und der Virenverpackungszelllinie Phoenix, beides Entwicklungen von G. Nolan und Mitarbeitern von der Universität Stanford. Es wurde eine cDNA-Library von der myeloischen Zellen Zelllinie K(^1a hejgesteljt,_ weil KG 1 a das CDw92-Molekül stark exprimierte. Die Library wurdennl/irusproduzierende 30 ' Phoenix-Zellen transfiziert und die erhaltenen Überstände (welche Virionen enthalten, die die Library repräsentieren) zur Infektion verschiedener Mauzzielzelllinien verwendet.

Transduzierte Zellen, die den CDw92-mAk VIM15 zu binden vermochten, wurden anschließend mit Hilfe der MACS Magnetkügelchentechnik sortiert. Nach vier Zyklen MACS-Sortierung zeig-35 ten 60-90% der Zellen (abhängig von der im einzelnen verwendeten Mauszelllinie) eine positive Reaktion mit dem mAk VIM15.

Die mit Hilfe der MACS-Sortierung erhaltene Zellpopulation wurde einer limitierenden Verdünnung unterzogen, um einen einzelnen Zellklon zu isolieren, der eine intensive Anfärbung mit 40 den CDw92-mAks aufwies. Dieser Zellklon wurde expandiert, die RNA isoliert und das CDw92-cDNA-lnsert mit der RT-PCR-Technik unter Einsatz flankierender Primer komplementär zur multiplen Klonierungsstelle des Retrovirenvektor amplifiziert.

Fig. 2 bezieht sich auf die RT-PCR-Amplifikation der CDw92-cDNA. Die mit CDw92 transduzier-45 ten Mauszellen sowie nicht-transduzierte Mauszellen (negative Kontrolle) wurden einer RT-PCR mit flankierenden Primern für die multiple Klonierungsstelle des Vektor pBabeMN-lacZ unterzogen. Das bei den transduzierten Zellen spezifisch amplifizierte Fragment mit einer Größe von 3 kb sowie die Größenmarker sind in der Abbildung hervorgehoben. so Wie Fig. 3 zu entnehmen ist, führte die Amplifikation zu einem Fragment mit einer Größe von 3 kb. Um herauszufinden, ob es sich bei diesem Fragment tatsächlich um die CDw92-cDNA handelte, wurde es erneut in den Vektor pBabeMN-lacZ kloniert. Anschließend wurden Phoenix-Zellen mit dem so erhaltenen Plasmid transfiziert, um auf diese Weise Retrovirenenthaltende Überstände für die Transduktion der Mauszelllinie BW5147 zu erhalten. Die Reak-55 tionsfähigkeit der CDw92-mAks VIM15 und VIM15b mit der geklonten Zelllinie wurde mit Hilfe 8

AT 413 701 B der Immunfluoreszenzanfärbung und Durchflusszytometrieanalyse untersucht. Es wurde eine intensive Anfärbung mit beiden mAks bei den transduzierten Zellen, aber nicht bei den nicht-transduzierten BW5147-Mauszellen als negative Kontrolle beobachtet (Fig. 3). 5 In Fig. 3 wird Bezug genommen auf die FACS™-Analyse der CDw92A6-transduzierten Zellen, die bei der stabilen Transduktion von Mauszellen der Zelllinie BW5147 mit der Retroviruskonstruktion CDw92A6 entstanden sind und anschließend mittels indirekter Immunfluoreszenzanalyse und Durchflusszytometrie unter Verwendung der CDw92-mAks VIM15 und VIM15b (dunkle Bereiche) oder eines Kontroll-mAks vom gleichem Isotyp (offene Bereiche) analysiert wurden, io Als weitere Kontrolle wurden auch nicht-transduzierte BW5147-Zellen einer Anfärbung unterzogen.

Die dabei festgestellte spezifische Bindung beider CDw92-mAks an die transduzierten Zellen ist ein Beleg, dass das erhaltene Plasmid CDw92A6 die CDw92-cDNA als Insert (eingefügtes 15 Stück) enthält.

Analyse des nativen und des rekombinanten CDw92-Moleküls mittels Immunpräzipitation

Als weiteren Beweis, dass das Plasmid CDw92A6 den Kode für das Protein CDw92 enthält, 20 wurde das von CDw92A6 kodierte rekombinante Protein mittels SDS-PAGE mit dem nativen, auf KG1a-Zellen exprimierten CDw92 Protein verglichen. Zu diesem Zweck wurden Lysate von CDw92A6-transduzierten und nicht-transduzierten BW5147-Mauszellen und von der myeloischen Humanzelllinie KG1a einer Immunpräzipitation mit dem CDw92-mAk VIM15b unterzogen. Die Präzipitate wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE aufgetrennt. 25 Die aus den Lysaten der CDw92A6-transduzierten BW5147-Zellen mit dem mAk VIM15b erhaltenen Immunpräzipitate enthielten eine Polypeptidbande mit einer Größe von 70 kDa, deren Gelwanderungseigenschaften dem nativen CDw92 Protein aus den myeloischen KG1a-Zellen entsprachen. Diese 70 kDa-Bande war in den Lysaten der nicht-transduzierten BW5147-Zellen und in den Immunpräzipitaten des Kontroll-mAks nicht nachzuweisen (Fig. 4). Dieses Experi-30 ment bestätigt demnactrdie Klonierung-der-cDNA~für-das Protein-CDw92,-FigT-4-stellt-eine-Immunpräzipitationsanalyse der nativen und der rekombinanten Form des Proteins CDw92 dar. Zelllysate von BW5147-Mauszellen nach Oberflächenbiotinylierung und vorheriger Infektion mit der Retroviruskonstruktion CDw92A6 sowie Zelllysate aus myeloischen KG1a-Zellen und nicht-transduzierten BW5147-Zellen wurden einer Immunpräzipitation mit dem CDw92-mAk VIM15b 35 und einem Kontroll-mAk unterzogen. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE (10% Gel) unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Angaben zu den Größenmarkern sind in kDa gehalten.

