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TECHNISCHES
GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die als flk-2 bekannte
hämatopoetische Stammzellrezeptoren
erkennen sowie frühe
hämatopoetische
Stammzellpopulationen, die den flk-2-Rezeptor enthalten.
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STAND DER
TECHNIK
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Das
hämatopoetische
System der Säuger
enthält
rote und weiße
Blutzellen. Diese Zellen sind die ausgereiften Zellen, die aus frühen und
abstammungsbeschränkten
Vorläuferzellen
resultieren. Die Zellen des hämatopoetischen
Systems wurden von Dexter und Spooncer in Annual Review of Cell
Biology 3, 423–441 (1987)
zusammenfassend beschrieben.
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Rote
Blutzellen oder Erythrozyten stammen aus frühen Zellen, die Dexter und
Spooncer als Erythroid burst-forming units (BFU-E) bezeichnen. Die
direkten Nachfahren der Erythroid burst-forming units werden Erythroid
colony-forming units (CFU-E) genannt.
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Die
weißen
Blutzellen enthalten die ausgereiften Zellen des Lymph- und Myeloidsystems.
Die Lymphzellen umfassen B-Lymphozyten und T-Lymphozyten. Die B-
und T-Lymphozyten stammen aus frühen
Vorläuferzellen,
die Dexter und Spooncer als preT- und
preB-Zellen bezeichnen.
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Das
Myeloidsystem enthält
eine Reihe von Zellen, einschließlich Granulozyten, Monozyten,
Makrophagen und Megakaryozyten. Die Granulozyten sind wiederum in
Neutrophile, Eosinophile, Basophile und Mastzellen unterteilt. Die
Megakaryozyten stoßen
Teile ihres Zytoplasmas ab, um Blutplättchen auszubilden.
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Jede
der ausgereiften hämatopoetischen
Zellen ist auf spezielle Funktionen spezialisiert. Beispielsweise
sind Erythrozyten für
den Sauerstoff- und Kohlendioxidtransport verantwortlich. T- und
B-Lymphozyten sind jeweils für
die Zell- und Antikörpervermittelte
Immunantwort verantwortlich. Blutplättchen sind in die Blutgerinnung
involviert. Gra nulozyten und Makrophagen fungieren allgemein als
Scavenger und Helferzellen der Immunantwort gegen eindringende Organismen
und ihre Nebenprodukte.
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Im
Zentrum des hämatopoetischen
Systems stehen eine oder mehrere totipotente hämatopoetische Stammzellen,
die durch eine Reihe von Differenzierungsschritten zu immer stärker zelllinienbeschränkten Vorläuferzellen
führen.
Die stärker
ausgereiften Vorläuferzellen
sind auf die Herstellung von ein oder zwei Zelllinien beschränkt. Einige
von Dexter und Spooncer erwähnten
Beispiele von zelllinienbeschränkten
Vorläuferzellen
umfassen die Granulozyten/Makrophagen-koloniebildenden Zellen (GM-CFC).
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Das
hämatopoetische
System funktioniert mittels einer genau kontrollierten Produktion
verschiedener ausgereifter Zelllinien. Es wird angenommen, dass
die totipotente Stammzelle sowohl die Fähigkeit zur Selbsterneuerung
sowie zur Differenzierung in festgelegte Vorläufer für alle hämatopoetischen Zelllinien besitzt.
Die frühesten
hämatopoetischen
Zellen sind sowohl nötig
wie auch ausreichend zur vollständigen
und dauerhaften Wiederherstellung des hämatopoetischen Systems in Säugern nach
Strahlungsschädigung
des hämatopoetischen
Systems. Die Fähigkeit
der Stammzellen zur Regenerierung des gesamten hämatopoetischen Systems stellt
die Basis der Knochenmarkstransplantationstherapie dar.
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Menschliche
und Maus-hämatopoetische
Stammzellen sind durch die Anwesenheit bestimmter Antigene charakterisiert.
Beispielsweise zeigt die Anwesenheit des Stammzellantigens 1 (Sca-1)
und Thy-1 das Vorhandensein muriner hämatopoetischer Stammzellen
an. Siehe Tsukamoto et al., europäische Patentanmeldung 451,611.
Die Gegenwart von CD34, Thy-1 und Klasse II HLA (sowie seines konservierten
DR-Epitops, das von dem J1-43 benannten monoklonalen Antikörper erkannt
wird) weist in allen Fällen
auf die Anwesenheit menschlicher hämatopoetischer Stammzellen
hin.
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Die
für murine
hämatopoetische
Stammzellen charakteristischen Antigene wie Sca-1 und Thy-1 und für menschliche
hämatopoetische
Stammzellen wie Klasse II HLA, CD34+ und Thy-1 sind nicht ausschließlich auf
hämatopoetischen
Stammzellen und frühen
Vorläuferzellen
zu finden. Solche Antigene werden auch auf einer ganzen Reihe stärker ausgereifter,
zelllinienbeschränkter
Zellpopulationen gefunden.
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Hämatopoetische
Stammzellen sind auch durch die Abwesenheit einer Reihe anderer
Antigene charakterisiert, die nur auf stärker ausgereiften Zellen gefunden
werden. Einige Beispiele von menschlichen Antigenen, die nur auf
stärker
ausgereiften hämatopoetischen
Zellen gefunden werden, umfassen CD3, CD7, CD8, CD10, CD14, CD15,
CD19, CD20, CD33. Von diesen sind CD10, CD19 und CD20 mit B-Zellen
assoziiert; CD3, CD4 und CD8 mit T-Zellen assoziiert; und CD14,
CD15 und CD33 mit myeloiden Zellen assoziiert.
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Die
CD3-, CD8-, CD10-, CD19-, CD20- und CD33-Antigene werden gemeinsam
als Lin bezeichnet. Entsprechend ist eine hoch aufgereinigte menschliche
Stammzellpopulation durch CD34+ Lin- und CD34+ Lin- Thy-1+ charakterisiert.
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Es
wird immer erkennbarer, dass die Proteintyrosinkinasen (pTKs) eine
wichtige Rolle als zelluläre
Rezeptoren für
hämatopoetische
Wachstumsfaktoren spielen. Einige der Rezeptor-pTKs umfassen c-kit
und die Rezeptoren des colony stimulating factor 1 (CSF-1) und PDGF.
Diese Rezeptoren werden jedoch sowohl auf ausgereiften hämatopoetischen
Zellen wie auch auf frühen
hämatopoetischen
Stammzellen gefunden.
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Ein
Rezeptor, von dem gesagt wird, dass er mit frühen hämatopoetischen Stammzellen
assoziiert ist, ist der flk-2-Rezeptor. Die Nukleotidsequenz sowie
die Aminosäuresequenz
des flk-2-Rezeptors sind in der internationalen Patentanmeldung
US92/05401 von Ihor R. Lemischka sowie in Matthews et al., Cell
65, 1143–1152
(1991) wiedergegeben. Dieser Rezeptor definiert eine Population
früher
hämatopoetischer
Stammzellen (flk-2+).
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Leicht
unterschiedliche murine und intrazelluläre menschliche flk-2-Nukleotid-
und Aminosäuresequenzen
wurden von Rosnet et al. publiziert, die diesen Rezeptor als flt-3
bezeichnen, siehe jeweils Oncogene, 6, 1641–1650 (1991) und Genomics 9,
380–385
(1991). Es ist nicht bekannt, ob die Unterschiede in den Sequenzen
von Rosnet et al. 's
Artikeln und in der Patentanmeldung von Lemischka und dem Artikel
von Matthews et al. auf Sequenzierfehlern oder Polymorphismus beruhen.
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Verschiedene
Organe exprimieren den flk-2-Rezeptor. Solche Organe umfassen die
fetale Leber, fetale Milz, fetaler Thymus, das Gehirn des Erwachsenen
und Knochenmark des Erwachsenen. Zum Beispiel wird flk-2 in einzelnen
multipotenten CFU-Blast-Kolonien
exprimiert, die nach Verpflanzung in der Lage sind, verschiedene
multilineare Kolonien auszubilden.
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Der
flk-2-Rezeptor kann in leicht erkennbare Domänen aufgeteilt werden. Die
zu den pTKs korrespondierende DNA-Sequenz kodiert, angefangen an
ihren 5'-Enden,
eine hydrophobe Leader-Sequenz, der eine hydrophile extrazelluläre Domäne folgt.
Direkt unterhalb der extrazellulären
Rezeptordomäne
ist eine hydrophobe Transmembranregion. Der Transmembranregion folgt
unmittelbar eine einfache katalytische Domäne.
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Die
folgende Tabelle zeigt die Nukleinsäure- und Aminosäurezahlen,
die mit dem Signalpeptid, der extrazellulären Domäne, der Transmembranregion
und der intrazellulären
Domäne
für murines
flk-2 (mflk-2) und menschliches flk-2 (hflk-2) korrespondieren,
wie sie in der internationalen PCT-Anmeldung US92/05401 beschrieben
werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Antikörper zur Verfügung zu
stellen, die spezifisch an den flk-2-Rezeptor binden sowie an Zellen,
die den flk-2-Rezeptor exprimieren. Eine weitere Aufgabe ist es, Stammzellpopulationen
zur Verfügung
zu stellen, die durch die Gegenwart des flk-2-Rezeptors gekennzeichnet
sind. Diese und andere Aufgaben, die für den Fachmann ersichtlich
sind, wurden gelöst
durch Entwickeln von Hybridomzelllinien, welche den monoklonalen
anti-Maus flk-2-Ratten-Antikörper
2A13 (ATCC Hinterlegungsnummer HB 11444), den monoklonalen anti-Maus
flk-2- Ratten-Antikörper 23H
(ATCC Hinterlegungsnummer HB 11443), den monoklonalen anti-Mensch flk-2-Ratten-Antikörper 19A
(ATCC Hinterlegungsnummer HB 11442) und den monoklonalen anti-Mensch
flk-2-Maus-Antikörper
6J11 (ATCC Hinterlegungsnummer HB 11445) und den monoklonalen Anti-Mensch
flk-2-Ratten-Antikörper
71E exprimieren. Solche Antikörper
ermöglichen
die Isolierung einer hämatopoetischen
Stammzellpopulation, die durch die Gegenwart des flk-2-Rezeptors
charakterisiert ist, und sie können
auch als Agonisten und Antagonisten des flk-2-Rezeptors verwendet werden.
