JP2018082723A - Cd20特異的抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】B細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患のようなB細胞疾患において、B細胞機能を変化させるための改良された試薬および方法を提供すること。【解決手段】上記課題は、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合性フラグメント、ならびにこれらを含む薬学的組成物を提供することによって解決された。本発明はさらに、例えば、B細胞を枯渇させる方法において、またはB細胞疾患の処置において、モノクローナル抗体、抗原結合性フラグメント、および薬学的組成物を用いる方法を提供する。また、モノクローナル抗体を産生する細胞、核酸および方法も提供する。1つの実施形態において、このB細胞へのmAbまたは抗原結合性フラグメントの結合密度は、B細胞および/またはそれらの悪性対応物への1以上の従来のmAb(例えば、mAb 1F5)の結合密度よりも、少なくとも2倍高い。【選択図】なし
Description
(連邦政府の補助の記載)
本発明は、National Institute of Health/Cancer Insutituteによって与えられた助成金番号CA81776、CA96547、AI56363およびCA54464の連邦政府の補助によりなされた。アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、National Institute of Health/Cancer Insutituteによって与えられた助成金番号CA81776、CA96547、AI56363およびCA54464の連邦政府の補助によりなされた。アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
(関連出願の情報)
本出願は、U.S.C.35条の119(e)のもとに、本明細書中に参照としてその全体が援用される、米国仮特許出願番号60/469,451(2003年5月9日出願)の優先権の利益を主張する。
本出願は、U.S.C.35条の119(e)のもとに、本明細書中に参照としてその全体が援用される、米国仮特許出願番号60/469,451(2003年5月9日出願)の優先権の利益を主張する。
(発明の分野)
本発明は、CD20に対して指向されるモノクローナル抗体ならびにこれらを生成および使用する方法に関する。
本発明は、CD20に対して指向されるモノクローナル抗体ならびにこれらを生成および使用する方法に関する。
(発明の背景)
Bリンパ球は、体液性免疫の起源であり、造血性悪性腫瘍の相当な部分に相当し、かつ、自己免疫に寄与する。従って、B細胞およびそれらの悪性対応物によって発現される細胞表面分子は、免疫療法のための重要な標的である。MS4A遺伝子ファミリーのB細胞特異的メンバーであるCD20は、未成熟および成熟B細胞ならびにそれらの悪性対応物の表面上に発現される(TedderおよびEngel(1994)Immunol.Today 15:450〜454)。
Bリンパ球は、体液性免疫の起源であり、造血性悪性腫瘍の相当な部分に相当し、かつ、自己免疫に寄与する。従って、B細胞およびそれらの悪性対応物によって発現される細胞表面分子は、免疫療法のための重要な標的である。MS4A遺伝子ファミリーのB細胞特異的メンバーであるCD20は、未成熟および成熟B細胞ならびにそれらの悪性対応物の表面上に発現される(TedderおよびEngel(1994)Immunol.Today 15:450〜454)。
マウス細胞株および組織におけるCD20転写物の限定的解析によって、マウスCD20もまたB細胞特異的であることが示唆される(Tedderら(1988)J.Immunol.141:4388)。ヒトCD20およびマウスCD20の両方のcDNAは、膜を4回貫通するのに十分な長さの疎水性領域を有する膜埋込みタンパク質をコードする(Tedderら(1988)J.Immunol.141:4388;Tedderら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85:208;Einfeldら(1988)EMBO J.7:711;StamenkovicおよびSeed(1988)J.Exp.Med.167:1975)。マウスおよびヒトCD20は、アミノ酸配列において、特に膜貫通型の長いアミノ−およびカルボキシル−末端細胞質ドメインにおいて、よく保存されている(73%)(Tedderら(1988)J.Immunol.141:4388)。これらの細胞質ドメインは、セリン−およびトレオニン−リッチであり、リン酸化のための複数のコンセンサス配列を有する。ヒトCD20はグリコシル化されないが、異なるセリンおよびトレオニン残基での単一タンパク質の差次的リン酸化の結果として、3つのアイソフォーム(33−、35−および37,000Mr)が生じる(Tedderら(1988)Molec.Immunol.25:1321;TedderおよびSchlossman(1988)J.Biol.Chem.263:10009;Valentineら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:8085)。
CD20は、ヒトB細胞の活性化、増殖およびCa2+輸送の調節に関与する(Tedderら(1985)J.Immunol.135:973;Bubienら(1993)J.Cell Biol.121:1121)。CD20の抗体連結によって膜貫通シグナルを生成し得、その結果、CD20のリン酸化増強(TedderおよびSchlossman(1988)J.Biol.Chem.263:10009)、c−mycおよびB−myb癌遺伝子発現の誘導(Smelandら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:6255;Golayら(1992)J.Immunol.149:300)、細胞タンパク質のセリン/トレオニンおよびチロシンリン酸化の誘導(Deansら(1993)J.Immunol.151:4494)、CD18、CD58およびMHCクラスII分子発現の増大(Whiteら(1991)J.Immunol.146:846;ClarkおよびShu(1987)J.Immunol.138:720)、ならびにB細胞接着を誘導するタンパク質チロシンキナーゼ活性化(KansasおよびTedder(1991)J.Immunol.147:4094)をもたらす。CD20連結は、膜貫通Ca2+輸送を促進するが(Bubienら(1993)J.Cell Biol.121:1121)、通常、大規模な架橋後を除いて(Deansら(1993)J.Immunol.151:4494)、細胞内カルシウム([Ca2+]i)3レベルを増加させない(Bubienら(1993)J.Cell Biol.121:1121;Tedderら(1986)Eur.J.Immunol.16:881;Golayら(1985)J.Immunol.135:3795)。CD20に結合している抗体は、マイトジェン刺激によって細胞周期のG1期からS/G2+M期へのB細胞進行を阻害し、かつ、マイトジェン誘導性のB細胞分化および抗体分泌を阻害する(Tedderら(1985)J.Immunol.135:973;Tedderら(1986)Eur.J.Immunol.16;Golayら(1985)J.Immunol.135:3795;GolayおよびCrawford(1987)Immunology 62:279)。大規模なCD20架橋はまた、アポトーシスにも影響を及ぼし得る(Holderら(1995)Eur.J.Immunol.25:3160;Shanら(1998)Blood 91:1644)。これらの相違する観察は、CD20が、細胞周期進行の間に活性化される膜輸送体またはCa2+イオンチャネルを形成するオリゴマー複合体の構成要素であるという知見(Bubienら(1993)J.Cell Biol.121:1121;Kanzakiら(1995)J.Biol.Chem.270:13099;Kanzakiら(1997)J.Biol.Chem.272:14733;Kanzakiら(1997)J.Biol.Chem.272:4964)によって、部分的に説明され得る。これにもかかわらず、CD20欠損(CD20−/−)マウスの系統におけるB細胞発達および機能は、正常であると報告されている(O’Keefeら(1998)Immunogenetics 48:125)。
ヒトB細胞系統悪性腫瘍の大部分は、CD20を発現する(Andersonら(1984)Blood 63:1424)。CD20に対して指向される、キメラのまたは放射標識したモノクローナル抗体に基づく治療は、非ホジキンリンパ腫に対して用いられてきた(Pressら(2001)Hematology:221〜240;Kaminskiら(1993)N.Engl.J.Med.329:459〜465;Weiner(1999)Semin.Oncol.26:43〜51;Onrustら(1999)Drugs 58:79〜88;McLaughlinら(1998)Oncology 12:1763〜1769)。臨床研究により抗CD20モノクローナル抗体治療はまた、関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病および溶血性貧血ならびに他の免疫媒介疾患の発現も寛解させることが示される(SilvermanおよびWeisman(2002)Arthritis Rheum.48:1484〜1492;EdwardsおよびCambridge(2001)Rheumatology 40:1〜7)。
競合する仮説が、インビボにおける抗CD20モノクローナル抗体の治療効力を説明するのに用いられる。1つのモデルにおいて、CD20は、生来の免疫系の活性化またはエフェクター機構の活性化を介して、モノクローナル抗体媒介性のB細胞枯渇の膜埋込み標的として働く(Reffら(1994)Blood 83:435〜445;Maloneyら(1997)Blood 90:2188〜2195;Maloneyら(1997)J.Clin.Oncol.15:3266〜3274)。
キメラヒトIgG1抗ヒトCD20モノクローナル抗体であるリツキシマブは、古典経路補体(C)活性化ならびに新しく単離したリンパ腫細胞およびB細胞株のC依存性細胞傷害性の誘導に、極めて有効である(Reffら(1994)Blood 83:435〜445;Golayら(2001)Blood 98:3383〜3389;Craggら(2003)Blood 101:1045〜1052;Di Gaetanoら(2003)J.Immunol.171:1581〜1587;Bellosilloら(2001)Blood 98:2771〜2777)。リツキシマブはまた、患者(van der Kolkら(2001)Br.J.Hematol.115:807〜811)および霊長類(Kennedyら(2003)Blood 101:1071〜1079)の両方において、インビボでCを活性化する。さらに、CD59を含むC調節タンパク質の腫瘍細胞発現は、抗CD20治療への耐性と関連する(Golayら(2001)Blood 98:3383〜3389;Treonら(2001)J.Immunotherapy 24:263〜271)。大多数は、C依存性細胞傷害性を、リツキシマブ抗体によってインビトロおよびインビボにおいてヒトリンパ腫細胞を枯渇させるのに用いられる主要経路とみなすが(Golayら(2001)Blood 98:3383〜3389;Craggら(2003)Blood 101:1045〜1052;Di Gaetanoら(2003)J.ImmunoL 171:1581〜1587;Golayら(2000)Blood 95:3900〜3908;Di Gaetanoら(2001)Br.J.Hematol.114:800〜809;Weiner(2003)Blood 101:788)、その他は、C媒介性溶解ならびに腫瘍細胞上でのCインヒビターCD46、CD55、およびCD59の発現に対する腫瘍細胞の感受性によって、リツキシマブ治療の成果は予測されないことを見出している(WengおよびLevy(2001)Blood 98:1352〜1357)。臨床的に用いられるアイソタイプと異なるアイソタイプのキメラ抗CD20モノクローナル抗体が、非ヒト霊長類において正常B細胞を枯渇させないことから、他の抗体依存性作用もまた重要なようであり(Andersonら(1997)Biochem.Soc.Transac.25:705〜708)、抗CD20モノクローナル抗体の抗腫瘍作用は、IgGに対するFcレセプター(FcγR)を介する免疫活性化に一部依存する(Clynesら(2000)Nature Med.6:443〜446)。あるいは、抗CD20モノクローナル抗体処置によって膜貫通Ca2+輸送およびB細胞機能が変化し、それにより細胞周期を通じて進行を妨害し(TedderおよびEngel(1994)Immunol.Today 15:450〜454)、B細胞アポトーシスを誘導し得る(Shanら(1998)Blood 91:1644〜1652;Demidemら(1997)Cancer Biother.Radiopharm.12:177〜186)。
免疫療法を受けているヒトにおいて機構研究を実施することの複雑性のため、インビボにおいてこれらの仮説を区別するのは困難である(EdwardsおよびCambridge(2001)Rheumatology 40:1〜7)。さらに、人体研究は、骨髄の他に、B細胞の2%未満を含む、血液中の変化に主に集中している。従って、末梢リンパ系組織中に見出される大多数のB細胞に対する抗CD20治療の効果を正確に確認することは困難である。
特に、B細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患のようなB細胞疾患において、B細胞機能を変化させるための改良された試薬および方法が、当該分野で必要とされている。また、CD20に対して指向される従来のモノクローナル抗体と異なる免疫反応性特性を有する、新しい抗CD20モノクローナル抗体も必要とされている。
(発明の要旨)
本発明は、所望の特性を有するCD20と反応する新規のモノクローナル抗体の生成および同定に一部基づく。
本発明は、所望の特性を有するCD20と反応する新規のモノクローナル抗体の生成および同定に一部基づく。
従って、1つの実施形態において、本発明はCD20に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このB細胞へのmAbまたは抗原結合性フラグメントの結合密度は、B細胞および/またはそれらの悪性対応物への1以上の従来のmAb(例えば、mAb 1F5)の結合密度よりも、少なくとも2倍高い。
別の局面として、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、B細胞(および/またはそれらの悪性対応物)上のこのCD20へのmAbまたは抗原結合性フラグメントの結合により、mAbまたは抗原結合性フラグメントのためのB細胞上の結合部位のアップレギュレーションがもたらされる。
さらなる局面として、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、HB20−3、HB20−4、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbと同じ抗原決定基に結合する。特定の実施形態において、このmAbは、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択される。他の実施形態において、この抗原結合性フラグメントは、HB20−25およびMB20−11の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される。
別の局面において、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、HB20−3、HB20−4、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖CDR3領域、あるいは、このHB20−3、HB20−4、HB20−25またはMB20−11の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖CDR3領域を含む。
さらに他の実施形態において、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖CDR3領域、あるいは、このHB20−3、HB20−4またはHB20−25の軽鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖CDR3領域を含む。
さらなる実施形態において、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、このHB20−3、HB20−4またはHB20−25のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む。
なおさらなる実施形態において、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、このHB20−3、HB20−4またはHB20−25の、それぞれCDR1、CDR2およびCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む。
さらに別の局面として、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、以下からなる群より選択される:
(a)配列番号3(HB20−3)、配列番号5(HB20−4)、配列番号9(HB20−25)または配列番号21(MB20−11)の重鎖可変領域、あるいはこの配列番号3、配列番号5、配列番号9または配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号31(HB20−3)、配列番号33(HB20−4)、または配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域、あるいはこの配列番号31、配列番号33、または配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)(a)および(b)に記載の重鎖および軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(a)配列番号3(HB20−3)、配列番号5(HB20−4)、配列番号9(HB20−25)または配列番号21(MB20−11)の重鎖可変領域、あるいはこの配列番号3、配列番号5、配列番号9または配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号31(HB20−3)、配列番号33(HB20−4)、または配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域、あるいはこの配列番号31、配列番号33、または配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)(a)および(b)に記載の重鎖および軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
さらに別の局面として、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、以下からなる群より選択される:
(a)配列番号3(HB20−3)の重鎖可変領域またはこの配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号31(HB20−3)の軽鎖可変領域またはこの配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号5(HB20−4)の重鎖可変領域またはこの配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号33(HB20−4)の軽鎖可変領域またはこの配列番号33のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)配列番号9(HB20−25)の重鎖可変領域またはこの配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域またはこの配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(a)配列番号3(HB20−3)の重鎖可変領域またはこの配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号31(HB20−3)の軽鎖可変領域またはこの配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号5(HB20−4)の重鎖可変領域またはこの配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号33(HB20−4)の軽鎖可変領域またはこの配列番号33のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)配列番号9(HB20−25)の重鎖可変領域またはこの配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域またはこの配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
他の特定の実施形態において、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、HB20−3(配列番号3)、HB20−4(配列番号5)、HB20−25(配列番号9)およびMB20−11(配列番号21)からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖可変領域を含む。
なお、さらなる実施形態において、本発明はCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、HB20−3(配列番号31)、HB20−4(配列番号33)およびHB20−25(配列番号37)からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖可変領域を含む。
さらなる局面として、本発明はマウスCD20に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを提供する。
本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物もまた提供される。
1つの実施形態として、本発明は、HB20−1、HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbと同じ抗原決定基に特異的に結合する、mAbまたはその抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントを生成するための細胞株も提供する。
さらなる局面として、本発明は、B細胞および/またはそれらの悪性対応物を枯渇させるのに有効な量で、本発明のmAbもしくは抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法を提供する。
なおさらなる局面として、本発明は、CD20に特異的に結合する処置有効量のmAbまたはその抗原結合性フラグメントを、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、B細胞疾患を処置する方法を提供し、ここで、このmAbまたはその抗原結合性フラグメントは、循環B細胞および/またはそれらの悪性対応物に少なくとも75%の枯渇をもたらす、125mg/m2以下の処置有効投薬量範囲を有する。
なおさらなる局面として、本発明は、処置有効量の本発明のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは薬学的組成物を、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、B細胞疾患を処置する方法を提供する。
前記方法の特定の実施形態において、このB細胞疾患は、B細胞悪性腫瘍または自己免疫疾患である。
さらなる局面として、本発明は、処置有効量の以下:(i)本発明のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは薬学的組成物、および(ii)単球またはマクロファージ機能を増強する化合物を、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、B細胞疾患を処置する方法を提供する。
別の局面として、本発明はCD20に特異的に結合するmAbを生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する:(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;(b)この哺乳動物から抗体産生細胞を収集する工程;(c)この抗体産生細胞を、培養不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成する工程;(d)このハイブリドーマ細胞を、モノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに(e)この培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程。
さらに別の局面として、本発明はCD20に特異的に結合するmAbを生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する:(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;(b)この哺乳動物から、CD20に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程;(c)この抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程;(d)この免疫グロブリンコード遺伝子を細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程;(e)この形質転換細胞を、この免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに(e)この培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程。
本発明は、B細胞(および/またはそれらの悪性対応物)を枯渇させるのに用いるための、および/またはB細胞疾患の処置のための、本発明の核酸、ベクター、mAbもしくは抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物の使用をさらに提供する。
他の局面として、本発明は、本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントの重鎖および軽鎖をコードする単離核酸をさらに提供する。さらに、これらの単離核酸を含むベクターおよび細胞も提供する。
本発明は、例えば以下を提供する。
(項目1)
CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメントであって、該mAbまたは抗原結合性フラグメントのB細胞への結合密度が、mAb 1F5のB細胞への結合密度よりも少なくとも2倍高い、mAbまたはその抗原結合性フラグメント。
(項目2)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントがヒトCD20に特異的に結合する、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目3)
項目2に記載のmAbであって、該mAbは、以下の工程:
(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;
(b)該哺乳動物から、CD20に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程;
(c)該抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程;
(d)該免疫グロブリンコード遺伝子を細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程;(e)該形質転換細胞を、該免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに
(e)該培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程
を包含する方法によって生成される、mAb。
(項目4)
前記抗原結合性フラグメントが、F(ab’)2、Fab’、FabまたはFvフラグメントである、項目1に記載の抗原結合性フラグメント。
(項目5)
検出可能に標識される、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目6)
治療化合物と結合体化される、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目7)
細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目6に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目8)
裸の抗体である、項目1に記載のmAb。
(項目9)
二重特異性抗体である、項目1に記載のmAb。
(項目10)
CD20の細胞外ドメインに結合する、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目11)
キメラmAbまたは抗原結合性フラグメントである、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目12)
ヒト化mAbまたは抗原結合性フラグメントである、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目13)
B細胞上のCD20への前記mAbまたは抗原結合性フラグメントの結合により、該B細胞上のmAbまたは抗原結合性フラグメントに対する結合部位のアップレギュレーションがもたらされる、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目14)
HB20−3、HB20−4、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbと同じ抗原決定基に結合する、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目15)
前記mAbがHB20−25およびMB20−11からなる群より選択される、項目14に記載のmAb。
(項目16)
HB20−3およびHB20−4の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目14に記載の抗原結合性フラグメント。
(項目17)
HB20−3、HB20−4、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖CDR3領域、あるいは、該HB20−3、HB20−4、HB20−25またはMB20−11の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖CDR3領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目18)
前記HB20−25mAbに由来する重鎖CDR3領域、または、該HB20−25の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖CDR3領域を含む、項目17に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目19)
HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖CDR3領域、あるいは、該HB20−3、HB20−4またはHB20−25の軽鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖CDR3領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目20)
前記HB20−25mAbに由来する軽鎖CDR3領域、または、前記HB20−25の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖CDR3領域を含む、項目19に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目21)
HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該HB20−3、HB20−4またはHB20−25のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目22)
HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該HB20−3、HB20−4またはHB20−25のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目23)
前記HB20−25mAbに由来するCDR3領域を含むか、または該CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する、項目22に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目24)
項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
(a)配列番号3(HB20−3)、配列番号5(HB20−4)、配列番号9(HB20−25)または配列番号21(MB20−11)の重鎖可変領域、あるいは、該配列番号3、配列番号5、配列番号9または配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号31(HB20−3)、配列番号33(HB20−4)、または配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域、あるいは、該配列番号31、配列番号33、または配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)(a)および(b)に記載の重鎖および軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目25)
項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
(a)配列番号3(HB20−3)の重鎖可変領域または該配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号31(HB20−3)の軽鎖可変領域または該配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号5(HB20−4)の重鎖可変領域または該配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号33(HB20−4)の軽鎖可変領域または該配列番号33のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)配列番号9(HB20−25)の重鎖可変領域または該配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域または該配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目26)
項目25に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
配列番号9(HB20−25)の重鎖可変領域または該配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域または該配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目27)
HB20−3(配列番号3)、HB20−4(配列番号5)、HB20−25(配列番号9)およびMB20−11(配列番号21)からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖可変領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目28)