Analyse der Nukleotid- und der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz von CDw92 40

Die Sequenzierung des cDNA-lnserts des Plasmids CDw92A6 ergab eine Länge von 2679 Basispaaren mit einem offenen Leseraster (ORF) von 1959 Basispaaren mit dem Kode für 652 Aminosäurereste. Diese Sequenz wurde in der Nukleotidsequenzdatenbank EMBL/GenBank hinterlegt (Zugriffsnummer: AJ272365). Das vorhergesagte Molekulargewicht der Polypeptidket-45 te von CDw92 beläuft sich auf 72,98 kDa. Ein Vergleich dieses Rechenergebnisses mit dem Molekulargewicht des nativen CDw92-Moleküls in SDS-PAGE (70 kDa) zeigt, dass CDw92 nur geringfügig oder gar nicht an einer der drei potenziellen N-Glykosylierungsstellen glykosyliert ist (Fig. 5). Die Nukleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz von CDw92 sind in Fig. 5 dargestellt. Die Nummerierung der Nukleotidpositionen ist auf der linken Seite angege-50 ben, die Angaben zu den Aminosäurepositionen auf der rechten. Vom TopPred Il-Programm als sicher eingestufte TMD-Vorhersagen sind schwarz schattiert dargestellt (TMDs 1-6, TMDs 11-12), während mutmaßliche TMDs grau dargestellt sind (TMDs 7-10). Die 3 potenziellen N-Glykosylierungsstellen sowie das mutmaßliche ITIM sind ebenfalls grau schattiert dargestellt. 55 Bei der Hydropathie- und Topografieanalyse der Proteinsequenz von CDw92 kamen mehrere 9

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Vorhersagealgorithmen zum Einsatz. Bei Anwendung der KD-Skala sagte das Programm TopPred II (5) acht sichere TMDs mit Hydrophobizitätswerten über 1,5 (TMDs 1-6, TMDs 11-12) und vier mutmaßliche TMDs mit Hydrophobizitätswerten zwischen 1,1 und 1,5 vorher (TMDs 7-10, Fig. 5 und Tabelle I). 5

Tabelle I: Eigenschaften der potenziellen TMDs des Proteins CDw92 10 15 20 25 TMD-Nr. WAHRSCHEINLICHKEIT AMINOSÄUREPOSITION von - bis HYDROPHOBIZITÄT 1 sicher 29-49 2,5052 2 sicher 213-233 2,8083 3 sicher 239-259 2,2010 4 sicher 290-310 2,5479 5 sicher 314-334 1,6156 6 sicher 341-361 2,1667 7 mutmaßlich 385-405 1,4583 8 mutmaßlich 445-465 1,4187 9 mutmaßlich 473-493 1,3854 10 mutmaßlich 516-536 1,1719 11 sicher 540-560 1,8781 12 sicher 567-587 2,7865