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Das
Verfahren zur Isolierung einer Population von hämatopoetischen Stammzellen,
die den flk-2-Rezeptor exprimiert, aus einer Mischung hämatopoetischer
Stammzellen, umfasst die folgenden Schritte: (a) das Binden der
Zellen, die den flk-2-Rezeptor exprimieren, an einen anti-flk-2-Antikörper; (b)
das Trennen der an den anti-flk-2-Antikörper gebundenen Zellen, die
den flk-2-Rezeptor exprimieren, von dem Rest der Mischung aus hämatopoetischen
Zellen; (c) das Lösen
der Bindung der Zellen, die den flk-2-Rezeptor exprimieren, von dem
anti-flk-2-Antikörper,
und (d) das Isolieren der Zellen, die den flk-2-Rezeptor exprimieren.
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BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1A.
Titration von 23H7 durch ELISA (Beispiel 10).
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1B.
Titration von 2A13 durch ELISA (Beispiel 10).
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2.
FACS-Analyse von Saponin-behandelten 3T3-Zellen und i3T3-Zellen
mit 2A13 (Beispiel 12).
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3.
Analyse der 2A13 und 23H7-Bindung an Flag-mflk-2 auf dem Biacore
(Beispiel 12).
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DETAILLYERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Antikörper
der vorliegenden Erfindung sind gegen eine fetale Leberkinase 2
(flk-2) genannte Proteintyrosinkinase gezüchtet und binden spezifisch
an diese. Zum Zwecke dieser Beschreibung soll flk-2 den Tyrosinkinaserezeptor
bedeuten, wie er von Lemischka in der internationalen PCT-Anmeldung
US92/05401 und in Cell 65, 1143–1152
(1991) sowie von Rosnet als flt-3 in Oncogene 6, 1641–1650 (1991)
und in Genomics 9, 380–385
(1991) beschrieben wurde. Die Antikörper sind vorzugsweise gegen
die extrazelluläre
Rezeptordomäne
des flk-2-Rezeptors gezüchtet
und für
diesen spezifisch.
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Der
flk-2-Rezeptor, gegen den diese Antikörper hergestellt wurden, kann
an eine Zelle gebunden sein. Alternativ kann der flk-2-Rezeptor
frei von Zellen vorliegen, vorzugsweise in löslicher Form.
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Funktionale Äquivalente
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Die
Erfindung umfasst auch funktionale Äquivalente der Antikörper, die
in dieser Beschreibung beschrieben sind. Funktionale Äquivalente
haben Bindungscharakteristika, die vergleichbar mit denen der Antikörper sind,
und umfassen, beispielsweise, einzelkettige, chimerisierte und humanisierte
Antikörper.
Chimerisierte Antikörper
haben vorzugsweise konstante Regionen, die im Wesentlichen oder
ganz von menschlichen Antikörper
konstanten Regionen abgeleitet sind, sowie variable Regionen, die
im Wesentlichen oder ganz von der Sequenz der variablen Region eines
Säugetiers
abgeleitet sind, das kein Mensch ist. Humanisierte Antikörper haben
vorzugsweise konstante Regionen und variable Regionen, außer den
Komplement-bestimmenden Regionen (complement determining regions,
CDRs), die im Wesentlichen oder ganz von den korrespondierenden
humanen Antikörperregionen
abgeleitet sind und CDRs, die im Wesentlichen oder ganz von einem Säugetier
abgeleitet sind, das kein Mensch ist. Geeignete Säuger außer dem
Menschen umfassen jegliche Säugetiere,
von denen monoklonale Antikörper
hergestellt werden können,
wie Kaninchen, Ratte, Maus, Pferd, Ziege oder Primat.
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Funktionelle Äquivalente
umfassen ferner Fragmente von Antikörpern, die die gleichen Bindungscharakteristika
oder vergleichbare Bindungscharakteristika haben wie der ganze Antikörper. Solche
Fragmente können
ein oder beide Fab-Fragmente oder das F(ab')2-Fragment
beinhalten. Vorzugsweise enthalten die Antikörperfragmente alle sechs Komplement-bestimmenden
Regionen des gesamten Antikörpers,
obwohl Fragmente, die weniger als alle solcher Regionen enthalten,
wie drei, vier oder fünf
CDRs, auch funktionell sein können.
Fragmente können
durch Verfahren hergestellt werden, wie sie von Lamoyi et al. in
Journal of Immunological Methods 56, 235–243 (1983) und von Parham
in Journal of Immunology 131, 2895–2902 (1983) beschrieben werden.
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Herstellung der flk-2-Rezeptoren
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Um
die flk-2-Rezeptoren herzustellen, gegen die die Antikörper gemacht
sind, können
Nukleinsäuremoleküle, die
die flk-2-Proteine der Erfindung kodieren, oder Teile davon, insbesondere
die extrazellulären
Teile davon, in bekannte Expressionsvektoren unter Verwendung von
standard rekombinanter DNA-Techniken eingefügt werden. Standard rekombinante
DNA-Techniken werden in Sambrook et al., "Molecular Cloning," Second Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1987) und von Ausubel et al. (Eds) "Current Protocols in
Molecular Biology," Green
Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990) beschrieben.
Die Vektoren können
ringförmig
(beispielsweise Plasmide) oder nicht ringförmig sein. Standardvektoren
sind zur Klonierung und Expression in einer Wirtszelle verfügbar.
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Die
Wirtszelle kann prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Prokaryontische
Wirtszellen sind vorzugsweise E. coli. Bevorzugte eukaryontische
Wirtszellen umfassen Hefe, Insekten- und Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen
umfassen beispielsweise CHO, COS und menschliche Zellen.
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Die
in die Wirtszelle eingefügte
DNA kann den gesamten extrazellulären Teil des flk-2-Rezeptors kodieren
oder ein lösliches
Fragment des flk-2-Rezeptors. Der durch die DNA kodierte extrazelluläre Teil
des flk-2-Rezeptors ist wahlweise an einem oder beiden der 5'- oder 3'-Enden mit zusätzlichen
Aminosäuresequenzen
versehen. Die zusätzliche
Aminosäuresequenz
kann natürlicherweise
mit der flk-2 extrazellulären Region
verbun den sein, wie solche, die die Leader-Sequenz, die Transmembranregion
und/oder die intrazelluläre
Region des flk-2 darstellen. Die zusätzlichen Aminosäuresequenzen
können
aber auch Sequenzen sein, die nicht in der Natur mit dem flk-2 verbunden
sind. Vorzugsweise dienen die zusätzlichen Aminosäuresequenzen
einem bestimmten Zweck, wie der Verbesserung der Expression, der
Löslichkeit
oder der Immunogenizität.
Einige geeignete zusätzliche
Aminosäuresequenzen
umfassen beispielsweise das FLAG-Peptid (DYKDDDDKI),
das wahlweise an einem der beiden Enden an den Fc-Teil eines Immunoglobulins
(Ig) gebunden sein kann.
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Bezugsauelle der flk-2-Rezeptor
kodierenden DNA
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Zur
Herstellung von Nukleinsäuremolekülen, die
den flk-2 kodieren, wird eine Bezugsquelle von Zellen zur Verfügung gestellt,
die den flk-2 exprimieren. Geeignete fetale Quellen umfassen Leber,
Milz oder Thymuszellen. Geeignete ausgewachsene Quellen umfassen
Knochenmark, Blut (peripheres oder Nabelschnur) oder Hirnzellen.
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Beispielsweise
können
geeignete fetale Maus-Leberzellen am 14. Tag der Schwangerschaft
gewonnen werden. Fetale Maus-Thymuszellen können am 14.-18., vorzugsweise
am 15. Tag der Schwangerschaft gewonnen werden. Geeignete fetale
Zellen anderer Säugetiere
können
zu Zeiten der Schwangerschaft gewonnen werden, die mit den Zeiten
der Schwangerschaft der Maus korrespondieren.
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Isolierung der flk-2-Rezeptor
kodierenden Nukleinsäuremoleküle
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Gesamt-RNS
wird nach Standardverfahren aus flk-2-Rezeptor-enthaltendem Gewebe
oder Zellen gewonnen. Die Gesamt-RNA wird zur cDNA-Synthese verwendet.
Standardverfahren zur Isolierung von RNA und zur Synthese von cDNA
werden in den Standardhandbüchern
der Molekularbiologie zur Verfügung
gestellt, wie beispielsweise in Sambrook et al., "Molecular Cloning," Second Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und in Ausubel et al.
(Eds), "Current
Protocols in Molecular Biology," Greene
Associates/Wiley Interscience, New York (1990).
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Die
cDNA der Rezeptoren kann durch bekannte Methoden amplifiziert werden.
Beispielsweise kann die cDNA als Matrize zur Amplifikation durch
Polymerasekettenreakti on (polymerase chain reaction, PCR) verwendet
werden; siehe Saiki et al., Science, 239, 487 (1988) oder Mullis
et al., US-Patent 4,683,195. Die Sequenzen der Oligonukleotidprimer
für die
PCR-Amplifikation werden jeweils den Sequenzen von Maus- und Mensch-flk-2
entnommen. Die Oligonukleotide werden nach Verfahren aus dem Stand
der Technik synthetisiert. Geeignete Verfahren umfassen die von
Caruthers in Science 230, 281–285
(1985) beschriebenen.
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Zur
Isolierung der gesamten Protein-kodierenden Regionen für die flk-2-Rezeptoren
ist der stromaufwärts
gelegene PCR-Oligonukleotidprimer komplementär zur Sequenz des 5'-Endes, vorzugsweise
umfassend das ATG-Startcodon und mindestens 5–10 Nukleotide oberhalb des
Startcodons. Der stromabwärts
gerichtete PCR-Oligonukleotidprimer ist komplementär zur Sequenz
am 3'-Ende der gewünschten
DNA-Sequenz. Vorzugsweise kodiert die gewünschte DNA-Sequenz den gesamten
extrazellulären
Teil des flk-2-Rezeptors und wahlweise kodiert sie alles oder einen
Teil der Transmembranregion und/oder alles oder einen Teil der intrazellulären Region
einschließlich
des Stopcodons. Eine Mischung von upstream- und downstream-Oligonukleotiden
wird zur PCR-Amplifikation verwendet. Die Bedingungen für jedes
individuelle Primerpaar werden nach Standardverfahren optimiert.
Das PCR-Produkt kann durch aus dem Stand der Technik bekannte Methoden
auf cDNA mit der korrekten Größe, die
der Sequenz zwischen den Primern entspricht, analysiert werden.
Geeignete Verfahren umfassen beispielsweise die Elektrophorese.
