DE69434731T2

DE69434731T2 - Ein Gen das für ein Polypeptid kodiert welches die Fähigkeit hat Prä-B Zellwachstum zu ermöglichen

Info

Publication number: DE69434731T2
Application number: DE69434731T
Authority: DE
Inventors: Toshio Osaka-shi Hirano; Tsuneyasu Ashiya-shi Kaisho
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-05-21
Filing date: 1994-05-20
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2014-05-21
Also published as: WO1994028130A1; TW403783B; AU6658494A; EP1160253B1; ZA943348B; US6232453B1; EP0725135A1; ATE325811T1; EP0725135B1; US20020156260A1; ATE214425T1; DE69430133T2; DE69434731D1; DE69430133D1; EP1160253A1; ES2260134T3; US6307023B1; HK1041008A1; ES2170768T3; US5753464A

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine Teilanmeldung der Europäischen Patentanmeldung Nr. 94915279.7, die als EP-P-0 725 135B erteilt wurde.
Die vorgenannte Hauptanmeldung betrifft ein Gen und ein Adhäsionsmolekül, das durch dieses Gen kodiert wird, und betrifft speziell ein Gen, das ein Polypeptid kodiert, das über eine Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, einen dieses Gen enthaltenden Vektor, Transformanten, wie beispielsweise Mikroorganismen oder Zellen, die mit Hilfe dieses Vektors transformiert werden; und betrifft ein Verfahren zum Herstellen des Adhäsionsmoleküls mit einer zum Prä-B-Zellwachstum unterstützenden Fähigkeit unter Verwendung dieses Gens.
Das vorgenannte Gen kodiert ein neuartiges Adhäsionsmolekül, d.h. ein Polypeptid, welches die Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit auf der Oberfläche von Knochenmarkszellen und Synovialzellen verstärkt, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) oder multiplem Myelomen (MM) abgenommen sind. Ein homogenes und gereinigtes Polypeptid mit Prä-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit kann in Großen Mengen durch Transformieren entsprechender Wirtszellen mit einem geeigneten Vektor erzeugt werden, worin das vorgenannte Gen insertiert wird. Damit besteht gemäß der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit, multiples Myelom (MM) und rheumatoide Arthritis (RA) zu identifizieren und auch für deren klinische Diagnose Reagentien herzustellen.
Die vorliegende Anmeldung bezieht sich auf das vorgenannte Polypeptid.
Es ist veröffentlicht worden, dass Anomalitäten von Knochenmarkzellen effektiv bei der Pathogenese von B-Zellenmaliginomen und Autoimmunerkrankungen beteiligt sind (Annu, Rev. Immunol., 9:243 (1991)).
Bei dem multiplem Myelom (MM) handelt es sich um einen Tumor, der sich in Abhängigkeit von der Mikroumgebung im Knochenmark entwickelt, und ist außerdem ein monoklonaler plasmacytischer Tumor, der durch ein eingeschränktes Wachstum in dem Knochenmark gekennzeichnet ist, und es ist in zahlreichen Studien vorgeschlagen worden, dass die onkogene Transformation von multiplem Myelom (MM) im Verlaufe des Prozesses der Differenzierung und der Proliferation der anfänglichen B-Zellentwicklung (Prä-B-Zelle) auftritt, die von den stromalen Knochenmarkzellen abhängt (J. Exp. Med., 150:792 (1979), und Cancer Genet. Cytogenet, 17:13 (1985)).
Darüber hinaus ist über den Sachverhalt veröffentlicht worden, dass von Knochenmark-Stromazellen nachgewiesen worden ist, dass sie das Wachstum der Prekursorzellen von multiplem Myelom (MM) einleiten, die in der peripheren Blutbahn von Patienten mit multiplem Myelom (MM) zirkulieren (Blood, 77:2688 (1991)).
Daher ist es möglich, dass Knochenmark-Stromazellen stimulatorische Signale vermitteln, die für die Erzeugung von multiplem Myelom (MM) entscheidend sind.
In diesem Zusammenhang ist bekannt geworden, dass die anomale Erzeugung von IL-6 eine Rolle in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis (RA) spielen kann (Eur. J. Immunol., 18:1797 (1988), und Clin. Immunol. Immunophatol., 62:s60 (1992)). Davon abgesehen ist nach den Ergebnissen unter Hinzunahme mehrerer Autoimmunmodelle von Mäusen entsprechend der Veröffentlichung in Eur. J. Immunol., 20:723 (1990) und Eur. J. Immunol., 21:63 (1991) vorgeschlagen worden, dass vom Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) abgenommenes Knochenmark wahrscheinlich befallen ist.
So ist in der rheumatoiden Arthritis (RA) auch vorgeschlagen worden, dass eine polyklonale B-Zellenaktivierung wahrscheinlich durch das an befallener Arthrose angrenzende Knochenmark hervorgerufen wird.
In den EP-A-0 314 415 (Immunex Corp.) und Goodwin rg et al.: "Human interleukin 7: Molecular cloning and growth factor activity on human and murine B-lineage cells" PROC NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, USA, Januar 1989, 86 (1), P302-6, United States XP002077974 wurde eine DNA offenbart, die ein Polypeptid (Interleukin-7) kodiert, das über das Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, und es wurde ebenfalls ein Rekombinationsvektor offenbart, der diese DNA enthält, eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die mit einem solchen Vektor transformiert ist in einer Methode zur Erzeugung eines solchen Polypeptids. Es ist möglich, dass die Interleukin-7 kodierende DNA oder mindestens ein Teil dieser DNA unter speziellen Bedingungen hybridisiert werden kann, worin die Sequenz Nr.:2 ist oder mindestens mit einer DNA, die von dieser DNA-Sequenz deriviert ist.
Die WO 94 17184 A (Schering Corp.: University of Leland Stanford Junior (US); Parkhouse R. Micha) 4. August, 1994, die unter Artikel 54 (3) zitiert werden kann, beschreibt die Stimulation von B-Zellen und einschließlich Prä-B-Zellen durch kontaktieren dieser Zellen mit beispielsweise einem löslichen Fragment von CV38, kodiert durch die DNA-Sequenzen SEQ ID NO: 1. Allerdings wird in diesen Fundstellen kein Polypeptid offenbart, das eine Aminosäuresequenz enthält, wie sie in der Sequenz Nummer 1 der Sequenz-Tabelle dieser Patentanmeldung gezeigt ist oder einen Teil ihrer Aminosäuresequenz.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung waren mit umfangreichen Untersuchungen der Funktion der Mikroumgebungen des Knochenmarks in patho logischen Zuständen befasst, die Anomalitäten von B-Zellen hervorrufen, und es ist veröffentlicht worden, dass die Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit von BM-Stromazellen die von Patienten mit RA oder MM deriviert sind, im Vergleich zu denen von gesunden spenderderivierten BM-Stromazellen verstärkt ist und das die direkte Zelle-Zelle-Wechselwirkung von Prä-B-Zellen und Stromazellen eine wesentliche Rolle in dieser unterstützenden Fähigkeit spielen kann. Gleichzeitig haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Proben von Knochenmark erhalten, die von Patienten mit MM und RA mit informierter Zustimmung abgenommen wurden und haben neuartige Stromazelllinien hergestellt (RASV5-5, MMSV3-3) die ein Molekül enthalten, welches das Wachstum von Prä-B-Zellen verstärkt, und zwar auf der Grundlage der Annahme, dass es ein Oberflächenmolekül geben müßte, welches das Wachstum von Prä-B-Zellen auf den Knochenmark-Stromazellen verstärkt, die von Patienten mit RA und MM abgenommen wurden. Es ist vorgeschlagen worden, dass die Prä-B-Zellwachstum unterstützende Aktivität dieser Stromazelllinien aller Wahrscheinlichkeit nach von unbekannten Adhäsionsmolekülen hervorgerufen wird, die sich von den bekannten Stammzellfaktoren (SCF), ICAM-1, CD44, VCAM-1, LFA-1α, LFA-1β, NCAM und ELAM-1 (J. Immunol., 149:4088 (1992)) verschieden sind.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher einen monoklonalen Antikörper unter Verwendung der BM-Stromazelllinie RASV5-5 mit verstärkter Prä-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit hergestellt, die von Patienten mit RA als ein Antigen für die Immunisierung abgenommen wurde und einen monoklonalen Antikörper in RF3 ansprechend auf BM-Stromazelllinien erhalten, die von Patienten mit RA und MM abgenommen wurden, und nicht ansprechend auf Stromazelllinie NFSV1-1, die von dem menschlichen Knochenmark abgenommen wurde, das über keine Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügte. Ferner haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass ein monoklonaler Antikörper, der von dem Hybridom SG2 geliefert wurde, das von der immunisierten Zelllinie SynSV6-14 der Synovialzelle von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) erhalten wurde, auf BM-Stromazelllinie RASV5-5 anspricht, die von Patienten mit RA abgenommen wurde, und nicht anspricht auf die Stromazelllinie NFSV1-1, die von menschlichem Knochenmark abgenommen wurde, das über keine Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt.