Auf der Grundlage dieser Vorhersage sind 16 verschiedene Membrantopologien möglich, die entweder alle vier (Struktur 1) oder einige (Strukturen 2-15) oder keine (Struktur^ 16) dermut- -------maßlichen-TMDs-enthalten-(Fig. 6)rDer Figr6 sind die Topolögievorhersagen für das Protein 30 CDw92 in schematischer Darstellung zu entnehmen. Bei der Konstruktion des Modells wurden sämtliche als sicher eingestufte TMDs berücksichtigt (TMDs 1-6, 11-12; schwarze Zylinder); die vier vom Programm TopPred II als mutmaßlich eingestufte TMDs (TMDs 7-10, graue Zylinder) wurden jeweils entweder berücksichtigt oder nicht berücksichtigt. Die Looplänge (LL) sowie die Anzahl an Lysin- (K) und Arginin (R)-Resten in den Aminosäureregionen auf beiden Seiten der 35 TMDs sowie die Positionen der potenziellen N-Glykosylierungsstellen und des mutmaßlichen ITIM-Motivs sind angegeben. Die Struktur 11 mit dem größten Ladungsunterschied durch KR-Reste in den Zytosol- gegenüber den exoplasmatischen Segmenten {KR Diff - 20) ist umrandet dargestellt. 40 Unter Anwendung der Regel „positive Ladungen auf der Innenseite der Zelle“, d.h. der Beobachtung, dass positiv geladene AA-Reste in Zytoplasmaabschnitten eines Proteins mit größerer Häufigkeit auftreten (11-13), besitzt die Struktur 11 der Vorhersage zufolge die beste Topologie, da diese Struktur den größten Unterschied von Lysin- (K) und Arginin (R)-Resten in zytoplasmatischen gegenüber exoplasmatischen Abschnitten aufweist {KR Diff. = 20). Struktur 11 45 enthält zehn TMDs (TMDs 1-7, 9, 11, 12) und sowohl der N- als auch der C-Terminus befinden sich im Zytoplasma (Fig. 6). Bei Anwendung des Programms PHDTopography als zweitem Strukturvorhersagealgorithmus wurde eine ähnliche Topologie mit zehn TMDs ermittelt. Bei diesem Modell befinden sich die TMDs 1-4, 6-8 und 11-12 sowie ein zusätzlicher Abschnitt zwischen den Aminosäureresten 178 und 195 in der Membran. Der KR D/77-Wert für diese so Struktur beläuft sich jedoch nur auf 12 (Daten nicht dargestellt). Beide Algorithmen sagen eine zytosolische Position für den N- und den C-Terminus vorher. Dies ist von besonderem Interesse, da das C-terminale Segment in den Positionen 587 bis 593 die Aminosäuresequenz SIY-EMV enthält, die der Konsenssequenz V/l/xYxxL/V des „immunoreceptor tyrosine-based inhibi-tory“ (ITIM)-Motivs sehr ähnlich ist. 55 10

AT 413 701 B ITIMs spielen nachweislich eine Schlüsselrolle bei der Downregulation von Kinase-vermittelten Immunrezeptorsignalen (Beispiel: Antigenrezeptoren der T- und B-Zellen) durch Rekrutierung von Phosphatasen mit SH2-Domänen (ein Überblick ist den Literaturstellen 14-16 zu entnehmen). ITIM-ähnliche Sequenzen mit einem Serin anstatt V/l zwei AA-Positionen vor dem Tyro-5 sin, wie in der Sequenz von CDw92, sind in mehreren Rezeptoren und Signalübertragungsmo-lekülen, u.a. α-Kette des IL-9-Rezeptors oder in MAFA (Mast Cell Function Associated Antigen) der Maus anzutreffen. Gelegentlich sind auch Serinreste an der kritischen Position drei AA nach dem Tyrosinrest anzutreffen (z.B. in SLAM, α-Kette des IL-6-Rezeptors). Daher hat Sinclair eine Neudefinition der Konsenssequenz für ITIMs wie folgt vorgeschlagen: V/l/L/SxYxxL/V/l/S. Un-io terstützung erhält dieser Vorschlag durch neue Erkenntnisse, denen zu Folge an Tyrosin phosphorylierte Peptide mit der mutmaßlichen MAFA-ITIM-Sequenz SIYSTL an die Phosphatasen SHP-1, SHP-2 und SHIP zu binden vermochten. Dies deutet darauf hin, dass SIYSTL in MAFA eine Funktion als klassisches ITIM-Motif übernimmt, das zur Inhibition der IgE-vermittelten Degranulation von Mastzellen durch MAFA beitragen könnte. 15

Aus diesem Grund wurde die Hypothese aufgestellt, die in CDw92 enthaltene Aminosäuresequenz SIYEMV könne möglicherweise CDw92 in ITIM-vermittelte Signalübermittlungskaskaden einbinden. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde CDw92 in CPII-Mausmastzellen, die mit einem TNF-a-Reportergen stabil transfiziert waren, exprimiert und anschließend analysiert, ob 20 die Inkubation mit dem mAk VIM15 oder VIM15b die IgE-vermittelte Aktivierung dieses Gens in den genannten Zellen hemmte. Die Anwendung der mAks führte weder nach Vernetzung (mit gegen Maus-Ig gerichteten F(ab')2-Fragmenten vom Kaninchen) noch in der monomeren Form zu einer signifikanten Inhibition der FccRI-abhängigen Transkriptionsinduktion von TNF-α im Vergleich zu einem Kontroll-mAk mit dem selben Isotyp. Außerdem waren auch keine Unter-25 schiede zwischen CDw92-transfizierten CPII-Mastzellen und der zugehörigen Elternzelllinie zu erkennen. Um ausschließen zu können, dass diese Zelllinie vielleicht gar keine über ITIM verlaufende Signalkaskade zur negativen Regulation enthält, wurden die Auswirkungen einer Vernetzung von FcsRI mit dem endogenen, ITIM-enthaltenden FcyRII untersucht. Unter den-genannten experimentellen _Bedingungemwar dieTranskriptiön"\7önTNF-a um 50% reduziert 30—(Daten nichT dargestellt). Interessant ist in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass CDw92 ein Kopräzipitat mit bestimmten Proteinkinasen zu bilden vermochte, die für die Phosphorylierung von ITIM-Motiven benötigt werden. Demzufolge ist zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht schlüssig geklärt, ob dieser ITIM-ähnlichen Sequenz eine Rolle bei der Funktion von CDw92 zukommt. 35