HB20−3(配列番号31)、HB20−4(配列番号33)およびHB20−25(配列番号37)からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖可変領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目29)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目30)
前記組成物が、単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目29に記載の薬学的組成物。
(項目31)
薬学的に受容可能なキャリア中に、HB20−1、HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるモノクローナル抗体と同じ抗原決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目32)
モノクローナル抗体HB20−25と同じ抗原決定基に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを含む、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目33)
前記抗原結合性フラグメントが、F(ab’)2、Fab’、FabまたはFvフラグメントである、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目34)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが検出可能に標識される、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目35)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが治療化合物と結合体化される、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目36)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目35に記載の薬学的組成物。
(項目37)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが裸の抗体である、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目38)
前記mAbが二重特異性抗体である、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目39)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、キメラmAbまたは抗原結合性フラグメントである、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目40)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、ヒト化mAbまたは抗原結合性フラグメントである、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目41)
前記mAbが、HB20−1、HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択される、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目42)
前記mAbがHB20−25である、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目43)
前記抗原結合性フラグメントが、HB20−1、HB20−3、HB20−4およびHB20−25の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目44)
マウスCD20に特異的に結合する、モノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメント。
(項目45)
前記抗原結合性フラグメントが、F(ab’)2、Fab’、FabまたはFvフラグメントである、項目44に記載の抗原結合性フラグメント。
(項目46)
検出可能に標識される、項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目47)
治療化合物と結合体化される、項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目48)
細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目47に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目49)
裸の抗体である、項目44に記載のmAb。
(項目50)
二重特異性抗体である、項目44に記載のmAb。
(項目51)
CD20の細胞外ドメインに結合する、項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目52)
B細胞上のCD20へのmAbまたは抗原結合性フラグメントの結合により、該B細胞上のmAbまたは抗原結合性フラグメントのための結合部位のアップレギュレーションがもたらされる、項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目53)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択されるmAbと同じ抗原決定基に特異的に結合する、項目44に記載のmAbまたは
抗原結合性フラグメント。
(項目54)
前記mAbが、MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択される、項目53に記載のmAb。
(項目55)
MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目53に記載の抗原結合性フラグメント。
(項目56)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−11、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖CDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−11、MB20−14、MB20−16またはMB20−18の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖CDR3領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目57)
MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖CDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14またはMB20−18の軽鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖CDR3領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目58)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14またはMB20−18のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目59)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14およびMB20−18のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目60)
項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
(a)配列番号11(MB20−1)、配列番号13(MB20−2)、配列番号15(MB20−7)、配列番号17(MB20−8)、配列番号21(MB20−11)、配列番号23(MB20−14)、配列番号25(MB20−16)または配列番号27(MB20−18)の重鎖可変領域、あるいは、該配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号21、配列番号23、配列番号25または配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号39(MB20−1)、配列番号41(MB20−2)、配列番号43(MB20−3)、配列番号45(MB20−7)、配列番号47(MB20−8)、配列番号51(MB20−13)、配列番号53(MB20−14)または配列番号55(MB20−18)の軽鎖可変領域、あるいは、該配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号51;配列番号53および配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)(a)および(b)に記載の重鎖および軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目61)
項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
(a)配列番号11(MB20−1)の重鎖可変領域または該配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号39(MB20−1)の軽鎖可変領域または該配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号13(MB20−2)の重鎖可変領域または該配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号41(MB20−2)の軽鎖可変領域または該配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(c)配列番号15(MB20−7)の重鎖可変領域または該配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号45(MB20−7)の軽鎖可変領域または該配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(d)配列番号17(MB20−8)の重鎖可変領域または該配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号47(MB20−8)の軽鎖可変領域または該配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(e)配列番号11(MB20−13)の重鎖可変領域または該配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号51(MB20−13)の軽鎖可変領域または該配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(f)配列番号23(MB20−14)の重鎖可変領域または該配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号53(MB20−14)の軽鎖可変領域または該配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(g)配列番号27(MB20−18)の重鎖可変領域または該配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号55(MB20−18)の軽鎖可変領域または該配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目62)
MB20−1(配列番号11)、MB20−2(配列番号13)、MB20−7(配列番号15)、MB20−8(配列番号17)、MB20−11(配列番号21)、MB20−14(配列番号23)、MB20−16(配列番号25)およびMB20−18(配列番号27)からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖可変領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目63)
MB20−1(配列番号39)、MB20−2(配列番号41)、MB20−3(配列番号43)、MB20−7(配列番号45)、MB20−8(配列番号47)、MB20−13(配列番号51)、MB20−14(配列番号53)およびMB20−18(配列番号55)からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖可変領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目64)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目65)
前記組成物が、単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目64に記載の薬学的組成物。
(項目66)
項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを産生する、細胞株。
(項目67)
前記細胞株がハイブリドーマ細胞株である、項目66に記載の細胞株。
(項目68)
ハイブリドーマ細胞株HB20−25およびMB20−11からなる群より選択される、項目67に記載の細胞株。
(項目69)
項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを産生する、細胞株。
(項目70)
前記細胞株がハイブリドーマ細胞株である、項目69に記載の細胞株。
(項目71)
ハイブリドーマ細胞株MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択される、項目70に記載の細胞株。
(項目72)
項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目31に記載の薬学的組成物を、B細胞を枯渇させるのに有効な量で哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目73)
項目3に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目32に記載の薬学的組成物を、B細胞を枯渇させるのに有効な量で哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目74)
前記哺乳動物被験体がヒトであり、かつ、前記薬学的組成物が皮下投与される、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記組成物が1回の投与当たり375mg/m2よりも低い用量で投与される、項目73に記載の方法。
(項目76)
前記組成物が1回の投与当たり37.5mg/m2よりも低い用量で投与される、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記組成物が1回の投与当たり0.375mg/m2よりも低い用量で投与される、請求項76に記載の方法。
(項目78)
前記組成物が0.075mg/m2と125mg/m2との間の用量で投与される、請求項74に記載の方法。
(項目79)
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目72に記載の方法。
(項目80)
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目72に記載の方法。
(項目81)
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目80に記載の方法。
(項目82)
0.075mg/m2と125mg/m2との間の用量の前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、1回の投与につき前記哺乳動物被験体に投与される、項目72に記載の方法。
(項目83)
10mg/m2と75mg/m2との間の前記mAbまたは抗原結合性フラグメントを含む用量が、1回の投与につき前記哺乳動物被験体に投与される、項目82に記載の方法。
(項目84)
循環B細胞において少なくとも75%の枯渇が達成される、項目82に記載の方法。
(項目85)
組織B細胞において少なくとも60%の枯渇が達成される、項目82に記載の方法。
(項目86)
循環B細胞における前記枯渇が、少なくとも7日間観察される、項目82に記載の方法。
(項目87)
循環B細胞における前記枯渇が、少なくとも30日間観察される、項目82に記載の方法。
(項目88)
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体へのmAb、抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物の2回以上の投与を含む、項目82に記載の方法。
(項目89)
B細胞疾患を処置する方法であって、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメントの処置有効量を、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含し、ここで、該mAbまたはその抗原結合性フラグメントは125mg/m2以下の処置有効投薬量範囲を有し、循環B細胞に少なくとも75%の枯渇をもたらす、方法。
(項目90)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、37.5mg/m2以下の処置有効投薬量範囲を有する、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、10mg/m2以下の処置有効投薬量範囲を有する、項目89に記載の方法。
(項目92)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、0.375mg/m2以下の有効投薬量範囲を有する、項目89に記載の方法。
(項目93)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、0.075mg/m2以下の有効投薬量範囲を有する、項目89に記載の方法。
(項目94)
循環B細胞における前記枯渇が、少なくとも7日間観察される、項目89に記載の方法。
(項目95)
循環B細胞における前記枯渇が、少なくとも30日間観察される、項目89に記載の方法。
(項目96)
前記B細胞疾患がB細胞悪性腫瘍である、項目89に記載の方法。
(項目97)
前記B細胞疾患が自己免疫疾患である、項目89に記載の方法。
(項目98)
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目89に記載の方法。
(項目99)
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目89に記載の方法。
(項目100)
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体への薬学的組成物の2回以上の投与を含む、項目89に記載の方法。
(項目102)
B細胞疾患を処置する方法であって、処置有効量の項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目31に記載の薬学的組成物を、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目103)
前記B細胞疾患がB細胞悪性腫瘍である、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記B細胞疾患が自己免疫疾患である、項目102に記載の方法。
(項目105)
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目102に記載の方法。
(項目106)
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目102に記載の方法。
(項目107)
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目106に記載の方法。
(項目108)
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体への薬学的組成物の2回以上の投与を含む、項目102に記載の方法。
(項目109)
B細胞疾患を処置する方法であって、処置有効量の以下:
(i)項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目31に記載の薬学的組成物、および
(ii)単球またはマクロファージ機能を増強する化合物を、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目110)
前記哺乳動物被験体が、抗CD20mAb治療に対して耐性である、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記哺乳動物被験体が、mAb C2B8を用いた治療に対して耐性である、項目110に記載の方法。
(項目112)
前記哺乳動物被験体が、化学療法により処置されていたかまたは現在処置中である、請求項109に記載の方法。
(項目113)
前記哺乳動物被験体が、B細胞疾患を再発している、項目109に記載の方法。
(項目114)
前記哺乳動物被験体が、免疫無防備状態である、項目109に記載の方法。
(項目115)
CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法であって、以下の工程:(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;
(b)該哺乳動物から抗体産生細胞を収集する工程;
(c)該抗体産生細胞を、培養不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成する工程;
(d)該ハイブリドーマ細胞を、モノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに
(e)該培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程を包含する、方法。
(項目116)
前記哺乳動物がマウスである、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記抗体産生細胞がB細胞である、項目115に記載の方法。
(項目118)
前記不死化細胞が骨髄腫細胞である、項目115に記載の方法。
(項目119)
抗CD20モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を単離する工程をさらに包含する、項目115に記載の方法。
(項目120)
項目115に記載の方法によって生成される、モノクローナル抗体。
(項目121)
項目120に記載のモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメント。
(項目122)
CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法であって、以下の工程:(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;
(b)該哺乳動物から、CD20に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程;
(c)該抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程;
(d)該免疫グロブリンコード遺伝子を細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程;(e)該形質転換細胞を、該免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに
(e)該培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程
を包含する、方法。
(項目123)
HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−25またはMB20−11のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目124)
HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−25またはMB20−11のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目125)
配列番号2(HB20−1)、配列番号4(HB20−3)、配列番号6(HB20−4)、配列番号8(HB20−5)、配列番号10(HB20−25)および配列番号22(MB20−11)の重鎖可変領域、あるいは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号22と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を有する重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目126)
HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5またはHB20−25のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目127)
HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5またはHB20−25のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目128)
配列番号30(HB20−1)、配列番号32(HB20−3)、配列番号34(HB20−4)、配列番号36(HB20−5)および配列番号38(HB20−25)の軽鎖可変領域、あるいは、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36または配列番号38と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目129)
項目123に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目130)
項目124に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目131)
項目125に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目132)
項目126に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目133)
項目127に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目134)
項目128に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目135)
項目123に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目136)
項目124に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目137)
項目125に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目138)
項目126に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目139)
項目127に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目140)
項目128に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目141)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−14、MB20−16またはMB20−18のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目142)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−14、MB20−16またはMB20−18のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目143)
配列番号12(MB20−1)、配列番号14(MB20−2)、配列番号16(MB20−7)、配列番号18(MB20−8)、配列番号20(MB20−10)、配列番号22(MB20−11)、配列番号24(MB20−14)、配列番号26(MB20−16)および配列番号28(HB20−18)の重鎖可変領域、あるいは、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26または配列番号28と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目144)
MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−13、MB20−14またはMB20−18のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目145)
MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−13、MB20−14またはMB20−18のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目146)
配列番号40(MB20−1)、配列番号42(MB20−2)、配列番号44(MB20−3)、配列番号46(MB20−7)、配列番号48(MB20−8)、配列番号50(MB20−10)、配列番号52(MB20−13)、配列番号54(MB20−14)および配列番号56(MB20−18)の軽鎖可変領域、あるいは、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54または配列番号56と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目147)
項目141に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目148)
項目142に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目149)
項目143に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目150)
項目144に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目151)
項目145に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目152)
項目146に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目153)
項目141に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目154)
項目145に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目155)
項目143に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目156)
項目144に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目157)
項目145に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目158)
項目146に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目159)
哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法であって、項目3に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含し、抗CD22または抗CD19抗体を投与する工程をさらに包含する、方法。
(項目160)
CD20に特異的に結合する抗ヒトCD20mAbまたはその抗原結合性フラグメントであって、該mAbまたはその抗原結合性フラグメントの重鎖CDR3領域がアミノ酸配列FYXYXXX1YGAX2XXYを含む、抗ヒトCD20mAbまたはその抗原結合性フラグメント。
(項目161)
アミノ酸配列NXXXXを含む重鎖CDR1領域をさらに含む、項目160に記載のそのmAb抗原結合性フラグメント。
(項目162)
アミノ配列XHFWXX3XWXを含む軽鎖CDR3領域をさらに含む、項目161に記載のそのmAb抗原結合性フラグメント。
(項目163)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目160に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目164)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目161に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目165)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目162に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目166)
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目163に記載の薬学的組成物。
(項目167)
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目164に記載の薬学的組成物。
(項目168)
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目165に記載の薬学的組成物。
(項目169)
項目163に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目170)
項目164に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目171)
請求項165に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目1)
CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメントであって、該mAbまたは抗原結合性フラグメントのB細胞への結合密度が、mAb 1F5のB細胞への結合密度よりも少なくとも2倍高い、mAbまたはその抗原結合性フラグメント。
(項目2)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントがヒトCD20に特異的に結合する、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目3)
項目2に記載のmAbであって、該mAbは、以下の工程:
(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;
(b)該哺乳動物から、CD20に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程;
(c)該抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程;
(d)該免疫グロブリンコード遺伝子を細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程;(e)該形質転換細胞を、該免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに
(e)該培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程
を包含する方法によって生成される、mAb。
(項目4)
前記抗原結合性フラグメントが、F(ab’)2、Fab’、FabまたはFvフラグメントである、項目1に記載の抗原結合性フラグメント。
(項目5)
検出可能に標識される、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目6)
治療化合物と結合体化される、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目7)