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Alternativ
kann die kodierende Region in zwei oder mehr überlappende Fragmente amplifiziert
werden. Die überlappenden
Fragmente sind so gewählt,
dass sie eine Restriktionsschnittstelle umfassen, die das Zusammenfügen einer
intakten cDNA aus den Fragmenten ermöglicht.
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Die
flk-2-Rezeptoren kodierende DNA kann in einer Vielzahl von Klonierungsvektoren
in einer Vielzahl von Wirtszellen repliziert werden. Die Wirtszelle
kann prokaryontisch oder eukaryontisch sein.
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Die
Vektoren, in die die DNA eingespleist ist, können Segmente chromosomaler,
nicht chromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen enthalten. Einige
geeignete prokaryontische Klonierungsvektoren umfassen Plasmide
von E. coli, wie colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM und RP4.
Prokaryontische Vektoren umfassen auch Derivate von Phagen-DNA wie
M13 und andere filamentöse
einzelsträngige
DNA-Phagen.
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Expression und Isolierung
von Rezeptoren
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Die
die Rezeptoren der Erfindung kodierende DNA wird in geeignete Expressionsvektoren
eingefügt und
in geeigneten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen
exprimiert. Vektoren zur Expression von Proteinen in Bakterien,
insbesondere E. coli, sind bekannt. Solche Vektoren umfassen die
PATH-Vektoren wie sie von Dieckmann und Tzagoloff in J. Biol. Chem.
260, 1513–1520
(1985) beschrieben werden. Diese Vektoren enthalten DNA-Sequenzen,
die die Anthranilat-Synthetase (TrpE) kodieren, an die sich ein
Polylinker am Carboxyterminus anschließt. Andere Expressionsvektorsysteme
basieren auf beta-Galactosidase (pEX); lambda PL;
Maltose-bindendes Protein (pMAL); und Glutathion-S-transferase (pGST) – siehe
Gene 67, 31 (1988) und Peptide Research 3, 167 (1990).
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Vektoren
zur Verwendung in Hefe sind verfügbar.
Ein geeignetes Beispiel ist das 2µ-Plasmid.
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Geeignete
Vektoren zur Verwendung in Säugetierzellen
sind auch bekannt. Solche Vektoren umfassen die gut bekannten Derivate
des SV-40, Adenovirus, Retrovirus-abgeleitete DNA-Sequenzen und
Shuttle-Vektoren, die aus einer Kombination funktioneller Säugetiervektoren
abgeleitet sind, wie die, die oben beschrieben sind und funktionelle
Plasmide und Phagen-DNA.
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Weitere
eukaryontische Expressionsvektoren sind aus dem Stand der Technik
bekannt (z.B., P.J. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1,
327–341
(1982); S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854–864 (1981);
R.J. Kaufmann und P.A. Sharp, "Amplification
And Expression Of Sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate
Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol. 159, 601–621 (1982);
R.J. Kaufmann und P.A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601–664 (1982);
S.I. Scahill et al., "Expression
And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon
DNA Gene In Chinese Hamster Ocary Cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4654–4659 (1983);
G. Urlaub und L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216–4220, (1980).
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Die
für die
vorliegende Erfindung brauchbaren Expressionsvektoren enthalten
mindestens eine Expressionskontrollsequenz, die operativ mit der
DNA-Sequenz oder dem Fragment, das exprimiert werden soll, verbunden
ist. Die Kontrollsequenz ist in den Vektor eingefügt, um die
Expression der klonierten DNA-Sequenz zu kontrollieren und zu regulieren.
Beispiele für
brauchbare Expressionskontrollsequenzen sind das lac-System, das
trp-System, das tac-System, das trc-System, die hauptsächlichen
Operator- und Promoter-Regionen des lambda-Phagen, die Kontrollregion
des fd-Hüllproteins,
die glycolytischen Promotoren der Hefe, z.B. der Promotor von 3-Phosphoglycerat-Kinase,
die Promotoren der Hefesäurephosphatase,
z.B. Pho5, die Promotoren der Hefe alphamating Faktoren und Promotoren,
die aus Polyoma, Adenovirus, Retrovirus und Simian Virus abgeleitet
sind, z.B. die frühen
und späten
Promotoren oder SV40 und andere Sequenzen, von denen bekannt ist,
dass sie die Expression von Genen von prokaryontischen oder eukaryontischen
Zellen und deren Viren oder Kombinationen davon kontrollieren.
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Rezeptor-kodierende
DNA und Kontrollsignale enthaltende Vektoren werden in die Wirtszelle
zur Expression des Rezeptors eingefügt. Einige brauchbare Expressionswirtszellen
umfassen bekannte prokaryontische und eukaryontische Zellen. Einige
geeignete prokaryontische Wirtszellen umfassen beispielsweise E. coli,
wie E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776,
E. coli X2282, E. coli DHI und E. coli MRCI, Pseudomonas, Bacillus
wie Bacillus subtilis und Streptomyzeten. Geeignete eukaryontische
Zellen umfassen Hefe und andere Pilze, Insekten-, tierische Zellen,
wie COS-Zellen und
CHO-Zellen, menschliche Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekultur.
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Nach
der Expression in einer Wirtszelle, die sich in einem geeigneten
Medium befindet, können
die flk-2-Rezeptoren aus dem Medium isoliert werden und nach dem
Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden. Wenn die
flk-2-Rezeptoren nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, werden
die Wirtszellen vor der Isolierung und Reinigung lysiert.
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Zellen, die die flk-2-Rezeptoren
zur Verwendung als Antigen exprimieren
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Andere
Quellen von flk-2-Rezeptoren zur Herstellung der Antikörper der
Erfindung sind flk-2-Rezeptoren, die auf der Oberfläche von
Zellen gebunden sind, die den flk-2-Rezeptor exprimieren. Die Zellen,
an welche die flk-2-Rezeptoren gebunden sind, können Zellen sein, die natürlicherweise
den Rezeptor exprimieren wie hämatopoetische
Stammzellen. Alternativ kann die Zelle, an welche der vollständige oder
trunkierte Rezeptor gebunden ist, eine solche Zelle sein, in welche
die den Rezeptor kodierende DNA transfiziert wurde, wie 3T3-Zellen.
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Bevorzugte
Quellen von Säugetierstammzellen,
die die flk-2-Rezeptoren zur Verwendung als Antigene zur Herstellung
von anti-flk-2-Antikörpern
exprimieren, umfassen Knochenmark und ausgewachsene periphere oder
Nabelschnurblutzellen. Stammzellen können aus Knochenmark oder Blut
nach Verfahren aus dem Stand der Technik isoliert werden.
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Herstellung
von Antikörpern
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Die
Antikörper
können
polyklonal oder monoklonal sein. Die Antikörper können, wie oben beschrieben, nach
bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik modifiziert sein.
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Die
Antikörper
sind vorzugsweise monoklonal. Monoklonale Antikörper können nach den Verfahren aus
dem Stand der Technik hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen
das immunologische Verfahren, das von Kohler und Milstein in Nature
256, 495–497
(1975) beschrieben wird, und das Verfahren von Campbell in "Monoclonal Antibody
Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human
Hybridomas" in Burdon
et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985);
sowie die rekombinanten DNA-Verfahren, die von Huse et al. in Science 246,
1275–1281
(1989) beschrieben werden.
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Isolierung einer Stammzellpopulation,
die den flk-2-Rezeptor exprimiert
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Es
wird eine Quelle hämatopoetischer
Stammzellen zur Verfügung
gestellt. Diese Quelle ist normalerweise eine Mischung hämatopoetischer
Zellen, die die gewünschte
Population von Stammzellen, die den flk-2-Rezeptor exprimieren,
sowie ausgereiftere Zellen, die den flk-2-Rezeptor nicht exprimieren,
enthält.
Geeignete fetale Quellen hämatopoetischer
Stammzellen umfassen Leber, Milz oder Thymus. Geeignete ausgewachsene
Quellen von hämatopoetischen
Stammzellen umfassen Knochenmark, Blut (peripheres oder Bauchnabel)
oder Hirnzellen. Die bevorzugte Quelle ist menschliches erwachsenes
Knochenmark.
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Geeignete
hämatopoetische
Stammzellen können
aus einem geeigneten Säugetierspender
durch Verfahren aus dem Stand der Technik gewonnen werden. Beispielsweise
kann Knochenmark von einem menschlichen Patienten gewonnen werden,
der eine autologe Knochenmarkstransplantation durchmacht. Alternativ
kann Knochenmark aus einem geeigneten Knochenmarksdonor gewonnen
werden, der an einer allogenen Transplantation teilnimmt.
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Die
Quelle von Stammzellen wie Blut oder Knochenmarkszellen wird einem
Antikörper
ausgesetzt, der den flk-2-Rezeptor bindet, wie ein Antikörper der
vorliegenden Erfindung, vorzugsweise der monoklonale 19A-Antikörper oder
der monoklonale 6J11-Antikörper.
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Die
Zellen, die den flk-2-Rezeptor exprimieren, also die flk-2+-Population
der Zellen, werden an den anti-flk-2-Antikörper gebunden. Die an die Antikörper gebundenen
Zellen werden wahlweise von den ungebundenen Zellen nach Verfahren
aus dem Stand der Technik getrennt und dann frei von dem Antikörper isoliert. Zum
Beispiel können
die Zellen von den Antikörpern
durch Behandlung mit einer Protease wie Chymotrypsin getrennt werden.
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In
einer Ausführungsform
ist ein anti-flk-2-Antikörper
der Erfindung an einen festen Träger
gebunden. Einige geeignete feste Träger umfassen Nitrozellulose,
Agaroseperlen, Polystyrolperlen, Hohlfasermembranen und Plastikpetrischalen.
Beispielsweise kann der Antikörper
kovalent an Pharmacia Sepharose 6MB Makroperlen gebunden sein. Die genauen
Bedingungen und die Dauer der Inkubation für die festphasengebundenen
Antikörper
mit der Markszellsuspension ist abhängig von einer Reihe von Faktoren,
die spezifisch für das
verwendete System und im Stand der Technik bekannt sind.
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An
den Antikörper
gebundene Zellen werden aus der Zellsuspension durch die physikalische
Trennung des festen Trägers
aus der Zellsuspension entfernt. Beispielsweise werden die ungebundenen
Zellen nach einer ausreichenden Zeit zur Bindung des Trägermaterials
an die Stammzellen eluiert oder mit physiologischem Puffer ausgewaschen.