Vergleich der Aminosäuresequenz von CDw92

Beim Vergleich der Aminosäuresequenz von CDw92 mit Hilfe des BLAST-Programmes des National Center for Biotechnology Information ergab sich eine 99,1% Identität mit dem huma-40 nen Cholintransporter-ähnlichen Molekül 1 (hCTL1). An Unterschieden zur Proteinsequenz von hCTL1 wurden festgestellt: Cys-69 statt Arg, Val-79 statt Ile, Ala-644 statt Ser, Ile651 statt Leu und der C-Terminus von hCTL1 enthält zwei zusätzliche Aminosäuren (Lys-653 und Arg-654)(Fig. 7). Fig. 7 stellt die Aminosäuresequenzen von CDw92 und hCTL1 gegenüber. Die identischen Stellen sind mit Punkten, Abweichungen durch Kästchen dargestellt. Die Numme-45 rierung der AA-Positionen ist auf der rechten Seite angegeben.

Bei hCTL1 handelt es sich um das humane Ortholog von CTL1, ein Gen, welches von O'Regan et al. aus einer Expressionslibrary der elektrischen Lappen von Torpedo marmorata durch funktionelle Komplementierung einer Cholintransporter-defizienten Hefe geklont wurde. Beim so Menschen sind mit hCTL2 und hCTL4 zwei weitere CTL1-Homologe entdeckt worden. Bei anderen Arten wurden weitere orthologe und homologe Gene identifiziert, u.a. bei Caenorhabdi-tis elegans, Drosophila, Ratte, Maus und Hefe (22). Auch O'Regan und Mitarbeiter haben für hCTL1 ein Strukturmodell mit 10 membranüberspannenden Domänen (TMDs) vorgeschlagen. Den Vorhersagen dieser Verfasser zufolge dienen die TMDs 1-4, 6-8 und 10-12 zur Verankerung in der Membran, doch weist dieses Modell im Gegensatz zu vorliegendem Vorschlag 55 1 1

AT 413 701 B (Fig. 6) lediglich einen KR D/'/f-Wert von 16 auf. Beide Modellvorschläge gehen vom Vorhandensein von zehn membranüberspannenden Segmenten in hCTL1/CDw92 aus. Für mehrere andere Transporter werden ebenfalls Modelle mit zehn Transmembranhelices diskutiert, z.B. für den Bicarbonattransporter (PFAM-Datenbank: http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/Pfam/getacc? 5 PF00955), der den Hauptregulator für den pH-Wert in Tierzellen darstellt, sowie für die Sympor- ter für Natrium und gelöste Stoffe (PFAM-Datenbank: http://www.sanger.ac.uk/cgir bin/Pfam/getacc?PF00474), welche die an eine gleichzeitige Aufnahme von Natrium gekoppelte Aufnahme eines breiten Spektrums von Molekülen vermittelten, und für den Glukose-6-Phosphattransporter. Demzufolge stellen die Struktureigenschaften von hCTL1/CDw92 in Ver-io bindung mit der Aufnahme von Cholin durch eine Hefemutante nach Expression von Torpedo marmorata-CTL1 einen Hinweis für eine Transporterfunktion von hCTL1/CDw92, insbesondere für Cholin, in Humanzellen dar.

Zur Analyse dieser möglichen Funktion von CDw92 als Cholintransporter wurde in einem ersten 15 Experiment die Aufnahme von 14C-Cholinchlorid durch CDw92-transduzierte Zellen im Vergleich zu den nicht-transduzierten Elternzellen untersucht. Dabei wurde ein reproduzierbarer Anstieg des 14C-Cholineinbaus um 10 - 15% bei der CDw92-transduzierten Mastzelllinie CPU festgestellt, aber nicht bei CDw92-transduzierten Mausthymomzellen der Linie BW5147. Festzustellen war die Steigerung der 14C-Cholinaufnahme nur nach 60 Minuten, aber zu keinem anderen 20 Zeitpunkt. Daher ist dieses Experiment eher als ein weiterer Hinweis, denn als schlüssiger Beweis, für eine Funktion von CDw92 als Cholintransporter anzusehen. Da bekannt ist, dass mehrere Cholintransporter nebeneinander existieren (22), die möglichenweise in ihrer Funktion für einander einspringen können, ist für die eindeutige Identifikation von CDw92 als Cholintransporter eine eigene Reihe sorgfältig geplanter Experimente erforderlich. 25