細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目6に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目8)
裸の抗体である、項目1に記載のmAb。
(項目9)
二重特異性抗体である、項目1に記載のmAb。
(項目10)
CD20の細胞外ドメインに結合する、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目11)
キメラmAbまたは抗原結合性フラグメントである、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目12)
ヒト化mAbまたは抗原結合性フラグメントである、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目13)
B細胞上のCD20への前記mAbまたは抗原結合性フラグメントの結合により、該B細胞上のmAbまたは抗原結合性フラグメントに対する結合部位のアップレギュレーションがもたらされる、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目14)
HB20−3、HB20−4、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbと同じ抗原決定基に結合する、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目15)
前記mAbがHB20−25およびMB20−11からなる群より選択される、項目14に記載のmAb。
(項目16)
HB20−3およびHB20−4の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目14に記載の抗原結合性フラグメント。
(項目17)
HB20−3、HB20−4、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖CDR3領域、あるいは、該HB20−3、HB20−4、HB20−25またはMB20−11の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖CDR3領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目18)
前記HB20−25mAbに由来する重鎖CDR3領域、または、該HB20−25の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖CDR3領域を含む、項目17に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目19)
HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖CDR3領域、あるいは、該HB20−3、HB20−4またはHB20−25の軽鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖CDR3領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目20)
前記HB20−25mAbに由来する軽鎖CDR3領域、または、前記HB20−25の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖CDR3領域を含む、項目19に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目21)
HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該HB20−3、HB20−4またはHB20−25のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目22)
HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該HB20−3、HB20−4またはHB20−25のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目23)
前記HB20−25mAbに由来するCDR3領域を含むか、または該CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する、項目22に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目24)
項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
(a)配列番号3(HB20−3)、配列番号5(HB20−4)、配列番号9(HB20−25)または配列番号21(MB20−11)の重鎖可変領域、あるいは、該配列番号3、配列番号5、配列番号9または配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号31(HB20−3)、配列番号33(HB20−4)、または配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域、あるいは、該配列番号31、配列番号33、または配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)(a)および(b)に記載の重鎖および軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目25)
項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
(a)配列番号3(HB20−3)の重鎖可変領域または該配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号31(HB20−3)の軽鎖可変領域または該配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号5(HB20−4)の重鎖可変領域または該配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号33(HB20−4)の軽鎖可変領域または該配列番号33のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)配列番号9(HB20−25)の重鎖可変領域または該配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域または該配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目26)
項目25に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
配列番号9(HB20−25)の重鎖可変領域または該配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号37(HB20−25)の軽鎖可変領域または該配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目27)
HB20−3(配列番号3)、HB20−4(配列番号5)、HB20−25(配列番号9)およびMB20−11(配列番号21)からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖可変領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目28)
HB20−3(配列番号31)、HB20−4(配列番号33)およびHB20−25(配列番号37)からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖可変領域を含む、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目29)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目30)
前記組成物が、単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目29に記載の薬学的組成物。
(項目31)
薬学的に受容可能なキャリア中に、HB20−1、HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択されるモノクローナル抗体と同じ抗原決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目32)
モノクローナル抗体HB20−25と同じ抗原決定基に特異的に結合するmAbまたはその抗原結合性フラグメントを含む、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目33)
前記抗原結合性フラグメントが、F(ab’)2、Fab’、FabまたはFvフラグメントである、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目34)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが検出可能に標識される、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目35)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが治療化合物と結合体化される、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目36)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目35に記載の薬学的組成物。
(項目37)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが裸の抗体である、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目38)
前記mAbが二重特異性抗体である、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目39)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、キメラmAbまたは抗原結合性フラグメントである、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目40)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、ヒト化mAbまたは抗原結合性フラグメントである、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目41)
前記mAbが、HB20−1、HB20−3、HB20−4およびHB20−25からなる群より選択される、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目42)
前記mAbがHB20−25である、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目43)
前記抗原結合性フラグメントが、HB20−1、HB20−3、HB20−4およびHB20−25の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目31に記載の薬学的組成物。
(項目44)
マウスCD20に特異的に結合する、モノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメント。
(項目45)
前記抗原結合性フラグメントが、F(ab’)2、Fab’、FabまたはFvフラグメントである、項目44に記載の抗原結合性フラグメント。
(項目46)
検出可能に標識される、項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目47)
治療化合物と結合体化される、項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目48)
細胞傷害性薬剤と結合体化される、項目47に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目49)
裸の抗体である、項目44に記載のmAb。
(項目50)
二重特異性抗体である、項目44に記載のmAb。
(項目51)
CD20の細胞外ドメインに結合する、項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目52)
B細胞上のCD20へのmAbまたは抗原結合性フラグメントの結合により、該B細胞上のmAbまたは抗原結合性フラグメントのための結合部位のアップレギュレーションがもたらされる、項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目53)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択されるmAbと同じ抗原決定基に特異的に結合する、項目44に記載のmAbまたは
抗原結合性フラグメント。
(項目54)
前記mAbが、MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択される、項目53に記載のmAb。
(項目55)
MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18の抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、項目53に記載の抗原結合性フラグメント。
(項目56)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−11、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖CDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−11、MB20−14、MB20−16またはMB20−18の重鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖CDR3領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目57)
MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖CDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14またはMB20−18の軽鎖CDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖CDR3領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目58)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14またはMB20−18のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目59)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−13、MB20−14およびMB20−18のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目60)
項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
(a)配列番号11(MB20−1)、配列番号13(MB20−2)、配列番号15(MB20−7)、配列番号17(MB20−8)、配列番号21(MB20−11)、配列番号23(MB20−14)、配列番号25(MB20−16)または配列番号27(MB20−18)の重鎖可変領域、あるいは、該配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号21、配列番号23、配列番号25または配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号39(MB20−1)、配列番号41(MB20−2)、配列番号43(MB20−3)、配列番号45(MB20−7)、配列番号47(MB20−8)、配列番号51(MB20−13)、配列番号53(MB20−14)または配列番号55(MB20−18)の軽鎖可変領域、あるいは、該配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号51;配列番号53および配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(c)(a)および(b)に記載の重鎖および軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目61)
項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントであって、以下:
(a)配列番号11(MB20−1)の重鎖可変領域または該配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号39(MB20−1)の軽鎖可変領域または該配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(b)配列番号13(MB20−2)の重鎖可変領域または該配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号41(MB20−2)の軽鎖可変領域または該配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(c)配列番号15(MB20−7)の重鎖可変領域または該配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号45(MB20−7)の軽鎖可変領域または該配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(d)配列番号17(MB20−8)の重鎖可変領域または該配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号47(MB20−8)の軽鎖可変領域または該配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(e)配列番号11(MB20−13)の重鎖可変領域または該配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号51(MB20−13)の軽鎖可変領域または該配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;
(f)配列番号23(MB20−14)の重鎖可変領域または該配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号53(MB20−14)の軽鎖可変領域または該配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント;ならびに
(g)配列番号27(MB20−18)の重鎖可変領域または該配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号55(MB20−18)の軽鎖可変領域または該配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、mAbまたは抗原結合性フラグメント
からなる群より選択される、mAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目62)
MB20−1(配列番号11)、MB20−2(配列番号13)、MB20−7(配列番号15)、MB20−8(配列番号17)、MB20−11(配列番号21)、MB20−14(配列番号23)、MB20−16(配列番号25)およびMB20−18(配列番号27)からなる群より選択されるmAbに由来する重鎖可変領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目63)
MB20−1(配列番号39)、MB20−2(配列番号41)、MB20−3(配列番号43)、MB20−7(配列番号45)、MB20−8(配列番号47)、MB20−13(配列番号51)、MB20−14(配列番号53)およびMB20−18(配列番号55)からなる群より選択されるmAbに由来する軽鎖可変領域を含む、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメント。
(項目64)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目53に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目65)
前記組成物が、単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目64に記載の薬学的組成物。
(項目66)
項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを産生する、細胞株。
(項目67)
前記細胞株がハイブリドーマ細胞株である、項目66に記載の細胞株。
(項目68)
ハイブリドーマ細胞株HB20−25およびMB20−11からなる群より選択される、項目67に記載の細胞株。
(項目69)
項目44に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを産生する、細胞株。
(項目70)
前記細胞株がハイブリドーマ細胞株である、項目69に記載の細胞株。
(項目71)
ハイブリドーマ細胞株MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択される、項目70に記載の細胞株。
(項目72)
項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目31に記載の薬学的組成物を、B細胞を枯渇させるのに有効な量で哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目73)
項目3に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目32に記載の薬学的組成物を、B細胞を枯渇させるのに有効な量で哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目74)
前記哺乳動物被験体がヒトであり、かつ、前記薬学的組成物が皮下投与される、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記組成物が1回の投与当たり375mg/m2よりも低い用量で投与される、項目73に記載の方法。
(項目76)
前記組成物が1回の投与当たり37.5mg/m2よりも低い用量で投与される、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記組成物が1回の投与当たり0.375mg/m2よりも低い用量で投与される、請求項76に記載の方法。
(項目78)
前記組成物が0.075mg/m2と125mg/m2との間の用量で投与される、請求項74に記載の方法。
(項目79)
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目72に記載の方法。
(項目80)
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目72に記載の方法。
(項目81)
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目80に記載の方法。
(項目82)
0.075mg/m2と125mg/m2との間の用量の前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、1回の投与につき前記哺乳動物被験体に投与される、項目72に記載の方法。
(項目83)
10mg/m2と75mg/m2との間の前記mAbまたは抗原結合性フラグメントを含む用量が、1回の投与につき前記哺乳動物被験体に投与される、項目82に記載の方法。
(項目84)
循環B細胞において少なくとも75%の枯渇が達成される、項目82に記載の方法。
(項目85)
組織B細胞において少なくとも60%の枯渇が達成される、項目82に記載の方法。
(項目86)
循環B細胞における前記枯渇が、少なくとも7日間観察される、項目82に記載の方法。
(項目87)
循環B細胞における前記枯渇が、少なくとも30日間観察される、項目82に記載の方法。
(項目88)
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体へのmAb、抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物の2回以上の投与を含む、項目82に記載の方法。
(項目89)
B細胞疾患を処置する方法であって、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)またはその抗原結合性フラグメントの処置有効量を、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含し、ここで、該mAbまたはその抗原結合性フラグメントは125mg/m2以下の処置有効投薬量範囲を有し、循環B細胞に少なくとも75%の枯渇をもたらす、方法。
(項目90)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、37.5mg/m2以下の処置有効投薬量範囲を有する、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、10mg/m2以下の処置有効投薬量範囲を有する、項目89に記載の方法。
(項目92)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、0.375mg/m2以下の有効投薬量範囲を有する、項目89に記載の方法。
(項目93)
前記mAbまたは抗原結合性フラグメントが、0.075mg/m2以下の有効投薬量範囲を有する、項目89に記載の方法。
(項目94)
循環B細胞における前記枯渇が、少なくとも7日間観察される、項目89に記載の方法。
(項目95)
循環B細胞における前記枯渇が、少なくとも30日間観察される、項目89に記載の方法。
(項目96)
前記B細胞疾患がB細胞悪性腫瘍である、項目89に記載の方法。
(項目97)
前記B細胞疾患が自己免疫疾患である、項目89に記載の方法。
(項目98)
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目89に記載の方法。
(項目99)
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目89に記載の方法。
(項目100)
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体への薬学的組成物の2回以上の投与を含む、項目89に記載の方法。
(項目102)
B細胞疾患を処置する方法であって、処置有効量の項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目31に記載の薬学的組成物を、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目103)
前記B細胞疾患がB細胞悪性腫瘍である、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記B細胞疾患が自己免疫疾患である、項目102に記載の方法。
(項目105)
前記哺乳動物被験体がヒトである、項目102に記載の方法。
(項目106)
前記薬学的組成物が非経口経路によって投与される、項目102に記載の方法。
(項目107)
前記薬学的組成物が、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与からなる群より選択される経路によって投与される、項目106に記載の方法。
(項目108)
前記方法が、長期間にわたる哺乳動物被験体への薬学的組成物の2回以上の投与を含む、項目102に記載の方法。
(項目109)
B細胞疾患を処置する方法であって、処置有効量の以下:
(i)項目1に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントあるいは項目31に記載の薬学的組成物、および
(ii)単球またはマクロファージ機能を増強する化合物を、B細胞疾患を有する哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目110)
前記哺乳動物被験体が、抗CD20mAb治療に対して耐性である、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記哺乳動物被験体が、mAb C2B8を用いた治療に対して耐性である、項目110に記載の方法。
(項目112)
前記哺乳動物被験体が、化学療法により処置されていたかまたは現在処置中である、請求項109に記載の方法。
(項目113)
前記哺乳動物被験体が、B細胞疾患を再発している、項目109に記載の方法。
(項目114)
前記哺乳動物被験体が、免疫無防備状態である、項目109に記載の方法。
(項目115)
CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法であって、以下の工程:(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;
(b)該哺乳動物から抗体産生細胞を収集する工程;
(c)該抗体産生細胞を、培養不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成する工程;
(d)該ハイブリドーマ細胞を、モノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに
(e)該培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程を包含する、方法。
(項目116)
前記哺乳動物がマウスである、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記抗体産生細胞がB細胞である、項目115に記載の方法。
(項目118)
前記不死化細胞が骨髄腫細胞である、項目115に記載の方法。
(項目119)
抗CD20モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を単離する工程をさらに包含する、項目115に記載の方法。
(項目120)
項目115に記載の方法によって生成される、モノクローナル抗体。
(項目121)
項目120に記載のモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメント。
(項目122)
CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法であって、以下の工程:(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;
(b)該哺乳動物から、CD20に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程;
(c)該抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程;
(d)該免疫グロブリンコード遺伝子を細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程;(e)該形質転換細胞を、該免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに
(e)該培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程
を包含する、方法。
(項目123)
HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−25またはMB20−11のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目124)
HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−25およびMB20−11からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−25またはMB20−11のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目125)
配列番号2(HB20−1)、配列番号4(HB20−3)、配列番号6(HB20−4)、配列番号8(HB20−5)、配列番号10(HB20−25)および配列番号22(MB20−11)の重鎖可変領域、あるいは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号22と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を有する重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目126)
HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5またはHB20−25のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目127)
HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5およびHB20−25からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該HB20−1、HB20−3、HB20−4、HB20−5またはHB20−25のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目128)
配列番号30(HB20−1)、配列番号32(HB20−3)、配列番号34(HB20−4)、配列番号36(HB20−5)および配列番号38(HB20−25)の軽鎖可変領域、あるいは、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36または配列番号38と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目129)
項目123に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目130)
項目124に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目131)
項目125に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目132)
項目126に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目133)
項目127に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目134)
項目128に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目135)
項目123に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目136)
項目124に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目137)
項目125に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目138)
項目126に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目139)
項目127に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目140)
項目128に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目141)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−14、MB20−16またはMB20−18のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目142)
MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−14、MB20−16およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−14、MB20−16またはMB20−18のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目143)