Die vorliegende Erfindung gewährt ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, wie sie in der Sequenz-Tabelle mit der Sequenz Nr. 1 gezeigt wird und über eine Funktion der Förderung des Prä-B-Zellwachstums verfügt.
Bevorzugte Merkmale sind in den Ansprüchen 2 und 3 festgelegt.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden detailliert nachfolgend beschrieben.
Das in der vorliegenden Erfindung genutzte Gen wird beispielsweise über die Herstellung von mRNA aus einer Zelle erhalten, die ein Adhäsionsmolekül mit Human-Prä-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit exprimiert, wonach diese in eine doppelsträngige cDNA entsprechend einer bekannten Methode umgewandelt wird. Als eine Zelle, die zur Herstellung der mRNA verwendet wird, können Zelllinien RASV5-5 und SynSV6-14 genannt werden, die als Immunquellen für Hybridoma RF3 und SG2 verwendet werden, ohne das man auf diese Zelllinien beschränkt ist, sodass jeder beliebige Typ von Zellen verwendet werden kann, die das Adhäsionsmolekül exprimieren, das über eine Human-Prä-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit verfügt. Als eines der Beispiele dafür lassen sich verschiedene Stromazelllinien nennen die offenbart wurden im J. Immunol., 149:4088 (1992). Im Übrigen ist in der vorliegenden Erfindung SynSV1-4 verwendet worden.
Für die Herstellung der Gesamt-RNA um mRNA zu erhalten, kann eine Methode zum Erlangen der Gesamt-RNA eingesetzt werden, die darin besteht, dass man eine Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation nach einer Guanidinthiocyanat-Behandlung ausführt (Chirgwin et al., Biochemistry, 18:5294 (1979)), bei der es sich um eine Methode handelt, die in der Ausführung einer Oberflächenbehandlung und einer Phenol-Behandlung in Gegenwart des Ribonuclease-Inhibitors eines Vanadium-Komplexes ausführt (Berger & Birkenmeier, Biochemistry, 18:5143 (1979)), sowie mit Hilfe anderer bekannter Methoden.
Die Herstellung von mRNA aus der Gesamt-RNA kann erreicht werden, indem Poly(A)+RNA aus der Gesamt-RNA mit Hilfe beispielsweise einer Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung von Sephalose oder Cellulose oder eine Chargenmethode ausgeführt werden. Außerdem lässt sich Poly(A) +RNA mit Hilfe einer Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation reinigen. Darüber hinaus lässt sich eine Methode zur Erlangung von Poly(A)+RNA direkt ohne Herstellung von RNA oder eine bequemem Methode unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Kits nennen.
Um eine doppelsträngige cDNA aus der so erhaltenen mRNA zu erhalten, wird beispielsweise eine DNA (cDNA) komplementär zu mRNA synthetisch unter Verwendung von mRNA als ein Template dargestellt sowie unter Verwendung eines Oligo(dT)-Komplementärs zu einer Poly-A-Kette, die sich als Primer an der Stelle R' befindet, sowie Behandeln dieser mit Umkehrtranskriptase.
Die doppelsträngige cDNA lässt sich auch durch Abbau von mRNA mit Hilfe einer alkalischen Behandlung erhalten, indem die erhaltene einsträngige cDNA als Template einer Behandlung mit Umkehrtranskriptase oder DNA-Polymerase (z.B. Klenow-Fragment) unterworfen wird und anschließend mit ihrer Behandlung mit S1 Nuclease oder Behandeln direkt mit RNase und DNA-Polymerase (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) und Gubler & Hoffman, Gene, 25:263 (1983)). Gegenwärtig befinden sich einfache Kits auf dem Markt, und eine doppelsträngige cDNA kann mit deren Anwendung erhalten werden.
Die cDNA-Genbank kann erhalten werden, indem die auf diese Weise erhaltene cDNA in einen geeigneten Vektor insertiert wird, wie beispielsweise in einen Plasmid-Vektor vom EK-Typ, zum Beispiel pBR322 und pSC101, sowie einen Phagenvektor, wie beispielsweise λgt10, und anschließend Escherichia coli mit diesem Vektor transformiert werden (z.B., X1776, HB101, DH1, DH5) oder dergleichen (siehe beispielsweise das vorgenannte "Molecular Cloning").
Andererseits lassen sich Wirtszellen anderer Prokaryoten und Eukaryoten unter Verwendung eines geeigneten Expressionsvektors transformieren, worin die nach der vorgenannten Methode erhaltene doppelsträngige cDNA insertiert wird. Die Ligation der doppelsträngigen cDNA zu dem Vektor lässt sich ausführen; indem ein geeigneter, auf chemische Weise synthetisch dargestellter DNA-Adapter hinzugefügt wird und dieses mit einem mit Hilfe eines Restriktionsenzyms gespalteter Vektor DNA einer Behandlung mit T4-Phagen-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP unterworfen wird.
Der benötigte Expressionsvektor enthält einen replikativen Ursprung, einen selektiven Marker, einen Promotor, der sich in der vorgeschalteten Region eines Gens befindet, das exprimiert werden soll, eine RNA-Spleißstelle einem polyadenylierten Signal.
Als ein Gen-Expressionspromotor in einer Säugerzelle können Virus-Promotoren verwendet werden, wie beispielsweise Retrovirus, Polyomvirus, Adenovirus und Simiam-Virus (SV) 40, sowie Promotoren, die von Zellen deriviert sind, wie beispielsweise den Human-Polypeptidkettenverlängerungsfaktor 1α (HEF-1α). Beispielsweise kann dieser im Fall der Verwendung eines Promotors von SV40 mühelos mit Hilfe einer Methode von Mulligan et al. (Nature, 277:108 (1979)).
Als ein Replikationsursprung können solche verwendet werden, die von dem SV40-Polyomvirus, Adenovirus und Rinderpapillomvirus (BPV) deriviert sind, wobei als ein selektiver Marker eine Phosphotransferase APH (3') II oder I (Neo)-Gen, ein Thymidinkinase-Gen (TK), eine Escherichia coli-Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (Ecogpt)-Gen und ein Dihydrofoliat-Reduktase (DHFR)-Gen verwendet werden.
Um das gewünschte Gen unter Verwendung einer prokaryotischen Zelle als Wirtszelle zu exprimieren, wird die Wirtszelle mit einem Replicon transformiert, das von einer Spezies deriviert ist, die als Wirte ausgestattet ist, d.h. ein Plasmidvektor der einen Replikationsursprung und eine Regulationssequenz enthält. Ein Vektor der über ein Markergen verfügt, das in der Lage ist, einem Phänotyp zu transformierten Zellen Selektivität zu vermitteln, wird bevorzugt. Beispielsweise kann er im Fall der Verwendung von Escherichia coli als Wirtszelle unter Verwendung von pBR322 transformiert werden, bei dem es sich um einen von der Wirtszelle stammenden Vektor handelt (Boliver et al., Gene, 2:95 (1975)). Das pBR322 enthält ein gegen Ampicillin widerstandsfähiges Gen und ein gegen Tetracyclin widerstandsfähiges Gen, weshalb Transformanten unter Nutzung beider dieser Resistenzeigenschaften identifiziert werden können. Als ein Promotor, der für die Genexpression einer prokaryotischen Wirtszelle benötigt wird, lässt sich ein Promotor eines β-Lactamase-Gens nennen (Chang et al., Nature, 275:615 (1978)), ein Lactose-Promotor (Goeddle et al., Nature, 281:544 (1979)), ein Tryptophan-Promotor (Goeddle et al., Nucleic Acid Res., 8:4057 (1980)), ein Tac-Promotor und dergleichen.