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Die
gebundenen Zellen werden abhängig
hauptsächlich
von der Natur der festen Phase und des Antikörpers von der festen Phase
durch ein geeignetes Verfahren getrennt. Zum Beispiel können gebundene
Zellen aus einer Plastikpetrischale durch heftiges Schütteln eluiert
werden. Alternativ können
gebundene Zellen auch durch das enzymatische "nicking" oder den Verdau einer Enzym-sensiblen "spacer"-Sequenz zwischen der
festen Phase und dem Antikörper
eluiert werden. Geeignete Spacer-Sequenzen, die an Agaroseperlen
gebunden sind, sind beispielsweise von Pharmacia käuflich verfügbar.
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Die
eluierte angereicherte Zellfraktion kann dann mit einem Puffer durch
Zentrifugation gewaschen werden und gemäß herkömmlicher Technologie bei niedrigen
Temperaturen zur späteren
Nutzung in einem lebensfähigen
Zustand aufbewahrt werden. Die Zellen können auch sofort verwendet
werden, z.B. zur intravenösen
Infusion eines Transplantationsempfängers.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante
des oben beschriebenen Verfahrens wird Blut direkt aus dem Kreislauf
eines Spenders entnommen. Das Blut wird kontinuierlich durch eine
Kolonne perkoliert, die einen Festphasen-gebundenen monoklonalen
Antikörper
zur Entfernung der Stammzellen enthält. Das Stammzell-reduzierte
Blut wird umgehend in das Kreislaufsystem des Spenders zurückgeführt unter
Verwendung von Methoden des Standes der Technik wie der Hämapherese.
Das Blut wird auf diese Weise solange behandelt bis eine ausreichende
Anzahl von Stammzellen an die Kolonne gebunden hat. Dieses Verfahren erlaubt
die seltenen peripheren Blutstammzellen aus einem sehr großen Blutvolumen
zu isolieren, wobei dem Spender die Kosten und die Schmerzen einer
Isolierung aus Knochenmark erspart bleiben sowie die damit assoziierten
Risiken der Anästhesie,
Analgesie, Bluttransfusion und Infektion.
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Die
nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellten Stammzellsuspensionen
enthalten im Wesentlichen Zellpopulationen, die den flk-2-Rezeptor
(flk-2+) exprimieren. Solche Zellsuspensionen sind im Wesentlichen
frei von ausdifferenzierten lymphoiden und myeloiden Zellen.
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Andere
Verfahren zur Isolierung gereinigter Populationen von flk-2+-Antikörpern sind
auch bekannt. Solche Methoden umfassen die magnetische Trennung
von Antikörperbelegten
magnetischen Perlen, Affinitätschromatografie,
cytotoxische Agenzien wie Komplement, an das der Antikörper gebunden
ist und "panning" mit einem Antikörper, der
an ein festes Trägermaterial
gebunden ist.
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Allgemeines Protokoll
zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein markierter Antikörper
der Erfindung an flk-2+-Zellen gebunden und die markierten Zellen
durch einen mechanischen Zellsortierer abgetrennt, der die Gegenwart des
Marker erkennt. Der bevorzugte mechanische Zellsortierer ist ein
Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (FACS). FACS-Maschinen sind
kommerziell verfügbar.
Im Allgemeinen ist das folgende FACS-Protokoll für dieses Verfahren geeignet:
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Ein
Coulter Epics Eliter sorter wird dadurch sterilisiert, dass 70 %iges
Ethanol durch das System läuft. Die
Verbindungen werden mit sterilem destillierten Wasser gewaschen.
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Die
Zellen werden mit einem primären
Antikörper
wie 19A oder 6J11 für
60 Minuten auf Eis inkubiert, wobei die Zellen mit Hank's-Salzlösung verdünnt werden,
die mit 1 %igem Rinderserumalbumin (HB) versetzt ist. Die Zellen
werden mit HB gewaschen und mit einem sekundären mit Fluorescein-Isothiocyanat
(FITC) markierten Antikörper
für 30
Minuten auf Eis inkubiert. Der zweite Marker bindet den primären Antikörper. Zum
Beispiel ist im Falle des 19A ein geeigneter sekundärer Antikörper der
anti-Ratte-Ziegen-FITC.
Im Fall von 6J11 ist ein geeigneter sekundärer Antikörper der anti-Maus-Ziegen-FITC. Die
Sortierungsparameter wie Grundlinienfluoreszenz werden mit einem unwichtigen
primären
Antikörper
bestimmt. Die endgültige
Zellkonzentration wird im Allgemeinen auf eine Million Zellen pro
ml eingestellt.
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Während die
Zellen markiert werden, wird eine Sortierungsmatrix unter Verwendung
der Fluoreszenzperlen als Mittel zur Justierung des Instruments
bestimmt.
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Sobald
die geeigneten Parameter bestimmt sind, werden die Zellen sortiert
und in sterilen Röhren
gesammelt, die Medium enthalten, das mit fetalem Rinderserum und
Antibiotika versetzt wurde (im Allgemeinen Penicillin, Streptomycin
und/oder Gentamycin). Nach der Sortierung werden die Zellen noch
einmal auf dem FACS analysiert, um die Reinheit der Sortierung zu
bestimmen.
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Flusscytometrie
-
Ein
weiteres Verfahren zur Isolierung von flk-2+-Zellpopulationen ist
die Flusscytometrie; siehe z.B. Loken et al., europäische Patentanmeldung
317,156. Die erhaltenen Zellen können
dadurch untersucht oder allgemein verwendet werden, dass sie strahlungsbehandelten
Säugetieren
nach bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik zur Rekonstitution
des hämatopoetischen
Systems des Säugetiers
eingepflanzt werden, wie es im Folgenden beschrieben wird; siehe
beispielsweise Jordan et al., Cell 61, 953–963 (1990).
-
Vorgereinigte
Stammzellpopulation
-
Bevor
grob gereinigte hämatopoetische
Zellpopulationen mit den Antikörpern
der Erfindung behandelt werden, werden diese Zellen vorzugsweise
nach Verfahren aus dem Stand der Technik vorgereinigt. Zum Beispiel
können
menschliche hämatopoetische
Stammzellen mittels des anti-My-10 monoklonalen Antikörpers gereinigt
werden, wie er von Civin in dem US-Patent 5,130,144 beschrieben
wird. Die Hybridomzelllinie, die den anti-My-monoklonalen Antikörper exprimiert,
ist von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, USA verfügbar. Der anti-My-10 monoklonale
Antikörper
bindet an das CD34- Antigen. Zellpopulationen, die im Wesentlichen
aus CD34-exprimierenden Zellen bestehen, werden als CD34+-Population
von Stammzellen bezeichnet. Einige zusätzliche Quellen von Antikörpern, die
in der Lage sind CD34+-Zellen zu selektieren, umfassen AMAC, Westbrook,
Maine; Coulter, Hialea, Florida; und Becton Dickinson, Mountain
View, Kalifornien. CD34+-Zellen können auch mittels vergleichbarer
Antikörper isoliert
werden, wie sie nach bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik
herstellbar sind, wie die, die von Civin im US-Patent 5,130,144
beschrieben werden.
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Die
oben beschriebene CD34+-Population menschlicher hämatopoetischer
Stammzellen wird vorzugsweise weiter gereinigt mittels des Thy-1-Antikörpers und/oder
der Palette von Lin-Antikörpern
durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren; siehe Tsukamoto
et al. US-Patent 5,061,620. Die bevorzugte Zellpopulation, die zur
Herstellung der flk-2+-Stammzellpopulation mit den Antikörpern der
Erfindung verwendet wird, ist daher vorzugsweise CD34+, mehr bevorzugt
CD34+ Lin- und am meisten bevorzugt CD34+ Lin- Thy-1+. Solche Zellpopulationen
werden vorzugsweise weitergereinigt mittels Antikörpern gegen
Klasse II HLA (einschließlich
seines konservierten DR-Epitops, das durch den J1-43 genannten monoklonalen
Antikörper
erkannt wird), so dass sie Klasse II HLA+ sind.
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VERWENDUNG
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Die
flk-2+-Zellpopulationen der Erfindung können dazu verwendet werden,
die Zellen des Erythroid-, Myeloid- oder Lymphsystems in einem Säugetier
wiederherzustellen, das die Fähigkeit
zur Herstellung solcher Zellen verloren hat, beispielsweise durch
Strahlenbehandlung. Geeignete Säugetiere
umfassen beispielsweise Mäuse,
Ratten, Kaninchen und Menschen. Vorzugsweise werden flk-2+ Zellpopulationen
verwendet, um zwei der Systeme wiederherzustellen und mehr bevorzugt,
um alle drei dieser Systeme wiederherzustellen.
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Entsprechend
können
die flk-2+-Stammzellpopulationen der Erfindung für therapeutische Verfahren wie
die Stammzelltransplantation und andere verwendet werden, die den
Fachleuten gegenwärtig
sind. Beispielsweise können
solche Zellpopulationen einem Patienten intravenös zugeführt werden, der eine Knochenmarkstransplantation
braucht, wie z.B. bei Strahlentherapie-behandelten Säugern, in
einer Menge, die ausreichend ist, das hämatopoetische und/oder das
Immunsystem des Patienten wiederherzustellen oder einen Teil des
hämatopoetischen
und Immunsystems des Patienten wiederherzustellen.
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Die
zur Wiederherstellung des hämatopoetischen
und/oder Immunsystems eines Patienten nötige Anzahl von Zellen in der
flk-2+Stammzellpopulation kann leicht durch den Fachmann bestimmt
werden. Diese Anzahl wird von dem genauen Zustand, der durch die
Therapie behandelt wird, abhängig
sein sowie von den relevanten Besonderheiten des Säugers wie
Alter, Größe, Gesundheit,
etc. Im Allgemeinen ist eine Menge von flk-2+-Stammzellen, die ungefähr die gleiche
Anzahl von Stammzellen enthält,
wie sie in einem halben bis ganzen Liter von aspiriertem Mark zu
finden ist, ausreichend.
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Zusätzlich zu
den therapeutischen Verwendungen wie sie oben beschrieben wurden
kann die flk-2+Zellpopulation als Ausgangsmaterial zur Herstellung
weiterer wertvoller Materialien verwendet werden. Beispielsweise
können
die Zellen als Quelle für
die flk-2-Rezeptoren
oder die DNA, die diese Rezeptoren kodiert, verwendet werden oder
als Antigen zur Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper, die
den flk-2-Rezeptor oder andere Antigene auf der Oberfläche von
flk-2+-Zellen erkennen und binden.