配列番号12(MB20−1)、配列番号14(MB20−2)、配列番号16(MB20−7)、配列番号18(MB20−8)、配列番号20(MB20−10)、配列番号22(MB20−11)、配列番号24(MB20−14)、配列番号26(MB20−16)および配列番号28(HB20−18)の重鎖可変領域、あるいは、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26または配列番号28と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目144)
MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−13、MB20−14またはMB20−18のCDR3領域に対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR3領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目145)
MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−13、MB20−14およびMB20−18からなる群より選択されるmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域、あるいは、該MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−13、MB20−14またはMB20−18のCDR1、CDR2およびCDR3領域のそれぞれに対して少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有するCDR1、CDR2およびCDR3領域を含む、可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目146)
配列番号40(MB20−1)、配列番号42(MB20−2)、配列番号44(MB20−3)、配列番号46(MB20−7)、配列番号48(MB20−8)、配列番号50(MB20−10)、配列番号52(MB20−13)、配列番号54(MB20−14)および配列番号56(MB20−18)の軽鎖可変領域、あるいは、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54または配列番号56と少なくとも80%のアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域からなる群より選択される可変領域を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
(項目147)
項目141に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目148)
項目142に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目149)
項目143に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目150)
項目144に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目151)
項目145に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目152)
項目146に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目153)
項目141に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目154)
項目145に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目155)
項目143に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目156)
項目144に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目157)
項目145に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目158)
項目146に記載の単離核酸を含む、細胞。
(項目159)
哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法であって、項目3に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含し、抗CD22または抗CD19抗体を投与する工程をさらに包含する、方法。
(項目160)
CD20に特異的に結合する抗ヒトCD20mAbまたはその抗原結合性フラグメントであって、該mAbまたはその抗原結合性フラグメントの重鎖CDR3領域がアミノ酸配列FYXYXXX1YGAX2XXYを含む、抗ヒトCD20mAbまたはその抗原結合性フラグメント。
(項目161)
アミノ酸配列NXXXXを含む重鎖CDR1領域をさらに含む、項目160に記載のそのmAb抗原結合性フラグメント。
(項目162)
アミノ配列XHFWXX3XWXを含む軽鎖CDR3領域をさらに含む、項目161に記載のそのmAb抗原結合性フラグメント。
(項目163)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目160に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目164)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目161に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目165)
薬学的に受容可能なキャリア中に、項目162に記載のmAbまたは抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
(項目166)
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目163に記載の薬学的組成物。
(項目167)
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目164に記載の薬学的組成物。
(項目168)
単球またはマクロファージ機能を増強する化合物をさらに含む、項目165に記載の薬学的組成物。
(項目169)
項目163に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目170)
項目164に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
(項目171)
請求項165に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法。
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の本発明の説明においてより詳細に記載される。
(発明の詳細な説明)
本発明は、従来の抗CD20mAb(例えば、1F5または2B8)と比較して異なる結合特性および他の特徴を有する、ヒトCD20に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)のパネルの生成に一部基づく。特に、本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントは、従来の抗CD20抗体とは分子レベルで(例えば、軽鎖および/または重鎖可変領域あるいは相補性決定領域(「CDR」)のような可変領域の特定の断片のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列によって)区別され得る。
本発明は、従来の抗CD20mAb(例えば、1F5または2B8)と比較して異なる結合特性および他の特徴を有する、ヒトCD20に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)のパネルの生成に一部基づく。特に、本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントは、従来の抗CD20抗体とは分子レベルで(例えば、軽鎖および/または重鎖可変領域あるいは相補性決定領域(「CDR」)のような可変領域の特定の断片のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列によって)区別され得る。
特定の実施形態において、本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントは、従来のmAbよりも高密度でB細胞に結合し得、この性質が、B細胞を枯渇させる方法にとって、治療法または診断法にとって、あるいは実験用試薬としての使用(例えば、B細胞の同定またはB細胞の精製のため)にとって有利である。
本発明はまた、マウスCD20に特異的に結合するmAbおよびその抗原結合性フラグメントも提供する。
さらに、CD20−/−哺乳動物(例えば、マウス)から単離された抗体産生細胞(例えば、B細胞)から産生される抗CD20mAbを提供する。
次に、本発明を、添付図面を参照して説明し、その中で本発明の好ましい実施形態を示す。本発明は、種々の形態で具体化され得、本明細書中で示した実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、この開示が詳細かつ完全であるように、かつ当業者に本発明の範囲を十分に伝達するように、これらの実施形態を提供する。例えば、1つの実施形態に関して例証した特徴は他の実施形態に組み込まれ得、そして特定の実施形態に関して例証した特徴はその実施形態から削除され得る。さらに、本明細書中で示した実施形態に対する多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者にも明らかであり、本発明から逸脱しない。
他に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中で本発明の記述に用いられる用語は、単に特定の実施形態を記述する目的のためであって、本発明を限定することを意図しない。
本発明の記載および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに別のものを示さない限り、複数形も同様に包含することを意図する。
本明細書中に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。
特に指示のない限り、標準方法が、本発明による抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントの生成、核酸配列の操作、形質転換細胞の作製などに用いられ得る。このような技術は当業者に公知である。例えば、SAMBROOKら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL 第2版(Cold Spring Harbor,NY,1989);F.M,AUSUBELら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Green Publishing Associates,Inc.およびJohn Wiley & Sons,Inc.,New York)を参照のこと。
(抗CD20mAb、抗原結合フラグメントおよび細胞株)
1つの局面として、本発明は、CD20に特異的に結合するmAbおよびそれらの抗原結合性フラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、「CD20に特異的に結合するmAb」および「抗CD20mAb」ならびに類似語は、置き替え可能である。特定の実施形態において、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、ヒトCD20および/またはマウスCD20に特異的に結合する。このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、CD20タンパク質の任意の領域に結合可能であるが、代表的な実施形態においては、CD20の細胞外領域に結合する。
1つの局面として、本発明は、CD20に特異的に結合するmAbおよびそれらの抗原結合性フラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、「CD20に特異的に結合するmAb」および「抗CD20mAb」ならびに類似語は、置き替え可能である。特定の実施形態において、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、ヒトCD20および/またはマウスCD20に特異的に結合する。このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、CD20タンパク質の任意の領域に結合可能であるが、代表的な実施形態においては、CD20の細胞外領域に結合する。
本明細書中で使用される場合、多様な文法形態での用語「抗体」または「抗体分子」とは、免疫グロブリン分子(IgG、IgE、IgA、IgM、IgDを含む)および/または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分(すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含み、かつ抗原に結合可能な分子)をいう。「抗体結合部位」または「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変および超可変(CDR)領域からなる、抗体分子の構造部分である。当該分野で公知のように、抗体の特有の性質は、免疫グロブリンアイソタイプに関連している。代表的な実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、IgG2a、IgG1またはIgG2bアイソタイプ分子である。この抗体またはフラグメントはさらに、鳥類(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラなど)および哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなど)の種を含む、任意の種の起源由来であってもよい。
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「mAb」とは、実質的に同種の抗体の集団(すなわち、この集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に生じる突然変異の可能性を除いて、同一である)から得られる抗体をいう。mAbは非常に特異的であり、抗原上の単一の抗原決定基(すなわち、エピトープ)に対して指向される。この特性は、代表的には異なる抗原決定基に対して指向される抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物と対照的である。
用語「抗体」および「mAb」は、本明細書において最も広い意味で使用され、具体的には、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、裸の抗体、抗体結合体、および抗体フラグメントを、これらが所望の生物活性を示す限りは包含する。さらに、用語「抗体」および「mAb」は、インタクトな(すなわち、完全な)免疫グロブリン分子、または、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメントを含めた、パラトープを含む抗体の抗原結合性フラグメント、ダイアボディー(diabodies)、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を包含する。
単鎖Fvまたは「sFv」抗体フラグメントは、抗体重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、sFvが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。sFvの総説について、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、133巻、RosenburgおよびMoore編、Springer−Verlag、New York、pp.269〜315(1994)を参照のこと。単鎖抗体の生成は当該分野で記載されており(例えば、米国特許第第5,260,203号を参照のこと)、その開示内容は、参考として本明細書中に援用される。単鎖抗体を生成する1つの例示的な方法において、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを、免疫動物の脾臓から単離したRNAから調製し、適切な抗体を発現しているファージミドを内皮組織上でパニングによって選択する。従来のハイブリドーマ技術を超える本アプローチの利点は、単回に約104倍もの数の抗体が生成され、かつスクリーニングされ得ること、ならびに単鎖中のHおよびL鎖の組合せによって新しい特異性が生じ、適切な抗体を見出す機会がさらに増大することである。
用語「ダイアボディー」とは、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメインと連結した重鎖可変ドメインを含む。同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補ドメインと強制的に対合させ、2つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディーは当該分野において公知であり、例えば、欧州特許第404,097号;WO93/11161;およびHollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci 90:6444〜6448(1993)を参照のこと。
本明細書中で使用される場合、「直鎖状抗体」との表現は、一対の抗原結合部位を形成する一対のタンデムFdセグメント(VH−CH1−VH−CH1)を含む抗体をいう。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得、Zapataら、Protein Eng.8:1057〜1062(1995)に、より詳細に記載される。
抗体フラグメントの生成のために、種々の技術が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントはインタクトな抗体のタンパク分解性消化によって生成された(例えば、Morimotoら、J.Biochem.Biophys.Methods 24:107〜117(1992)およびBrennanら、Science 229:81(1985)を参照のこと)。しかしながら、今やこれらのフラグメントは、形質転換宿主細胞中で組換え核酸技術によって直接生成され得る。例えば、Fab’−SHフラグメントは、E.coliから直接回収され得、化学的に結合してF(ab’)2フラグメントを形成する(Carterら、Bio/Technology 10:163〜167(1992))。あるいは、F(ab’)2は、F(ab’)2分子のアセンブリを促進するために、ロイシンジッパーGCN4を用いて形成される。別のアプローチによれば、Fv、FabまたはF(ab’)2フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者に明らかである。
本発明の例示的なmAbとしては、本明細書中に開示されるように、HB20−1、HB20−2、HB20−3,HB20−4、HB20−5、HB20−6、HB20−25、MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8,MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18が挙げられる。HB20−1、HB20−2、HB20−3、HB20−4、HB20−5およびHB20−6は、以前に、それぞれHB13a、HB13b、HB13c、HB13d、HB13eおよびHB13fと指定されている。
本発明はさらに、本明細書中で具体的に記載される抗体の対応する鎖もしくは領域と比較して、実質的に類似の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および/またはCDR1、CDR2および/またはCDR3領域の核酸配列および/またはアミノ酸配列を有し(以下により詳細に記載されるように)、かつCD20に特異的に結合し、そして必要に応じて本明細書中で具体的に記載される抗体および抗体フラグメントの1以上の他の機能特性(例えば、結合密度、B細胞枯渇の効力)を示す、本明細書中で具体的に開示されるmAbおよび抗原結合性フラグメントの機能的等価物を包含する。1つの例示的な実施形態において、本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントは、本明細書中で具体的に記載されるmAbおよび抗原結合性フラグメントと同じ抗原決定基(すなわち、エピトープ)に結合する。
当業者は、エピトープマッピングによって、抗体が、本明細書中に開示されるmAbの特異性を有するか否かを、過度の実験を行うことなく日常的に決定する。例えば、問題の抗体の1以上の重鎖および/または軽鎖CDR領域あるいは重鎖および/または軽鎖可変領域の、核酸配列および/またはアミノ酸配列を決定し得る。これらの領域における同一の、または機能的に等価なアミノ酸残基配列を有する抗体分子は、同一のまたは類似の結合特異性を有する。可変領域およびCDR領域の類似性を評価および比較して機能的等価を決定する方法は、当業者に公知である。
モノクローナル抗体が本明細書中に記載されるような抗体と同じ特異性を有するか否かを決定する別の方法は、アミノ酸配列に基づくコンピュータモデリングによって予測される抗体パラトープの3次元構造の比較によるものである。エピトープ−抗体パラトープ相互作用は、代表的には以下の4つの力を包含する:ファンデルワールス力(双極子間相互作用)、水素結合、疎水的相互作用、およびイオン(クーロン)結合。非共有結合は、抗体−抗原複合体を安定化させ、かつ結合させる。この相互作用は、両方の分子の3D構造によって決定される。従って、抗体パラトープ、エピトープ、および/またはエピトープ−抗体パラトープ複合体の3D構造を予測することによって、他の抗体に対する免疫特異性の比較が可能になる。
あるいは、またはさらに、ランダムにもしくは特定の遺伝子構造によってのいずれかで、抗体が結合する抗原の断片化に基づく技術を用い、そしてこの抗体を用いて得たフラグメントの反応性を決定することによって、エピトープマッピングが行われ得る。断片化はまた、例えばPCR技術によって核酸レベルで行われ、続いて転写、および放射性アミノ酸の存在下でインビトロにおけるタンパク質への翻訳が行われ得る。さらに詳細には、例えば、HarlowおよびLane、Using Antibodies,a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1999、pp.390〜392を参照のこと。
エピトープマッピングのさらなる方法によって、各々がタンパク質抗原の小さな直線状セグメントに対応する、一組の重複ペプチドを合成し、固相上に配列する。次いで、このペプチドのパネルを試験抗体でプローブし、結合した抗体を、酵素標識二次抗体を用いて検出する(HarlowおよびLane、前出、pp.393〜396)。
エピトープマッピングについて当該分野で周知のさらなる方法は、ランダム合成またはファージディスプレイペプチドライブラリーからの抗体選択である。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの複合体混合物を、f1型ssDNAファージの微動コートタンパク質遺伝子のアミノ末端にクローニングすることによって、構築され得る。このようなファージディスプレイライブラリーは、例えば、New England Biolabsから市販されている。これらのライブラリーをストックとして増幅させ得、次いで、各々独立したクローンの複数のコピーを示すのに十分なアリコートを目的の抗体と混合する。抗体結合ファージを「バイオパニング」と呼ばれる手順で回収し、非結合性のファージを除去する。これらの結合ファージを溶出して細菌に感染させるのに用い、そして選択されたストックを増幅させる。最終的に選択されたストックの個々のプラークを成長させ、特異的抗体反応性を(例えば、ELISAによって)チェックし、そして挿入部位前後のDNAを配列決定する。抗体が結合するペプチドをコードする配列の分析により、抗体の特異性を定義する。さらに詳細には、例えば、SmithおよびScott、Methods Enzymol.217:228〜257(1993)、ならびにHarlowおよびLane、前出、pp.397〜398を参照のこと。
信頼性は低いが、mAbが、本明細書中に記載されるようなmAbと同じ特異性を有するか否かを決定する別の方法は、前者が、後者が標的分子(例えば、CD20)に結合するのを妨げるか否かを確認することによるものである。標的分子への結合に関する標準的な競合アッセイにおいてmAbによる結合性の低下によって示されるように、試験されるmAbが、本明細書中に記載されるようなmAbと競合する場合、これらの2つのmAbは、同一の、または密接に関連したエピトープに結合可能である。しかしながら、これは確定的な試験ではない。試験されたmAbおよび本明細書中に開示されるmAbが結合する実際のエピトープは、たとえ試験された抗体が、本明細書中に開示される抗体によって標的分子への結合性を低下させることが可能であるとしてもなお、異なる場合がある。例えば、試験mAbによるその抗原決定基への結合によって、本明細書中に記載されるmAb抗体の抗原決定基がマスクされ、同じエピトープを結合することによってではなくむしろ、単にこの試験mAbの物理的大きさに起因して結合を妨げ得る。従って、特異性を確認するために、より正確な手順(例えば、可変領域のアミノ酸配列決定および3Dモデリング)を、競合方法と組み合わせて用いる場合が多い。
mAbが、本明細書中に記載されるmAbの特異性を有し得るか否かを決定するためのさらに別の方法は、本明細書中に開示されるmAbを標的分子(例えば、CD20)と共にプレインキュベートし、次いで、試験されるmAbを添加して、この試験されるmAbが標的に結合する能力を抑制されるか否かを決定することである。試験されるmAbが抑制される場合、本明細書中に開示されるmAbと同じかまたは機能的に等価な、エピトープ特異性を有する可能性がある。しかしながら、この手順は、上で議論した競合研究と同じ制限を受け、従って、必ずしも同一の特異性の決定因ではない。
本発明の特定の実施形態において、mAbまたはその抗原結合性フラグメントは、CD20に特異的に結合し、ここで、CD20および/またはB細胞に対するmAbまたは抗原結合性フラグメントの結合密度は、CD20および/またはB細胞に対する従来の抗CD20mAb(例えば、2H7、B9E9、1H4、2B8、1F5および/またはLeu−16抗体)の結合性よりも、少なくとも約30%、40%、50%、60%、75%、85%、2倍、3倍、4倍または5倍かあるいはそれより大きい。さらに、本発明のmAbは、より低密度でCD20を発現する悪性B細胞の枯渇において、治療的により有効であり得る。これらの従来の抗体は、当業者に入手可能である(例えば、Shanら(1999)J.Immunol.162:6589〜6595;Schultzら(2000)Cancer Res.60:6663〜6669;およびHaismaら(1998)Blood 92:184〜190;Stashenkoら(1980)J.Immunol.125:1678を参照のこと)。本発明の任意の特定の理論に限定されるつもりはないが、抗体結合の密度は、抗体によって結合されるエピトープの接近可能性または利用可能性に起因し得る。従って、この実施形態によれば、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、上記の1以上の従来の抗体と比較して、細胞表面上への接近可能性が増大したエピトープに対して指向されるようである。本発明のこの実施形態による抗体および抗原結合性フラグメントは、治療用途に有利である。なぜなら、これらは、従来の抗体よりも低い投薬量でB細胞枯渇を誘導し得るためである。従来の抗体と比較した結合密度の増加度が、標的(例えば、用いる細胞株)によって変動し得ることを、当業者は理解する。1つの例示的な実施形態において、mAbまたは抗原結合性フラグメントは、B細胞上の結合部位(すなわち、エピトープの接近可能性)をアップレギュレートし、その結果、B細胞および/またはそれらの悪性対応物に対するmAbまたは抗原結合性フラグメントの結合密度がより高くなる。
細胞に結合している抗体の密度を決定する方法は、当業者に公知である(例えば、Satoら、J.Immunology 165:6635〜6643(2000)を参照のこと;これは、CD19の細胞表面密度を評価する方法を開示している)。他の標準方法としては、スキャッチャード分析が挙げられる。例えば、抗体またはフラグメントを単離し、放射標識し、そしてこの放射標識した抗体の比活性を決定し得る。次いで、この抗体を、CD20を発現している標的細胞と接触させる。細胞に結合する放射能を測定し、この比活性に基づいて、細胞に結合した抗体または抗体フラグメントの量を決定し得る。
あるいは、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析を使用し得る。一般に、抗体または抗体フラグメントを、CD20を発現している標的細胞に結合する。次いで、この抗体に結合する二次試薬、例えば、蛍光色素標識した抗免疫グロブリン抗体を添加する。次いで、蛍光色素染色を測定し、これを用いて細胞に結合している抗体または抗体フラグメントの密度を決定し得る。
別の適切な方法として、抗体または抗体フラグメントを検出可能な標識(例えば、フルオロフォア)で直接標識し、標的細胞に結合させ得る。タンパク質に対する標識の比を決定し、既知量の標識が結合した標準ビーズと比較する。既知の標準物と、細胞に結合した標識の量の比較を用いて、細胞に結合した抗体の量を算出し得る。
本発明の他の実施形態において、機能的に等価な抗体またはフラグメントは、B細胞の枯渇および/またはB細胞疾患の処置に関して、本明細書中に記載される抗体またはフラグメントと同一のまたは類似の効力を有する。本発明のこの局面は、以下により詳細に記載される。例証のために、代表的な実施形態において、機能的に等価な抗体またはフラグメントは、約125mg/m2、75mg/m2、37.5mg/m2、10mg/m2、3.75mg/m2、1mg/m2、0.75mg/m2、0.375mg/m2、0.1mg/m2、0.05mg/m2、0.001mg/m2、0.0005mg/m2またはそれより少ない投薬量で、少なくとも約5日間、7日間、14日間、21日間、30日間、45日間、60日間、120日間または180日間以上、循環B細胞およびまたは組織B細胞において、少なくとも約25%、35%、50%、75%、85%、90%、95%または98%以上の枯渇を達成する。他の特定の投薬量、枯渇の程度、および枯渇時間は、以下により詳細に記載される。
本発明の代表的な実施形態において、本発明のmAbまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなmAbの重鎖または軽鎖を含む。他の例示的な実施形態において、本発明のmAbまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなmAbに由来する重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態において、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に開示されるmAbに由来する重鎖Vおよび/またはDおよび/またはJ領域ならびに/あるいは軽鎖Vおよび/またはJ領域を含む。さらに他の代表的な実施形態において、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるmAbの重鎖CDR1および/またはCDR2および/またはCDR3領域ならびに/あるいは軽鎖CDR1および/またはCDR2および/またはCDR3領域を含む。この実施形態によれば、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなmAbに由来するCDR1、CDR2およびCDR3領域(重鎖および軽鎖)を含み得る。
特定の実施形態において、抗ヒトCD20抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントは、CD20に特異的に結合し、かつ、アミノ酸配列FYXYXXX1YGAX2XXYを含む重鎖CDR3領域を有し、ここで、Xは任意のアミノ酸であり得、そしてここで、X1は任意のアミノ酸であり得、好ましくはYまたはSであり、そしてここで、X2は任意のアミノ酸であり得、好ましくはMまたはLであり、そしてここでFはフェニルアラニンであり、Yはチロシンであり、Gはグリシンであり、Aはアラニンであり、Mはメチオニンであり、Lはロイシンであり、そしてSはセリンである。CDRは、図15および18に示すように定義される。
ある実施形態において、抗ヒトCD20抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列NXXXXを含む重鎖CDR1領域をさらに含み、ここで、Xは任意のアミノ酸であり得、Nはアスパラギンである。
別の実施形態において、抗ヒト抗CD20抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列XHFWXX3XWXを含む軽鎖CDR3領域をさらに含み、ここで、Xは任意のアミノ酸配列であり得、Hはヒスチジンであり、Fはフェニルアラニンであり、Wはトリプトファンであり、そしてX3は任意のアミノ酸であり得、好ましくはTまたはIであり、ここでTはトレオニンであり、そしてIはイソロイシンである。
さらに、本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントは、上に特定したアミノ酸配列(例えば、重鎖または軽鎖、重鎖および/または軽鎖可変領域、V、D、および/またはJ領域あるいはCDR)との実質的な配列類似性、例えば、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%またはそれを超えるアミノ酸配列類似性を有するmAbおよび抗原結合性フラグメントを包含する。あるいは、これらの領域をコードする核酸は、本明細書中に記載される抗体の対応領域のヌクレオチド配列と、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%またはそれを超えるヌクレオチド配列類似性を有する。
当業者は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列および核酸配列に、本発明の範囲内でいくらかの変更をなし得ることを理解する。例えば、核酸分子またはタンパク質分子のクローニングまたは増幅手順あるいは他の実験室手技により、これらの配列を変更し、CD20および/またはB細胞への親和性および/または結合密度の増大を提供し、ならびに/あるいはFcレセプターとの相互作用の増大し得る。
特定の実施形態において、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、(a)本明細書中で具体的に開示されるmAbの重鎖可変領域、または本明細書中で具体的に開示されるmAbの重鎖可変領域のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列類似性(上記のような)を有する重鎖可変領域を含む、重鎖を含み;(b)本明細書中に開示されるmAbの軽鎖可変領域、または本明細書中で具体的に開示されるmAbの軽鎖可変領域のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む、軽鎖を含み;あるいは(c)上記(a)および(b)による重鎖および軽鎖を含むmAbまたは抗原結合性フラグメントである。特定の実施形態において、本発明のmAbまたは抗原結合性フラグメントは、本明細書中で具体的に開示されるmAbの重鎖可変領域またはこれと実質的なアミノ酸配列類似性を有する重鎖可変領域を含む重鎖、さらにまた、本明細書中に開示されるmAbと同じmAbに由来する軽鎖可変領域またはこれと実質的なアミノ酸配列類似性を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖の、両方を含む。