Vergleich der Nukleotidsequenz von CDw92

Bei einem Vergleich der Nukleotidsequenzen von CDw92 und hCTL1 ließen sich die Unterschiede der AA-Sequenzen auf die folgenden Unterschiede in den Basensequenzen-zurückfüh-30 ren: KodonJrGT-(Cys-69) statt CGT (Arg-69)7Ködön GtA (Val-79) statt ATA (lle-79) und Kodon GCC (Ala-644) statt TCC (Ser-644). Außerdem wurde eine Punktmutation ohne Änderung der AA-Sequenz im Kodon für Ala-7 (GCC statt GCT) festgestellt. Ob diese Unterschiede einen Polymorphismus darstellen oder auf Artefakte beim Klonieren zurückzuführen sind, ist nicht bekannt. Allerdings belegen die unterschiedlichen C-Termini (ATT (lle-651) und AAG (Lys-652) 35 bei CDw92 bzw. CTG (Leu-651), AAG (Lys-652), AAA (Lys-653), AGG (Arg-654) bei hCTL1) und die völlig unterschiedlichen Sequenzen auf der nicht-kodierenden 3’-Seite (3-untranslated region), dass CDw92 und hCTL1 trotz der weitgehenden Sequenzhomologie nicht identisch sind (Fig. 8). Die Gegenüberstellung der 5'- und 3'-Enden der cDNA-Klone von CDw92 und hCTL1 ist in Fig. 8 dargestellt. Identische Positionen sind durch Punkte angegeben. Die Num-40 merierung der Nukleotidpositionen ist auf der rechten Seite angegeben.

Ab Met-650 sind beide Sequenzen völlig ident mit Sequenzen in dem Genomklon RP11-287A8 (Zugriffsnummer: AL161627, Version Gl:10443402). Dieser Klon wurde aus dem Chromosom 9 hergestellt und von der Arbeitsgruppe „Sänger Centre Chromosome 9 Mapping Group“ sequen-45 ziert (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Chr9). Während der 3'-Abschnitt der CDw92-cDNA hinter Met-650 den Basenpaaren 8010 bis 8528 des Klons RP11-287A8 entspricht, befindet sich das 3’-Segment von hCTL1 48000 Basispaaren weiter zwischen den Basenpaaren 56387 und 56610 (Fig. 9). Die Fig. 9 zeigt in diagrammatischer Darstellung die Gegenüberstellung der cDNA-Klone von CDw92 und hCTL1 und ihren Bezug zum Genomklon RP11-287A8. Die 50 Nummerierung der Nukleotidpositionen ist angegeben.

Auf beiden Seiten der 3-Segmente befinden sich sogenannte „Splice Site Consensus Sequen-ces“. Daraus folgt, dass sowohl der extreme C-Terminus als auch die nicht-kodierenden 3'-Regionen von eigenen Exons kodiert werden und die cDNA-Klone von CDw92 und hCTL1 55 Spleißvarianten darstellen. Zur Suche nach möglichen weiteren 3'-Exons wurde zum einen der 12

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Sequenzabschnitt zwischen dem letzten gemeinsamen Exon von hCTL1/CDw92 und dem 3'-Exon von CDw92 (Basispaare 3609-8009 des Genomklons RP11-287A8, Fig. 9) und zum anderen der 48000 Basispaare lange Zwischenabschnitt zwischen den 3’-Exons von CDw92 und hCTL1 (Basispaare 8529-56386 des Genomklons RP11-287A8, Fig. 9) mit den EST (Ex-5 pressed Sequence Tag)-Einträgen in den Sequenzdatenbanken verglichen. Dabei wurden verschiedene ESTs entdeckt, die in diesen Sequenzbereichen einen Match ergeben.

Im Prinzip ist dieser Cluster von ESTs auf der folgenden Seite des Human Genome Server Ensemble zu sehen: <http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?chr=9&vc_start= io I07335209&vc_end=107435209&x=46&y=7>. Dieser Befund spricht für das tatsächliche Vorhandensein weiterer Spleißvarianten mit unterschiedlichen C-Termini und nicht-kodierenden 3'-Regionen. Vier unterschiedliche, aber überlappende EST-Klone (Zugriffsnummer: AV71362, AU 133344, BE787530 und AW408761) definieren eindeutig eine dritte Variante mit dem C-Terminus Ala-Ser-Gly-Ala-Ser-Ser-Ala-COOH. Interessanterweise wurde festgestellt, dass 15 Serinreste zwei Positionen vor dem C-Terminus (Position -2), wie in dieser Variante vorhanden, bei C-terminalen Peptidmotiven, die von PDZ-Domänen erkannt werden, eine kritische Rolle spielen. Zwei C-terminale Varianten wurden kürzlich auch für den Natrium: Bicarbonat-Cotransporter NBC4 nachgewiesen, bei dem es sich ebenfalls um ein Membranprotein mit mehreren TMDs handelt. Eine dieser Varianten enthält im äußersten C-Terminus ebenfalls eine 20 Konsensdomäne für die Wechselwirkung mit PDZ und dieses Sequenzmotiv scheint für die Einbindung von Proteinen in Signalübermittlungskaskaden ausschlaggebend zu sein. Für verschiedene Proteine wurde nachgewiesen, dass die nicht-kodierenden 3'-Regionen eine Bedeutung für die Stabilität der mRNA und die Regulation der Translation besitzen (27-32). Dass hCTL1/CDw92 mindestens drei separate Exons zur Transkription des C-Terminus und der 25 nicht-kodierenden 3'-Region verwenden, spricht dafür, dass die alternative Anwendung dieser Sequenzen eine kritische Kontrollfunktion für die Expression und Funktion des CDw92/hCTL1 Proteins darstellt.