Als prokaryotische Wirtszellen von Wirten, die in dem Expressionssystem der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen sollen, lassen sich Escherichia coli nennen, Bacillus subtilis, Bacillus thermophilus und dergleichen.
Zusätzlich lassen sich als eukaryotische Wirtszellen eukaryotische Mikroorganismen nennen, wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, sowie Zellen, die von Säugern deriviert sind, wie beispielsweise COS-Zelle, eine Zelle von den Ovarien chinesischer Hamster (CHO), eine C127-Zelle, eine 3T3-Zelle, eine Hela-Zelle, eine BHK-Zelle, eine Namalwa-Zelle und eine fötale Human-Nierenzelle (293 Zelle).
Im Übrigen lässt sich die Kultur der Transformanten durch Auswahl von Kulturbedingungen ausführen, die für die Wirtszellen dementsprechend geeignet sind.
Die Isolierung einer cDNA, die ein Adhäsionsmolekül kodiert, welches über eine Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, lässt sich beispielsweise unter Anwendung der Prä-B-Zellwachstum unterstützenden Fähigkeit als eine Kennzahl ausführen oder nach einer Methode, wie beispielsweise eines direkten Expressionsklonierens unter Verwendung eines Antikörpers. Die Messung der Prä-B-Zellwachstum unterstützenden Fähigkeit kann unter Verwendung einer Prä-B-Zelllinie DW34 von Mäusen ausgeführt werden (Eur. J. Immunol., 18:1767 (1988)).
Das bedeutet, eine Zelle, welche das Adhäsionsmolekül exprimiert, das über eine Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, wird so lange in Kultur genommen, bis sie auf 24-Multititerplatten subkonfluent ist (die Dichte beträgt vorzugsweise etwa 50%), wobei darauf eine entsprechende Strahlungsmenge aufgebracht wird, DW34 von 1 bis 2 × 10³ pro Mulde zugegeben wird und in RPMI-1640-Medium mit einem Gehalt von 10% FCS unter den Bedingungen von 5% CO₂ bei 37°C für etwa 4 bis 6 Tage in Kultur genommen wird. Der Grad der Verstärkung der Wachstum unterstützenden Fähigkeit lässt sich ermitteln, indem die Zahl der Lebendzellen von DW34 in jeder Mulde mit Trypanblau-Farbstoffausschluß untersucht wird.
Das gewünschte Gen könnte durch Wiederholung der Schritte geklont werden, die aus dem Folgenden bestehen: Auswählen eines das Adhäsionsmolekül exprimierenden Transformanten mit einem FACScan unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern RF3 und SG2, die das Adhäsionsmolekül, das über Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, erkennen, Herstellen eines Transformanten wiederum durch Sortieren der für die Herstellung des Transformanten verwendeten Plasmid DNA; und sodann Screening des Transformanten mit Hilfe der Durchfluss-Cytometrie.
So wurde ein transduzierter Transformant (293T-Zelle) auf Mikrotiterplatten in Kultur genommen und von den Platten mit PBS, die 0,02% EDTA enthielten, entfernt und, nachdem die Zelle mit einer FACS-Pufferlösung gewaschen wurde, die sich aus PBS mit einem Gehalt von 2% FCS und 0,02% NaN₃ zusammensetzte, umgesetzt mit RF3 und SG2 als die primären Antikörper. Danach wurden, nachdem die nicht umgesetzten primären Antikörper entfernt wurden, indem sie mit einer FACS-Pufferlösung gewaschen wurden, mit einem sekundären Antikörper weiter umgesetzt, mit einem FITC-markierten Antikörper (FITC-markierte Anti-Maus-Ziege-Ig-Antikörper); mit toten Zellen mit Propidiumiodid gefärbt und lebensfähige Zellen mit Hilfe eines FACScan analysiert, um Transformanten zu selektieren, die stark auf RF3 und SG2 ansprechen.
Darüber hinaus könnte durch Wiederholen der Schritte die vollständige Länge von cDNA (63-BOS), die ein Membranprotein-Polypeptid kodiert, das über eine neuartige Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, und in Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle gezeigt ist, erhalten werden, was aus Folgendem besteht: Behandeln von Escherichia coli (DH5), die die cDNA enthält, die für die Herstellung von Transformanten verwendet wurde, die auf den Antikörper mit Alkali anspricht, um eine Gruppe von Plasmiden zu selektieren, die das gewünschte Gen enthalten; Unterteilen der Gruppe von Plasmiden in mehrere Gruppen von Plasmiden; nochmals Transduzieren von diesen in 293T- Zellen, und danach Selektieren der Transformanten nach der FACScan-Analyse unter Verwendung der vorgenannten monoklonalen Antikörper RF3 und SG2.
Im Übrigen wurde der Stamm von Escherichia coli DH5α, der kein pBst-1 mit der in die Xbal-Spaltstellen eines pUC19-Vektors eingesetzten cDNA enthält, im National Institute of Bioscience & Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Japan hinterlegt, (Adresse: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japan), bei der es sich um eine internationale behördliche Hinterlegungsstelle nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vom 19. Mai, 1993 handelt, und zwar unter dem Namen, Escherichia coli DH5α (pBst-1) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4305.
Im Allgemeinen geht man davon aus, das die Gene von Eukaryoten Polymorphismus zeigen, wie er von Human-Interferon-Genen bekannt ist (z.B. Nishi et al., J. Biochem., 97:153 (1985)), wobei in einigen Fällen mindestens eine Aminosäure nach diesem Polymorphismus substituiert ist und sich in anderen Fällen Aminosäuren überhaupt nicht ändern, wenn gleich es Veränderungen in der DNA-Sequenz gibt.
Außerdem besteht die Möglichkeit, dass einige Polypeptide, die mindestens eine Aminosäure mehr oder weniger als die Aminosäuresequenz haben, wie sie in der Sequenz Nr. 1 der Sequenz-Tabelle gezeigt ist, oder einige Polypeptide, die mit mindestens einer Aminosäure substituiert sind, ebenfalls über eine Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügen. So ist beispielsweise bereits bekannt geworden, dass das von einem Human-Interleukin-2(IL-2)-Gen erhaltene Polypeptid, in welchem eine DNA-Sequenz entsprechend dem Cystein zu einer Sequenz entsprechend dem Serin umgewandelt ist, ebenfalls über eine IL-2 Aktivität verfügt (Wang et al., Science, 224:1431 (1984)).
Darüber hinaus können ein bekanntes Protein-Gen und ein Gen, das in Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle gezeigt ist, mit Hilfe eines geeigneten Restriktionsenzyms oder Adaptors über eine Ligation verknüpft werden, um eine Polypeptidbindung an dem bekannten Protein zu liefern. Als ein solches bekanntes Protein-Gen läßt sich Immunoglobulin nennen und es kann unter Verwendung des in Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle gezeigten Gens an dem Fc-Abschnitt davon gebunden werden an der Stelle der variablen Region davon ((Zettlmeiss) et al., DNA AND CELL BIOLOGY, 9:347-353 (1990)).
Darüber hinaus tritt im Fall der Expression eines Polypeptids in eukaryotischen Zellen in vielen Fällen eine Glykosylierung auf, wobei die Glykosylierung über die Umwandlung von mindestens einer Aminosäure reguliert werden kann; in diesem Fall können sie ebenfalls über eine Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügen.
Daher können selbst die Gene, in denen die Stelle, die ein Polypeptid mit Prä-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit kodiert, künstlich modifiziert sind, insofern in die vorliegende Erfindung einbezogen werden, wie die Polypeptide, die von den Genen erhalten werden, über Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügen.