当該分野で公知のように、多数の異なるプログラムを用いて、核酸またはポリペプチドが既知の配列に対して配列同一性または類似性を有するか否かを確認し得る。配列同一性および/または類似性は、以下を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の標準技術を用いて決定され得る:Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2,482(1981)の部分的配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J.Mol.Biol.48,443(1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444(1988)の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP,BESTFIT,FASTA,およびTFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,WI)によって、Devereuxら,Nucl.Acid Res.12,387〜395(1984)に記載されるBest Fit配列プログラム(好ましくは初期設定を用いて)、あるいは検査によって。
有用なアルゴリズムの例は、PILEUPである。PILEUPは、連続的な、ペアをなすアラインメントを用いて、関連配列の群から複数の配列アラインメントを作製する。このアラインメントを作製するのに用いられるクラスター化関係を示す系統樹もプロットし得る。PILEUPは、Feng & Doolittle,J.Mol.Evol.35,351〜360(1987)の連続的アラインメント方法の単純化したものを用いる;この方法は、Higgins & Sharp,CABIOS 5,151〜153(1989)に記載の方法に類似している。
有用なアルゴリズムの別の例は、Altschulら,J.Mol.Biol.215,403〜410,(1990)およびKarlinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873〜5787(1993)に記載されるBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、WU−BLAST−2プログラムであり、Altschulら、Methods in Enzymology,266,460〜480(1996)から入手した。WU−BLAST−2はいくつかの検索パラメータを用い、これらのパラメータは好ましくは初期値に設定される。これらのパラメータは動的値であり、目的の配列が検索される特定配列の構成および特定データベースの構成に依存して、プログラム自体によって設定される;しかしながら、これらの値は感度を上げるために調整され得る。
さらなる有用なアルゴリズムは、Altschulら((1997)Nucleic Acids Res.25,3389〜3402)によって報告されるようなギャップ化BLASTである。
アミノ酸配列同一性値の百分率は、マッチしている同一残基の数を、整列した領域中の「より長い」配列の残基の総数で割ることによって決定され得る。「より長い」配列は、整列した領域中で最大の実際の残基(アラインメントスコアを最大化するためにWU−Blast−2によって導入されたギャップは無視される)を有する配列である。
このアラインメントは、整列される配列中へのギャップの導入を含み得る。さらに、本明細書中で具体的に開示されるポリペプチドよりも多いかまたは少ないアミノ酸を含む配列について、1つの実施形態において、配列同一性の百分率は、アミノ酸の総数に対する同一のアミノ酸の数に基づいて決定されると理解されている。従って、例えば、本明細書中で具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、1つの実施形態において、このより短い配列中のアミノ酸の数を用いて決定される。同一性パーセント計算において、相対的重みは、配列バリエーション(例えば、挿入、欠失、置換など)の種々の発現に割り当てられない。
1つの実施形態において、同一であるもののみがポジティブにスコア付けされ(+1)、ギャップを含む全ての形態の配列バリエーションは値「0」を割り当てられ、これにより、配列類似性計算のための下記のような重み付けスケールまたはパラメータの必要性が除去される。パーセント配列同一性は、例えば、マッチしている同一残基の数を、整列した領域中の「より短い」配列の残基の総数で割り、100をかけることによって算出され得る。「より長い」配列は、整列した領域中で最大の実際の残基を有する配列である。
他の実施形態において、本明細書中で具体的に記載されるmAbまたは対応する抗原結合性フラグメントあるいは特定領域に対して、「実質的な配列類似性」を有するmAb、抗原結合性フラグメント、またはその特定領域は、当業者に公知の標準条件下で、本明細書中に具体的に開示される核酸の対応するセグメントにハイブリダイズし、かつ本明細書中で定義されるような機能的に等価なmAbまたは抗原結合性フラグメントをコードする核酸によって、コードされる。
例証のために、本明細書中で具体的に開示される配列に対して、このような核酸配列のハイブリダイゼーションを、低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたは実にストリンジェントな条件下(例えば、それぞれ、37℃で5×デンハート溶液、0.5%SDSおよび1×SSPEを含む35〜40%ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーで表される条件;42℃で5×デンハート溶液、0.5%SDS、および1×SSPEを含む40〜45%ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーで表される条件;および/または42℃で5×デンハート溶液、0.5%SDSおよび1×SSPEを含む50%ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーで表される条件)で実行し得る。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)を参照のこと。
遺伝コードの縮重に起因して、本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントをコードする核酸に可変性が存在し得ることを当業者は理解する。この遺伝コードの縮重(これにより、異なる核酸配列が同じポリペプチドをコードすることが可能になる)は、当該分野で周知である。
この核酸配列中のさらなるバリエーションは、非翻訳配列(例えば、イントロン配列ならびに5’および3’非翻訳配列)の存在(または非存在)によって導入され得る。
ところで、本発明者らは、望ましい特性を有する抗CD20mAbのパネルを生成し、特徴付けしてきたが、類似のまたは改良した抗体およびフラグメントを生成することは、当業者にとって日常的である。例えば、この重鎖および/または軽鎖可変領域(またはそれらの部分、例えば、1以上のCDR)の配列は、所望の特性を有する他の抗体の同定のための起点として用いられ得る。1つのアプローチとして、本明細書中に開示される配列の変異体を含むファージライブラリーが生成され得る。このファージライブラリーは、任意の望ましい特性、例えば、CD20反応性、結合密度、B細胞枯渇の効力、B細胞疾患処置の効力などに基づいて、選択され得る。
さらに、本明細書中で具体的に開示されるmAbおよびその抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列および核酸配列を変更するために、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性または相違を含む、当該分野で公知の任意の特性(例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなど)に基づき得る。特定の実施形態において、アミノ酸配列中に保存的置換を行う。本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、天然に生じる置換の確率が、偶然に生じる置換の確率よりも約10倍より大きい置換である(例えば、Dayhoffら,Atlas of Protein Sequence and
Structure,1971,95〜96頁および図9〜10に記載される計算方法によって定義されるような)。
Structure,1971,95〜96頁および図9〜10に記載される計算方法によって定義されるような)。
アミノ酸置換を行う際に、アミノ酸の疎水性親水性指標(ヒドロパシーインデックス(hydropathic index))が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般に当該分野において理解されている(KyteおよびDoolittle、(1982)J.Mol.Biol.157:105を参照のこと;その全体が本明細書中に参考として援用される)。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子(例えば、酵素、基質、レセプター、DNA、抗体、抗原など)とそのタンパク質の相互作用を規定することが一般に認められている。
各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられており(KyteおよびDoolittle、同上)、これらの値は以下である:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/システイン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);スレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);およびアルギニン(−4.5)。
このアミノ酸の置換が、親水性に基づいてなされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第4,554,101号(その全体が本明細書中に参考として援用される)は、タンパク質の最大局所的平均親水性(the greatest local average hydrophilicity)が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
米国特許第4,554,101号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた:アルギニン(+3.0);リジン(±3.0);アスパラギン酸(+3.0±1);グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);トリプトファン(−3.4)。
他の実施形態において、機能的に等価な本発明のmAbおよび抗原結合性フラグメントは、14、12、10、8、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を有する、本明細書中に開示されるmAbまたは抗原結合性フラグメントに由来する、上記の1以上の特定領域(例えば、重鎖または軽鎖、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域またはその部分)を含むものを包含する。特定の実施形態において、本発明のmAbまたは抗原結合性フラグメントは、CDR1、CDR2および/またはCDR3領域を含み、ここで、各CDR領域は、5、4、3、2または1以下のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む。例示的な実施形態において、このCDR1、CDR2および/またはCDR3領域は各々、5、4、3、2または1以下の保存的アミノ酸置換を含む。
これらの抗体またはフラグメントは、さらに1を超える抗原特異性を有し得、例えば、二重特異性抗体である得る。この二重特異性抗体は、例えば、さらに別のCD20エピトープに結合し得る。さらに、この二重特異性抗体は、他の抗原、例えばCD19、CD22、CD52、CD3、CD28、またはHLA−DR10(Lym−1)に対する;あるいはFcレセプター、例えば、CD16、CD64およびCD89に対する;T細胞レセプター(例えば、T細胞レセプター複合体のゼータ鎖)または他の細胞表面分子(例えば、サイトカイン、ホルモンまたは成長因子レセプターのようなレセプター)に対する、結合特異性を有し得る。
これらの抗体およびそのフラグメントは、さらに「キメラ」抗体であり得る。キメラ抗体および抗原結合性フラグメントは、2以上の異なる種(例えば、マウスおよびヒト)に由来する部分を含む。キメラ抗体は、ヒト定常ドメイン遺伝子セグメント中にスプライスされた所望の特異性のマウス可変領域を用いて生成され得る(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)。このように、非ヒト(例えば、マウス)抗体を改変して、ヒト臨床用途により適するように生成され得る。
本発明のmAbは、さらに「ヒト化」または「CDRグラフト化」形態の非ヒト(例えば、マウス)mAbであり得、これらはマウスmAbよりも、ヒトに対する治療薬として利益をもたらし得る。なぜなら、特に、本発明のmAbはマウス抗体ほど迅速にはヒトの循環から取り除かれず、かつ、ヒト被験体に投与した場合、一般に有害な免疫反応を引き起こさないためである。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された1以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入(import)」残基と称される場合が多く、これらは代表的には「移入」可変ドメインから受け取られる。ヒト化抗体を調製する方法は、一般に当該分野で周知であり、本明細書中に開示されるmAbに容易に適用され得る。例えば、Winterおよび共同研究者の方法(Jonesら,Nature,321:522〜525(1986);Riechmannら,Nature,332:323〜327(1988);Verhoeyenら,Science,239:1534〜1536(1988))に従って、げっ歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することによって、ヒト化を本質的に行い得る。特定の実施形態において、非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、レシピエント抗体の超可変(CDR)領域残基が、所望の特異性、親和性、および結合能を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)に由来する超可変領域残基によって置換される、ヒト抗体(レシピエント抗体)である。ある場合に、このヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基はまた、対応する非ヒト残基によっても置換される(いわゆる「復帰突然変異」)。このような復帰突然変異のための位置は、配列および構造分析によって、またはコンピュータモデルを用いた可変領域の3次元構造の分析によって決定され得る。さらに、ファージディスプレイライブラリーは、抗体配列内の選択された位置でアミノ酸を変化させるのに用いられ得る。ヒト化抗体のこの特性はまた、ヒトフレームワークの選択によっても影響を受ける。さらに、親和性などの抗体特性をさらに改善するために、ヒト化およびキメラ化抗体を改変して、レシピエント抗体中またはドナー抗体中には見出されない残基を含み得る。一般に、このヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのCDRドメインに対応する全てのまたは実質的に全ての少なくとも1つ、2つ、または実に3つ全てのCDRドメインを含み、かつ、全てのまたは実質的に全てのこのフレームワーク領域残基がヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域残基である。このヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も必要に応じて含む。さらに詳細については、Jonesら,Nature 321:522〜525(1986);およびReichmannら、Nature 332:323〜329(1988)を参照のこと。従って、本発明の1つの実施形態において、抗原(すなわち、CD20)を結合する抗体の能力を実質的に干渉することなく、グラフトすることによってヒト免疫グロブリンの構成要素を導入するヒト化されたmAbが提供される。
本発明のmAbまたは抗原結合性フラグメントは、他の薬剤(例えば、治療薬)と結合体化しない裸の抗体または抗原結合性フラグメントであり得る。あるいは、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、治療薬(例えば、細胞傷害性薬剤、低分子化合物、ホルモン、成長因子、サイトカイン、酵素、RNase、コード配列を含むリボザイムまたは核酸分子、アンチセンスRNAおよびRNAi)と結合体化し得る(すなわち、免疫複合体を形成する)。
例示的な細胞傷害性薬剤としては、タンパク質毒素、例えば、リシン、ジフテリア毒素、ブドウ球菌(Staphylococcal)エンテロトキシン、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、アブリンまたは他のリボソーム不活化タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、化学的架橋剤を用いて化学的に、あるいはタンパク質毒素の全てかまたは一部をコードする融合タンパク質を構築することによる組換え核酸技術によって、抗体または抗体フラグメントに連結させ得る。他の例示的な細胞傷害性薬剤としては、90Y、131Iまたは111Inのような高エネルギー放射性同位体が挙げられる。さらなる細胞傷害性薬剤としては、細胞傷害性薬および細胞増殖抑止薬、例えば、メトトレキサート、クロラムブシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンおよびビンクリスチンが挙げられる。
あるいは、このmAbまたは抗原結合性フラグメントは、検出可能に標識され得る。例示的な検出可能標識としては、放射標識、重金属、発色団、フルオロフォアおよび酵素反応の最終産物が検出可能な酵素が挙げられる。検出可能に標識された抗体および抗原結合性フラグメントは、例えば、診断法および実験室的方法に用いられ得る。
これらの抗CD20mAbは、当該分野で公知の任意の標準方法によって、例えば、ハイブリドーマ方法(KoehlerおよびMilstein,Nature 256:495〜497(1975);ならびにGoding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59〜103,(Academic Press,1986))によって、または組換え技術(例えば、米国特許第4,816,567号に開示される、およびWoodら、Nature 314:446〜9(1985)による)によって、生成され得る。
モノクローナル抗体は、代表的には、同じ抗体結合部位を有する抗体分子の均質な集団を生成する、ハイブリドーマ細胞のような単一細胞のクローン化によって生成される。このハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞と、骨髄腫または他の自己永続的細胞株を融合させることによって生成される。このような抗体の調製は、KohlerおよびMilstein(Nature 256:495〜497(1975))によって初めて記載され、この記載は、その全体が本明細書中に参考として援用される。さらなる方法は、Zola(Monoclonal Antibodies:a Manual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987))によって記載される。そのようにして調製したハイブリドーマ上清を、抗体分子(CD20に結合し、かつ/または本明細書中に記載されるような他の望ましい特性を有する)の存在についてスクリーニングし得る。
一般に、抗CD20mAbを産生するハイブリドーマを生成するために、骨髄腫または他の自己永続的細胞株を、CD20に対して高免疫化した哺乳動物の脾臓、リンパ節または他の抗体産生細胞から得たリンパ球と融合する(例えば、Kearneyら、J.Immunol.,123:1548−50(1979)を参照のこと)。
1つの実施形態において、ハイブリドーマを調製するのに用いられる骨髄腫細胞株は、リンパ球と同じ種に由来する。本発明における使用に適したマウス骨髄腫は、the American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,United States of Americaから入手可能なNS−1骨髄腫細胞株である。
脾細胞は、代表的には、ポリエチレングリコール(PEG)1500を用いて骨髄腫細胞と融合させる。融合ハイブリッドをHATに対する感受性によって選択する。開示されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、本明細書中に記載される酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)および蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて同定する。
これらの抗体産生細胞は、近交系マウス系、例えばC57BL/6系から採取可能である。他の実施形態において、この抗体産生細胞は、CD20−/−哺乳動物、例えばCD20−/−マウスに由来する。1つの代表的な実施形態において、このCD20−/−マウスは、初めに129系マウスから得られる。このCD20−/−哺乳動物は、当業者に公知であり、かつ本明細書中に記載されるような技術(例えば、Hoganら(1986)Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照のこと)を用いて作製され得る。
本発明の抗CD20mAbは、完全ヒトであり得る。完全ヒト抗体を調製する方法は、当分野で公知であり、トランスジェニック動物およびファージディスプレイ技術の使用を含む。
次に、内因性免疫グロブリン生成がない場合に、免疫の際にヒト抗体のレパートリーを生成する能力のあるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することも可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されてきた。このような生殖細胞系変異体マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することによって、抗原負荷の際にヒト抗体の生成がもたらされる。例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90、2551〜255(1993);Jakobovitsら、Nature 362,255〜258(1993)を参照のこと。
Mendezら(Nature Genetics 15:146〜156(1997))は、この技術をさらに改良し、抗原を負荷されると高親和性完全ヒト抗体を生成する、「Xenomouse II」と称されるトランスジェニックマウスの系統を作製した。これは、上記のように内因性JHセグメントに欠損を有するマウスへの、メガベースヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の生殖細胞系組込みによって達成された。このXenomouse IIは、約66個のVH遺伝子、完全DHおよびJH領域ならびに3つの異なる定常領域(μ、δおよびχ)を含む1,020kbのヒト重鎖遺伝子座を有し、かつ、32個のVκ遺伝子、JκセグメントおよびCκ遺伝子を含む800kbのヒトκ遺伝子座も有する。これらのマウスにおいて生成される抗体は、遺伝子再配列、アセンブリ、およびレパートリーを含むあらゆる点で、ヒトにおいて見られる抗体に酷似している。これらのヒト抗体は、マウス遺伝子座での遺伝子再配列を妨げる内因性JHセグメントにおける欠損に起因して、内因性抗体よりも優先的に発現される。
mAbを生成する他の方法もまた、公知である。例えば、Sastryら(Proc Natl Acad Sci USA 86:5728〜5732(198));およびHuseら(Science 246:1275〜1281(1989))によって記載されるような、免疫学的レパートリーからmAbを単離する方法を参照のこと。
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら、Nature 348、552〜553(1990))は、免疫されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで生成するのに用いられ得る。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ(例えば、M13またはfd)の主動または微動コートタンパク質遺伝子のいずれかの中にインフレームでクローン化され、そしてファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして提示される。この糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、この抗体の機能特性に基づく選択は、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。従って、このファージはB細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行われ得る;例えば、Johnson,Kevin S.およびChiswell,David J.、Current Opinion in Structural Biology 3、564〜571(1993)を参照のこと。
V遺伝子セグメントのいくつかの供給源が、ファージディスプレイに用いられ得る。Clacksonら(Nature 352、624〜628(1991))は、免疫マウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫されていないヒトドナーに由来するV遺伝子のレパートリーが構築され得、そして抗原(自己抗原を含む)の多様なアレイに対する抗体が、Marksら、J.Mol.Biol.222,581〜597(1991)、またはGriffithら、EMBO J.12,725〜734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離され得る。自然免疫応答において、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する(体細胞超変異)。導入されたこれらの変更のいくつかによって高い親和性が授与され、高親和性表面免疫グロブリンを提示しているB細胞は、その後の抗原負荷の間に優先的に複製され、分化する。この天然プロセスは、「chainシャフリング」として公知の技術を用いて模倣され得る(Marksら、Bio/Technol.10、779〜783)。この方法において、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、この重鎖および軽鎖V領域遺伝子を、免疫されていないドナーから得られるVドメイン遺伝子の天然に存在する改変体(レパートリー)のレパートリーに順次置き換えることによって改善され得る。この技術によって、nMの範囲で親和性を有する抗体および抗体フラグメントの生成が可能になる。極めて大きなファージ抗体レパートリーを作製するためのストラテジーは、Waterhouseら(Nucl.Acids Res.21、2265〜2266(1993))によって記載されている。
モノクローナル抗体の生成に関するさらなる情報は、Goding,J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第3版,Academic Press,Inc.,London,San Diego,1996;LiddellおよびWeeks:Antibody Technology:A Comprehensive Overview,Bios Scientific Publishers:Oxford,UK,1995;BreitlingおよびDubel:Recombinant Antibodies,John Wiley & Sons,New York,1999;ならびにPhage Display:A Laboratory Manual,Barbasら,編,Cold Springs Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,2001もまた参照のこと。
本発明者らは、識別可能な特性(例えば、CDR領域、結合密度など)を有する新規の抗体がCD20−/−哺乳動物から生成され得るという、予期せぬ発見をした。従って、1つの代表的な実施形態において、本発明は、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する:(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物(例えば、マウス)を免疫する工程;(b)この哺乳動物から抗体産生細胞(例えば、B細胞)を収集する工程;(c)この抗体産生細胞を、培養不死化細胞(例えば、骨髄腫細胞)と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成する工程;(d)このハイブリドーマ細胞を、モノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに(e)この培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程。この方法は、抗CD20mAbを産生するハイブリドーマ細胞株の単離を必要に応じて包含し得る。
別の実施形態において、本発明はCD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する:(a)抗体応答を誘発するのに十分な条件下で、CD20またはその抗原的に有効なフラグメントでCD20−/−哺乳動物を免疫する工程;(b)この哺乳動物から、CD20に特異的に結合する抗体を産生する細胞を収集する工程;(c)この抗体産生細胞から、免疫グロブリンコード遺伝子を単離する工程;(d)この免疫グロブリンコード遺伝子を異なる細胞に導入して、形質転換細胞を生成する工程;(e)この形質転換細胞を、この免疫グロブリン遺伝子の転写および翻訳ならびにモノクローナル抗体の産生に十分な条件下で培養する工程;ならびに(e)この培養物から、CD20に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収する工程。特定の実施形態において、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は共に、この抗体産生細胞からかまたは異なる抗体産生細胞から単離され、そして形質転換細胞中に導入される。この形質転換細胞は、任意の適切な細胞、例えば、哺乳動物細胞またはCHOもしくはBHK細胞のような細胞株であってもよい。
上記のように、本発明のmAbを産生するハイブリドーマ細胞、ハイブリドーマ細胞株、およびハイブリドーマ細胞培養物もまた、本発明によって提供される。本発明の例示的なハイブリドーマ細胞株としては、ハイブリドーマHB20−1、HB20−2、HB20−3、HB20−4、HB20−5、HB20−6、HB20−25、MB20−1、MB20−2、MB20−3、MB20−6、MB20−7、MB20−8、MB20−10、MB20−11、MB20−13、MB20−14、MB20−16およびMB20−18が挙げられる。
ハイブリドーマ細胞株HB20−3、HB20−4、HB20−25、MB20−1、MB20−11およびMB20−18は、ブダペスト条約に従って、2004年5月5日にAmerican Type Culture Collection(「ATCC」;Manassas,VA,USA)に寄託され、それぞれ、ATCC受託番号_(HB20−3)、_(HB20−4)、_(HB20−25)、_(MB20−1)、_(MB20−11)および_(MB20−18)を付与された。
本発明はまた、本発明のmAb、抗原結合性フラグメント、抗体重鎖および/または抗体軽鎖またはその部分(例えば、可変領域、CDR領域)をコードする核酸も提供する。この核酸は、一本鎖または二本鎖の、DNA、RNAまたはそれらのキメラであり得、そして完全にまたは部分的に合成であるかまたは天然に存在してもよい。これらの核酸は、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。さらに、この核酸は、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなどの哺乳動物種を含む、任意の起源の種由来であってもよい。
特定の実施形態において、この核酸は、単離された核酸である。本明細書中で使用される場合、「単離された」核酸とは、天然に存在する生物体の少なくともいくつかの他の成分(例えば、一般にこの核酸に伴って見出される細胞構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸)から分離されているかまたはこれらの成分を実質的に含まない核酸を意味する。
本発明はまた、本発明の核酸を含む、発現ベクターおよび遺伝子送達ベクターを含むベクターも提供する。適切なベクターとしては、細菌発現ベクター、真菌発現ベクター、哺乳動物ベクター、酵母発現ベクターおよび植物発現ベクターが挙げられる。例示的なベクターとしては、細菌人工染色体、コスミド、酵母人工染色体、ファージ、プラスミド、脂質ベクターおよびウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなど)が挙げられる。
発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるポリペプチドの発現のために設計され得る。例えば、ポリペプチドは、E.coliのような細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系において)または哺乳動物細胞において発現され得る。いくつかの適切な宿主細胞が、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)においてさらに議論される。酵母S.cerevisiaeにおける発現のためのベクターとしては、例えば、pYepSecl(Baldariら,(1987)EMBO J.6:229〜234)、pMFa(KurjanおよびHerskowitz,(1982)Cell 30:933〜943)、pJRY88(Schultzら,(1987)Gene 54:113〜123)、ならびにpYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)が挙げられる。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)中でタンパク質を生成するための核酸の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、pAc系(Smithら,(1983)Mol.Cell.Biol.3:2156〜2165)およびpVL系(Lucklow,V.A.,およびSummers,M.d.(1989)Virology 170:31〜39)が挙げられる。
哺乳動物発現ベクターとしては、例えば、pCDM8(Seed,(1987)Nature 329:840)およびpMT2PC(Kaufmanら(1987),EMBO J.6:187〜195)が挙げられる。
このベクターは、一般に、本発明の核酸と作動可能に結合する発現制御エレメント(例えば、プロモーター)を含む。所望のレベルおよび所望の組織特異的発現によって、多様な発現制御エレメントを使用し得ることが理解される。さらに、このプロモーターは、構成性であっても誘導性であってもよい(例えば、メタロチオネインプロモーターまたはホルモン誘導性プロモーター)。この発現制御エレメントは、宿主細胞にとってネイティブであっても外来であってもよく、そして天然配列であっても合成配列であってもよい。このプロモーターは、一般に、目的の標的細胞(複数可)において機能するように選択される。これらの核酸は、さらに他の適切な発現制御配列(例えば、転写/翻訳制御シグナルおよびポリアデニル化シグナル)と結合し得る。ウイルス調節エレメントは、しばしば哺乳動物細胞中で使用される。例えば、哺乳動物発現ベクター中で一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来する。
さらに、挿入したタンパク質コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルが一般に必要とされる。これらの翻訳制御配列(ATG開始コドンおよび隣接配列を含み得る)は、天然および合成の両方の、多様な起源の配列であり得る。