Eine weitere Kontrollstelle für die Expression von CDw92/hCTL1 könnte innerhalb der nicht---30 kodierenden 5'-Region (5'-untranslated region) liegenfWie Fig. 6 zu entnehmen ist, weisen die hCTL1- und CDw92-Klone auch in diesem Bereich beträchtliche Sequenzunterschiede auf. Möglicherweise ist dies darauf zurückzuführen, dass es sich bei 175 der 209 Basen im nicht-kodierenden 5'-Segment des hier offengelegten CDw92-Klons um G oder C handelt. Dieser hohe G+C-Gehalt (83%) bereitete beträchtliche Schwierigkeiten bei der Sequenzierung dieser 35 Region, möglicherweise wegen der Bildung von stabilen Sekundärstrukturen. G+C-reiche Abschnitte sind bekannt für die Bildung solcher Strukturen (33), sodass an diesen stabilen Sekundärstrukturen die DNA-Polymerase und die reverse Transkriptase zum Anhalten gezwungen werden. Die ermittelte Sequenz für die nicht-kodierende 5'-Region ist jedoch zu 100% identisch mit dem Abschnitt zwischen Basispaaren 133821 und 134030 des Genomklons RP11-5K7 40 (Zugriffsnummer: AC016666, Version AC016666.2, Gl: 7230031). Demzufolge handelt es sich bei den Abweichungen im 5-Ende von hCTL1 gegenüber dem CDw92-Klon um Klonierungsartefakte. Im Genomklon RP11-5K7 folgen auf die nicht-kodierende 5-Region die ersten 36 Reste des offenen Leserasters von hCTL1/CDw92. Da dieser Sequenzabschnitt von 245 Basispaaren an einer Splice Junction Consensus Sequence endet, gehört diese Sequenz zum Exon 1 von 45 hCTL1/CDw92. Bisher war es jedoch noch nicht möglich zu klären, ob es sich dabei um das gesamte Exon 1 oder nur um einen Teil desselben handelt. Denn trotz der Länge von 245 Basenpaaren ist es aufgrund der problematischen 5'-Sequenz unklar, ob der hier vorgestellte CDw92-Klon das gesamte nicht-kodierende 5-Ende des hCTL1/CDw92-Transkripts enthält. Neben Exon 1 und den drei im Genomklon RP11-287A8 identifizierten Exons (Fig. 9) wurden so bei einer Prüfung der Humangenomsequenz mit dem Map Viewer auf der Homepage des National Center for Biotechnology Information weitere zwölf Exons für hCTL1/CDw92 identifiziert. Demzufolge bestehen die cDNAs von hCTL1 und CDw92 aus jeweils 16 Exons.

Das Auftreten von komplexen und äußerst stabilen Sekundärstrukturen in den nicht-55 kodierenden 5-Regionen zwingt nicht nur Klonierenzyme zum Anhalten, sondern auch die 13

AT 413 701 B 43S-Untereinheit des Ribosoms bei der Suche nach dem Startkordon AUG. Daher müssen Proteine, deren 5'-Regionen solche Sekundärstrukturen ausbilden, auf andere Mechanismen zur Initiation der Translation zurückgreifen als über die Suche durch Ribosom- oder Capabhängige Mechanismen, die von dem Proteinkomplex elF-4F eingeleitet werden, der die Bin-5 düng der 43S-Ribosomenuntereinheit an die mRNA ermöglicht. Einer dieser Alternativmechanismen zur Umgehung der hinderlichen RNA-Sekundärstrukturen in der 5'-Region ist der sogenannte interne Ribosomenzutritt. Kürzlich wurde berichtet, dass dieses Wechselspiel zwischen RNA-Sekundärstrukturen und internem Ribosomenzutritt die Translation von Schlüsselproteinen der Zelle garantiert, und zwar selbst unter Bedingungen, bei denen die allgemeine Proteinsyn-io these der Zelle und die Bildung des elF-4F-Komplexes gefährdet sind. Wachstumssperre, Hitzeschock, Stress, Apoptose, Hypoxie und Virusinfektion sind nur einige Beispiele für unwirtliche Bedingungen, die zur Einschränkung der Aktivität des elF-4F-Komplexes führen. Durch internen Ribosomenzutritt konnte c-Myc unter Apoptosebedingungen und der angiogene Wachstumsfaktor VEGF unter Hypoxiebedingungen effizient translatiert werden. Da ein solcher 15 interner Ribosomenzutritt auch bei c-Jun für die Translation verantwortlich gemacht wurde und c-Jun eine ähnliche GC-reiche Sequenz wie hCTL1/CDw92 aufweist, ist man geneigt zu spekulieren, dass dieser Mechanismus auch zur Regulation der Expression von hCTL1/CDw92 beiträgt. Angesichts der mutmaßlichen Rolle von hCTL1/CDw92 beim Cholintransport für die Phospholipid- und/oder Acetylcholinsynthese ist es durchaus vorstellbar, dass eine effiziente 20 Translation von hCTL1/CDw92 auch unter ungünstigen Bedingungen für die Zelle gewährleistet sein muss.