Darüber hinaus sind Gene, die mit der Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle gezeigten Genen hybridisiert werden sollen, ebenfalls in sofern in die vorliegende Erfindung einbezogen, wie die von den Genen exprimierten Polypeptide über Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügen. Die Hybridisierung kann unter Einsatz der üblichen Bedingungen der Hybridisierung ausgeführt werden (siehe hierzu beispielsweise die vorstehende Ausführung "Molekulares Klonen").
Das gewünschte homogene und gereinigte lösliche Adhäsionsmolekül kann erhalten werden durch Kultivieren eines Transformanten, wie beispielsweise Mikroorganismen oder Zellen, die mit einem Gen transformiert sind, das ein Polypeptid mit Prä-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit kodiert; durch Solubilisieren des erhaltenen Polypeptids mit einem geeigneten Detergens; und das resultierende Polypeptid einer Trennung und Reinigung unterziehen. Beispiele für das Detergens schließen Nonidet P-40 (NP-40), Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, Teeen 20 und dergleichen ein.
Darüber hinaus lassen sich lösliche Adhäsionsmoleküle mit Hilfe der Gentechnik herstellen. Da nämlich der Abschnitt des 272. Gln zu der 290. Leu in der Sequenz Nr. 1 der Sequenz-Tabelle ein Bereich mit stark hydrophoben Eigenschaften ist, läßt sich ein Gen mit einem Stop-Codon an einer Position vor der 272. Stelle unter Einsatz einer Methode der PCR-Mutagenese (M. Kamman et al., Nucl. Acids Res., 15:5404 (1989)).
Um es ebenfalls detailliert zu beschreiben, wird das Gen des abgeschiedenen pBst-1 mit Hilfe der Methode der PCR-Mutagenese unter Einsatz zweier Primer AAC CTC CAG AAG GAA AA (entsprechend der 185. bis zur 190. Stelle der Sequenz Nr. 1 der Sequenz-Tabelle) und ACC CAA GCT TTC TAG ATC AAT AAA GAC TTG GGG CTT (entsprechend der 264. bis zur 269. Stelle der Sequenz Nr. 1 der Sequenz-Tabelle + ein Stop-Codon + HindIII und den XbaI-Restriktionsstelle amplifiziert). Das gewünschte Gen wird unter Verwendung von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und dergleichen und zu Fragmenten mit BglII und HindIII aufgespalten. Nachdem das erhaltene Fragment BglII-HindIII in das pBst-1 insertiert ist, das mit dem gleichen Restriktionsenzym digeriert wurde, wird dieses mit EcoRI und HindIII digeriert und mit einem Klenow- Fragment zur Erzeugung eines stumpfen Endes behandelt. Das DNA-Fragment wird mit pEF-BOS legiert, das mit BstXI digeriert und mit dem Klenow-Fragment behandelt wird, wobei eine geeignete Wirtszelle damit transformiert wird, um ein lösliches Adhäsionsmolekül zu ergeben.
Als ein Mittel zur Separation und Reinigung des Moleküls kann ein Verfahren zum Einsatz gelangen, das im Fall eines üblichen Proteins angewendet wird; so kann beispielsweise das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zweckmäßig separiert und gereinigt werden, indem verschiedene Arten von Chromatographie gewählt und kombiniert werden, wie beispielsweise Affinitätschromatographie unter Verwendung der vorgenannten monoklonalen Antikörper, Ultrafiltration, Aussalzen, Dialyse und dergleichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1 das Wachstumsvermögen der Maus-Prä-B-Zelllinie DW34 eines neuartigen Adhäsionsmoleküls, das in den Beispielen der vorliegenden Erfindung erhalten wird;
2 die Ergebnisse der Analysen des hydrophoben Bereichs und des hydrophilen Bereich eines in den Beispielen erhaltenen Gens.
Nachfolgend werden in den "Referenzbeispielen" und "Beispielen" detailliert ein Gen beschrieben, welches das Adhäsionsmolekül kodiert, das über Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, ein rekombinanter Vektor, der über dieses Gen verfügt, Transformanten, die dieses enthalten, das gewünschte, durch Kultivieren der Transformanten erhaltene Protein sowie Methoden zu deren Erzeugung.
Referenzbeispiele
Referenzbeispiel 1
Erzeugen einer Stromazelllinie die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) und von gesunden Spendern abgenommen wurde, die das Prä-B-Zellwachstum unterstützen können.
Mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation nach Ficoll-Hypaque wurden mononukleare Zellfraktionen des Knochenmarks (BM) von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) und von gesunden Spendern erhalten und dem RPMI-1640-Kulturmedium mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum (FCS), 50 μM 2-Mercaptoethanol und Antibiotika bei 37°C über mehrere Wochen in Kultur genommen. Diese wurden wiederholt gewaschen, um nicht adhäsive Zellen zu entfernen und die verbleibenden Adhäsionszellen elektroporiert mit einem pAct-SVT-Plasmid, das eine große SV20-T-Antigen-cDNA enthielt und einen Küken-β-Actin-Promotor (BBRC, 186:129-134 (1992)) und zwar mit Hilfe eines "Genpulsers" (hergestellt von BioLad).
Die vorgenannten Zellen und Plasmide wurden in Wasser für 15 Minuten inkubiert, einer Elektroporation bei 250 V und einer elektrostatischen Kapazität von 250 μF unterworfen, weiter inkubiert auf Eis für 10 Minuten und in einer 10 cm-Petrischale kultiviert. Die darauf wachsenden Kolonien und einschließlich anhaftenden Zellen wurden mit einem kleinen Stück Filterpapier geerntet, um BM-Stromazelllinien zu erhalten, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) und gesunden Spendern (RASV5-5 und NFSV1-1) abgenommen wurden (J. Immunol., 149:4088 (1992)).
Referenzbeispiel 2
Herstellung einer synovialen Zelllinie von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), die über Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt.
Auf den synovialen Zellen, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) abgenommen wurden, wurde mit einem pAct-SVT-Plasmid elektroporiert, der eine große SV40-T-Antigen-cDNA enthielt und einen Küken-β-Actin-Promotor (BBRC, 186:129-134 (1992)), und zwar mit Hilfe eines "Genpulsers" (hergestellt von BioLad). So wurden 0,8 ml eines Aliquots der synovialen Zelle von 1 × 10⁷ Zellen/ml, die von Patienten mit (RA) abgenommen wurden, in PBS mit 10 μG des Plasmids gemischt und die Mischung auf Eis für 10 Minuten inkubiert, einer Elektroporation unter den Bedingungen von 250 V und einer elektrostatischen Kapazität von 250 μF unterworfen, auf Eis für 10 Minuten weiter inkubiert, in RPMI-1640-Medium (hergestellt von GIBCO) mit einem Gehalt von 10% FCS (hergestellt von Bioproducts) inkubiert und in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm in Kultur genommen. Das Kulturmedium wurde alle drei Tage ausgewechselt und in die gut gewachsenen adhäsiven Zellen etwa 2 Wochen später mit einem kleinen Stück Filterpapier imprägniert mit Trypsin geerntet, um synoviale Zellen zu erhalten, die von RA (SynSV1-4 und SynSV6-14) abgenommen wurden.
Referenzbeispiel 3
Herstellung von monoklonalen Antikörpern.
1) Antigene und Immunisierung
Stromazelllinie RASV5-5 und die synoviale Zelllinie SynSV6-14, die von Patienten mit RA abgenommen wurden, die über eine starke Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügten und in dem vorstehend ausgeführten Referenzbeispielen 1 und 2 erhalten wurden, wurden als Antigene zur Immunisierung verwendet. Unter Verwendung des RPMI-1640-Mediums (hergestellt von GIBCO) mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum (FCS, hergestellt von Bioproducts) und 50 μM 2-Mercaptoethanol als Medium wurden die Zelllinien in einem Inkubator, der 5% CO₂ enthielt, bei 37°C in Subkultur genommen.