さらに、本発明の単離された核酸およびベクターを含む宿主細胞(例えば、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞)が提供される。この細胞は、本発明の核酸またはベクターを用いて、一過性にまたは安定に形質転換され得る。特定の実施形態において、この核酸は宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。さらに、この細胞は培養され得る(すなわち、単離され得る)か、または生きた生物におけるインサイチュの細胞であり得る。
(使用方法)
本発明の抗体、抗原結合性フラグメント、核酸および薬学的組成物は、いくつかの調査、診断および/または治療用途に用いられ得る。例えば、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、B細胞特異的マーカーであるCD20に特異的に結合する。従って、これらの試薬は、B細胞を同定する方法、CD20機能を研究する方法ならびにCD20またはB細胞の免疫親和性精製の方法における用途が見出されている。B細胞を単離する方法は、研究室での研究、治療または診断方法に用いられ得る。例えば、B細胞悪性腫瘍を有する被験体から組織または細胞を取り出し、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを用いてこれらのB細胞を精製除去し、そしてこのB細胞枯渇組織または細胞を被験体に再導入し得る。さらに、本発明の抗体、抗原結合性フラグメントおよび組成物は、診断目的に、例えば、リンパ腫の同定に用いられ得る。本発明の方法はまた、(上記のように)治療薬と結合体化した抗体または抗原結合性フラグメントを用いた、分子のB細胞特異的送達にも提供される。さらに、本発明はまた、(例えば、B細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患のようなB細胞疾患の処置のために)B細胞を枯渇させる治療方法も提供する。
本発明の抗体、抗原結合性フラグメント、核酸および薬学的組成物は、いくつかの調査、診断および/または治療用途に用いられ得る。例えば、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、B細胞特異的マーカーであるCD20に特異的に結合する。従って、これらの試薬は、B細胞を同定する方法、CD20機能を研究する方法ならびにCD20またはB細胞の免疫親和性精製の方法における用途が見出されている。B細胞を単離する方法は、研究室での研究、治療または診断方法に用いられ得る。例えば、B細胞悪性腫瘍を有する被験体から組織または細胞を取り出し、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを用いてこれらのB細胞を精製除去し、そしてこのB細胞枯渇組織または細胞を被験体に再導入し得る。さらに、本発明の抗体、抗原結合性フラグメントおよび組成物は、診断目的に、例えば、リンパ腫の同定に用いられ得る。本発明の方法はまた、(上記のように)治療薬と結合体化した抗体または抗原結合性フラグメントを用いた、分子のB細胞特異的送達にも提供される。さらに、本発明はまた、(例えば、B細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患のようなB細胞疾患の処置のために)B細胞を枯渇させる治療方法も提供する。
1つの特定の実施形態において、本発明は、動物被験体(例えば、哺乳動物被験体)においてB細胞を枯渇させる方法を提供し、この方法は、本発明のmAb、抗原結合性フラグメントまたは薬学的組成物を、B細胞を枯渇させるのに有効な量でこの哺乳動物被験体に投与する工程を包含する。「B細胞を枯渇させるのに有効な量」とは、B細胞の少なくとも約25%、35%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%またはそれを超える削減(すなわち、枯渇)を達成するのに有効な量を意味する。いくつかの実施形態において、検出可能なB細胞は存在しないか、または実質的に存在しない。B細胞を検出する方法およびB細胞枯渇を測定する方法は、当該分野で公知である(例えば、実施例9〜12、14および17を参照のこと)。代表的な実施形態において、少なくとも約25%、35%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%またはそれを超える枯渇は、末梢循環および/または組織(例えば、脾臓、リンパ節)のB細胞において達成される。臨床用途のために、末梢循環B細胞が測定/モニターされ、これは、一般に組織においてB細胞枯渇を評価する方法よりも侵襲性が低いことを、当業者は理解する。
本発明はさらに、B細胞疾患を有する動物(例えば、哺乳動物)被験体に処置有効量の1以上の本発明のモノクローナル抗体、抗原結合性フラグメントまたは薬学的処方物を投与する工程を包含する、B細胞疾患を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、このB細胞疾患は、B細胞悪性腫瘍または自己免疫疾患である。
用語「B細胞悪性腫瘍」およびその文法的変形は、最も広い意味で使用され、代表的にはリンパ系組織(例えば、骨髄またはリンパ節)に生じるが、非リンパ系組織(例えば、甲状腺、胃腸管、唾液腺および結膜)にも生じ得る、B細胞の悪性腫瘍または新生物をいう。本発明の処置方法は、具体的には、非ホジキンリンパ腫(NHL)、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびプロリンパ性白血病のB細胞サブタイプを非限定的に含む、CD20陽性B細胞悪性腫瘍に関する。B細胞サブタイプ非ホジキンリンパ腫は、悪性B細胞リンパ球によって引き起こされるリンパ腫の(29タイプを超える)大きな群を包含して用いられる用語であり、低悪性度/濾胞性NHL、小リンパ球性(SL)NHL、中悪性度/濾胞性NHL、中悪性度びまん性NHL、高悪性度免疫芽球性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度小型非分割細胞NHLおよび巨大腫瘤病変NHLを含むがこれらに限定されない公知のタイプのリンパ腫の大きなサブセットを表す。
自己免疫疾患は、1つには自己寛容の崩壊によって引き起こされ、これは続いて、自己抗体の生成および患部組織における免疫グロブリンの沈積を含む、自己に対する免疫応答を引き起こす。自己抗体は免疫複合体を形成し、補体およびFcレセプター媒介性組織炎症および破壊を促進する。大部分の自己免疫疾患は、正常な体組織と反応性の抗体の生成によって生じるか、または正常な体組織と反応性の抗体の産生によって悪化する。Bリンパ球は、自己抗体の供給源であるので、これらのタイプの免疫媒介性疾患の処置に合理的な標的を提供する。Bリンパ球はまた、抗原を提示し、かつエフェクターTリンパ球の成長を調節し得る。
80種類を超える自己免疫疾患が同定されている。自己免疫疾患、それらの病因論および処置は、国立衛生研究所の自己免疫疾患調整委員会(Autoimmune Diseases Coordinating Committee)によって刊行されるAutoimmune Diseases Research Planにおいて広範に議論される。本発明によって処置可能な代表的な自己免疫疾患としては、免疫複合体性障害(例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、壊死性脈管炎、リンパ節炎、結節性動脈周囲炎および全身性エリテマトーデスにつながるような免疫複合体性障害)が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、潰瘍性大腸炎、全身性硬化症、皮膚筋炎/多発性筋炎、抗リン脂質抗体症候群、強皮症、尋常性天疱瘡、ANCA関連血管炎(例えば、ヴェーゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発性血管炎)、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、クローン病、ライター症候群、強直性脊椎炎、ライム関節炎、ギヤン‐バレー症候群、橋本甲状腺炎、および心筋症が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって処置可能な、抗体産生と関連する他の疾患としては、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、血小板減少性紫斑病、顆粒球減少症、自己免疫性溶血性貧血、外来抗原に対する免疫反応、例えば妊娠中の胎児A−B−O血液型、重症筋無力症、I型糖尿病、グレーヴズ病、およびアレルギー反応が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法は、例えば、移植拒絶を含む、B細胞または抗体が関与する任意の他の障害または状態の処置に用いられ得る。
「処置有効」量は、被験体の状態に多少の改善または寛解をもたらすか、あるいはこの状態の再発または回帰を防止するかまたは遅延させるのに十分な、抗CD20抗体または抗原結合性フラグメントの量である。
被験体は、当該分野で公知の標準技術によってモニターされ、B細胞悪性腫瘍または特定の自己免疫疾患の臨床的徴候を追跡され得る。例えば、B細胞悪性腫瘍の場合、腫瘍退縮(例えば、固形腫瘍の場合は腫瘍サイズ)、抗CD20抗体を用いた循環B細胞の表現型または生検組織の表現型がモニターされ得る。
被験体の年齢、性別、種および状態、所望の枯渇度、処置されるべき疾患および/または用いられる特定の抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含むいくつかの要因に基づいて、投薬量が選択され得、かつ当業者によって決定され得ることを、当業者は理解する。例えば、非ホジキンリンパ腫患者または自己免疫疾患を有する患者は、本明細書中に記載されるように、約0.0005〜約1500mg/m2/週、具体的には約0.001〜約150mg/m2/週、より具体的には約0.25〜約75mg/m2/週、より具体的には約2.5〜約50mg/m2/週の抗CD20抗体を受容し得る。
本発明の実施形態において、これらの抗体および抗原結合性フラグメントは、従来の抗CD20抗体よりも高密度でB細胞に結合し、従って、より効率的な(すなわち、より低い投薬量で)B細胞の枯渇をもたらし得る(上で定義したように)。あるいは、またはさらに、この抗体が反応する特定のエピトープに起因して、より効率的な枯渇がもたらされ得る。例示的な実施形態において、この抗体または抗原結合性フラグメントの投薬量(薬学的組成物の一部として、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中において)は、少なくとも約0.0005、0.001、0.05、0.075、0.1、0.25、0.375、0.5、1、2.5、5、10、20、37.5、50もしくは100mg/m2および/または約200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、15、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.1、0.075もしくは0.01mg/m2未満である。他の例示的な実施形態において、この投薬量は、約0.0005mg/m2と約200mg/m2の間、約0.001mg/m2と約150mg/m2の間、約0.075mg/m2と約125mg/m2の間、約0.375mg/m2と約100mg/m2の間、約2.5mg/m2と約75mg/m2の間、約10mg/m2と約75mg/m2の間、および約20mg/m2と約50mg/m2の間である。
本発明の方法のいくつかの実施形態において、本発明のmAb、抗原結合性フラグメントおよび/または組成物は、約375mg/m2未満の用量で;約37.5mg/m2未満の用量で;約0.375mg/m2未満の用量で;および/または約0.075mg/m2と約125mg/m2の間の用量で、投与され得る。
この指定の投薬量により、少なくとも約3、5、7、10、14、20、30、45、60、75、90、120、150もしくは180日間またはそれより長い期間、B細胞枯渇がもたらされ得る(上記のように)。
本発明の代表的な実施形態において、約125mg/m2以下の投薬量の抗体または抗原結合性フラグメントにより、少なくとも約7、14、21、30、45、60日間、90または120日間、B細胞枯渇がもたらされる(上記のように)。別の代表的な実施形態において、約37.5mg/m2以下の投薬量により、少なくとも約7、14、21、30、45、60、90または120日間、B細胞が枯渇する。さらに他の実施形態において、約0.375mg/m2以下の投薬量により、少なくとも約7、14、21、30、45または60日間、B細胞の枯渇がもたらされる。別の実施形態において、約0.075mg/m2以下の投薬量により、少なくとも約7、14、21、30、45または60日間、B細胞の枯渇がもたらされる。さらに他の実施形態において、約0.01mg/m2、0.005mg/m2または実に0.001mg/m2以下の投薬量により、少なくとも約3、5、7、10、14、21または30日間、B細胞の枯渇がもたらされる。これらの実施形態によれば、この投薬量は、任意の適切な経路によって投与され得るが(下記のように)、必要に応じて、皮下経路によって投与される。
別の局面として、本発明は、B細胞枯渇および/またはB細胞疾患の処置が、現在利用可能な方法で使用されている投薬量よりも低い投薬量の抗体または抗体フラグメントで達成され得るという研究結果を提供する。従って、別の実施形態において、本発明は、B細胞を枯渇させる方法および/またはB細胞疾患を処置する方法を提供し、これらの方法は、動物被験体(例えば、哺乳動物被験体)に、CD20に特異的に結合する有効量のmAbまたはその抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含し、ここで、約200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.25、0.1、0.075、0.05、0.001、0.0005mg/m2またはそれより少ない投薬量により、25%、35%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%またはそれより多いB細胞(循環および/または組織のB細胞)の枯渇が、少なくとも約3、5、7、10、14、21、30、45、60、75、90、120、150もしくは180日間またはそれより長い期間、もたらされる。代表的な実施形態において、約125mg/m2もしくは75mg/m2またはそれより少ない投薬量により、少なくとも約7、14、21、30、60、75、90、120、150または180日間、B細胞の少なくとも約50%、75%、85%または90%の枯渇がもたらされる。他の実施形態において、約50、37.5または10mg/m2の投薬量により、少なくとも約7、14、21、30、60、75、90、120または180日間、B細胞の少なくとも約50%、75%、85%または90%の枯渇がもたらされる。さらに他の実施形態において、約0.375または0.1mg/m2の投薬量により、少なくとも約7、14、21、30、60、75または90日間、B細胞の少なくとも約50%、75%、85%または90%の枯渇がもたらされる。さらなる実施形態において、約0.075、0.01、0.001、または0.0005mg/m2の投薬量により、少なくとも約7、14、21、30または60日間、B細胞の少なくとも約50%、75%、85%または90%の枯渇がもたらされる。これらの実施形態によれば、この投薬量は、任意の適切な経路によって投与され得るが(下記のように)、必要に応じて、皮下経路によって投与される。
この実施形態によれば、この抗体または抗原結合性フラグメントは、本明細書中に記載されるような抗体または抗原結合性フラグメント(機能的に等価な抗体および抗原結合性フラグメントを含む)である。他の特定の実施形態において、この抗体または抗原結合性フラグメントは、従来の抗体と比較してより高い密度でCD20またはB細胞に結合する(上記のように)。
本発明の抗体、抗原結合性フラグメントおよび薬学的組成物は、他の治療薬またはレジメンと組み合わせて用いられ得る。例えば、B細胞悪性腫瘍の場合、このようなレジメンまたは治療としては、化学療法、放射免疫治療(RIT)、化学療法および外部ビーム放射(併用様式療法、CMT)、または併用様式放射免疫治療(CMRIT)単独または組み合わせなどが挙げられる。従って、本発明の抗CD20抗体および抗体フラグメントは、非ホジキンリンパ腫を処置するために最も一般的な化学療法レジメンである、CHOP(シクロホスファミド−ヒドロキシドキソルビシン−オンコビン(ビンクリスチン)−プレドニゾロン)と組み合わせられ得る。さらに、本明細書中の抗CD20抗体は、抗CD19、抗CD22(例えば、米国特許第5,484,892号、米国出願番号10/371,797号の米国特許公開番号2004/0001828号、米国出願番号10/372,481号の米国特許公開番号2003/0202975号および米国仮出願番号60/420,472号に記載のように(これらの各々の全内容は、CD22抗原および抗CD22抗体のこれらの教示に関して、参考として本明細書中に援用される))、ならびに他の抗CD20抗体、例えば、Rituxan(商標)(C2B8;リツキシマブ;IDEC Pharmaceuticals)を含む、他の抗体と組み合わせて投与され得る。
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体においてB細胞を枯渇させる方法を提供し、これらの方法は、この被験体に、本発明のmAbおよび/またはその抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含し、そしてさらに1以上のさらなる抗体および/またはそれらの抗原結合性フラグメントを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、このさらなる抗体は、抗CD22、抗0CD−19抗体または両方の抗体であり得る。このさらなる抗体(単数または複数)および/またはその抗原結合性フラグメント(複数可)は、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの投与に関連して、任意の順序で投与され得る。例えば、このさらなる抗体(単数または複数)および/または抗原結合性フラグメント(複数可)は、本発明の抗体および/または抗原結合性フラグメントを被験体に投与する前に、投与と同時に、および/または投与の後に、投与され得る。このさらなる抗体(単数または複数)および/または抗原フラグメント(複数可)は、本発明の抗体および/または抗原結合性フラグメントと同じ薬学的組成物中に存在し得、ならびに/あるいは異なる薬学的組成物中に存在し得る。本発明の抗体および/または抗原結合性フラグメントの用量および投与の様式、ならびにこのさらなる抗体(単数または複数)および/または抗原結合性フラグメント(複数可)の用量は、本願において提供されるような、かつ当該分野で周知の投薬量および投与の様式の任意の教示に従って、同じであっても異なっていてもよい。
1つの特定の実施形態において、この被験体は、本発明の抗体に加えて、単球またはマクロファージの機能を(例えば、少なくとも約25%、50%、75%、85%、90%、9%またはそれを超えて)増強する化合物を投与される。このような化合物は当該分野において公知であり、非限定的に、サイトカイン、例えばインターロイキン(例えば、IL−12)、およびインターフェロン(例えば、αまたはγインターフェロン)が挙げられる。単球またはマクロファージの機能または増大を増強する化合物は、この抗体または抗原結合性フラグメントと同じ薬学的組成物中に処方され得る。この抗体/フラグメントと化合物が別々に投与される場合、これらは同時に(互いに数時間以内に)投与され得るか、治療の同一コースの間に投与され得るか、または順に(すなわち、患者はまず抗体/フラグメント処置のクールを受け、次にマクロファージ/単球機能を増強する化合物のコースを受ける、あるいは逆も同様)投与され得る。
本発明のこの実施形態は、本発明の抗体および抗体フラグメントを用いて、または当該分野で公知の他の抗体を用いて実施され得、そして抗CD20モノクローナル抗体治療(例えば、C2B8のような従来の抗体を用いた治療)に対して耐性のある被験体、化学療法で現在処置中であるかまたは以前に処置されていた被験体、B細胞疾患を再発している被験体、免疫無防備状態の被験体、あるいはさもなければマクロファージまたは単球機能に欠陥を有する被験体に、特に適している。本発明者らは、単球によって主に媒介される抗体依存性細胞傷害性(ADCC)が、B細胞枯渇において、以前に認識されていた役割よりも重要な役割を果たすことを見出した。抗CD20治療に対して耐性があるか、またはB細胞疾患の再発を有する患者の有病率は、マクロファージまたは単球の機能の欠陥に、少なくとも部分的に起因し得る。従って、本発明は、ADCCおよび/またはマクロファージおよび/または単球の機能を増強する方法を提供し、この方法は、抗CD20抗体および抗原結合性フラグメントを投与する方法と併せて用いられる。
本発明はまた、獣医学目的のために非ヒト哺乳動物および鳥類の処置にも実施され得るが、本発明に記載の被験体はヒト被験体であり得る。本発明の診断法および治療法を実施し得る哺乳動物被験体の非限定的な例としては、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギおよびヒトが挙げられる。鳥類としては、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ガチョウおよびアヒルが挙げられる。
本発明の抗体組成物は、吸入(例えば、エアロゾルによって)、口内(例えば、舌下)、局所(すなわち、気道表面を含む、皮膚表面および粘膜表面の両方)、鞘内、関節内、胸膜内(intraplural)、(大)脳内、静脈内、動脈内、腹腔内、経口、リンパ内、筋肉内、皮内、皮下、経皮、鼻腔内、直腸または腟投与が挙げられるがこれらに限定されない、任意の投与様式を用いて投与され得、そして蠕動手段によるかまたはデポー剤の形態で送達され得るが、ただし最適な経路は、いかなる所定の場合にも、当該分野で周知のように、被験体の種、年齢、性別および総合的状態のような要因、処置されるべき状態の性質および重症度および/または投与される特定の組成物の性質(すなわち、投薬量、剤形)に依存する。特定の実施形態において、投与の経路は、週に1回または2回、ボーラスまたは長期間にわたる連続注入によってである。他の特定の実施形態において、投与の経路は、必要に応じて週に1回または2回、皮下注射によってである。
投与に適したレジメンは、処置される被験体および状態によって可変であるが、代表的には、初期投与の後に、次の注射または他の投与が、1以上の間隔を置いて反復投与される。この投与の間の間隔は、ほんの数時間程度であってもよく、または1週間以上もの間であってもよい。あるいは、連続静脈内注入を使用して、有効な血中濃度を維持し得る。
本明細書中に開示される抗体はまた、インビトロでの手順に用いられ得る。これらの抗体は、CD20(Bリンパ球成長の特定段階の間、Bリンパ球上で発現される)を選択的に結合する。従って、本発明の抗体は、細胞の混合試料(例えば、全血)からBリンパ球を特異的に枯渇させるのに用いられ得る。次いで、富化したかまたは枯渇させたかのいずれかのBリンパ球画分が、他の細胞型による干渉または相互作用の危険性なしに、必要に応じて実験的に用いられ得る。インビトロで混合細胞集団からBリンパ球を単離するために、本明細書中に開示される抗体を利用する方法は、当該分野において周知である。非限定的な例として、FACS、パニングおよび磁気分離技術を本明細書中に開示される抗体と共に用いて、混合細胞集団からBリンパ球を分離し得る。
本明細書中に開示される抗体はまた、Bリンパ球の成長上の亜集団を相互に区別するためにも用いられ得る。CD20はプロBリンパ球上には発現されない。プレBリンパ球において、多少の発現が見出され得る。未成熟のT1およびT2移行Bリンパ球は、より高い量のCD20を発現する。成熟Bリンパ球は、より低レベルのCD20を発現する。この情報は、上で議論した技術と組み合わせるか、または当業者に公知の他の技術と組み合わせて、Bリンパ球の研究集団が経験している成長段階を決定するのに有用である。
(薬学的組成物)
本発明の抗体または抗体フラグメントを含む薬学的組成物もまた提供される。本発明の薬学的組成物は、本明細書中に記載される1以上の抗体または抗体フラグメントを有効成分としてその中に溶解または分散させて薬学的に受容可能なキャリアと共に含む。
本発明の抗体または抗体フラグメントを含む薬学的組成物もまた提供される。本発明の薬学的組成物は、本明細書中に記載される1以上の抗体または抗体フラグメントを有効成分としてその中に溶解または分散させて薬学的に受容可能なキャリアと共に含む。
本明細書中で使用される場合、組成物、キャリア、希釈剤および試薬に関して、用語「薬学的に受容可能」とは、これらの物質が望ましくない生理的影響または毒性を生じることなく動物に投与可能であることを示す。
薬学的組成物の処方物は、製薬化学の技術分野において周知である。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,(第15版、Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1975)、特に第87章、Blaug,Seymourによる)を参照のこと。薬学的組成物としては、非限定的に、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、無水吸着基剤、水中油または油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス(多様な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。代表的な投薬形態は、非経口(例えば、静脈内または皮下)経路による投与に適した、滅菌した等張性の水性溶液である。この薬学的処方物中における本発明の抗体または抗体フラグメントの濃度は、例えば、約0.01重量%、0.1重量%、0.5重量%、1重量%または2重量%未満から、5重量%、10重量%、20重量%または50重量%以上ほどまでも、広く変化し得、そして、選択された投与の特定の様式に従って、主に液量、粘性などによって選択される。
本発明の薬学的組成物はまた、リポソームによって投与され得る。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散系、ラメラ層などが挙げられる。これらの調製物中に、送達されるべき本発明の組成物が、単独で、あるいは所望の標的(例えば、抗体)に結合する分子と組み合わせて、または他の治療的もしくは免疫原性の組成物と組み合わせて、リポソームの一部として組み込まれる。本発明で用いるリポソームは、中性および負に帯電したリン脂質およびステロール(例えば、コレステロール)を一般に含む、標準的なベシクル形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般に、例えばリポソームサイズ、血流中のリポソームの酸不安定性および安定性などの検討によって導かれる。例えば、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)、米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、および同第5,019,369号に記載されるように、種々の方法が、リポソームの調製に利用可能である。
有効成分としてその中に溶解または分散させて含む薬学的組成物の調製は、当該分野において十分に理解されている。代表的には、このような組成物は溶液または懸濁液として調製される;しかしながら、溶液または懸濁液に適し、使用の前には液体である、固体形態も調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。
この有効成分は、薬学的に受容可能であり且つこの有効成分と適合性の賦形剤と、本明細書中に記載の方法における使用に適した量で、混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、この組成物は、この有効成分の有効性を高める微量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などを含み得る。
この薬学的組成物は、これらの成分の薬学的に受容可能な塩を含み得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩(ポリペプチドの遊離アミノ基により生成される)が挙げられ、これらは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて生成される。遊離カルボキシル基を用いて生成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第2鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。
例示的な液体キャリアは、有効成分および水以外の物質を含まないか、あるいは生理的pH値でリン酸ナトリウムのような緩衝液、食塩水、または両方(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水)を含む、滅菌水溶液である。なおさらに、水性キャリアは、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、ポリエチレングリコールならびに他の溶質のような塩に加えて、2種以上の緩衝塩を含み得る。
液体組成物もまた、水に加えて、および水を排除して、液相を含み得る。このようなさらなる液相としては、例えば、グリセリン、綿実油のような植物油、および水−油エマルジョンが挙げられる。
本発明を記載したところで、同発明を以下の実施例においてより詳細に説明する。これらの実施例は、単に説明の目的で本明細書中に含まれるものであり、本発明の限定を意図するものではない。
(実施例1)
(材料および方法)
CD20−/−マウスの作製。Cd20遺伝子の3’末端をコードするDNAを、129/Sv系マウスDNAファージライブラリーから単離し、マッピングし、そして配列決定して、イントロン−エクソン境界を確認した(図1Aおよび図1B)(Tedderら(1989)J.Immunol.142:2560)。遺伝子ターゲティングは、pMC1−HSV遺伝子の下流であるPstI(エクソン5)からEcoRV(エクソン6、約1.8kb)DNAフラグメントを含むpBluescript SKベースのベクター(p594)を用いた。約10kbのKpnI DNAフラグメントを、ネオマイシン耐性(Neor)マーカーの下流に挿入した(図1C)。このプラスミドを、固有のSalI制限酵素認識部位を用いて直線化し、標準方法にしたがいG418を用いて選択した129系由来のES細胞にトランスフェクトした(KollerおよびSmithies(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA 86:8932)。115個のうち6個のNeo耐性ES細胞コロニーが、標的対立遺伝子を保有していた(図1D)。同一のプローブを用いてBamHI(12kbよりも大きいフラグメントを6.5kbバンドに縮小した)、KpnI(7.2kbが5.5kbになった)、およびSspI(5.6kbが7.0kbになった)で消化したDNAのサザン分析によって、適切なターゲティングをさらに確認した。1つのES細胞クローンの細胞が、7世代以上にわたってC57BL/6マウスと交配させた、80〜100%キメラ雄性子孫を生じた。ヘテロ接合性子孫を交配して、ホモ接合性CD20−/−および野生型同腹仔を作製した(図1E)。ほとんどの場合、CD20−/−マウスおよび(C57BL/6×129)F1マウスの野生型同腹仔を用いて得た結果は同一であったので、これらの結果をプールした。3〜10組の同腹仔ペアを種々の年齢で用いて脾臓および腹腔サブセット分析を行ったので、野生型マウスとCD20−/−マウスの間の比較のみが有効である。マウスを特定の無菌バリア施設中で飼育し、2〜3ヶ月齢で用いた。
(材料および方法)
CD20−/−マウスの作製。Cd20遺伝子の3’末端をコードするDNAを、129/Sv系マウスDNAファージライブラリーから単離し、マッピングし、そして配列決定して、イントロン−エクソン境界を確認した(図1Aおよび図1B)(Tedderら(1989)J.Immunol.142:2560)。遺伝子ターゲティングは、pMC1−HSV遺伝子の下流であるPstI(エクソン5)からEcoRV(エクソン6、約1.8kb)DNAフラグメントを含むpBluescript SKベースのベクター(p594)を用いた。約10kbのKpnI DNAフラグメントを、ネオマイシン耐性(Neor)マーカーの下流に挿入した(図1C)。このプラスミドを、固有のSalI制限酵素認識部位を用いて直線化し、標準方法にしたがいG418を用いて選択した129系由来のES細胞にトランスフェクトした(KollerおよびSmithies(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA 86:8932)。115個のうち6個のNeo耐性ES細胞コロニーが、標的対立遺伝子を保有していた(図1D)。同一のプローブを用いてBamHI(12kbよりも大きいフラグメントを6.5kbバンドに縮小した)、KpnI(7.2kbが5.5kbになった)、およびSspI(5.6kbが7.0kbになった)で消化したDNAのサザン分析によって、適切なターゲティングをさらに確認した。1つのES細胞クローンの細胞が、7世代以上にわたってC57BL/6マウスと交配させた、80〜100%キメラ雄性子孫を生じた。ヘテロ接合性子孫を交配して、ホモ接合性CD20−/−および野生型同腹仔を作製した(図1E)。ほとんどの場合、CD20−/−マウスおよび(C57BL/6×129)F1マウスの野生型同腹仔を用いて得た結果は同一であったので、これらの結果をプールした。3〜10組の同腹仔ペアを種々の年齢で用いて脾臓および腹腔サブセット分析を行ったので、野生型マウスとCD20−/−マウスの間の比較のみが有効である。マウスを特定の無菌バリア施設中で飼育し、2〜3ヶ月齢で用いた。
ノックアウトマウス。FcγRI−/−マウスおよびFcγRIII−/−マウスは記載のとおりである(Bruhnsら(2003)Immunity 18:573〜581)。C57BL/6、FcγRII−/−(B6、129S−Fcgr2tm1Rav)、FcγRIII−/−(C57BL/6−Fcgr3tm1Sjv)、Beige(C57BL/6−Lystbg/bg)、Perforin−/− (C57BL/6−Pfptm1Sdz)、CSF1op(Csf1op)、およびヌード(C57BL/6−Hfh11nu)マウスを、The Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から入手した。FcR共通γ鎖(FcRγ)欠損マウス(FcRγ−/−、B6.129P2−Fcerg1tm1)を、Taconic Farms(Germantown、New York)から入手した。記載のようなC1q−/−マウス(Bottoら(1998)Nat.Genet.19:56〜59)は、Mark Walport(Imperial College、London、UK)の許可で、Garnett Kelsoe(Duke University)によって提供され、LAT−/−マウスは、Weiguo Zhang(Duke University)から、記載のように(Zhangら(1999)Immunity 10:323〜332)、そしてC3−/−およびC4−/−マウスは、Michael Carroll(Center for Blood Research、Boston、MA)から、記載のように(Wesselsら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11490〜11494)、提供された。マクロファージ欠損マウスを、標準方法(Van RooijenおよびSanders(1994)J.Immunol.Methods 174:83〜93)を用い、−2日目、1日目および4日目にクロドロネートカプセル化リポソーム(0.1mL/体重10グラム;Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)の尾静脈注射によって作製した。全てのマウスを特定の無菌バリア施設中で飼育し、2〜3ヶ月齢で初めて用いた。
免疫蛍光分析。単細胞白血球懸濁液を、十分に確立した方法(Zhouら(1994)Mol.Cell.Biol.14:3884)を用い、各抗体の所定の最適濃度を用いて20〜60分間、氷上で染色した。リンパ球の前方および側方光散乱特性を有する細胞を、FACScanまたはFACScaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson、San Jose、CA)で分析した。98%以上の細胞を排除するようにゲートを位置決めし、非反応性のコントロールモノクローナル抗体(Caltag Laboratories、Burlingame、CA)を用いて、バックグラウンド染色を決定した。用いた抗体は以下を含む:CD19モノクローナル抗体(MB19−1)(Tedderら(1988)Mol.Immunol.25:1321;TedderおよびSchlossman(1988)J.Biol.Chem.263:10009;Valentineら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:8085);B220モノクローナル抗体(RA3−6B2)(DNAX Corp.、Palo Alto、CA);Thy1.2(Caltag Laboratories、Burlingame、CA);IgM、I−A、CD5、CD11b、CD23およびCD43と反応性の抗体(BD PharMingen、Franklin Lakes、NJ);ならびに抗マウスIgG3、IgMおよびIgD抗体(Southern Biotechnology Associates Inc.、Birmingham、AL)。