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Die
Antikörper
der vorliegenden Erfindung können
zur Isolierung und Reinigung löslicher
flk-2-Rezeptoren wie auch von flk-2+ hämatopoetischen Stammzellen,
wie oben beschrieben, verwendet werden. Zudem können die Antikörper auch
diagnostisch verwendet werden zur Bestimmung der Menge an flk-2+Stammzellen oder
zur Bestimmung von Antikörpern
gegen den flk-2+Rezeptor in biologischen Proben. Einige Beispiele
biologischer Proben umfassen Körperflüssigkeiten
wie Knochenmark oder Blut. Eine solche diagnostische Verwendung
umfasst beispielsweise die Markierung von Antikörpern und die Durchführung von
Standardimmunoassays wie Radioimmunoassays wie sie im Stand der
Technik bekannt sind.
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Die
Antikörper
können
auch zur Detektion der Anwesenheit von flk-2 enthaltenden Zellen
in vitro verwendet werden wie Tumorzellen oder zur Darstellung solcher
Zellen in vivo. Geeignete Tumorzellen umfassen Leukämiezellen
wie beispielsweise akute myelogenose Leukämie und akute lymphozytische
Leukämie.
Die Antikörper
sind markiert und nachweisbar oder darstellbar durch aus dem Stand
der Technik bekannte Verfahren.
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Die
Antikörper
können
auch in vitro oder in vivo dazu verwendet werden, flk-2-Rezeptorwachstumsfaktoren
dadurch nachzuahmen, dass die Antikörper die Fähigkeit haben, an den flk-2-Rezeptor
zu binden, beispielsweise als Agonisten dieses Rezeptors. Solche
Agonisten sind wünschenswert,
um Zellen wachsen zu lassen, die den flk-2-Rezeptor exprimieren
wie hämatopoetische
Stammzellen. Solche Agonisten sind auch wünschenswert, um das Wachstum
von Zellen zu verhindern, die den flk-2-Rezeptor exprimieren oder überexprimieren,
wie Tumorzellen, insbesondere Tumorzellen des hämatopoetischen Systems, z.B.
die oben genannten Leukämiezellen
durch das Verursachen endgültiger
Differenzierung. Zum Beispiel sind einige Antikörper der Erfindung in der Lage,
flk-2-Rezeptor-Wachstumsfaktoren dadurch zu simulieren, dass sie
flk-2-Rezeptor-enthaltende Zellen zur Proliferation und/oder Differenzierung
stimulieren.
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Alternativ
können
die Antikörper
der Erfindung als Antagonisten von flk-2-Rezeptor-Wachstumsfaktoren
verwendet werden. Solche Antagonisten sind wünschenswert, um das Wachstum
von Zellen zu verhindern, welche den flk-2-Repeztor exprimieren
oder überexprimieren,
wie etwa Tumorzellen, insbesondere Tumorzellen des hämatopoetischen
Systems, d.h. leukämische
Zellen. Zum Beispiel kann die Bindung von Antikörpern an den flk-2-Rezeptor
die Proliferation und/oder Differenzierung von flk-2+-Zellen durch
Verhindern der Bindung des flk-2-Rezeptor-Wachstumsfaktors an die
Zellen verringern oder verhindern. Die Bindung von Antikörpern an
den flk-2-Rezeptor auf flk-2+-Zellen kann auch für die Zellen toxisch sein,
z.B. durch Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC).
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Falls
die Antikörper
selbst nicht toxisch oder nicht ausreichend toxisch sind, können die
Antikörper
toxisch oder toxischer gemacht werden durch die Verabreichung der
Antikörper
an einem Säuger
in Kombination mit einem oder mehreren Cytotoxinen. Die Antikörper und
Cytotoxine können
einem Säuger,
wie etwa einem vorstehend beschriebenen Säuger, getrennt verabreicht
werden, oder die Antikörper
können
an die Cytotoxine gebunden werden, z.B. durch Konjugation, wie im
Fachgebiet bekannt ist. Zu einigen geeigneten Toxinen gehören z.B.
Reicin und Gelonin.
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Die
flk-2+-Stammzellpopulationen der Erfindung können in therapeutischen Zusammensetzungen
verwendet werden, optional in der Gegenwart von pharmazeutisch sinnvollen
Hilfsstoffen, die für
den Fachmann leicht erkennbar sind. Solche therapeutischen Zu sammensetzungen
können
nach Verfahren des Standes der Technik appliziert werden, beispielsweise
intravenös
an Säuger,
die einen Agonisten oder Antagonisten der flk-2-Wachstumsfaktoren benötigen. Beispiele
von Säugern,
die einen Agonisten oder Antagonisten von flk-2-Wachstumsfaktoren
benötigen,
umfassen Säugetiere
mit Tumoren. Die Antikörper
der Erfindung werden in einer Menge angewendet, die für die Antikörper ausreichend
ist, als Agonisten oder Antagonisten von flk-2-Wachstumsfaktoren
zu wirken, beispielsweise zur Inhibierung des Wachstums von Tumoren.
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Beispiele
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Beispiel 1. Flag-flk-2-Expressionsplasmide
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Ein
synthetisches DNA-Fragment (Fragment 1) wird unter Verwendung der
komplementären
Oligonukleotide BP1 und BP2 synthetisiert (siehe unten sowie SEQ.
ID. NOS. 1 und 2). Fragment 1 kodiert die folgenden Merkmale in
der Reihenfolge 5' bis
3': Sal I-Restriktionsschnittstelle,
22 Basenpaare (bp) 5' untranslatierte Region,
enthaltend eine eukaryontische Ribosomenbindungsstelle, ein ATG-Initiationscodon,
Preprotrypsinogensignalsequenz, eine kodierende Region für das FLAG-Peptid
(DYKDDDDKI) und eine Bgl II-Restriktionsschnittstelle.
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Ein
Asn 27 bis Ser 544 kodierendes cDNA-Fragment (Fragment 2) des murinen
flk-2 wird durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung
von Primern hergestellt, die so gewählt sind, dass sie eine Bgl
II-Schnittstelle am 5'-Ende
(Oligonukleotid BP5, siehe unten und SEQ. ID. NO. 3) und ein Terminationscodon,
das von einer Not I-Schnittstelle am 3'-Ende gefolgt wird, einführen (Oligonukleotid
BP10, siehe unten und SEQ. ID. NO. 4). Die Matrize für die PCR-Reaktion
ist eine cDNA der Gesamtlänge
des flk-2 (Matthews et al., Cell 65, 1143–1152 (1991)). Fragment 2 wird
intensiv mit Bgl II- und
Not I-Restriktionsenzymen vor der Ligation verdaut.
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Zum
Zusammenfügen
des gesamten Flag-flk-2-Gens werden die Fragmente 1 und 2 in einer
Dreischrittligation in Sal I- und Not I-verdautes Plasmid pSPORT
(Gibco/BRL, Grand Island, NY) ligiert, um das Plasmid pFlag-flk-2
herzustellen.
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Vorzugsweise
ist das Flag-flk-2-Protein an einem der beiden Enden an den Fc-Teil
eines Immunoglobulins (Ig) gebunden. Das Ig ist vorzugsweise mit
dem flk-2-Teil des Flag-flk-2-Proteins verbunden. Zum Zusammensetzen
des Konstruktes pFlag-flk-2-Ig werden die Sequenzen, die für die CH1-Domäne
des humanen Immunoglobulins G (IgG1) kodieren,
unterhalb der flk-2-kodierenden Region in das Plasmid pFlag-flk-2
entsprechend dem Verfahren, wie es von Zettlemeissl et al., DNA
and Cell Biology 9: 347–352
(1990) beschrieben wird, eingefügt.
-
Die
Sequenzen der Oligonukleotide, die zur Herstellung des Flag-flk-2-Gens
verwendet werden, sind im Folgenden beschrieben:
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Oligonukleotid BP1:
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- 5'-AATTCGTCGACTTTCTGTCACCATGAGTGCACTTCTGATCCTAGCCCTTGTG
GGAGCTGCTGTTGCTGACTACAAAGATGATGATGACAAGATCTA-3'
-
Oligonukleotid BP2:
-
- 5'-AGCTTAGATCTTGTCATCATCATCTTTGTAGTCAGCAACAGCAGCTCCCACA
AGGGCTAGGATCAGAAGTGCACTCATGGTGACAGAAAGTCGACG-3'
-
Oligonukleotid BP5:
-
- 5'-TGAGAAGATCTCAAACCAAGACCTGCCTGT-3'
-
Oligonukleotid BP10:
-
- 5'-CCAATGGCGGCCGCTCAGGAGATGTTGTCTTGGA-3'
(siehe jeweils
SEQ. ID. NOS. 1–4)
-
Beispiel 2. Expression
des Flag-flk-2-Konstrukts
-
Zur
transienten Expression des Flag-flk-2-Konstrukts werden das Fragment
Sal I- bis Not I- von pFlag-flk-2 in das Plasmid pSVSPORT subkloniert
(Gibco/BRL), um das Plasmid pSVFlag-flk-2 herzustellen. Zur Expression
des Flag-flk-2-Proteins wird pSVFlag-flk-2 in COS-Affenzellen unter Verwendung
des DEAE-Dextranverfahrens transfiziert.
-
Zur
stabilen Expression in eukaryontischen Zellen wird das Sal I-Not
I-Fragment von pFlag-flk-2 in die EcoRV- und Not I-Schnittstellen
des Plasmids pcDNA I/Neo kloniert (Invitrogen Co., San Diego, CA).
Der zurückgebliebene
Sal I 3'-Terminus
des pFlag-flk-2 wird mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
I und einer Mischung aus Deoxyribonukleotiden gefüllt, um
die Stelle kompatibel zur EcoRV-Schnittstelle des Vektors zu machen.
Das resultierende Konstrukt wird in kultivierte Säugerzellen
unter Verwendung von entweder des Lipofectin- (Gibco/BRL) oder des
Calciumphosphat-Verfahrens eingeführt.
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Zur
Expression in Insektenzellen wird das Sal I bis Hind III- (aus dem
pSPORT-Polylinker) Fragment des pFlag-flk-2 in die BamH1-Hind III-Schnittstellen
des Baculovirus Transfervektors pBlueBac III (Invitrogen) subkloniert.
Die Vektor-Bam HI-Schnittstelle und die Insertionsschnittstelle
Sal I werden mit Klenow mit glatten Enden versehen (siehe oben).
Die Herstellung des rekombinanten Virus und die Infektion der Sf9-Insektenzellen
wird nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (Invitrogen).
-
Die
Expression des Flag-flk-2-Proteins wird durch Western-blotting von
SDS-PAGE-getrenntem
konditionierten Medien (Säugerzellen)
oder Zelllysaten (Insektenzellen) mit dem anti-Flag-monoklonalen
Antikörper
(mAb) M1 (International Biotechnology, Inc. (IBI), New Haven, CT)
nachgewiesen.