Die Zellen wurden mit 0,2% EDTA und PBS behandelt und aus einer Kultivierungsflasche des Inkubators durch Pipettieren gewonnen. Die Zellen wurden in dem RPMI-1640-Medium mit einer Menge von 1 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert und zu einer BALB/C-Maus (4 Wochen alt, weiblich, erzeugt von L. S. C of Japan) immunisiert. In der ersten Immunisierung wurden etwa 1 × 10⁷ /ml Zellen in die Bauchhöhle der Maus injiziert und 2 bis 3 Wochen später etwa 1 × 10⁷ /ml Zellen als zusätzliche Immunisierung. Darüber hinaus wurden in Abständen von etwa 2 bis 3 Wochen etwa 1 × 10⁷ /ml Zellen 2 bis 3 Mal als zusätzliche Immunisierung injiziert und 3 Tage nach der letzten Immunisierung die Maus getötet und die Milz zur Fusion gewonnen.
2) Zellfusion
Nachdem die von einer der Mäuse extirpierte Milz zu Stücken zertrennt wurde, wurden die isolierten Milzzellen zentrifugiert, in RPMI-1640-Medium (hergestellt von GIBCO) suspendiert und ausreichend gewaschen. Andererseits wurden 1 × 10⁷ Zellen, die durch Kultivieren einer Maus-Myelom-Zelllinie P3 × 63Ag8.653 (J. Immunol., 123:1548 (1979)) in DMEM (hergestellt von GIBCO)-Medium mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum (FCS, hergestellt von FILTRON) erhalten wurden, in dem vorgenannten DMEM-Medium in ähnlicher Weise gewaschen und in ein Zentrifugenröhrchen mit 1 × 10⁸ der genannten Milzzellen gegeben und gemischt und anschließend einer Zellfusion mit Polyethylenglykol 1500 (hergestellt von Boehringer) mit der üblichen Prozedur unterworfen (Clin. Exp. Immunol., 42:458-462 (1980)).
Die erhaltenen verschmolzenen Zellen wurden in 96-Mikrotiterplatten in das DMEM-Medium, das 10% FCS enthielt, und in einem Inkubator bei 37°C kultiviert, der 5% CO₂ enthielt. Am folgenden Tag wurde das Medium durch das HAT-selektive Medium (vollständiges RPMI-1640-Medium mit einem Gehalt von 1,0 × 10^–4 Mol Hypoxanthin, 4,0 × 10^–7 Mol Aminopterin und 1,6 × 10^–5 Mol Thymidin mit 10% FCS und 50 μMol 2-Mercaptoethanol darin zugegeben) langsam ausgewechselt und die Kultur fortgesetzt. Nachdem die Kultur gestartet worden war, wurde die Hälfte des Überstandes durch das neue HAT-Medium 2 mal wöchentlich ausgewechselt und die Kultur zur Aufrechterhaltung der Poliferation fortgesetzt.
Die so erhaltenen verschmolzenen Zellen wurden mit der eingrenzenden Verdünnungsanalyse geklont.
So wurde unter Verwendung der Antikörper in dem Überstand der Kultur, die durch Kultivieren der vorgenannten verschmolzenen Zellen erhalten wurden, das Ansprechen auf die Antigene untersucht und nach der üblichen Prozedur unter Einsatz einer eingrenzenden Verdünnungsanalyse Klone erhalten, die über ein starkes Ansprechen auf die Antigene allein verfügten.
So wurden zur Ausführung der Erzeugung von Klonen das vorgenannte Hybridom und die Milzzellen einer BALB/C-Maus in den vorstehend beschriebenen Mengen hergestellt, auf 96-Mikrotiterplatten mit einer Rate von 1 bis 10 Hybridom(a) pro Mulde geimpft und in einem Inkubator bei 37°C kultiviert, der 5% CO₂ enthielt. Der Vorgang des Klonens von aufgezogenen Nybridoma wurde in der gleichen Weise mit der üblichen eingrenzenden Verdünnungsanalyse so lange wiederholt, bis sie theoretisch zu einem einzigen Klon wurden. Die Klone, die den gewünschten Antikörper lieferten, wurden unter Verwendung der vorgenannten Antigene einem Screening unterzogen.
So wurden zwei Arten von Hybridoma (RF3, SG2), die Antikörper lieferten, die auf RASV5-5 reagierten, die jedoch nicht auf die Stromazelllinie NFSV1-1 reagierten, die von dem Knochenmark von gesunden Spendern mit keiner Prä-B-Zellwachstum unterstützenden Fähigkeit abgenommen wurden, separiert. Die Antikörper, die von diesen Hybridoma erhalten wurden, waren IgG2a und IgG2.
Im Übrigen waren die Hybridoma, die die vorgenannten monoklonalen Antikörper RF3 und SG2 lieferten, neuartige verschmolzene Zellen, die mit den Milzzellen einer BALB/C-Maus und Maus-Myelom P3 × 63AgB.653 als Ausgangszellen erzeugt wurden und am National Institute of Bioscience & Human-Technology, Agency of Industrial Science Ind. Technology in Japan (Adresse: 1-3, Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki 305, JAPAN), hinterlegt wurden, bei der es sich um eine internationale behördliche Hinterlegungsstelle nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren, von 28. April, 1993 handelt, und zwar unter dem Namen Maus-Maus-Hybridom RF3 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4656, sowie mit dem Namen Maus-Maus-Hybridom SG2 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4657.
3) Screening
Das Screening von verschmolzenen Zellen (Hybridoma) wurde mit der indirekten Fluoreszens-Antikörper-Technik ausgeführt, eine Durchfluss-Cytometrieanalyse mit Hilfe eines Durchfluss-Cytometers.
Das Screening von Klonen, die den Zielantikörper liefern, wurde ausgeführt, indem verwendet wurden: a) RASV5-5 (Antigen für die Immunisierung) und b) die Stromazelllinie NFSV1-1, die von dem Knochenmark gesunder Spender als Targetzellen abgenommen wurde. So wurde nach dem Immunisieren der BM-Stromazelllinie (RASV5-5) abgenommen von Patienten mit RA, die eine starke Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit zu einer BALB/C-Maus hatte, wurde das Screening von monoklonalen Antikörper die auf RASV5-5 reagierten, nicht jedoch auf die BM-Stromazelllinie (NFSV1-1) reagierten, die von gesunden Spendern abgenommen wurde, die über keine Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügten, wie folgt ausgeführt. Das erste Screening wurde unter Verwendung von RASV5-5 ausgeführt, eine Zelle, die einer Reaktion unterworfen werden soll und zwar als ein Antigen für die Immunisierung. Zunächst wurde ein Kulturüberstand, der auf RASV5-5 reagierte, in Hinblick auf die Auswahl von verschmolzenen Klonen ausgewählt, die auf das RASV5-5 reagierten, und anschließend ein primäres Screening ausgeführt.
So wurden in einem Reaktionspuffer (PBS mit einem Gehalt von 2% FCS und 0,02% NaN₃) suspendierte Zellen in 20 μl eines Überstandes einer Hybridomkultur (etwa 5 × 10⁵/20 μl) suspendiert und für 20 Minuten bei 4°C zur Reaktion gebracht.
Diese wurden mit dem vorgenannten Puffer 2-mal gewaschen und dazu FITC-markierter Anti-Maus-Ziege-Ig-Antikörper (hergestellt von Cappel) zugegeben und die Mischung für 20 Minuten inkubiert. Nachdem das Reaktionsprodukt 3-mal gewaschen wurde, wurde es mit Hilfe eines Durchfluss-Cytometers (FACScan, hergestellt von Becton Dickinson) analysiert.
Anschließend wurde die Knochenmark-Stromazelllinie NFSV1-1 von gesunden Spendern als eine Zelle verwendet, die einer Reaktion unterworfen werden sollte und mit Hilfe des vorgenannten Durchfluss-Cytometers analysiert. Es wurden zwei Arten von Zellen als Hybridoma erhalten, die Antikörper lieferten, die dementsprechend stark auf RASV5-5 ansprechende Antikörper lieferten.