抗体。HB20−1〜HB20−6モノクローナル抗体を、標準方法(Steeberら(1997)J.Immunol.159:952〜963)を用い、ヒトCD20をコードするcDNAをトランスフェクトしたマウスプレB細胞株で免疫したBALB/cマウスにおいて生成させた。このHB20−25マウス抗ヒトCD20モノクローナル抗体を、先に記載の方法(Steeberら(1997)前出)と類似の方法を用い、ヒトCD20をコードするcDNAでトランスフェクトしたマウスプレB細胞株300.19で免疫した、C57Bl/6×129遺伝的背景のCD20−/−マウスにおいて生成させた。全てのMB20モノクローナル抗体を、上記のように、C57Bl/6×129遺伝的背景のCD20−/−マウスにおいて生成させた。
CD20特異的マウスモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、NS−1骨髄腫細胞を、マウスCD20−緑色蛍光タンパク質(GFP)をトランスフェクトした300.19細胞で免疫したCD20−/−マウス由来の脾臓細胞と融合させることによって生成した(Kearneyら(1979)J.Immunol.123:1548)。これらの抗CD20モノクローナル抗体MB20−1、−2および−14は、IgG1アイソタイプのものであり;MB20−6、−11、および−16はIgG2aであり;MB20−7、−8、−10および−18はIgG2bであり;ならびにMB20−3および−13はIgG3モノクローナル抗体であった。GFPと融合したマウスCD20を発現している、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞および300.19プレB細胞株は、これらの融合タンパク質をコードするcDNAを用いて各細胞株をトランスフェクトすることによって生成した(Tedderら(1988)J.Immunol.141:4388)。トランスフェクト細胞を、GFP発現に基づく蛍光ベースの細胞選別によって単離した。
抗CD20モノクローナル抗体1F5(Shanら(1999)J.Immunol.162:6589〜6595)、B9E9(Schultzら(2000)Cancer Res.60:6663〜6669)、および1H4(Haismaら(1998)Blood 92:184〜190)を、Fifth International Workshop and Conference on Human Leukocyte
Differentiation Antigens(Boston、MA;11月3〜7日、1993)によって入手した。Beckman−Coulter(Miami、FL)から入手したB1抗CD20モノクローナル抗体(Stashenkoら(1980)J.Immunol.125:1678)を精製モノクローナル抗体として、または希釈腹水として用いた。
Differentiation Antigens(Boston、MA;11月3〜7日、1993)によって入手した。Beckman−Coulter(Miami、FL)から入手したB1抗CD20モノクローナル抗体(Stashenkoら(1980)J.Immunol.125:1678)を精製モノクローナル抗体として、または希釈腹水として用いた。
細胞内Ca2+測定。ヤギF(ab’)2抗IgM抗体(5〜40μg/mL;Cappel/ICN Pharmaceuticals,Inc.、Aurora、OH)、抗マウスCD19モノクローナル抗体(MB19−1;40μg/mL)、タプシガルジン(1μM;Sigma,St.Louis,MO)、またはイオノマイシン(2.67μg/mL;CALBIOCHEM(登録商標)Biosciences,Inc.,La Jolla,CA)で細胞を処理した後に、[Ca2+]iレベルの変化を標準方法(Shanら(1998)Blood 91:1644)を用いてフローサイトメトリーによってモニターした。場合によっては、EGTA(最終5mM)を細胞懸濁液に添加した後に、上記の薬剤を添加した。
B細胞活性化アッセイ。脾臓B細胞を、Thy1.2抗体を被覆した磁気ビーズ(DYNAL(登録商標)Inc.,Lake Success,NY)を用いてT細胞を除去することによって精製した(>93%B220+)。シグナル伝達研究のために、B細胞を、5%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地中で、37℃にて5分間インキュベートした後(2×107/mL)、F(ab’)2抗マウスIgM抗体フラグメントを添加した(40μg/mL)。400μMのEDTAおよび100μMのオルトバナジウム酸Naを含む冷生理食塩水を添加した後、これらの細胞を、十分に確立された方法(Bradburyら(1992)J.Immunol.149:2841;Fujimotoら(1999)J.Immunol.162:7088)を用いて界面活性剤で溶解させた。CD20構造研究のために、B細胞をEZ−LINK(商標)Sulfo−NHS−Biotin(0.5mg/mL;Pierce,Rockford,IL)で表面ビオチン化し、次いで、界面活性剤で溶解させた。2μgのモノクローナル抗体およびProteinG−SEPHAROSE(商標)を用いてタンパク質を免疫沈降させるとともに、細胞溶解物を、IgG1モノクローナル抗体(1μg)およびProteinG−SEPHAROSE(商標)(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)の50%懸濁液50μLを用いて事前に取り除いた。これらのビーズを高塩濃度および低塩濃度RIPA緩衝液で2回、リン酸緩衝化食塩水(PBS)で2回洗浄し、サンプル緩衝液中(10%の2−メルカプトエタノールを含むかまたは含まない)で煮沸し、電気泳動し、そしてニトロセルロース膜に転写した。全細胞溶解物のブロットを、MB20−1モノクローナル抗体、ペルオキシダーゼ結合体化4G10抗体(Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY)を用いて、あるいは抗ホスホ−CD19(Y513)、−PLCγ(Y783)、−Syk(Y525/Y526)、−BTK(Y223)、−Srcファミリーキナーゼ抗体(Cell Signaling Technology,Inc.,Beverly、MA)、または抗活性MAPK抗体(PROMEGA(登録商標)、Madison、WI)を用いてプローブした。これらの膜を剥ぎ取り、ウサギポリクローナル抗SHP−1抗体(Upstate Biotechnology)、または抗Lyn(lyn−44)、抗Fyn(Fyn3)および抗ERK2(C−14)抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.、Santa Cruz、CA)でリプローブした。ビオチン化タンパク質または抗体を、ストレプトアビジン結合体化西洋ワサビペルオキシダーゼ(Southern Biotechnology Assoc.,Birmingham,AL)および化学発光増強キット(ECL(商標);Pierce,Rockland,IL)を用いて検出した。
CD20リン酸化の研究のために、初代B細胞(107/mL)をリポ多糖(LPS)(E.coli血清型0111:B4、10μg/mL、Sigma,St.Louis,MO)とともに48時間培養した。次いで、初代B細胞および細胞株を、リン酸塩を含まない培地中で1時間培養し、200μCi/mL[32P]オルトリン酸塩(PerkinElmer,Boston,MA)を含む培地中で90分間培養し、洗浄し、溶解させ、免疫沈降させ、そしてSDS−PAGEによって分離すると共に、標準方法(KansasおよびTedder(1991)J.Immunol.147:4094;Leveilleら(1999)Eur.J.Immunol.29:65)に従ってオートラジオグラフィーを行った。
機能アッセイ。脾臓B細胞増殖を、[3H]チミジン取込み反応の標準方法(Engelら(1995)Immunity 3:39)によって測定した。8週齢マウスを、2,4−ジニトロフェノール結合体化キーホールリンペットヘモシニアン(100μg、DNP−KLH;CALBIOCHEM(登録商標)−Novabiochem、La Jolla、CA)で免疫したか、または周知の方法(Jacobら(1991)J.Exp.Med.173:1165)に従ってミョウバン中に沈殿させたニワトリγグロブリン(50μg、NP18−CGG)と結合体化した(4−ヒドロキシ−3−ニトロフェニルアセチル)で2回免疫した。血清DNP−およびNP−特異的抗体レベルを、ELISAによって測定し(Engelら(1995)Immunity 3:39;Takahashiら(1998)J.Exp.Med.187:885)、同時に標準方法(Takahashiら(1998)J.Exp.Med.187:885)を用いて抗体応答の相対的親和性/結合活性(avidity)を評価した。
免疫療法。200μLのPBS中の滅菌抗マウスCD20およびアイソタイプコントロールモノクローナル抗体(0.5〜250μg)を、側方尾静脈に注射した。別に指示しない限り、全ての実験で250μgのモノクローナル抗体を用いた。処置1時間後および2、4、7、28、48、50、52、54、56または58日後に、血液および脾臓を回収した。赤血球溶解の後に、白血球数を血球計数器によって定量化し、同時にフローサイトメトリー分析を用いた免疫蛍光染色によってB220+B細胞頻度を決定した。ヒトおよびマウスにおける抗体用量(表7)を、Oncology Tool Dose Calculator(www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)を用いて比較した。
Cアッセイ。WTマウス脾臓B細胞を、Thy−1.2モノクローナル抗体を被覆した磁気ビーズ(DYNAL(登録商標)、Lake Success、NY)を用いてT細胞を除去することによって精製した(>93% B220+)。インビトロでのC媒介性B細胞死滅の数量化は、標準方法(Gazzano−Santoroら(1997)J.Immunol.Methods 202:163〜171)に従った。脾臓B細胞を、各抗CD20モノクローナル抗体(0.5μg/mL)および子ウサギC(50倍希釈;GIBCO−BRL、Grand Island、NY)と共に37℃で2時間インキュベートした。37℃で4時間インキュベーションしながら各チューブにPBSを添加し、その後、これらの細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム(PI)および抗B220モノクローナル抗体で染色し、同時にヨウ化プロピジウム排除をフローサイトメトリー分析によって決定した。
重鎖および軽鎖遺伝子利用。細胞質RNAを、RNEASY(登録商標)Mini Kit(QIAGEN(登録商標)、Chatsworth、CA)を用いて、1〜10×105個のハイブリドーマ細胞から抽出した。第一鎖cDNAを、オリゴ−dTプライマー(dT18)およびSUPERSCRIPT(商標)キット(Gibco BRL、Gaithersburg、MD)を用いて、細胞質RNAから合成した。1μLのcDNA溶液を、VH遺伝子のPCR増幅のための鋳型として用いた。10mMのTris−HCl(pH8.3)、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、200μMのdNTP(Perkin Elmer、Foster City、CA)、50pmolの各プライマー、および5UのTaq DNAポリメラーゼ(ISC Bioexpress、Kaysville、UT)からなる100μL容量の反応混合物中で、PCR反応を行った。増幅を30サイクル行った(94℃で1分間、58℃で1分間、72℃で1分間;Thermocycler、Perkin Elmer)。VH遺伝子は、当該分野で周知の乱交雑センス5’VHプライマー(MsVHE;5’GGG AAT TCG AGG TGC AGC TGC AGG AGT CTG G 3’;配列番号110)(Kantorら(1996)J.Immunol.158:1175〜1186)、およびCμコード領域に相補的なアンチセンスプライマー(プライマーCμ−in;5’GAG GGG GAA GAC ATT TGG GAA GGA CTG 3’;配列番号111)、Cγ領域に相補的なアンチセンスプライマー(プライマーCγ1;5’GAG TTC CAG GTC ACT GTC ACT GGC 3’;配列番号112)またはCα領域に相補的なアンチセンスプライマー(プライマーCα;5’GTG AAT TCA GGC GGC CGC TAA 3’;配列番号113)を用いて増幅した。軽鎖cDNAは、センスVκプライマー(表1)およびCκアンチセンスプライマー(5’ACT GGA TGG TGG GAA GAT G 3’;配列番号114)を用いて増幅した。増幅したPCR産物を、QIAQUICK(登録商標)ゲル精製キット(QIAGEN(登録商標))を用いてアガロースゲルから精製し、AMPLITAQ(登録商標)DNAポリメラーゼおよび初期PCR増幅用と同じプライマーを用いたPerkin Elmer Dye Terminator Sequencingシステムを用いて増幅した後に、ABI 377 PRISM(登録商標)DNAシーケンサーを用いて、直接的に双方向に配列決定した。全てのVHおよび軽鎖領域を、センスおよびアンチセンスDNA鎖の両方について完全に配列決定した(図14および図17)。
抗ヒトおよび抗マウスCD20モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖領域についてのCDR配列を、表2および表3にそれぞれ記載する。
統計分析。全てのデータを平均値±SEMとして示す。スチューデントt検定を用いて、母平均値間の有意差を決定した。
(実施例2)
(CD20−/−マウスの作製)
ターゲティングベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含むCD20の第2細胞外ループ、第4膜貫通ドメイン、および大きなカルボキシル末端細胞質ドメインの一部をコード化するエクソンを置換した(図1A〜1D)。Cd20遺伝子破壊のためのマウスホモ接合体は、標的ES細胞を用いて生成した創始マウスのヘテロ接合性子孫の交雑によって、予想されたメンデル頻度で得られた。ホモ接合性子孫に由来するゲノムDNAのサザンブロットおよびPCR分析により、適切なCd20遺伝子ターゲティングおよびエクソン6〜8のゲノム欠失をさらに確認した(図1Eおよび図IF)。CD20−/−マウスの脾細胞から生成されたcDNAのPCR増幅によって確認したように、野生型CD20mRNAは、CD20−/−マウスに存在しなかった(図1G)。融合CD20−Neor遺伝子転写物は、PCRによってCD20−/−マウスにおいて低レベルで検出され、この転写物は、Neor遺伝子プロモーター配列によってコードされた88アミノ酸ペプチドと融合した、157番目のアミノ酸で切断された異常なCD20ペプチドに翻訳された。CD20−/−マウスにおける細胞表面CD20タンパク質発現の欠如を、CD20−GFP cDNAを用いてトランスフェクトした300.19細胞およびCHO細胞と反応性であるが、トランスフェクトされなかった細胞とは反応性ではない、12種類のマウス抗マウスCD20モノクローナル抗体のパネルを用いて確認した(図1H)。これらのモノクローナル抗体は、野生型マウス由来のCD19+脾細胞によって発現される細胞表面CD20エピトープと反応したが、CD20−/−マウス由来のものとは反応しなかった(図1I)。従って、Cd20遺伝子を標的とする突然変異により、細胞表面のCD20発現が排除された。
(CD20−/−マウスの作製)
ターゲティングベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含むCD20の第2細胞外ループ、第4膜貫通ドメイン、および大きなカルボキシル末端細胞質ドメインの一部をコード化するエクソンを置換した(図1A〜1D)。Cd20遺伝子破壊のためのマウスホモ接合体は、標的ES細胞を用いて生成した創始マウスのヘテロ接合性子孫の交雑によって、予想されたメンデル頻度で得られた。ホモ接合性子孫に由来するゲノムDNAのサザンブロットおよびPCR分析により、適切なCd20遺伝子ターゲティングおよびエクソン6〜8のゲノム欠失をさらに確認した(図1Eおよび図IF)。CD20−/−マウスの脾細胞から生成されたcDNAのPCR増幅によって確認したように、野生型CD20mRNAは、CD20−/−マウスに存在しなかった(図1G)。融合CD20−Neor遺伝子転写物は、PCRによってCD20−/−マウスにおいて低レベルで検出され、この転写物は、Neor遺伝子プロモーター配列によってコードされた88アミノ酸ペプチドと融合した、157番目のアミノ酸で切断された異常なCD20ペプチドに翻訳された。CD20−/−マウスにおける細胞表面CD20タンパク質発現の欠如を、CD20−GFP cDNAを用いてトランスフェクトした300.19細胞およびCHO細胞と反応性であるが、トランスフェクトされなかった細胞とは反応性ではない、12種類のマウス抗マウスCD20モノクローナル抗体のパネルを用いて確認した(図1H)。これらのモノクローナル抗体は、野生型マウス由来のCD19+脾細胞によって発現される細胞表面CD20エピトープと反応したが、CD20−/−マウス由来のものとは反応しなかった(図1I)。従って、Cd20遺伝子を標的とする突然変異により、細胞表面のCD20発現が排除された。
(実施例3)
(CD20−/−マウスにおけるB細胞の成長)
CD20−/−マウスは、野生型同腹仔と同様に、9年間の観察の間中よく成長かつ繁殖し、生後1年間明らかな解剖学的または形態学的異常、あるいは感染に対する感受性はいずれも示さなかった。CD20−/−マウスは、正常頻度のIgM−B220loプロ/プレB細胞、IgM+B220lo未成熟B細胞およびIgM+B220hi成熟B細胞(図1J、表4)、ならびに正常数のAA4.1+または熱安定抗原(HSA)hiB220lo未成熟/移行B細胞を、骨髄に有していた。血液、脾臓およびリンパ節のIgM+B220+B細胞の数は、CD20−/−マウスとそれらの野生型同腹仔との間で有意差はなかった(表4)。
(CD20−/−マウスにおけるB細胞の成長)
CD20−/−マウスは、野生型同腹仔と同様に、9年間の観察の間中よく成長かつ繁殖し、生後1年間明らかな解剖学的または形態学的異常、あるいは感染に対する感受性はいずれも示さなかった。CD20−/−マウスは、正常頻度のIgM−B220loプロ/プレB細胞、IgM+B220lo未成熟B細胞およびIgM+B220hi成熟B細胞(図1J、表4)、ならびに正常数のAA4.1+または熱安定抗原(HSA)hiB220lo未成熟/移行B細胞を、骨髄に有していた。血液、脾臓およびリンパ節のIgM+B220+B細胞の数は、CD20−/−マウスとそれらの野生型同腹仔との間で有意差はなかった(表4)。
a 値は、3〜10匹の野生型およびCD20−/−の2ヶ月齢同腹仔に由来する、示された細胞表面マーカーを発現しているリンパ球の平均(±SEM)数または百分率(側方および前方光散乱特性に基づく)を表す。
b B細胞数は、各組織から収集した細胞の総数に基づいて算出した。
c 値は、1mL当たりの細胞数を示す。
d 鼠径部リンパ節の対に相応する値。
* 試料平均値は野生型同腹仔と有意差があった、p<0.05;**p<0.01。
B細胞IgM発現は、CD20−/−マウスにおいて、野生型同腹仔の未成熟および成熟B細胞と比較して有意に低かった(表4、図1J)。さらに、CD20−/−同腹仔の脾臓におけるIgMhiB220loB細胞の数は、約50%減少した。IgMhiB220loB細胞数の減少は、大部分のB細胞によるIgM発現の低下を反映し得るが、脾臓辺縁帯B細胞における低下には起因しなかった。なぜなら、CD1dhiCD21+表現型を含む細胞の数は、CD20−/−と野生型同腹仔との間で有意差がなかったためである(表4)。同様に、移行T1(CD21loHSAhi)およびT2(CD21hiHSAint)B細胞の数(骨髄からの新規移出を表す)は減少しなかった(表4)。むしろ、T1細胞の頻度および数は、CD20−/−マウスの骨髄で観察される成熟IgM+B220hiB細胞の頻度の増大と同様に、通常はCD20−/−マウスにおいてより高かった。IgMhiB220loB細胞数の減少は、脾臓B1細胞の減少に一部起因し得る。なぜなら、CD20−/−マウスの腹腔内のCD5+B220loB1a細胞数が64%減少したためである。CD20−/−および野生型同腹仔の腹膜におけるIgM+B220+B細胞の総数は、CD5−B220hiB細胞数の増加に起因して類似していた(表4、図1J)。B1b B細胞(CD11b+CD5−B220lo)の数は、CD20−/−および野生型同腹仔において類似していた(表4)。野生型同腹仔由来のB細胞と比較した場合、骨髄、血液、リンパ節または脾臓から単離したCD20−/−B細胞のサイズ(光散乱特性)に明らかな差異はなかった。脾臓組織切片の免疫組織化学分析により、B220+B細胞の別の正常な構築および組織化が明らかになった。従って、IgM発現の低下、脾臓におけるIgMhiB220loB細胞サブセットの減少、および腹腔内のB1細胞数の低下は例外として、CD20発現は、B細胞の成長および組織局在化に必須ではなかった。
(実施例4)
(CD20−/−B細胞機能)
表面IgM連結に対する精製CD20−/−B細胞の増殖応答は、抗体濃度の範囲(1〜40μg/mL)にわたって野生型B細胞に匹敵した(図1K)。B細胞が、濃度範囲(0.1〜10μg/mL)にわたるLPS(図1K)によって、または最適以下(5μg/mL)の濃度で抗IgM抗体を加えたIL−4(10〜100U/mL)を用いて活性化された場合、増殖も正常であった。従って、CD20の減少により、マイトジェン誘導性増殖に対する検出可能な影響はなかった。正常レベルの全てのIgアイソタイプが、CD20−/−マウス由来の血清中に見出された(図1L)。CD20−/−マウスはまた、T細胞依存性抗原であるDNP−KLHで免疫した後に野生型同腹仔において観察されるのと類似した、全てのアイソタイプの一次および二次抗体応答を生じた(図1M)。さらに、CD20−/−マウスおよびその野生型同腹仔は、NP−CGGで免疫した後、同等の一次および二次IgMならびにIgG1抗NP抗体応答を生じた(各群当たり5匹のマウス)。さらに、CD20−/−マウスにおいて生じた一次および二次IgG1抗NP抗体応答の親和性は、その野生型同腹仔において生じたものと類似していた。従って、CD20機能は、体液性免疫応答の生成中のT−B細胞相互作用、アイソタイプスイッチングまたは親和性成熟に必要ではなかった。
(CD20−/−B細胞機能)
表面IgM連結に対する精製CD20−/−B細胞の増殖応答は、抗体濃度の範囲(1〜40μg/mL)にわたって野生型B細胞に匹敵した(図1K)。B細胞が、濃度範囲(0.1〜10μg/mL)にわたるLPS(図1K)によって、または最適以下(5μg/mL)の濃度で抗IgM抗体を加えたIL−4(10〜100U/mL)を用いて活性化された場合、増殖も正常であった。従って、CD20の減少により、マイトジェン誘導性増殖に対する検出可能な影響はなかった。正常レベルの全てのIgアイソタイプが、CD20−/−マウス由来の血清中に見出された(図1L)。CD20−/−マウスはまた、T細胞依存性抗原であるDNP−KLHで免疫した後に野生型同腹仔において観察されるのと類似した、全てのアイソタイプの一次および二次抗体応答を生じた(図1M)。さらに、CD20−/−マウスおよびその野生型同腹仔は、NP−CGGで免疫した後、同等の一次および二次IgMならびにIgG1抗NP抗体応答を生じた(各群当たり5匹のマウス)。さらに、CD20−/−マウスにおいて生じた一次および二次IgG1抗NP抗体応答の親和性は、その野生型同腹仔において生じたものと類似していた。従って、CD20機能は、体液性免疫応答の生成中のT−B細胞相互作用、アイソタイプスイッチングまたは親和性成熟に必要ではなかった。
(実施例5)
(B細胞成長中のCD20発現)
マウス抗マウスCD20モノクローナル抗体のパネルを用いたところ、2つのマウスプレB細胞株(300.19および38B9)および2つのT細胞株(BW5147およびBL4)はCD20細胞表面タンパク質を発現できず、一方、70ZプレB株、A20およびAJ9成熟B細胞株ならびにNS−1プラズマ細胞腫株はCD20+であった(図1Hおよび図2A)。同様に、CD20は骨髄においてB220+細胞のサブセットによってのみ発現され(図2B);30±3%のB220loリンパ球はCD20+であったが、一方、全てのB220hiB細胞はCD20+であった(n=6匹のマウス)。骨髄におけるCD19+B細胞の類似の画分は、CD20+であった(51±2%、n=6)。これと一致して、CD43+B220+プロB細胞はCD20を発現しなかったが、一方、10±1%(n=3)のCD43−IgM−B220loプレB細胞はCD20を低密度で発現した(図2G)。全てのCD20+プレB細胞(CD43−IgM−B220lo)は、それらの光散乱特性に基づいて小さかったが、これは、CD20発現が主に重鎖発現時または重鎖発現時前後に開始したことを示している。これと一致して、未成熟IgM+B220loB細胞の大多数はCD20を発現した(76±9%、n=3;画分I、図2G)。骨髄において、未成熟IgMhiB220+の亜集団(画分II、図2G)またはCD19loB細胞は、成熟B220hi(画分III、図2G)またはCD19hiB細胞(図2B)よりも277±53%(n=3)高い密度でCD20を発現した。従って、CD20は、小型プレB細胞から未成熟B細胞への移行中に初めて発現し、成熟とともにCD20発現が増大し、次いで成熟B220hiプール中への循環B細胞の流入とともに減少する。
(B細胞成長中のCD20発現)
マウス抗マウスCD20モノクローナル抗体のパネルを用いたところ、2つのマウスプレB細胞株(300.19および38B9)および2つのT細胞株(BW5147およびBL4)はCD20細胞表面タンパク質を発現できず、一方、70ZプレB株、A20およびAJ9成熟B細胞株ならびにNS−1プラズマ細胞腫株はCD20+であった(図1Hおよび図2A)。同様に、CD20は骨髄においてB220+細胞のサブセットによってのみ発現され(図2B);30±3%のB220loリンパ球はCD20+であったが、一方、全てのB220hiB細胞はCD20+であった(n=6匹のマウス)。骨髄におけるCD19+B細胞の類似の画分は、CD20+であった(51±2%、n=6)。これと一致して、CD43+B220+プロB細胞はCD20を発現しなかったが、一方、10±1%(n=3)のCD43−IgM−B220loプレB細胞はCD20を低密度で発現した(図2G)。全てのCD20+プレB細胞(CD43−IgM−B220lo)は、それらの光散乱特性に基づいて小さかったが、これは、CD20発現が主に重鎖発現時または重鎖発現時前後に開始したことを示している。これと一致して、未成熟IgM+B220loB細胞の大多数はCD20を発現した(76±9%、n=3;画分I、図2G)。骨髄において、未成熟IgMhiB220+の亜集団(画分II、図2G)またはCD19loB細胞は、成熟B220hi(画分III、図2G)またはCD19hiB細胞(図2B)よりも277±53%(n=3)高い密度でCD20を発現した。従って、CD20は、小型プレB細胞から未成熟B細胞への移行中に初めて発現し、成熟とともにCD20発現が増大し、次いで成熟B220hiプール中への循環B細胞の流入とともに減少する。
脾臓、血液、末梢リンパ節および腹腔において、圧倒的多数のIgM+またはB220+B細胞がCD20を発現した(図2C〜2F)。CD20hiB220lo細胞の小亜集団は、血液(9±1%、n=3)および脾臓(7±2%、n=3)のB細胞の間で観察された(図2Cおよび図2E)。脾臓におけるこれらのCD20hiB220lo細胞は、主に移行T1およびT2のB細胞(図2H)であり、骨髄からの新規移出を示している可能性が高い。T1細胞(CD21loHSAhi)は、成熟B細胞よりも139±23%(n=3)高い密度でCD20を発現し、一方、T2細胞(CD21hiHSAhi)は、58±11%(n=3)高い密度でCD20を発現した。T1細胞(CD21−CD23−IgMhi)および辺縁帯B細胞(CD21+CD23−IgMhi)(Loderら(1999)J.Exp.Med.190:75)はまた、大多数の脾臓B細胞よりも高いレベルでCD20を発現した(図21)。少数のCD20−末梢B細胞が一部のマウスにおいて観察されたが、この数は代表的にはB220+細胞の2%未満であった。腹腔において、CD20は、CD5+およびCD5−B細胞の両方によって同様に発現された(図2F)。CD20は、試験したいずれの組織においても、白血球の他の亜集団によって検出可能なレベルで発現されなかった。従って、マウスCD20は、もっぱらB細胞によって発現され、発現は小型プレB細胞成熟中に遅れて開始した。
(実施例6)
(CD20の構造特性)
マウスおよびヒトのCD20を、マウスCD20と反応性のMB20−1モノクローナル抗体およびヒトCD20の細胞質エピトープと反応性のPB4モノクローナル抗体を用いて、表面標識したB細胞株からこれらの分子を沈殿させることによって比較した。マウスCD20は、非還元条件下でヒトCD20よりも速く移動したが、また、33,000および35,000のMrを有する少なくとも2つの異なる分子種としても移動した(図3A)。還元条件下では、マウスCD20は40,000および42,000のMrを有する少なくとも2つの同等に表示される分子種として移動した(図3A)。複数の細胞表面分子が、ヒトCD20で起きるように、マウスCD20と共沈した(Tedderら(1988)Molec.Immunol.25:1321;Deansら(1993)J.Immunol.151:4494)。PB4モノクローナル抗体は、CD20細胞外ドメインと反応するモノクローナル抗体よりも良好に、ヒトCD20と関連する分子を共沈させる。マウスにおけるCD20関連分子の共沈は、モノクローナル抗体の交差反応性に起因しなかった。なぜなら、ウエスタンブロット分析において、MB20−1モノクローナル抗体はマウスCD20とのみ反応し、CD20または他のタンパク質はCD20−/−B細胞の溶解物から沈殿しなかったためである(図3B)。予想外に、マウスCD20は、ホルボールミリスチルアセテート(PMA)処理後であっても、休止初代マウスB細胞、抗IgM抗体活性化B細胞もしくはLPS活性化B細胞、またはB細胞株において、ヒトB細胞(TedderおよびSchlossman(1988)J.Biol.Chem.263:10009;Genotら(1993)J.Immunol.151:71)とは異なり、主要なリンタンパク質ではなかった(図3C)。さらに、LPS芽細胞またはB細胞株におけるPMA誘導性のCD20リン酸化によって、ヒトCD20を特徴づける、CD20タンパク質Mrの速い種から遅い種への有意なシフトを生じなかった(TedderおよびSchlossman(1988)J.Biol.Chem.263:10009;Valentineら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:8085)。従って、マウスおよびヒトCD20は、多数の構造特性を共有するとともに、いくつかの異なる特性を有する。
(CD20の構造特性)
マウスおよびヒトのCD20を、マウスCD20と反応性のMB20−1モノクローナル抗体およびヒトCD20の細胞質エピトープと反応性のPB4モノクローナル抗体を用いて、表面標識したB細胞株からこれらの分子を沈殿させることによって比較した。マウスCD20は、非還元条件下でヒトCD20よりも速く移動したが、また、33,000および35,000のMrを有する少なくとも2つの異なる分子種としても移動した(図3A)。還元条件下では、マウスCD20は40,000および42,000のMrを有する少なくとも2つの同等に表示される分子種として移動した(図3A)。複数の細胞表面分子が、ヒトCD20で起きるように、マウスCD20と共沈した(Tedderら(1988)Molec.Immunol.25:1321;Deansら(1993)J.Immunol.151:4494)。PB4モノクローナル抗体は、CD20細胞外ドメインと反応するモノクローナル抗体よりも良好に、ヒトCD20と関連する分子を共沈させる。マウスにおけるCD20関連分子の共沈は、モノクローナル抗体の交差反応性に起因しなかった。なぜなら、ウエスタンブロット分析において、MB20−1モノクローナル抗体はマウスCD20とのみ反応し、CD20または他のタンパク質はCD20−/−B細胞の溶解物から沈殿しなかったためである(図3B)。予想外に、マウスCD20は、ホルボールミリスチルアセテート(PMA)処理後であっても、休止初代マウスB細胞、抗IgM抗体活性化B細胞もしくはLPS活性化B細胞、またはB細胞株において、ヒトB細胞(TedderおよびSchlossman(1988)J.Biol.Chem.263:10009;Genotら(1993)J.Immunol.151:71)とは異なり、主要なリンタンパク質ではなかった(図3C)。さらに、LPS芽細胞またはB細胞株におけるPMA誘導性のCD20リン酸化によって、ヒトCD20を特徴づける、CD20タンパク質Mrの速い種から遅い種への有意なシフトを生じなかった(TedderおよびSchlossman(1988)J.Biol.Chem.263:10009;Valentineら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:8085)。従って、マウスおよびヒトCD20は、多数の構造特性を共有するとともに、いくつかの異なる特性を有する。
(実施例7)
(CD20−/−B細胞における還元[Ca2+]i応答)
CD20−/−マウスにおける正常なB細胞成長にもかかわらず、CD20−/−マウス由来の脾臓B220+B細胞は、野生型B細胞と比較した場合、最適な濃度(40μg/mL;図4A)および最適以下の濃度(5μg/mL)の抗IgM抗体とIgMの連結後に、[Ca2+]i応答の低下を生じた。この迅速な[Ca2+]i応答の速度論は、CD20−/−B細胞において変化しなかった。しかしながら、最大[Ca2+]i増加の大きさは、CD20−/−B細胞において34±4%低く(p<0.001、n=9)、より遅い時点で観察された持続的増加のレベルも、同様に低下した。EGTAを用いた細胞外Ca2+のキレート化により、CD20−/−および野生型B細胞でのIgM架橋後に観察された[Ca2+]i増加の速度論および大きさが低下した。EGTA存在下での最大の[Ca2+]i応答の大きさは、野生型B細胞と比較して、CD20−/−B細胞において38±7%低かった(p<0.002、n=7)。
(CD20−/−B細胞における還元[Ca2+]i応答)
CD20−/−マウスにおける正常なB細胞成長にもかかわらず、CD20−/−マウス由来の脾臓B220+B細胞は、野生型B細胞と比較した場合、最適な濃度(40μg/mL;図4A)および最適以下の濃度(5μg/mL)の抗IgM抗体とIgMの連結後に、[Ca2+]i応答の低下を生じた。この迅速な[Ca2+]i応答の速度論は、CD20−/−B細胞において変化しなかった。しかしながら、最大[Ca2+]i増加の大きさは、CD20−/−B細胞において34±4%低く(p<0.001、n=9)、より遅い時点で観察された持続的増加のレベルも、同様に低下した。EGTAを用いた細胞外Ca2+のキレート化により、CD20−/−および野生型B細胞でのIgM架橋後に観察された[Ca2+]i増加の速度論および大きさが低下した。EGTA存在下での最大の[Ca2+]i応答の大きさは、野生型B細胞と比較して、CD20−/−B細胞において38±7%低かった(p<0.002、n=7)。
CD19誘導性の[Ca2+]i応答は、野生型B細胞と比較して、CD20−/−B細胞について有意に低かった(70±4%、p<0.001、n=5)(図4B)。より低い[Ca2+]i応答は、CD20−/−B細胞によるCD19発現の低下に起因しなかった(図4D)。EGTAを用いた細胞外Ca2+のキレート化により、野生型およびCD20−/−B細胞の両方におけるCD19誘導性の[Ca2+]i応答が大部分排除された。CD20−/−B細胞によるIgM連結またはCD19連結後の[Ca2+]i応答の低下は、おそらく内部Ca2+貯蔵または細胞外Ca2+濃度の相違に起因するものではなかった。なぜなら、タプシガルジン誘導性およびイオノマイシン誘導性の[Ca2+]i応答は、野生型B細胞におけるよりもCD20−/−B細胞において、平均してわずかに高かったためである(図4C)。このCD20−/−B細胞における[Ca2+]i応答の低下はまた、遺伝的バックグラウンドの相違に起因する可能性も低かった。CD20−/−マウスおよびそれらの野生型同腹仔を129系ES細胞から作製したが、少なくとも7世代の間C57BL/6マウスと戻し交配させた。コントロール実験において、IgM誘導性およびCD19誘導性[Ca2+]i応答は、もしC57BL/6、(C57BL/6×129)F1および129B細胞(n=4)について同一でなければ、類似していた。従って、CD20−/−マウスにおける[Ca2+]i応答の低下は、バックグラウンドの相違よりもむしろ、CD20機能の欠如に起因する可能性が高かった。CD19架橋後に観察される[Ca2+]i応答は主に膜貫通Ca2+フラックスに依存し、かつ、CD19誘導性[Ca2+]i応答はCD20−/−マウスにおいて有意に撹乱されたので、CD20機能は膜貫通Ca2+輸送にとって特に重要であり得る。