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Beispiel 3. Reinigung
von rekombinantem Flag-flk-2
-
Die
Affinitätsreinigung
des Flag-flk-2-Proteins aus COS-konditioniertem Medium oder Insektenzelllysaten
wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt unter Verwendung des anti-Flag
monoklonalen Antikörpers
M1, der auf Agarose immobilisiert war (International Biotechnology,
Inc., New Haven, CT).
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Baculovirus-abgeleitetes
Flag-flk-2 wurde aus geernteten SF-9-Zellen 48–72 Stunden nach der Infektion
geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3500 × g für 10 Minuten
bei 4°C
gesammelt und mit eiskaltem PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde
in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 500 mM NaCl, 300 mM Sucrose, 2 mM CaCl2, 0,05 % Tween 80, 10 g/ml Leupeptin, 1
g/ml Pepstatin und 1 mM PMSF resuspensiert und auf Eis homogenisiert.
Das Zelllysat wurde bei 100000 × g
für 60
Minuten bei 4°C
zentrifu giert und die überstehende
Fraktion gesammelt. Das geklärte
Zelllysat wurde auf eine 3 ml anti-Flag M1-Agarosekolonne geladen (IBI),
die zuvor mit Puffer A (0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,5M NaCl, 2 mM
CaCl2, 0,05 % Tween 80) äquilibriert wurde. Nachdem
die Probe fünfmal über das
M1-Harz geleitet wurde, wurde die Kolonne mit 60 ml von Puffer A
gewaschen und mit 30 ml Puffer B (0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M
NaCl, 10 mM EDTA, 0,05 % Tween 80) eluiert. Die Fraktionen, die
den flk-2-Rezeptor enthalten, wurden zusammengeführt, in PBS dialysiert und
bei –70°C gefroren.
Protein wurde nach dem BCA-Verfahren unter Verwendung von Rinderserumalbumin
als Standard quantifiziert (Pierce).
-
Beispiel 4A. Herstellung
der anti-Maus-flk-2 monoklonalen Antikörper 2A13 (IgG2a) und 23H (IgG1)
-
Monoklonale
Antikörper
wurden unter Verwendung zweier Protokolle hergestellt. In dem ersten
wurden weibliche Lewis Ratten (Charles River) mit Flag-flk-2 immunisiert
(hergestellt aus COS-Zell-konditioniertem Medium entsprechend Beispiel
3), das an anti-Flag monoklonalen Antikörper M1 gebunden ist, der an Agarose
gekoppelt war. Am Tag 0 erhielten die Ratten 100 µl des Harz-Protein-Komplexes
in unvollständigem Freund's Adjuvanz (IFA) über den
subkutanen Weg. Die Ratten erhielten weitere Injektionen des Komplexes an
den Tagen 26 (plus Ribi-Adjuvanz) und Tag 62 (ohne Adjuvanz). Zu
verschiedenen Zeiten wurde den Tieren Blut abgezapft, um den Antikörpertiter
zu bestimmen. Die Ratten erhielten zwei zusätzliche subkutane Immunisierungen
von gereinigtem Baculovirus-abgeleitetem Flag-flk-2 (jeweils 10
und 40 g/Injektion; beide mit Ribi-Adjuvans) an den Tagen 91 und
105. Vier Tage nach der letzten Inokulation wurde eine Ratte geopfert
und die Milz aseptisch zur Isolierung behandelter B-Zellen entfernt.
-
Im
zweiten Protokoll wurden männliche
Lewis Ratten (Charles River) mit Baculovirushergestelltem gereinigten
Flag-flk-2 über
den intraperitonealen Weg am Tag 0 immunisiert (25 g in vollständigem Freund's Adjuvanz; Tag 7
(25 g in Ribi-Adjuvanz)). Blutproben wurden zu verschiedenen Zeiten
zur Bestimmung des anti-flk-2-Titers genommen. Vier Tage nach der
letzten Injektion wurde ein Tier geopfert und die Milz zur anschließenden Fusion entfernt.
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Die
nach einem der beiden Protokolle hergestellten Milzzellen wurden
mit der murinen Myelomazelllinie NS1 unter Verwendung von Polyethylenglycol
(PEG 3350; Baker) wie bereits beschrieben fusioniert; siehe Goldstein
et al., Anticancer Research 10, 491 (1990). Die Zellen wurden in
HT-Medium resuspendiert (Hypoxanthin/Thymidin; Sigma), das aus Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) besteht,
das mit 20 % hitzeinaktiviertem fetalen Rinderserum (Hyclone), L-Glutamin
(2 mM), HT-Supplement (Flow Labs) und Antibiotika supplementiert
ist und in einer Konzentration von 1,6 × 105 Zellen
pro Well in 96 Well-Mikrotiterplatten plattiert. Am Tag eins wird
das Medium gegen das oben genannte HAT-enthaltende Medium (statt
HT) ausgetauscht. Nach 10–14
Tagen werden makroskopische Kolonien sichtbar und fertig für das erste
Screening.
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Beispiel 4B. Herstellung
der monoklonalen anti-mensch-flk-2 Antikörper 19A (IgG2B) und 6J11 (IgG1)
-
Der
monoklonale Ratten-Antikörper
19A wurde durch die Hyperimmunisierung weiblicher Lewis Ratten (Charles
River Laboratories) mit einer gereinigten Präparation von löslichem
menschlichen Flag-flk-2 hergestellt, die in Cos-7-Zellen exprimiert
wurden (Beispiele 2 und 3). Der murine monoklonale Antikörper 6J11 wurde
durch Hyperimmunisierung weiblicher Balb/c-Mäuse (Charles River Laboratories)
wie oben hergestellt. Alle Injektionen wurden intraperitoneal unter
Verwendung des folgenden Schemas gegeben:
-
Für 19A erhielten
vorher mit murinem Flag-flk-2 immunisierte Ratten am Tag 0 (10 µg in Ribi-Adjuvanz),
Tag 7 (10 µg
ohne Ribi) und Tag 14 (15 µg
plus 20 µg
des Mutein IL-6) Injektionen. Für
6J11 erhielten Mäuse,
die zuvor mit einer menschliches flk-2 exprimierenden Leukämie-Zelllinie
ML-1 immunisiert wurden, am Tag 0 (10 µg plus Ribi-Adjuvanz), Tag
7 (10 µg
plus 20 µg
IL-6) und Tag 14 (10 µg
plus 20 µg
IL-6) Injektionen. (Vergleichbare Ergebnisse werden mit anderen
flk-2-Protein-exprimierenden Leukämie-Zelllinien gewonnen, wie HL-60 (ATCC)
und KG-1A (ATCC)). Vor der Fusion wurde den Tieren Blut abgenommen
und die Seren mittels ELISA auf Bindungsaktivität an gereinigtem humanen flk-2
untersucht.
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Drei
bis vier Tage nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet und
die Milz aseptisch entfernt. Die Milzzellen wurden durch mechanisches
Aufbrechen der Milz gewon nen, in sterilem, serumfreien Medium gewaschen
(normalerweise Dulbecco's
modified Eagle's
medium) und mit NS1, einer murinen Myeloma-Zelllinie, gemischt.
Die Fusion wurde durch die schrittweise Addition von 1 ml Polyethylenglycol
innerhalb von 2 Minuten (50 % in serumfreien Medium; PEG 3600; JT
Baker) und anschließender
Verdünnung
mit 10 ml serumfreien Medium durchgeführt. Die Zellen wurden zentrifugiert
(200 × g
für 5 Minuten),
resuspendiert auf 1–5 × 105 Zellen pro ml in HT-Medium (Dulbecco's modified Eagle's medium, supplementiert
mit 10 % fetalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, Antibiotika und 1 × HT-Mediumsupplement)
und 100 µl
in jedes Well von mehreren 96 Well-Gewebekulturplatten allquotiert.
Nach 24 Stunden bei 37°C
wurden 100 µl
HAT-Medium zum Zweck der Selektion hinzugefügt (HT-Medium plus 1 × HAT (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin);
Sigma).
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Kolonien
wurden an den Tagen 10 bis 20 in der Kultur sichtbar. Hybridomüberstände wurden
erstmals mittels ELISA untersucht. In diesem Assay wurden 25 ng
von gereinigtem menschlichen flk-2-Protein in Carbonatpuffer, pH
9,6, auf 96-Well-Mikrotiterplatten aufgetragen (über Nacht bei 4°C). Die Platten
wurden mit Hank's-Salzlösung, die
1 % BSA enthielt, für
60 Minuten bei 37°C
abgestoppt. Nach ausführlichem
Waschen wurde mit Meerrettichperoxidase-markierter sekundärer Antikörper (Ziege-anti-Maus
Ig für
6J11 oder Ziege-anti-Ratte Ig für
19A) für
60 Minuten bei 37°C
hinzugefügt.
Eine positive Bindung wurde unter Verwendung des Chromogens TMB
bestimmt und die Platten in einem ELISA-Lesegerät ausgewertet.
-
Beispiel 5. ELISA-Protokoll
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Gereinigtes
Flag-flk-2 aus Baculovirus wurde auf 96-Well-Mikrotiterplatten aufgetragen
(50 ng/Well) unter Verwendung von 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH
9,6. Nach einer Übernachtinkubation
bei 4°C
wurden die Platten zweimal in destilliertem Wasser gewaschen und
mit 10 % Kälberserum
von Neugeborenen (Hyclone) in PBS (NB10) für 30 Minuten bei 37°C abgestoppt.
Die behandelten Flüssigkeitsüberstände der
Fusionen wurden zu den abgesaugten Wells hinzugefügt und für zwei Stunden
bei 37°C
inkubiert. Die Wells wurden dreimal in destilliertem Wasser gewaschen
und mit einem Ziege-anti-Ratte
sekundären
Antikörper
untersucht, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist (HRP; Tago).
Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C wurden die Wells ausführlich mit
destilliertem Wasser gewaschen und das chromogene Substrat (TMV;
Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, Maryland) hinzugefügt. Die
Reaktion wurde mit 1N Schwefelsäure
gestoppt und die Platten bei 450 nm im automatisierten ELISA-Meßgerät ausgelesen.
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Nach
der Klonierung (siehe unten) wurden monoklonale Antikörper isotypisiert
unter Verwendung eines capture-ELISA. Die Platten wurden über Nacht
bei 4°C
mit Ziegeanti-Ratte Ig überzogen.