3) Reinigung von Antikörpern
Die verschmolzenen Zellen, die wie vorstehend unter 2) hergestellt wurden, wurden nach einer üblichen Prozedur kultiviert und die Antikörper, die in dem Kulturüberstand erhalten wurden, nach einer üblichen Prozedur gereinigt. So wurden die Hybridoma aus den Mulden mit dem höchsten Antikörpertiter auf das vorgenannte Antigen aufgenommen und eine der Mulden, in der das Wachstum von Zellen erkannt werden konnte, herausgenommen und die erhaltenen Kulturzellen in eine Gewebekulturflasche unter den Bedingungen von 5% CO₂ bei 37°C erneut aufgezogen. Die erhaltenen Zellen wurden in die Bauchfellhöhle einer BALB/C-Maus (6 Wochen alt, weiblich, erzeugt von S. L. C. of Japan) mit zudosiertem Pristan injiziert. 10 bis 14 Tage später wurde die Ascites aufgenommen, mit 50% Ammoniumsulfat ausgesalzen, mit PBS dialysiert und mit einer QAB-Säule gereinigt. Die Antikörper wurden weiter ausgesalzen und ausreichend dialysiert, um ein gereinigtes Produkt von etwa 6 mg/ml zu erhalten.
Referenzbeispiel 4
Es wurden monoklonale Maus-Antikörper RF3 und SG2, die selektiv die BM-Stromazelllinien erkennen, von Patienten mit RA mit Prä-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit gefunden, die das gleiche Molekül mit der folgenden Methode erkennen.
So wurde, nachdem jeder Antikörper mit Hilfe von NFSV1-1-Hydroxysuccininimid-Biotin (Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)), biotiniert wurde, ein Kreuz-Hemmtest unter Verwendung der BM-Stromazelllinie RASV5-5 von Patienten mit Ra ausgeführt. Die RASV5-5 Zelllinie wurde in 20 μl eines FACS-Puffers suspendiert, der phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem Gehalt von 2% FCS und 0,2% NaN₃ in Kombination mit biotiniertem RF3 und SG2 aufwies, oder biotiniertes SG2 und RF3, suspendiert und auf Eis für 20 Minuten inkubiert, 2-mal mit einer FACS-Pufferlösung gewaschen und nach Zugabe des FITC-markierten Streptoavidins das resultierende Produkt weiter für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Nachdem dieses 3-mal mit einer FACS-Pufferlösung gewaschen wurde, wurde es auf einem FACScan (hergestellt von Becton Dickinson) und in jeder Kombination eine Kreuzhemmung gefunden. Aus der vorstehenden Ausführung wurde geschlossen, dass monoklonale Maus-Antikörper RF3 und SG2 das gleiche Epitop des gleichen Moleküls oder des Epitops, das sich äußerst nahe an diesem befindet, erkennen.
Beispiele
Nachfolgend wird eine detaillierte Beschreibung der Beispiele der Erfindung ausgeführt.
Beispiel 1
1. Herstellung einer cDNA-Genbank
1) Herstellung von Poly(A)+RNA
Die Herstellung von Poly(A)+RNA aus der synovialen Zelllinie SynSV1-4 von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) wurde unter Verwendung eines mRNA-Isolationkits "Fast Track^TM", Version 3.2, (hergestellt von Invitrogen) ausgeführt.
So wurden die SynSV1-4-Zellen für zwanzig Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm homogenisiert und danach die gesamte RNA nach der zu diesem Kit zugehörigen Prozedur hergestellt. Ferner wurde die Poly(A)+RNA mit Hilfe der dem Kit beigefügten Oligo(T)-Zellulose nach dem Kit beigefügten Prozedur gereinigt.
2) Aufbau der cDNA-Datenbank
Es wurde eine doppelsträngige cDNA synthetisch hergestellt, indem die vorgenannte Poly(A)+RNA mit 5 μg als Material nach der dem cDNA-Synthesekit beigefügten Prozedur von Time Saver^TM-cDNA-Synthesekit (hergestellt von Pharmacia) verwendet wurde und ein BstXI-Adaptor (hergestellt von Invitrogen) damit durch Ligation mit Hilfe eines DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) nach der dem Kit beigefügten Prozedur verknüpft wurde. Die Entfernung des freien BstXI-Adaptors wurde mit Hilfe der beigefügten Säule "Size Sep 400 Spin Column" nach der dem Kit beigefügten Prozedur vorgenommen, um etwa 100 μl einer Adaptor-ligierten, doppelsträngigen cDNA zu erhalten.
Sodann wurden von den etwa 100 μl hergestellten ligierten doppelsträngigen cDNA 2 μl in einer Ligationsreaktion verwendet und eine cDNA-Genbank aufgebaut, indem diese mit einem pEF-BOS-Vektor (Nuc. Acid Res., 18:5322 (1990)) über eine Ligation verknüpft wurde, der zuvor mit einem Restriktionsenzym BstXI und Alkaliphosphatase (hergestellt von Takara Shuzo) mit Hilfe eines cDNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) behandelt wurde. Die aufgebaute cDNA wurde in die Escherichia coli-Zelllinie DH5 (hergestellt von Toyobo) transformiert, und es wurde davon ausgegangen, dass es sich um einen unabhängigen Klon mit der Gesamtgröße von etwa 2 × 10⁵ handelte. Es wurden fünfzig Pools hergestellt, von denen jeder Pool 2.000 bis 4.000 Klone von transduzierter Escherichia coli aufwies, und danach in den nachfolgenden Tests verwendet.
2. Klonen nach der Methode der Direkten Expression
1) Transfektion in 293T-Zellen
Die Amplifikation einer cDNA wurde ausgeführt, indem die vorgenannten gepoolten Escherichia coli in dem LB-Medium in Kultur genommen wurde, das 50 μg/ml Ampicillin (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) enthielt und eine Plasmid-DNA aus Escherichia coli nach einer Alkali-Methode gewonnen (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Der Grad der Reinigung der erhaltenen Plasmid-DNA wurde durch wiederholte Ultrazentrifugation mit Hilfe der Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation verstärkt und die gereinigte Plasmid-DNA zu einer 293T-Zelle transfiziert (Zelllinie, hergestellt durch Transfektion einer SV40-groß-T-Antigen-cDNA in einer 293-Zelle (transformierte, primäre, embryonale Niere-Human-ATCC CRL 1573)) nach der Calciumphosphat-Methode.
So wurden 2 μg der gereinigten Plasmid-DNA in 100 μl einer Pufferlösung aufgelöst, die 1 ml Tris-HCl und 0,1 mMol EDTA enthielt und nach Zugabe von 14 μl 2M CaCl₂ dazu die resultierende Mischung mit einer Pufferlösung aus 50 mMol HEPES (pH: 7,1), 280 mMol NaCl, und 1,5 mMol Natriumphosphat langsam gemischt und danach die erhaltene Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und den 293T-Zellen in 24-Mikrotiterplatten zugegeben. Die 293T-Zellen wurden in DMEM (hergestellt von GIBCO)-Medium mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum (FCS, hergestellt von Bioproproducts) unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ für 2 Tage kultiviert.
2) Analyse mit Hilfe der FACS
Die transduzierten 293T-Zellen wurden aus den 24-Mikrotiterplatten in PBS mit einem Gehalt von 0,02% EDTA entnommen und mit einer FACS-Pufferlösung 2-mal gewaschen, die PBS mit einem Gehalt von 2% FCS und 0,02 NaN₃ aufwies, und sodann in 20 μl der FACS-Pufferlösung in Gegenwart einer Mischung von 10 μg/ml RF3 und SG2 als einen primären Antikörper suspendiert und für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Nachdem diese 2-mal mit FACS-Pufferlösung gewaschen wurde, wurden diese für 15 Minuten auf Eis weiter inkubiert, indem FITC-markierter Anti-Maus-Ziege-Ig-Antikörper (hergestellt von Cappel) als sekundärer Antikörper verwendet wurde. Dazu wurde Propidiumiodid (PI) zugesetzt, so dass die Endkonzentration davon 1 μg/ml betrug, wonach die Mischung weiter für 5 Minuten auf Eis inkubiert wurde, 3-mal mit der FACS-Pufferlösung gewaschen wurde und die Zellen mit Hilfe der Lichtstreuungsmessung analysiert wurden und lediglich die lebensfähigen Zellen einer Analyse mit Hilfe des FACScan (hergestellt von Becton Dickinson) analysiert wurden.