Analyse der Expression von CDw92 bei der Zellaktivierung/Zelldifferenzierung 25 Da das 5'- und das 3'-Ende der hCTL1/CDw92-mRNA darauf schließen lassen, dass die Expression von hCTL1/CDw92 einer komplexen Regulation unterliegt, war sehr großes Interesse gegeben, die Regulation von CDw92 bei bzw. nach Zellaktivierung/Zelldifferenzierung zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde zuerst die Bindung von CDw92-mAks an unterschiedlich aktivierte PBLs im Vergleich zu unbehandelten Zellen untersucht.BeLdeLStimulie- 30____rung mit-PHA-oder lonomycin-ergaben sich keine Hinweise für eine unterschiedliche Expression von CDw92. Bei der Analyse von TNF-a-behandelten HUVECs und dHMVECs zeigten sich auch bei diesen Zellen im Einklang mit einem früheren Bericht keine Änderung der CDw92-Anfärbungsmuster nach der Stimulation (Fig. 10). 35 Fig. 10 bezieht sich auf die Expression von CDw92 auf unterschiedlich aktivierten humanen PBLs und Endothelzellen. Die PBLs wurden 2 Tage mit oder ohne PHA oder lonomycin in Kultur gehalten; unter denselben Bedingungen wurden HUVECs und dHMVECs mit TNF-a behandelt. Die Beurteilung der Expression von CDw92 erfolgte mittels indirekter Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie unter Verwendung des mAks VIM15 (dunkle Bereiche). Der mAk 40 VIAP diente als Kontrolle (offene Bereiche). Die dargestellten Daten geben die Ergebnisse von drei separaten Experimenten wieder.

Auch bei Granulozyten war in Gegenwart von PMA keine Änderung der Oberflächenexpression von CDw92 festzustellen. Dasselbe galt für die Differenzierung von Monozyten zu Mo-DC durch 45 GM-CSF plus IL-4. Und schließlich wurde die Expression von CDw92 auf unterschiedlich aktivierten Monozyten und Mo-DCs aus dem peripheren Blut untersucht. Beide Zelltypen wurden 1 Tag in Gegenwart von LPS, LPS/TNF-α, IFN-a, IFN-γ, Calciumionophor oder lonomycin in Kultur gehalten. Dabei war auf der Oberfläche der Monozyten keine geänderte Expression von CDw92 durch die stimulierenden Substanzen festzustellen (Daten nicht dargestellt). Auch Mo-50 DCs zeigten keine geänderte Expression von CDw92 nach der Stimulation mit LPS, LPS/TNF-a, IL-10, IFN-γ oder IFN-a (Fig. 11 bzw. Daten nicht dargestellt). Im Unterschied zu diesen Ergebnissen war bei der Behandlung (1 Tag) von Mo-DCs mit lonomycin oder Calciumionophor eine Downregulation der Expression von CDw92 festzustellen. Interessanterweise wurde CDw92 wieder jedoch re-induziert, wenn die lonomycin- oder Calciumionophor-behandelten 55 Mo-DCs mit IL-10 behandelt wurden (Fig. 11). Fig. 11 stellt die Expression von CDw92 auf 14

AT 413 701 B unterschiedlich aktivierten humanen Mo-DCs dar. Die Mo-DCs wurden 1 Tag in Anwesenheit der angegebenen stimulierenden Substanzen in Kultur gehalten. Zur Analyse der Reinduktion der CDw92-Expression nach der Downregulation durch lonomycin wurden die Zellen 1 Tag entweder nur in Medium oder in Gegenwart von IL-10 kultiviert (lonomycin —► IL-10). Die Beur-5 teilung der Expression von CDw92 erfolgte mittels indirekter Immunfluoreszenz und Durchfluss-zytometrie unter Verwendung des mAks VIM15 (dunkle Bereiche). Der mAk VIAP diente als Kontrolle (offene Bereiche). Die dargestellten Daten geben die Ergebnisse von vier separaten Experimenten wieder. io CD83 und CD86 sind allgemein anerkannte Marker für einen reifen Phänotyp von stark immunstimulierend wirkenden DCs. Sowohl CD83 als auch CD86 waren auf Mo-DCs infolge der lonomycin- oder LPS-Behandlung stark hochreguliert (Fig. 11). Allerdings bewirkte nur das Ca2+-freisetzende Mittel eine Herunterregulierung von CDw92 und Neuexpression nach Einwirkung von IL-10. Dies ist als Hinweis zu werten, dass lonomycin und LPS unterschiedliche Reifungs-15 Stadien in DCs induzieren.