Nach dem Abstoppen wurden Flüssigkeitsüberstände für zwei Stunden
bei 37°C
hinzugefügt,
gewaschen und mit Isotyp-spezifischen Antikörpern untersucht, die TMB als
Chromogen verwenden, wie oben beschrieben.
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Beispiel 6. Klonierungsprotokolle
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Basierend
auf den Ergebnissen des ELISA's
wurden eine Reihe von Hybridomkolonien ausgewählt und auf 24 Well-Mikrotiterplatten
vermehrt. Die Überstände wurden
wieder auf die Bindung an gereinigtes Flag-flk-2 aus Baculovirus
untersucht und dreimal mit limitierender Verdünnung kloniert (1 Zelle pro
Well). Die Klone wurden mittels ELISA auf flk-2-Bindung untersucht.
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Beispiel 7. Western Blot-Protokolle
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Die
folgenden Zelllinien wurden bis zum Zusammenwachsen in 75 cm2-Gefäßen gezüchtet: NIH3T3 und
i3T3 (Gesamt-mflk-2-transfizierte 3T3-Zellen). Medium wurde abgesaugt
und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Ein ml Lysepuffer (enthaltend
10 mM Tris HCl, pH 8,0, 0,2 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA,
1 mM PMSF und 5 g/ml Aprotinin) wurde in die Gefäße gegeben, die auf Eis gehalten
wurden bis die Lyse der Zellen sichtbar wurde. Anheftendes Material
wurde durch Kratzen mit dem Gummispatel entfernt und das ganze für eine weitere
Stunde auf Eis gehalten. Zelldebris wurde durch Zentrifugation bei
10000 Upm in einer Labortischmikrofuge bei 4°C entfernt. Die Proteinkonzentration
des Lysats wurde unter Verwendung des Biorad Assays vor der Trennung
durch SDS PAGE durchgeführt.
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Fünf Mikrogramm
Proben in SDS-Probenpuffer (2 % SDS, 5 % 2-Mercaptoethanol, 10 %
Glycerin, 60 mM Tris-HCl, 0,01 % Bromphenol blau, pH 6,8) wurden
wie beschrieben auf Gradientengelen von 10–20 % (Enprotech, Natick MA)
laufen gelassen (Laemli Nature 227, 680 (1970). Nach der Elektrophorese
wurden die Banden auf eine Immobi lon-P-Membran transferiert. Die
Blots wurden bei 4°C
für maximal
zwei Tage aufbewahrt bevor eine Western Blot-Analyse durchgeführt wurde;
siehe Goldstein et al., Anticancer Research 10, 491 (1990). Die
Membran wurde für
die Dauer einer Stunde bei Raumtemperatur mit NB-1 abgestoppt, das
0,1 % Triton X-100 enthielt, und mit Hybridombehandeltem Medium
mit zusätzlichen
0,1 % Triton X-100 für
eine Stunde unter Schwenken inkubiert. Die Membran wurde dreimal
mit PBS gewaschen, das 0,1 % Triton X-100 enthielt und für eine Stunde
mit Ziege-anti-Ratte HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert (1:1000; Tago,
Burlingame, Kalifornien). Die Membran wurde dreimal mit PBS gewaschen,
das 0,1 % Triton X-100 enthält
und für
eine Stunde mit Ziege-anti-Ratte HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert
(1:1000; Tago). Die Membran wurde dreimal gewaschen und die Banden
mit TMB entwickelt, das Membranverstärkerlösung enthält (Kirkegaard und Perry).
Nach dem Erscheinen der Banden wurde die Membran in kaltem Leitungswasser
gewaschen.
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Beispiel 8. Metabolische
Markierung und Immunopräzipitationsanalyse
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NIH-3T3
und i3T3-flk-2-transfizierte Zellen (i3T3) wurden in 100 mm Schalen
gesät und
bis zur Vollständigkeit
wachsen gelassen. Die Zellen wurden in Methionin- und Cysteinfreiem
Medium für
30 Minuten ausgehungert (Gibco, Grand Island, NY) und anschließend für 48 Stunden
in Methionin- und Cystein-freiem Medium inkubiert, das 0,2 mCi/ml
Tran-35S-Marker (ICN, Amersham) enthält. Die
markierten Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und in IP-Puffer
lysiert (0,1 % NP-40, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,2
% Deoxycholat, 0,1 % SDS, 1 mM PMSF, pH 7,4). 500 µl Allquote
von Zelllysat wurden mit 5 µg
gereinigtem monoklonalen Antikörper
23H immunopräzipitiert.
Die Immunokomplexe wurden an Ziege-anti-Ratten-Ig (Tago) absorbiert,
das an Protein-A-Sepharose
gekoppelt war. Die Immunkomplexe wurden mehrfach in IP-Puffer gewaschen
und durch Kochen für
2 Minuten in Elektrophoreseprobenpuffer solubilisiert. Die Proteine
wurden auf 8 %igen Polyacrylamid/SDS-Gelen wie oben beschrieben
aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 40 % Methanol/7
% Essigsäure
für eine
Stunde fixiert, in Enlightening (NEN, Boston, MA) für eine Stunde
gewaschen, getrocknet und bei –70°C autoradiografiert.
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Beispiel 9. FACS-Analyse
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Die
Zellen zur Analyse wurden aus T-Gefäßen unter Verwendung eines
nicht enzymatischen Dissoziationspuffers (Sigma) entnommen, gezählt und
in 12 × 75
mm Glasröhren
bei einer Endkonzentration von ungefähr einer Million Zellen pro
Röhrchen
allquotiert. Alle Schritte wurden auf Eis durchgeführt, um
die Internalisierung der Rezeptor-Antikörperkomplexe zu vermeiden.
Die Zellen werden bei 1000 Upm pelletiert und in 100 µl primärer Antikörperlösung resuspendiert:
100 µl
behandelter Überstand
oder 5 µg
pro Röhrchen
von gereinigtem Antikörper
in Hank's-Salzlösung enthaltend
1 % BSA (HBSS-B).
Nach einer Stunde Inkubation wurden die Zellen in 1 ml HBSS-B resuspendiert,
pelletiert und der Flüssigkeitsüberstand
verworfen. Mit FITC (5 µg/Röhrchen;
Tago) konjugiertes Ziege-anti-Ratten-IgG wird zu jedem Röhrchen für weitere
30–60
Minuten unter Lichtausschluss hinzugefügt. Die Zellen werden dreimal
mit HBSS-B gewaschen, in 1 ml HBSS-B resuspendiert und sofort analysiert.
Andernfalls werden die Zellen mit 1 % neutral gepuffertem Formaldehyd
fixiert und innerhalb von 48 Stunden analysiert. In einigen Experimenten
wurde Saponin verwendet, um die FLK-2-Epitope zu exponieren. Für diese
Studien wurde 0,1 % Saponin in allen Inkubations- und Waschschritten
verwendet.
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Die
Bindung der anti-flk-2 monoklonalen Antikörper an Stammzellen aus muriner
fetaler Leber wurde wie folgt untersucht. Schwangere Balb/c-Mäuse (nicht
abgestimmte Schwangerschaften, ungefähr 14 Tage; Charles River Labs)
wurden geopfert und die Fötusse
entfernt. Lebergewebe wurde aseptisch gesammelt und auf Eis aufgeschlossen.
Die resultierende Zellsuspension wurde mit 0,17 M Ammoniumchlorid
behandelt, um rote Blutzellen zu entfernen, zweimal mit HBSS-B gewaschen
und in kaltem HBSS-B bei einer Endkonzentration von ungefähr zehn
Millionen Zellen pro ml resuspendiert. Allquote von 100 ml wurden
in Glasröhrchen
gegeben und für
1 Stunde auf Eis mit verschiedenen Antikörpern inkubiert, einschließlich 2A13,
23H, AA4.1, DC101 (ein Ratten-IgG1
monoklonaler Antikörper
gegen den flk-1-Rezeptor) und ein irrelevantes Ratten-IgG (Tago). Nach
dem Waschen der Zellen wurde Ziege-anti-Ratte IgG-FITC hinzugefügt und 30
Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden umfassend gewaschen
und wie oben beschreiben analysiert.
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FITC-markierte
Zellen wurden in einem Coulter Elite cell sorter unter Verwendung
des Multigraphprogramms analysiert. Für jede Zelllinie wurde ein
isotypisch passender irrelevanter monoklonaler Ratten-Antikörper zur
Bestimmung der Basisfluoreszenz durchgeführt.
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Beispiel 10. Spezifität der murinen
monoklonalen Antikörper
2A13 und 23H
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Zuerst
werden die monoklonalen Antikörper
unter Verwendung eines ELISA gegen Maus und Mensch flk-2 und andere
verwandte Proteintyrosinkinasen einschließlich c-kit und flk-1 untersucht.
Wie in 1 zu sehen ist, binden beide
Antikörper
an Flag-flk-2, aber weder an c-kit noch an flk-1 (US92/05401). Keiner
der monoklonalen Antikörper
scheint an den Humanrezeptor zu binden.
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Beispiel 11. Immunopräzipitation
von murinen flk-2-Antikörpern
mit monoklonalen Antikörpern
2A13 und 23H
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Die
monoklonalen Antikörper
2A13 und 23H sind in der Lage, radiomarkierte, lösliche und zelluläre murine
flk-2 zu immunopräzipitieren.
Jeder Antikörper
immunopräzipitiert
lösliches
Flag-flk-2 als Einzelprotein, wie durch die Gegenwart einer Einzelbande
im SDS-PAGE nachgewiesen wurde, bei ungefähr 95 kD, welches das geschätzte Molekulargewicht
dieses Konstrukts ist. 23H ist auch in der Lage, Gesamt-flk-2 aus
den transfizierten Zelllinien i3T3 zu immunopräzipitieren, wie durch die Gegenwart
zweier Banden im SDS-PAGE nachgewiesen wurde, die ein ungefähres Molekulargewicht
von 135 kD und 155 kD aufweisen, welches die geschätzten Molekulargewichte
von zellulärem
flk-2 mit verschiedenen Glycosylierungsmustern ist.