3) Klonen der cDNA-Genbank
Die aus Escherichia coli von 2.000 bis 4.000 Klonen als ein Pool nach der Alkali-Methode gewonnenen Plasmid-DNA wurden nach der vorgenannten Methode zu 293T-Zellen transfiziert und transfizierten Zellen nach der vorgenannten FACS-Analyse einem Screening unterworfen. Es wurde in dem 20. Pool der 293T-Zellen ein stark mit monoklonalem Maus-Antikörpern RF3 und SG2 gefärbter Peak erkannt. Die Plasmid-DNA wurde in Escherichia coli DH5α (hergestellt von GIBCO BRL) nochmals transduziert und auf einer LB-Agarplatte beimpft, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt.
Es wurden 2.000 Kolonien-erzeugende Klone nacheinander auf einer Agarplatte beimpft, deren Boden in einer netzähnlichen Form unterteilt war, sodass die Position eines beimpften Klons bei einer Rate von 100 Klonen pro Platte erkannt werden konnte, und zwei Reihen von jeder Platte hergestellt. Es wurden 20 Pools, von denen jeder Pool 100 Klone aufwies, in der gleichen Weise hergestellt und Escherichia coli in dem LB-Medium kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Nachdem die Plasmid-DNA nach der Alkali-Methode gewonnen wurden, wurde diese nach der Calciumphosphat-Methode zu 293T-Zellen transfiziert und die transfizierten Zellen einer FACS-Analyse in der gleichen Weise wie vorstehend unterworfen. Als Ergebnis der FACS-Analyse wurden 100 Klone von Escherichia coli nacheinander aus einem Pool isoliert, der als positiv erkannt wurde, und jeder Klon kultiviert und anschließend die Plasmid-DNAs nach der Alkali-Methode gewonnen. Jede Plasmid-DNA wurde zu 293T-Zellen nach der Calciumphosphat-Methode transfiziert und die FACS-Analyse in der gleichen Weise wie vorstehend ausgeführt, um ein einzelnes positives Klon zu erhalten, der als 63-BOS bezeichnet wurde.
Der Klon wurde einer Sequenzierungsreaktion unter Verwendung eines "Auto Read"-Sequenzierungskits (hergestellt von Pharmacia) und eines "Auto Cycle"-Sequenzierungskits (hergestellt von Pharmacia) nach der dem Kit beigefügten Prozedur unterzogen und die Bestimmung der DNA-Sequenz davon mit Hilfe eines ALE^TM-DANN-Sequenators (hergestellt von Pharmacia) ausgeführt. Als Ergebnis war dieses ein neuartiges Gen mit der vollen Länge von 1.411 bp (Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle) von dem ausgegangen wurde, dass es eine Sequenz der 318 Aminosäure-Reste von dem längsten offenen Leseraster kodiert.
3. Expression durch eine BALB3T3-Zelle
Das neuartige Molekül wurde in eine BALB3T3-Zelle transfiziert und die Expression in Mammalia-Zellen untersucht.
So wurden 20 μg von 63-BOS und 2 μGewichtsprozent von pSV2neo, die ein gegen Neomycin widerstandsfähiges Gen haben (P. J. Souethem und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1:327 (1982)) und zu 0,8 ml eines Aliquots von 1 × 10⁷ Zellen/ml gegeben und für 10 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend mit Hilfe eines "Genpulsers" (hergestellt von BioLad) unter den Bedingungen von 250 V und einer elektrostatischen Kapazität von 250 μF einer Transfektion unterworfen, um gleichzeitig eine Transduktion zu erzielen.
Ferner wurde die Zelle, nachdem sie auf Eis für 10 Minuten inkubiert wurde, in dem DMEM-Medium (hergestellt von GIBCO) suspendiert, das 2mg/ml G418 und 10% FCS (hergestellt von Bioproducts) enthielt, und in 24-Mikrotiterplatten kultiviert. Das Auswechseln des Kulturmediums wurde alle 3 Tage vorgenommen und etwa 2 Wochen später eine transformierte Zelle BALB3T363S2, die auf den vorgenannten monoklonalen Maus-Antikörper RF3 anspricht, aus der Mulde erhalten, die eine einzige Kolonie von gut gewachsenen Adhäsionszellen mit Widerstandsfähigkeit gegen Neomycin bildete. Zusätzlich wurde als eine Kontrollzelle eine transformierte Zelle BALB3T363S1 die nicht auf RF3 ansprach, jedoch über eine Widerstandsfähigkeit gegen Neomycin verfügte, erhalten.
4. Biologische Eigenschaften des neuartigen Moleküls
Die biologischen Eigenschaften des neuartigen Moleküls wurden unter Verwendung einer Maus-Prä-B-Zelllinie DW34, die unabhängig auf Stromazellen wächst, mit der Zahl der gewachsenen Zellen als Index nach der folgenden Methode analysiert.
Als Erstes wurde die transduzierte Zelle BALB3T363S2 und die Kontrollzelle BALB3T363S1 in 24-Mikrotiterplatten solange kultiviert, bis sie subkonfluent wurden. Es wurde eine Strahlung von 30 Gy aufgegeben, darin DW34 von 2 × 10³ pro Mulde zugegeben und das resultierende Produkt in dem RPMI-1640 (hergestellt von GIBCO)-Medium kultiviert, das 10% FCS (hergestellt von Bioproducts) enthielt, und zwar unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ für 4 Tage. Die Zahl der lebensfähigen Zellen von DW34 in jeder Mulde wurde mit einem Trypanblau-Farbstoffausschluß gezählt, um die wachstumsunterstützende Fähigkeit zu analysieren. Als Ergebnis war das Wachstum von DW34 in der transduzierten Zelle BALB3T363S2 im Vergleich zu der Kontrollzelle BALB3T363S1 entsprechend der Darstellung in 1 verstärkt.
5. Physicochemische Eigenschaften des neuartigen Moleküls
1) Erkennung von Glykosylphosphatidylinositol (GPI) verankertem Protein.
Die von RA abgenommene Knochenmark-Stromazelllinie RASV5-5 der transduzierten Zelle BALB3T363S2 wurde in 1 % FCS enthaltender PBS bei 37°C in Gegenwart oder bei Abwesenheit von 2 U/ml von Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PIPLC, hergestellt von Funakoshi) für 1 bis 2 Stunden inkubiert, 2-mal mit der vorgenannten FACS-Pufferlösung gewaschen und anschließend in Gegenwart von RF3 für 20 Minuten inkubiert. Nachdem diese 2- mal mit der FACS-Pufferlösung gewaschen wurde, wurde sie weiter mit der FACS-Pufferlösung, die FITC-markierten Anti-Maus-Ziege-Ig-Antikörper (hergestellt von Cappel) enthielt, für 20 Minuten auf Eis inkubiert und 3-mal mit der FACS-Pufferlösung gewaschen und danach einen FACScan (hergestellt von Becton Dickinson) unterworfen.
Als ein Kontrolltest wurde CD29 (VLAβ1, hergestellt von Immunotech) in RASV5-5 verwendet und R25 in BALB3T363S2 (J. Immunol., 148:989-995 (1992)) als primärer Antikörper verwendet, wobei als sekundärer Antikörper der gleiche Antikörper wie vorstehend genannt verwendet wurde. Als Ergebnis wurde, obgleich in CD29 und R25 keinerlei Änderung der Fluoreszenzstärke erkannt wurde, die Abnahme der Fluoreszenzstärke in solchen erkannt, in denen ein RF3-Antikörper verwendet wurde. Es ist wahrscheinlich, dass das neuartige Molekül an einer Zellmembran über GPI entsprechend diesem Ergebnis gebunden sein kann.