Modulation der Funktion von DCs durch CDw92-mAks

Gestützt auf die selektive Regulation von CDw92 auf Mo-DCs wurde von einer besonderen 20 Funktion des CDw92-Moleküls bei diesen Zellen ausgegangen. Um das zu studieren wurden die CDw92-mAks als Ersatzliganden verwendet und ihr Einfluss auf die Funktion von Mo-DCs analysiert. Der interessanteste Befund dieser Experimente war eine 2,8-fache Steigerung der LPS-induzierten IL-10 Produktion von Mo-DCs (1167 ± 388 pg/ml gegenüber 411 ±41 pg/ml; n=3) durch einen vorliegender CDw92-mAks (VIM15b). Der andere CDw92-mAk zeigte dage-25 gen keine Wirkung. Der Effekt des mAks VIM15b schien spezifisch für IL-10- und LPS-vorbehandelte Mo-DCs zu sein, da keine Veränderungen bei der Produktion von TNF-α, IL-1 ß und IL-12-p40 bei diesen Zellen oder unbehandelten Mo-DCs festzustellen waren. Außerdem besaß keiner der beiden CDw92-mAk eine signifikante Wirkung auf die Produktion dieser Zytokine bei Monozyten, weder mit bzw. ohne Vorbehandlung mit LPS, IFN-γ oder LPS plus IFN-y 30 (Fig7T2 bzwrDaten nicht dargestellt). Figr12 zeigt~die'Modulation derZytokinproduktionhuma-ner MoDCs durch die CDw92-mAk. Die Mo-DCs wurden mit oder ohne LPS in An- oder Abwesenheit der angegebenen mAks in Kultur gehalten. Nach 48 Stunden wurden die Kulturüber-stände gesammelt und die Zytokinspiegel mittels Sandwich-ELISA-Assays gemessen. Die Assays wurden jeweils in zweifacher Ausführung durchgeführt. Die Daten entsprechen den 35 Ergebnissen von drei separaten Experimenten.

Außerdem wurden beide CDw92-mAks auf die folgenden Eigenschaften untersucht: 1) Modulation der von allogenen Mo-DCs induzierten Proliferation von T-Zellen, 2) derselbe Aspekt bei IL-10-behandelten Mo-DCs, 3) die Hemmung der CTL-Induktion durch unreife Mo-DCs, 4) 40 Einfluss auf die von GM-CSF plus IL-4 induzierte Differenzierung von Monozyten zu Mo-DCs oder 5) die LPS-induzierte Reifung von Mo-DCs, 6) Einfluss auf die Präsentation von Teta-nustoxoid oder 7) mannosyliertem Tetanustoxoid durch Mo-DCs gegenüber autologen T-Zellen. Und schließlich wurde analysiert, ob die CDw92-mAk Mo-DCs modulieren können im Hinblick auf 8) die Makropinozytose (mit Hilfe von Lucifer Yellow als Messreagenz) und 9) die Antigen-45 aufnahme über den Mannoserezeptor (mit Hilfe von mannosylierten BSA-FITC). Bei keinem der genannten Assays zeigten die CDw92-mAk eine modulierende Funktion, was als ein Beleg für die Besonderheit der Steigerung der IL-10-Produktion auf LPS-behandelten MoDCs durch den CDw92-mAk VIM15b zu werten ist. Dieser Befund und die von IL-10 bewirkte Neuinduktion des CDw92-Moleküls nach der Downregulation durch lonomycin spricht für eine Rolle von CDw92 so als Teil einer selbstregulierenden Signalschleife, die die Expression und Aufrechterhaltung der Produktion von IL-10 in DCs kontrolliert.

Aus vorliegenden Ergebnissen kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass hCTL1/CDw92 auf verschiedenen Zellen des hämatopoetischen Systems konstitutiv und relativ 55 stabil exprimiert wird, jedoch auf Mo-DCs einer Feinregulation durch immunmodulierende Sub-

Claims (3)

1 5 AT 413 701 B stanzen, lonomycin, IL-10 unterliegt, lonomycin ist bekannt als starker Aktivator der DC abhängigen Immunantwort beispielsweise durch Hochregulierung von antigenpräsentierenden und co-stimulierenden Molekülen (39 und Fig. 11), während IL-10 die Funktionen von DCs negativ reguliert (40-42). Die spezifische Regulation von CDw92 durch diese Substanzen zusammen 5 mit der ermittelten Strukturinformation, das ist das potenzielle ITIM-Motiv, sowie die beobachtete Rolle bei der Expression von IL-10 durch DCs, weisen darauf hin, dass hCTL1/CDw92 möglicherweise nicht nur als Transporter von Cholin für die Membranphospholipidsynthese von Zellen des Immunsystems fungiert, sondern auch an der spezifischen Regulation von Immunfunktionen beteiligt sein könnte, insbesondere an negativen Signalübertragungsmechanismen. 10 Patentansprüche: 1. Nukleinsäuresequenz des CDw92-Antigens mit einer Länge von 2679 Basispaaren sowie 15 die davon abgeleitete Polypeptidsequenz von 652 Aminosäuren gemäß Fig. 5 und der EMBL/GenBank-Sequemzbankidentifikationsnummer AJ272365.

2. Sequenz einer Spleißvariante der Sequenz gemäß Anspruch 1 mit dem C-Terminus Ala-Ser-Gly-Ala-Ser-Ser-Ala-COOH. 20

3. Mit der Sequenz gemäß Anspruch 1 gentechnisch transfizierte/transduzierte Zellen. Hiezu 12 Blatt Zeichnungen 25 30' 35 40 45 50 55