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Beispiel 12. Bindungsstudien
mit monoklonalen Antikörpern
2A13 und 23H
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2A13
und 23H wurden auf dem FACS analysiert bezüglich ihrer Fähigkeit
zur Bindung an Zellen die FLK-2 exprimieren. 2 zeigt
die Ergebnisse dieser Studien. Sowohl 2A13 als 23H banden an i3T3,
nicht aber an untransfizierte 3T3-Zellen. Allerdings band nur 23H
an intakte lebensfähige
Zellen, während
2A13 einer vorherigen Saponin-Behandlung (0,1 %) der Zielzellen
zur Bindung bedurfte. Dieses scheint anzuzeigen, dass das Epitop,
das von 2A13 erkannt wurde, nicht zugänglich für diesen monoklonalen An tikörper ist,
im Gegensatz zur Verfügbarkeit
der 23H-Determinante. Dass diese beiden monoklonalen Antikörper zwei
unterschiedliche Epitope erkennen, wurde durch Studien bestätigt, die
unter Verwendung eines Instrument stattfanden, das Echtzeit-biospezifische
Wechselwirkungen auf Basis von Oberflächenplasmonresonanz misst (BIAcore,
Pharmacia Biosensor AB). Wie in 3 ersichtlich,
stört die
Bindung des 2A13 nicht die anschließende Bindung des 23H.
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Beispiel 13. Zellen, die
die Gesamtlänge
des flk-2-Rezeptors exprimieren (Y-stk)
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Y-stk-Zellen
werden durch Kotransfektion von DNA, die den humanen flk-2-Rezeptor
und neo-Resistenz kodiert, in NIH 3T3-Zellen hergestellt. Transfizierte
Zellen werden in Medium selektiert, das 1 mg/ml G418 enthält. Lebensfähige Kolonien,
die nach zwei bis drei Wochen erscheinen, werden isoliert, expandiert
und auf die Gegenwart von menschlichem flk-2 unter Verwendung der
Western Blot-Analyse untersucht. Für diese Studien werden transfizierte
Kolonien lysiert, in SDS-Probenpuffer resuspendiert und mittels
SDS-PAGE getrennt. Die Proteine werden auf Nitrozellulosepapier
geblottet und mittels IM140 untersucht, einem Kaninchen polyklonalen
Antikörper,
der gegen die C-terminale Aminosäuresequenz
des flk-2 hergestellt wurde. Es wurde gefunden, dass eine Kolonie,
die Y-stk genannt wird, humanen flk-2 exprimiert, und sie wurde
für weitere
Studien vermehrt.
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Beispiel 14. Monoklonaler
Ratten-Antikörper
71E (IgG2B)
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Ratten
wurden mit Y-stk an den Tagen 0, 15, 30, 44, 51 und 61 hyperimmunisiert.
Serum wurde zu verschiedenen Zeiten während des Immunisierungsplans
gesammelt, um das Vorhandensein einer humoralen Reaktion auf den
Rezeptor zu überprüfen. 4 Tage
nach der letzten Injektion (Tag 61) wurden zwei Tiere getötet und
die Milz isoliert und für
eine Hybridisierung weiterverarbeitet.
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Hybridome
wurden anfänglich
durch ELISA untersucht (siehe nachstehendes Beispiel 15), wobei
nicht fixierte Y-stk-Zellen verwendet wurden. Nachfolgende Screening-Assays verwendeten
Zelllysate (siehe nachstehendes Beispiel 16) und die vorstehend
für 19A4B
et al. beschriebene FACS-Analyse. Ein als 71E bezeichnetes Hybridom
er wies sich in diesen Assays als positiv und wurde durch limitierende
Verdünnung
kloniert. Hybridom 71E exprimiert den monoklonalen Antikörper 71E.
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Der
monoklonale Antikörper
71E bindet an menschliches flk-2, was durch ELISA festgestellt wird;
bindet an menschliche flk-2 exprimierende Zellen, was durch FACS
festgestellt wird; immunopräzipitiert
eine diffuse Bande in der flk-2-Region, welche den Banden entspricht,
die durch einen polyklonalen Kaninchen-Antikörper, der für die C-terminale Region von
flk-2 spezifisch ist (Im140), immunopräzipitiert werden; blockiert
die Phosphorylierung des menschlichen flk-2-Rezeptors durch seinen
natürlichen
Liganden (siehe nachstehendes Beispiel 17); und bindet an menschliche
flk-2 exprimierende leukämische
Zellen KG1a (ATCC), aber nicht flk-2 negative Zellen, wenn ein Screening
durch FACS-Analyse durchgeführt
wird.
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Beispiel 15. ELISA-Protokoll
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Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen werden mit 1 µg/Vertiefung IM140 überzogen.
Die Platten werden gewaschen und mit Hank's-Salzlösung blockiert, der 1 % BSA
zugesetzt wurde. Dann werden in jede Vertiefung 5 bis 10 µg Y-stk
oder Kontroll-3T3-Lysat (siehe Beispiel 16 unten) hinzugefügt. Nach
2 Stunden Inkubation bei 37°C
werden die Platten gewaschen und die Bindung mit Ziege-anti-Ratten-IgG
untersucht, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist, und anschließend erfolgt
die Zugabe des Chromogens TMB. Die Platten werden bei 450 nm ausgelesen.
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Beispiel 16. Herstellung
der Zelllysate
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Y-stk
oder Kontroll-3T3-Zellen werden in großen Petrischalen bis zur Konfluenz
wachsen gelassen. Die Zellen werden von den Platten mit einem Gummispatel
abgekratzt, durch Zentrifugation gesammelt und in Lyse-Puffer resuspendiert
(0,02 M Tris-HCL, pH 7,2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 % Triton X-100,
10 % Glycerin, 100 µg/ml
Aprotinin, 500 µg/ml
Leupeptin, 400 µg/ml
Pefabloc). Die Lysate werden durch Western Blot-Analyse auf menschliches flk-2 untersucht
und bei –70°C gelagert.
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Beispiel 17. Phosphorylierungsassay
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Y-stk
oder Kontroll-3T3-Zellen werden bis zu 90 % Konfluenz in DME wachsen
gelassen, das mit 10 % Kälberserum
supplementiert wurde, und dann 24 Stunden ohne Serum in DME-0,5
% CS vor den Experimenten inkubiert. Für Neutralisationsassays wurden
die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des flk-2-Liganden
unter serumfreien Bedingungen (DME –0,1 % BSA) in der Gegenwart
und Abwesenheit des monoklonalen Antikörpers 71E oder Kontroll-Ratten-Antikörper für 15 Minuten
bei Raumtemperatur stimuliert. Die Antikörper wurden bei 10 bis 20 µg/ml untersucht.
Zur Untersuchung der Effekte der Antikörper auf die flk-2-Liganden-induzierte
Aktivierung des erkennenden Rezeptors wurde der Antikörper entweder
gleichzeitig (kompetitive Inhibition) oder 15 Minuten bei Raumtemperatur
vor der Zugabe des flk-2-Liganden vorgebunden hinzugefügt. Siehe
Lyman et al., Cell, 75, 1157–1167
(1993); Blood 83, 2795–2801
(1994); Oncogene 8, 815–822 (1993).
In serumfreiem Medium inkubierte Zellen in Abwesenheit oder Gegenwart
des Antikörpers
dienten als Kontrolle für
die Rezeptor-Autophosphorylierung jeweils in der Abwesenheit des
Liganden oder in der Anwesenheit des Antikörpers.
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Nach
der Stimulation wurden die Einzellagen mit eiskaltem PBS gewaschen,
das 1 mM Natriumorthovanadat enthält. Die Zellen wurden dann
in Lyse-Puffer lysiert [(20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % Triton X-100,
137 mM NaCl, 10 % Glycerin, 10 mM EDTA, 2 MM Natriumorthovanadat,
100 mM NaF, 100 mM Natriumpyrophosphat, 5 mM Pefabloc (Boehringer
Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 100 µg Aprotinin und 100 µg/ml Leupeptin]
und für
10 Minuten bei 14000 × g
zentrifugiert. Das Protein wurde unter Verwendung von IM140, das
an Protein-A-Sepharose-Perlen gebunden war, aus den Lysaten der
transfizierten Zellen immunopräzipitiert.
Die Perlen wurden dann einmal mit 0,2 % Triton X-100, 10 mM Tris-HCl,
pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA (Puffer A), zweimal mit Puffer A,
der 500 mM NaCl enthielt, und zweimal mit Tris-HCl, pH 8,0 gewaschen. Die
abgetropften Perlen wurden mit 30 µl mit 2 × SDS-Auftragspuffer gemischt
und einer SDS-PAGE mit 4–12 %
Gradientengelen unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine
auf Nitrozellulosefiltern zur Analyse geblottet. Zum Nachweis von
phosphoryliertem Rezeptor wurden die Proben mit einem monoklonalen Antikörper gegen
Phosphotyrosin (UBI, Lake Placid, NY) untersucht und in einem "enhanced chemiluminescence
system" (ECL, Amershaw)
untersucht.
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ZUSÄTZLICHE
OFFENBARUNG
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Die
beanspruchte Erfindung ist entsprechend der obengenannten Beschreibung
und der einfach verfügbaren
Literaturzitate und Ausgangsmaterialien nacharbeitbar. Trotzdem
hinterlegte der Anmelder am 24. August 1993 die unten aufgeführten Hybridomzelllinien
bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC),
die die unten genannten Antikörper
herstellen:
anti-Maus-flk-2 monoklonaler Ratten-Antikörper 2A13
(ATCC Hinterlegungsnummer HB 11444);
anti-Maus-flk-2 monoklonaler
Ratten-Antikörper
23H (ATCC Hinterlegungsnummer HB 11443);
anti-Mensch-flk-2
monoklonaler Ratten-Antikörper
19A (ATCC Hinterlegungsnummer HB 11442); und
anti-Mensch-flk-2
monoklonaler Maus-Antikörper
6J11 (ATCC Hinterlegungsnummer HB 11445);
anti-Mensch-flk-2
monoklonaler Ratten-Antikörper
71E (ATCC Hinterlegungsnummer HB.
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Diese
Hinterlegungen wurden nach den Richtlinien des Budapester Vertrags über die
internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren und die darunter fallenden Regeln durchgeführt (Budapester
Vertrag). Dieses garantiert den Erhalt einer lebensfähigen Kultur
für 30
Jahre ab dem Tag der Hinterlegung. Die Organismen werden unter den
Bedingungen des Budapester Vertrags durch die ATCC verfügbar gemacht
und sind Gegenstand einer Vereinbarung zwischen den Anmeldern und
der ATCC, welche die uneingeschränkte
Verfügbarkeit
nach der Erteilung des entsprechenden US-Patents garantiert. Die
Verfügbarkeit
der hinterlegten Stämme
ist nicht dahingehend auszulegen, dass sie als Lizenz zur Ausführung der
Erfindung entgegen den Rechten, die eine Regierungsautorität in Zusammenhang mit
ihren Patentgesetzen erteilt, verstanden wird.
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