2) Analyse des N-Endes
Die Analyse des hydrophoben Bereichs und des hydrophilen Bereichs des wie vorstehend erhaltenen Gens wurde unter Anwendung einer DNA-Analysensoftware "Gene Works" (2) ausgeführt. Als Ergebnis wurde ein hydrophober Bereich auf dem Abschnitt der 28 Aminosäure-Reste von der ersten bis zu der 28. Sequenz erkannt, die in der Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle dargestellt ist, und deshalb davon ausgegangen, dass das 29. Aminosäureglycin das N-Ende des vollentwickelten Proteins war.
Beispiel 2
1. Aufbau eines löslichen Adhäsionsmoleküls (sBst-1)
Nach der PCR-Mutagenese-Methode (M. Kamman et al., Nucl. Acids Res., 15:5404 (1989)) wurde ein lösliches Bst-1 aus einem Gen aufgebaut, das über ein Stop-Codon vor der Stelle verfügte, das der 272. Aminosäure entsprach. Dieses wurde mit Hilfe der PCR-Mutagenese-Methode erzeugt, indem S1 und S2' (S1-Primer: AAC CTC CAG AAG GAA AA; S2'-Primer: ACC CAA GCT TTC TAG ATC AAT AAA GAC TTG GGG CTT) als Primer und ein Plasmid pBst-1 als eine Template-DNA verwendet wurde.
100 μl einer PCR-Lösung enthalten 10 mMol Tris-HCl (pH: 8,3), 50 mMol KCl, 0,25 mMol dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5mMol M_gCl₂, 2,5 Einheiten von DNA-Polymerase AmpliTag (hergestellt von Perkin Elmer Cetus), 100pMol jedes Primers (S1 und S2') und 0,1 μg einer Plasmid-DNA. Die PCR-Lösung wurde mit 50 μl Mineralöl abgedeckt, bei einer Anfangstemperatur von 94°C für 1,5 Minuten erhitzt und der Heizcyclus anschließend für 1 Minute bei 94°C, für 1 Minute bei 50°C und für 1 Minute bei 72°C 25-mal wiederholt, dieses für 10 Minuten bei 72°C inkubiert.
Das DNA-Fragment von 274bp, ampliziert mit Hilfe der PCR-Methode, wurde mit 1,5% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunk (FMC, hergestellt von Bioproducts) gereinigt und anschließend mit Restriktionsenzymen BglII und HindIII (hergestellt von Takara Shuzo) digeriert. Das erhaltenen DNA-Fragment wurde in das pBst-1 ligiert, das mit Restriktionsenzymen BglII und HindIII (hergestellt von Takara Shuzo) mit Hilfe eines DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) nach einer dem Kit beigefügten Prozedur digeriert wurde, sodann digeriert mit Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII und anschließend mit 1,5% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC, hergestellt von Bioproducts) gereinigt, um etwa 1,0 kb des DNA-Fragmentes zu erhalten. An den Enden des DNA-Fragmentes wurden stumpfe Enden mit einem Klenow-Fragment erzeugt und das DNA-Fragment mit einem Restriktionsenzym BstXI digeriert und anschließend in pEF-BOS mit stumpfem Ende und hergestellt mit Hilfe eines Klenow-Fragmentes unter Anwendung eines DNA-Ligationskits (FMC, hergestellt von Takara Shuzo) nach der dem Kit beigefügten Prozedur insertiert, um pΔ 63-BOS zu erzeugen.
2. Expression mit Hilfe einer 293T-Zelle
Das auf diese Weise aufgebaute Expressionsplasmid pΔ 63-BOS wurde in Escherichia coli DH5α transduziert und das erhaltene Escherichia coli wird zur Amplifizierung der Plasmid-DNA in LB-Medium in Kultur genommen (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wonach die Plasmid-DNA aus dem Escherichia coli nach der Alkali-Methode (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) gewonnen wurde. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde durch 2-fache Wiederholung einer Ultrazentrifugation mit Hilfe der Methode des Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid-Dichtegradienten gereinigt und sodann in eine 293T-Zelle (Zelllinie hergestellt durch Transfektion einer SV40-groß-T-Antigen-cDNA in eine 293-Zelle (transformierte, primäre, embryonale Niere-Human-ATCC CRL 1573)) nach der Caltiumphosphat-Methode transfiziert.
Es wurden 10 μg der gereinigten Plasmit-DNA aufgelöst in 100 μl einer Pufferlösung, die 1 mMol Tris-HCl enthielt und 0,1 mMol EDTA, und danach 14 μl 2M CaCl₂ zugegeben, die resultierende Mischung mit einer Pufferlösung aus 50 mMol HEPES (pH: 7,1), 280 mMol NaCl und 1,5 mMol Natriumphosphat langsam gemischt und anschließend die erhaltene Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und zu 293T-Zellen in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben. Die 293T-Zellen wurden in DMEM (hergestellt von GIBCO)-Medium kultiviert, das 10% fötales Kälberserum enthielt (FCS, hergestellt von Bioproducts) und zwar für 24 Stunden und anschließend in DMEM-Medium (hergestellt von GIBCO) gegeben, das 1 % fötales Kälberserum enthielt (hergestellt von GIBCO) und unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Der Kulturüberstand in den 293T-Zellen wurde 48 Stunden später gewonnen, bis auf das 10-fache mit Hilfe einer Mikro-Konzentrationsvorrichtung (Centoprep 10, hergestellt von Amicon) eingeengt und sodann für den folgenden Test verwendet. In ähnlicher Weise wurde darüber hinaus pEF-BOS in eine 293T-Zelle transfiziert und ihr Kulturüberstand als Kontrolle verwendet.
3. Wachstumshemmung einer Prä-B-Lymphzelle DW34 mit Hilfe von sBst-1
Die biologischen Eigenschaften von sBst-1 wurden an Hand der Zahl der aufgezogenen Zellen als ein Index unter Verwendung einer Maus-Prä-B-Zelllinie DW34 analysiert, die unabhängig von Stromazellen mit Hilfe der folgenden Methode aufgezogen wurde.
Zunächst wurden die Knochenmark-Stromazelllinie RASV5-5 und die Synoviall-Zelllinie SynSV6-14 von Patienten mit RA, die über Prä-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, in 24-Mikrotiterplatten mit einer Rate von 1 × 10⁵ Zellen pro Mulde in Kultur genommen und 24 Stunden später mit 30 Gy bestrahlt. Die 2 × 10³ Zellen pro Mulde der Prä-B-Zelllinie DW34 wurden zugegeben und diese in RPMI-1640-Medium (hergestellt von GIBCO) kultiviert, das 10% FCS enthielt (hergestellt von Bioproducts) und zwar unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ für 4 Tage. Der eingeengte Kulturüberstand von 293T-Zellen, der sBst-1 enthielt, wurde mit der Tabelle 1 angegebenen Konzentration zugesetzt. Die Zahl der lebenden Zellen DW34 in jeder Mulde wurde mit Trypanblau-Farbstoffausschluß gezählt und die Wachstum unterstützende Fähigkeit davon analysiert. Als Ergebnis wurde das Wachstum von DW34 unabhängig von der Konzentration der 293T-Zellen gehemmt, die sBst-1 in dem Kulturüberstand entsprechend der Angabe in Tabelle 1 enthielten. Tabelle 1

Zahl der DW34 pro Mulde
(RASV5-5 : × 10^–4, SynSV6-14: × 10^–5) ± S.E.

Obgleich die vorliegende Erfindung an Hand der Beispiele zum Zwecke der Klarheit und des Eigenverständnisses bis zu einem gewissen Detail beschrieben worden ist, gilt als selbstverständlich, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Geltungsbereichs der beigefügten Ansprüche vorgenommen werden können.
SEQUENZ-LISTE

Claims

Polypeptid, enthaltend eine Aminosäuresequenz, dargestellt in der Sequenz Nr. 1 der Sequenztabelle, die über die Funktion der Unterstützung von Prä-B-Zellwachstum verfügt.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die in der Sequenz Nr. 1 der Sequenz-Tabelle gezeigte Aminosäuresequenz hat.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polypeptid enthält, das aus den Genen exprimiert ist, die mit dem Gen der Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle hybridisieren.