(実施例8)
(CD20−/−B細胞におけるシグナル伝達)
B細胞膜貫通シグナル伝達におけるCD20減少の影響を、IgM連結後の精製B細胞における総細胞タンパク質チロシンリン酸化を評価することによって調べた。チロシンリン酸化の総合レベルは、個々の実験における個々のマウス由来のB細胞間でいくつかのバリエーションが観察されたものの、CD20−/−および野生型同腹仔由来の休止脾臓B細胞において類似していた(図5A)。IgM連結後のタンパク質チロシンリン酸化もまた、CD20−/−および野生型同腹仔由来のB細胞において類似していた。Lynおよび他のSrcキナーゼ、PLCγ、CD19、BTK、およびMAPキナーゼを含む、IgMの下流の個々のシグナル分子のリン酸化もまた、CD20−/−および野生型同腹仔由来のB細胞において類似していた(図5B)。従って、CD20欠損により、基底のまたはIgM誘導性の膜貫通シグナル伝達が有意に変更された可能性は低かった。
(CD20−/−B細胞におけるシグナル伝達)
B細胞膜貫通シグナル伝達におけるCD20減少の影響を、IgM連結後の精製B細胞における総細胞タンパク質チロシンリン酸化を評価することによって調べた。チロシンリン酸化の総合レベルは、個々の実験における個々のマウス由来のB細胞間でいくつかのバリエーションが観察されたものの、CD20−/−および野生型同腹仔由来の休止脾臓B細胞において類似していた(図5A)。IgM連結後のタンパク質チロシンリン酸化もまた、CD20−/−および野生型同腹仔由来のB細胞において類似していた。Lynおよび他のSrcキナーゼ、PLCγ、CD19、BTK、およびMAPキナーゼを含む、IgMの下流の個々のシグナル分子のリン酸化もまた、CD20−/−および野生型同腹仔由来のB細胞において類似していた(図5B)。従って、CD20欠損により、基底のまたはIgM誘導性の膜貫通シグナル伝達が有意に変更された可能性は低かった。
(実施例9)
(インビボにおける抗CD20モノクローナル抗体によるB細胞の枯渇)
各IgGアイソタイプを代表する、12種類のマウス抗マウスCD20モノクローナル抗体を、インビボでB細胞に結合し、そしてこれらを枯渇させる能力について、評価した。各モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体アイソタイプとは無関係な特有の平均蛍光強度で、CD19+初代B細胞とインビトロで一律に反応した(図6A)。初代B細胞とのモノクローナル抗体の反応性を、モノクローナル抗体濃度の範囲にわたって評価したところ、ほとんどのモノクローナル抗体が、1〜10μg/mLの濃度で用いた場合に染色の飽和レベルに達した(図6B)。平均して、約0.5μg/mLのモノクローナル抗体濃度で、50%‐最大対数のモノクローナル抗体染色が達成された(矢印、図6B)。全てのモノクローナル抗体を0.5μg/mLで用いた場合、各モノクローナル抗体は、特有の低い平均蛍光強度から高い平均蛍光強度でCD19+初代B細胞と一律に反応した(図6C、表5)。同様の結果が、マウスCD20 cDNAをトランスフェクトしたプレB細胞株を、抗マウスIg二次抗体と共に用いて得られた。この分析に基づいて、MB20−1モノクローナル抗体は、最低の相対的親和性/結合活性(avidity)を有するモノクローナル抗体に相当し、一方、MB20−18モノクローナル抗体は、12種類全ての抗CD20モノクローナル抗体の最高レベルでB細胞および染色B細胞と強く反応した(表5)。従って、各モノクローナル抗体は、B細胞と特異的に反応し、そしてフローサイトメトリーで評価されるように妥当な結合特性を示した。
(インビボにおける抗CD20モノクローナル抗体によるB細胞の枯渇)
各IgGアイソタイプを代表する、12種類のマウス抗マウスCD20モノクローナル抗体を、インビボでB細胞に結合し、そしてこれらを枯渇させる能力について、評価した。各モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体アイソタイプとは無関係な特有の平均蛍光強度で、CD19+初代B細胞とインビトロで一律に反応した(図6A)。初代B細胞とのモノクローナル抗体の反応性を、モノクローナル抗体濃度の範囲にわたって評価したところ、ほとんどのモノクローナル抗体が、1〜10μg/mLの濃度で用いた場合に染色の飽和レベルに達した(図6B)。平均して、約0.5μg/mLのモノクローナル抗体濃度で、50%‐最大対数のモノクローナル抗体染色が達成された(矢印、図6B)。全てのモノクローナル抗体を0.5μg/mLで用いた場合、各モノクローナル抗体は、特有の低い平均蛍光強度から高い平均蛍光強度でCD19+初代B細胞と一律に反応した(図6C、表5)。同様の結果が、マウスCD20 cDNAをトランスフェクトしたプレB細胞株を、抗マウスIg二次抗体と共に用いて得られた。この分析に基づいて、MB20−1モノクローナル抗体は、最低の相対的親和性/結合活性(avidity)を有するモノクローナル抗体に相当し、一方、MB20−18モノクローナル抗体は、12種類全ての抗CD20モノクローナル抗体の最高レベルでB細胞および染色B細胞と強く反応した(表5)。従って、各モノクローナル抗体は、B細胞と特異的に反応し、そしてフローサイトメトリーで評価されるように妥当な結合特性を示した。
各抗マウスCD20モノクローナル抗体を、ヒトにおける抗CD20治療のために最初に4回投与される375mg/m2用量(Pressら(2001)Hematology:221〜240;Kaminskiら(1993)N.Engl.J.Med.329:459〜465;Weiner(1999)Semin.Oncol.26:43〜51;Onrustら(1999)Drugs 58:79〜88;McLaughlinら(1998)Oncology 12:1763〜1769)よりも約10倍低い用量に相当する単回用量である250μg/マウスで、マウスに投与した(表7)。これらの条件下で、複数のモノクローナル抗体は、末梢B細胞数に対して強力なかつ持続性の効果を有したが、一方、他のモノクローナル抗体は、異質のインビボ効果を有した(図7)。モノクローナル抗体誘導性のB細胞枯渇(2日目までには循環から、そして7日目までには脾臓から)の有効性は、モノクローナル抗体アイソタイプと密接に相関し(表5、図7Aおよび図7B)、IgG2a>IgG1>IgG2b>IgG3であった。MB20−11および他のIgG2aモノクローナル抗体(MB20−6および−16)は、95%を超える血液B細胞および約93%の脾臓B細胞を枯渇させた。わずかな残りの末梢B細胞は、骨髄から出現する未成熟細胞を主に表現型的に示した。このMB20−11モノクローナル抗体は、わずか0.5μg/マウスを単回用量として投与した場合、有意な数の循環B細胞を枯渇させたが、一方、7日目までに脾臓B細胞を有意に枯渇させるには、5倍高いmAb用量の2.5μg/マウスを必要とした(図7C)。MB20−11モノクローナル抗体の単回投与により、モノクローナル抗体処置の1時間以内に循環B細胞が枯渇し、B細胞が循環および脾臓で再増殖を開始する前の約57日間、耐久的効果を有したという研究結果も同じく印象的であった(図7D)。対照的に、いずれのモノクローナル抗体も、CD20−/−マウスに投与した場合は有意な効果を有さず、そしてアイソタイプコントロールモノクローナル抗体を同一条件下で投与しても、B細胞数に影響を及ぼさなかった(図7)。同様に、循環および組織のThy1.2+T細胞数は、B細胞に限定的なCD20発現と一致して、抗CD20モノクローナル抗体処置マウスにおいて不変であった(図7A)。
(実施例10)
(B細胞枯渇におけるFcvRの役割)
抗CD20モノクローナル抗体処置によるB細胞枯渇における先天性免疫系の役割を、FcγR欠損マウスを用いて評価した(Takaiら(1994)Cell 76:519〜529)。マウスエフェクター細胞は、IgGについて3つの異なるFcγRクラスである、高親和性FcγRI(CD64)、および低親和性FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)分子を発現する(RavetchおよびClynes(1998)Ann.Rev.Immunol.16:421〜432)。FcγRIおよびFcγRIIIは、それぞれのリガンド結合性γ鎖が共通のγ鎖(FcRγ)と結合する、ヘテロオリゴマー複合体である。FcRγ鎖発現は、マクロファージによる食作用およびNK細胞による細胞毒性を含む、エフェクター機能のFcγRアセンブリおよびFcγRトリガに必要である(Takaiら(1994)Cell 76:519〜529)。高親和性FcγRIは、優先的に単量体IgG2a>IgG2b>IgG3/IgG1に結合し、一方、2つの低親和性レセプターは、重合体IgGの種々のアイソタイプに結合する(Fossati−Jimackら(2000)J.Exp.Med.191:1293〜1302)。FcγRIIIは、IgG2a>IgG1>IgG2b>>IgG3に結合する(Fossati−Jimackら(2000)J.Exp.Med.191:1293〜1302)。
(B細胞枯渇におけるFcvRの役割)
抗CD20モノクローナル抗体処置によるB細胞枯渇における先天性免疫系の役割を、FcγR欠損マウスを用いて評価した(Takaiら(1994)Cell 76:519〜529)。マウスエフェクター細胞は、IgGについて3つの異なるFcγRクラスである、高親和性FcγRI(CD64)、および低親和性FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)分子を発現する(RavetchおよびClynes(1998)Ann.Rev.Immunol.16:421〜432)。FcγRIおよびFcγRIIIは、それぞれのリガンド結合性γ鎖が共通のγ鎖(FcRγ)と結合する、ヘテロオリゴマー複合体である。FcRγ鎖発現は、マクロファージによる食作用およびNK細胞による細胞毒性を含む、エフェクター機能のFcγRアセンブリおよびFcγRトリガに必要である(Takaiら(1994)Cell 76:519〜529)。高親和性FcγRIは、優先的に単量体IgG2a>IgG2b>IgG3/IgG1に結合し、一方、2つの低親和性レセプターは、重合体IgGの種々のアイソタイプに結合する(Fossati−Jimackら(2000)J.Exp.Med.191:1293〜1302)。FcγRIIIは、IgG2a>IgG1>IgG2b>>IgG3に結合する(Fossati−Jimackら(2000)J.Exp.Med.191:1293〜1302)。
野生型マウスにおけるほぼ完全なB細胞枯渇(図7)とは対照的に、MB20−11モノクローナル抗体処置により、FcRγ−/−マウスにおいて循環B細胞数が4日間にわたってわずかに20〜35%だけ減少し(図8A)、7〜18日目は影響がなかった。さらに、MB20−11モノクローナル抗体処置により、FcRγ−/−マウスにおける脾臓B細胞数は、未成熟B細胞数の増加に主に起因して、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して事実上増加した(図8Bおよび図8C)。アイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体は、FcRγ−/−マウスにおいて有意な効果がなかった。FcγRI−/−マウスにおいて、MB20−11モノクローナル抗体は、1時間でB細胞数の初期減少を誘導したが、2日目に循環B細胞の不完全な枯渇を誘導した。MB20−11モノクローナル抗体処置により、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較してFcγR−/−マウスにおいて、7日目に21%の脾臓B細胞を残してB細胞を一部分のみ枯渇させた。対照的に、MB20−11モノクローナル抗体は、野生型マウス、FcγRII−/−マウスおよびFcγRIII−/−マウスにおいて7日目までに、循環および組織B細胞を95%以上枯渇させた。本明細書中で観察された結果と同じ結果が、2つの独立したFcγRIII−/−マウス系を用いて観察された(Bruhnsら(2003)Immunity 18:573〜581;Hazenbosら(1996)Immunity 5:181〜188)。IgG1 MB20−1およびIgG2b MB20−18モノクローナル抗体によるB細胞枯渇は、FcRγ鎖の欠損によっても同様に影響を受けた。循環B細胞はFcRγ−/−マウスのMB20−1モノクローナル抗体処置によって有意には減少しなかったが、一方、循環B細胞は野生型マウスにおいて枯渇した(図8D)。同様に、脾臓B細胞はFcRγ−/−マウスのMB20−1モノクローナル抗体処置によって有意には減少しなかったが、一方、脾臓B細胞数は野生型マウスにおいて93%減少した。循環B細胞は、FcRγ−/−マウスのMB20−18モノクローナル抗体処置によって有意に減少したが、野生型マウスで起こったのと同程度には減少しなかった(図8E)。しかしながら、脾臓B細胞はFcRγ−/−マウスのMB20−18モノクローナル抗体処置によって有意には減少しなかったが、一方、脾臓B細胞数は野生型マウスにおいて74%減少した。従って、抗CD20モノクローナル抗体治療は、主としてFcRγ鎖発現を必要とする経路を介してB細胞を枯渇させた。
(実施例11)
(B細胞枯渇におけるCの役割)
C活性化は、抗CD20モノクローナル抗体治療の間のB細胞枯渇の主要なメカニズムであると考えられているので、抗CD20モノクローナル抗体処置によるB細胞枯渇におけるCの役割を、C欠損マウス(Wesselsら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11490〜11494)およびC1q欠損マウス(Zhangら(1999)Immunity 10:323〜332)を用いて評価した。各抗CD20モノクローナル抗体のC活性化能力を、まずインビトロで評価した。細胞傷害性能力は抗体間で異なったにもかかわらず、Cの存在下において、ほとんどの抗CD20モノクローナル抗体が、ヨウ化プロピジウム取り込みをアイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体と比較することによって示されるように、有意なB細胞溶解を誘導した(図9A)。Cがなければ、抗CD20モノクローナル抗体のいずれも、これらのインビトロアッセイの間、B細胞のPI取り込みまたはアポトーシスを誘導しなかった。MB20−11モノクローナル抗体もまたインビトロにおける有意なC媒介性B細胞溶解の誘導に有効であったが、MB20−18モノクローナル抗体は、最も強力なC依存性のB細胞溶解を惹起した。しかしながら、インビトロでC依存性B細胞死滅を誘導する各モノクローナル抗体の能力は、インビボでB細胞を枯渇させる各モノクローナル抗体の能力と相関していなかった(図7B)。さらに、MB20−11モノクローナル抗体は、C3−/−およびC4−/−マウスにおいて、全ての血液B細胞および90%を超える脾臓B細胞を効率的に取り除いた(図9B)。この観察は、モノクローナル抗体アイソタイプ特異的ではなかった。なぜなら、MB20−1およびMB20−18モノクローナル抗体は、C3−/−および野生型マウスの両方において同程度に血液および脾臓B細胞を効率的に枯渇させたためである(図9Cおよび図9D)。従って、抗CD20モノクローナル抗体治療は、主としてFcγR依存性ならびにC3−、C4−およびC1q−非依存性のメカニズムを介して、B細胞を枯渇させる。
(B細胞枯渇におけるCの役割)
C活性化は、抗CD20モノクローナル抗体治療の間のB細胞枯渇の主要なメカニズムであると考えられているので、抗CD20モノクローナル抗体処置によるB細胞枯渇におけるCの役割を、C欠損マウス(Wesselsら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11490〜11494)およびC1q欠損マウス(Zhangら(1999)Immunity 10:323〜332)を用いて評価した。各抗CD20モノクローナル抗体のC活性化能力を、まずインビトロで評価した。細胞傷害性能力は抗体間で異なったにもかかわらず、Cの存在下において、ほとんどの抗CD20モノクローナル抗体が、ヨウ化プロピジウム取り込みをアイソタイプが適合したコントロールモノクローナル抗体と比較することによって示されるように、有意なB細胞溶解を誘導した(図9A)。Cがなければ、抗CD20モノクローナル抗体のいずれも、これらのインビトロアッセイの間、B細胞のPI取り込みまたはアポトーシスを誘導しなかった。MB20−11モノクローナル抗体もまたインビトロにおける有意なC媒介性B細胞溶解の誘導に有効であったが、MB20−18モノクローナル抗体は、最も強力なC依存性のB細胞溶解を惹起した。しかしながら、インビトロでC依存性B細胞死滅を誘導する各モノクローナル抗体の能力は、インビボでB細胞を枯渇させる各モノクローナル抗体の能力と相関していなかった(図7B)。さらに、MB20−11モノクローナル抗体は、C3−/−およびC4−/−マウスにおいて、全ての血液B細胞および90%を超える脾臓B細胞を効率的に取り除いた(図9B)。この観察は、モノクローナル抗体アイソタイプ特異的ではなかった。なぜなら、MB20−1およびMB20−18モノクローナル抗体は、C3−/−および野生型マウスの両方において同程度に血液および脾臓B細胞を効率的に枯渇させたためである(図9Cおよび図9D)。従って、抗CD20モノクローナル抗体治療は、主としてFcγR依存性ならびにC3−、C4−およびC1q−非依存性のメカニズムを介して、B細胞を枯渇させる。
(実施例12)
(単球はインビボにおいてB細胞枯渇を媒介する)
抗CD20モノクローナル抗体処置の枯渇能力は、モノクローナル抗体アイソタイプおよびFcγR発現と直接相関していたので、FcγR媒介性のB細胞枯渇に対するNK細胞、T細胞、およびマクロファージの寄与を決定した。リポソームカプセル化クロドロネートで処置することによってマクロファージを欠乏させたマウスは、MB20−11モノクローナル抗体処置の1時間後までに循環B細胞を有意には枯渇せず、7日間まで正常数の循環B細胞を有した(図10A)。同様に、クロドロネート処置マウスにおける脾臓B細胞数は、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して、7日目に39%だけ減少した(図10B)。CSF−1欠損(CSF−1op)に起因してマクロファージ亜集団が組織特異的に減少するマウス(Cecchiniら(1994)Development 120:1357〜1372)もまた、MB20−11モノクローナル抗体処置後の循環B細胞の除去が緩徐であり、7日目までに表現型的に成熟した脾臓B細胞の84%を枯渇したにすぎなかった(図10)。対照的に、機能的T細胞を欠く胸腺欠損ヌードおよびLAT−/−マウス(Zhangら(1999)Immunity 10:323〜332)は、96%を超える血液および脾臓B細胞を枯渇させた。同様に、抗CD20モノクローナル抗体処置により、NK細胞機能に欠陥のあるベージュマウスおよびパーフォリン−/−マウス(Kagiら(1994)Nature 369:31〜37)において、約95%の循環および脾臓B細胞が除去された(図10)。これらの研究結果により、CSF−1依存性および非依存性マクロファージサブセットの両方が、インビボにおけるCD20+B細胞の枯渇のための主要なエフェクター細胞であり、T細胞依存性、NK細胞依存性、およびパーフォリン依存性メカニズムを本質的に排除することを示す。
(単球はインビボにおいてB細胞枯渇を媒介する)
抗CD20モノクローナル抗体処置の枯渇能力は、モノクローナル抗体アイソタイプおよびFcγR発現と直接相関していたので、FcγR媒介性のB細胞枯渇に対するNK細胞、T細胞、およびマクロファージの寄与を決定した。リポソームカプセル化クロドロネートで処置することによってマクロファージを欠乏させたマウスは、MB20−11モノクローナル抗体処置の1時間後までに循環B細胞を有意には枯渇せず、7日間まで正常数の循環B細胞を有した(図10A)。同様に、クロドロネート処置マウスにおける脾臓B細胞数は、コントロールモノクローナル抗体処置同腹仔と比較して、7日目に39%だけ減少した(図10B)。CSF−1欠損(CSF−1op)に起因してマクロファージ亜集団が組織特異的に減少するマウス(Cecchiniら(1994)Development 120:1357〜1372)もまた、MB20−11モノクローナル抗体処置後の循環B細胞の除去が緩徐であり、7日目までに表現型的に成熟した脾臓B細胞の84%を枯渇したにすぎなかった(図10)。対照的に、機能的T細胞を欠く胸腺欠損ヌードおよびLAT−/−マウス(Zhangら(1999)Immunity 10:323〜332)は、96%を超える血液および脾臓B細胞を枯渇させた。同様に、抗CD20モノクローナル抗体処置により、NK細胞機能に欠陥のあるベージュマウスおよびパーフォリン−/−マウス(Kagiら(1994)Nature 369:31〜37)において、約95%の循環および脾臓B細胞が除去された(図10)。これらの研究結果により、CSF−1依存性および非依存性マクロファージサブセットの両方が、インビボにおけるCD20+B細胞の枯渇のための主要なエフェクター細胞であり、T細胞依存性、NK細胞依存性、およびパーフォリン依存性メカニズムを本質的に排除することを示す。
(実施例13)
(モノクローナル抗体配列決定分析)
CD20は、分子の比較的小さな部分のみが細胞表面上に発現するという点で、大多数のBリンパ球細胞表面分子の中でも固有であり、約42アミノ酸であると推定される。従って、ほとんどの抗CD20モノクローナル抗体は、主に、空間的制約によって他の抗CD20モノクローナル抗体の結合をブロックする。ほとんどの抗CD20モノクローナル抗体がCD20タンパク質上の同一ではないにしても類似した領域またはエピトープに結合するという印象を残しているが、それはまだ示されていない。さらに、タンパク質抗原と、これらの抗原上の特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体の間の相互作用は複雑であり、かつ、各モノクローナル抗体およびその特定のアミノ酸配列にほぼ固有である。抗原および抗体の相互作用におけるこの複雑性のレベルは、ほとんどの外来抗原に対する多様な抗体レパートリーの生成に寄与する。しかしながら、抗CD20抗体多様性の限界は、マウスがCD20を自己抗原としても発現するという事実によって課される。従って、正常な状況下では、マウスは、ヒトCD20上に存在しておりマウスCD20とも共通である抗原決定基と反応性の抗体を生成しない。なぜなら、これらのモノクローナル抗体は自己反応性であるためである。従って、正常なマウスで生成された抗CD20モノクローナル抗体は、ヒトCD20上に存在し、かつヒトCD20に固有の、限定されたエピトープに結合する可能性がある。
(モノクローナル抗体配列決定分析)
CD20は、分子の比較的小さな部分のみが細胞表面上に発現するという点で、大多数のBリンパ球細胞表面分子の中でも固有であり、約42アミノ酸であると推定される。従って、ほとんどの抗CD20モノクローナル抗体は、主に、空間的制約によって他の抗CD20モノクローナル抗体の結合をブロックする。ほとんどの抗CD20モノクローナル抗体がCD20タンパク質上の同一ではないにしても類似した領域またはエピトープに結合するという印象を残しているが、それはまだ示されていない。さらに、タンパク質抗原と、これらの抗原上の特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体の間の相互作用は複雑であり、かつ、各モノクローナル抗体およびその特定のアミノ酸配列にほぼ固有である。抗原および抗体の相互作用におけるこの複雑性のレベルは、ほとんどの外来抗原に対する多様な抗体レパートリーの生成に寄与する。しかしながら、抗CD20抗体多様性の限界は、マウスがCD20を自己抗原としても発現するという事実によって課される。従って、正常な状況下では、マウスは、ヒトCD20上に存在しておりマウスCD20とも共通である抗原決定基と反応性の抗体を生成しない。なぜなら、これらのモノクローナル抗体は自己反応性であるためである。従って、正常なマウスで生成された抗CD20モノクローナル抗体は、ヒトCD20上に存在し、かつヒトCD20に固有の、限定されたエピトープに結合する可能性がある。
ほとんどのタンパク質抗原に対して生成され得る抗体の多様なレパートリーとは対照的に、マウスの近交系は、著しく均質な抗体を生成することによって、ハプテンまたは構造的に単純な抗原に反応する場合が多い(BlierおよびBothwell(1988)Immunol.Rev.105:27〜43)。制限された体液性応答の最たる例の1つは、(4−ヒドロキシ−3−ニトロフェニル)アセチル(NP)ハプテンに対するC57BL/6(Ighb)マウスの応答である(ImanishiおよびMakela(1975)J.Exp.Med.141:840〜854)。タンパク質キャリアと連結したNPで免疫したC57BL/6マウスは、異常なλ1軽鎖を担持する血清抗体を生成し、一方、キャリアタンパク質単独での免疫は、λ1抗体もλ1+B細胞も事実上誘発しない(ImanishiおよびMakela(1975)前出; MakelaおよびKarjalainen(1977)Immunol.Rev.34:119〜138;Rethら(1978)Eur.J.Immunol.8:393〜400;Rethら(1979)Eur.J.Immunol.9:1004〜1013;Karjalainenら(1980)J.Immunol.125:313〜317;WeissおよびRajewsky(1990)J.Exp.Med.172:1681〜1689;Jacobら(1991)J.Exp.Med.173:1165〜1175;CumanoおよびRajewsky(1986)EMBO J.5:2459〜2466)。抗NP応答の初期(免疫後4〜8日間)に、大部分の抗原活性化λ1+B細胞が、V186.2(V1S2)、C1H4、CH10、V23(V1S4)、24.8、V102(V1S7)、およびV583.5を含むVH遺伝子の大きなJ558(V1)ファミリーの選択メンバーと組み合わせて、種々のD遺伝子セグメントを発現する(JacobおよびKelsoe(1992)J.Exp.Med.176:679〜687;Bothwellら(1981)Cell 24:625〜637;Allenら(1988)EMBO J.7:1995〜2001;Jacobら(1993)J.Exp.Med.178:1293〜1307)。免疫10日後までに、大多数のλ1+B細胞が、YYGS(配列番号115)コンセンサスアミノ酸モチーフを含むチロシンリッチなCDR3領域をコードする、V1S2〜DFL16.1遺伝子再配列を発現する(WeissおよびRajewsky(1990)前出;Bothwellら(1981)前出;Jacobら(1993)前出;CumanoおよびRajewsky(1985)Eur.J.Immunol.15:512〜520;McHeyzer−Williamsら(1993)J.Exp.Med.178:295〜305)。λ1軽鎖と対になったV1S.2〜DFL16.1重鎖再配列は、標準的な抗NP B細胞抗原レセプターと称され(Rethら(1978)前出;Rethら(1979)前出)、NPに対するC57BL/6マウスの一次および二次体液性免疫応答を左右する。従って、これらの特異的抗体遺伝子セグメントの使用により、このモノクローナル抗体の抗原特異性が予測されると考えられている。
Ighbマウスにおける抗NP抗体応答の同質性(ImanishiおよびMakela(1975)前出)は、ホスホリルコリンに対するBALB/cマウスの応答(Crewsら(1981)Cell 25:59〜66);A系マウスにおいてp−アゾフェニルアルソン酸塩に対して生成される抗体(Pawlakら(1973)J.Exp.Med.137:22〜31);BALB/cおよびDBA/2マウスにおける2−フェニルオキサゾロン応答(Makelaら(1978)J.Exp.Med.148:1644〜1656);ならびにポリ(Glu60−Ala30−Tyr10)に対するBALB/cマウスの応答(ThezeおよびSomme(1979)Eur.J.Immunol.9:294〜301)を反映している。これらの抗体応答における低い遺伝分散の原因は、依然として不明のままである。単一V遺伝子セグメント(Siekevitzら(1983)Eur.J.Immunol.13:123〜132)またはIgh対立遺伝子(Siekevitzら(1982)Eur.J.Immunol.12:1023〜1032)に対する抗体応答制限の関係は、相同なV(D)J再配列を担持する少数のB細胞クローンの増殖をもたらす抗原相補性に対して、補助的な、単純で最良の解答を示す。この場合は、生殖細胞系列VH遺伝子のレパートリーの系特異的な相違が、構造的に類似の分子に対する抗体応答を調節する。あるいは、抗体応答の制限は、自己寛容によって(Manserら(1987)Immunol.Rev.96:141〜162;Handeら(1998)Immunity 8:189〜198)、または突然変異性変化に対して確実に寛容性のV(D)J再配列を発現するリンパ球クローンに依存して(Manserら(1984)Science 226:1283〜1288)、制限され得る。このメカニズムにかかわらず、規定された構造に対する抗体応答は同質であり、かつ、抗体レパートリー内の限られた応答を反映し得、これはまた、抗体が、抗体の可変領域内で特定の保存アミノ酸によって媒介される分子相互作用が全く同じではないにしても、類似の相互作用を介して同一の標的抗原に結合する、という事実も反映し得る。標的抗原とのモノクローナル抗体の相互作用は、主として抗体分子の相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸によって媒介されるが、フレームワークアミノ酸もまた、抗原結合性活性にとって重要である。従って、構造的に類似の抗体は、同じ抗原または標的分子の領域に結合する可能性が高く、一方、異なるV領域を有する構造的に異なる抗体は、異なる分子相互作用を介して、抗原の異なる領域と相互作用する可能性が高い。
標的抗原の同じ領域に結合する構造的に類似の抗体は、標的抗原上の同じ分子部位に結合する可能性がより高いので、公開された抗ヒトCD20モノクローナル抗体のアミノ酸配列を試験した。1F5(Shanら(1999)前出)、B9E9(Schultzら(2000)前出)、2H7(米国特許第6,120,767号)、2B8(米国特許第5,843,439号)、1H4(Haismaら(1998)前出)、およびLeu−16(Wuら(2001)前出)モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖V領域は、アミノ酸配列が相同である(図11)。この保存のレベルは、これらのモノクローナル抗体の各々がヌクレオチドレベルでも類似しているという事実を反映する。これらの抗CD20モノクローナル抗体の重鎖を、V1S121*01遺伝子セグメントに由来するV領域、L16、Q52またはSP2遺伝子セグメントに由来するD領域、およびJ1またはJ2遺伝子セグメントのいずれかに由来するJ領域と、V(D)J遺伝子セグメントの類似の組み合わせによって生成させる(表1)。同様に、軽鎖を、J1*02またはJ5*01遺伝子セグメントのいずれかに由来するJ領域を有する、いずれかのV4−72*01遺伝子セグメントから生成させた。既知の抗ヒトCD20モノクローナル抗体間の同質性のレベルにより、これらのモノクローナル抗体の各々が、ヒトCD20上の類似かまたは同一の部位に結合していることが示唆される。
既知の抗CD20モノクローナル抗体間のアミノ酸配列の相同性のレベルを、抗ヒトCD20および抗マウスCD20モノクローナル抗体のより大きなパネルと比較することによって強調する。比較のために、まずこれらの既知の抗CD20モノクローナル抗体を、同種のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有する第2群の抗ヒトCD20モノクローナル抗体(HB20−03、−04および−25)と対比させた。重鎖および軽鎖V領域間の比較類似性を、図12に示すようにUPGMA系統樹(算術平均を用いた非加重対グループ法)を用いて視覚化した。これらの図において、系統樹分岐点間の水平距離は、配列関連性の尺度である。例えば、既知のマウス抗ヒトCD20モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖は、互いに最も類似していたHB20−03、−04および−25モノクローナル抗体の配列に対してよりも、さらに互いに類似していた。軽鎖V領域配列の中でも、1H4およびB9E9配列が最も類似していたが、2H7、1F5および2B8モノクローナル抗体配列についての配列にもかなり類似していた。同様に、HB20−3およびHB20−4モノクローナル抗体もかなり類似したアミノ酸配列を有したが、これらの配列は、HB20−25モノクローナル抗体の対応する配列との類似性が相対的に低かった。しかしながら、HB20−3、−4および−25モノクローナル抗体の軽鎖配列は、既知の抗CD20モノクローナル抗体の配列とは、より一層異なっていた。各モノクローナル抗体間の対になった重鎖および軽鎖の配列相同性を比較したところ、既知の抗CD20モノクローナル抗体と、HB20−3、−4および−25モノクローナル抗体の間の配列相同性のレベルは全く異なっていた(図12)。このことから、これらの2つの群のモノクローナル抗体は別個であり、かつ、異なる分子相互作用を介してヒトCD20に結合するかまたはこのCD20タンパク質上の別個の部位で結合する可能性が高いことが示される。これらのHB20−3、−4および−25モノクローナル抗体は、既知の抗CD20モノクローナル抗体の共通の特性とは別個の、共通の生物学的特性を有することもまた企図される。
既知の抗CD20モノクローナル抗体間のアミノ酸配列相同性のレベルを、抗ヒトCD20および抗マウスCD20モノクローナル抗体のより大きなパネルとの比較によってさらに示した。一般に、2B8、B9E9、1F5、1H4、およびLeu−16重鎖は、HB20−01、−02および−06モノクローナル抗体の重鎖と配列が類似していた(図13および図15)。配列類似性に基づき、これらの重鎖VoJセグメントを群A配列と称してきた(図13)。2H7モノクローナル抗体のアミノ酸配列は類似していたが、他の群A重鎖と相違していたので、この重鎖を群B重鎖と称した。HB20−03、−04および−25は構造的に類似しており、これらを群C重鎖と称した。HB20−05モノクローナル抗体重鎖もまた構造的に別個であり、これを群D重鎖と称した。抗マウスCD20モノクローナル抗体の多くは、構造的に類似の重鎖(MB20−08、−10、−18、−07、−02および−14)を共有しており、これらを群E重鎖と称した。MB20−11および−16モノクローナル抗体重鎖は、十分に異なっていたので群Fと表した。MB20−01および−13モノクローナル抗体は、他の全ての抗CD20モノクローナル抗体と構造的に異なった非常に多様な重鎖を用い、これらを群G重鎖と称した。これらの異なる重鎖アミノ酸配列の群は、各々の抗CD20重鎖の生成のための異なるV(D)J遺伝子セグメントの利用と、密接に相関した(表1)。従って、これらの既知の抗CD20モノクローナル抗体重鎖は、本明細書中に開示される大多数の抗CD20モノクローナル抗体重鎖とは構造的に異なっていた。
既知の抗CD20モノクローナル抗体間のアミノ酸配列相同性の著しい高さを、抗ヒトCD20および抗マウスCD20モノクローナル抗体のパネル間の軽鎖利用の比較によって、さらに強調した。2B8、B9E9、1F5、1H4、Leu−16および2H7軽鎖は、配列がかなり類似していたが、他の抗CD20モノクローナル抗体によって用いられる軽鎖とは異なっていた(図16および図18)。配列類似性に基づいて、これらの軽鎖を群A配列と称した(図16)。複数の抗マウスCD20モノクローナル抗体軽鎖のアミノ酸配列は最も類似していたが、群A配列と相違していたので、これらの軽鎖を群Bと称した。HB20−03、−04および−25は構造的に異なっており、これらを群C軽鎖と称した。HB20−01、−02および−06モノクローナル抗体は、群Eと称される類似の軽鎖を用いた。MB20−18およびMB20−01は構造的に異なった軽鎖を用い、従って、これらをそれぞれ群FおよびGと称した。これらの異なる軽鎖アミノ酸配列の群は、各々の抗CD20モノクローナル抗体の生成のための異なるVJ遺伝子セグメントの利用と、密接に相関した(表1)。従って、これらの既知の抗CD20モノクローナル抗体軽鎖は、本明細書中に開示される抗CD20モノクローナル抗体によって用いられる軽鎖とは構造的に異なっていた。
対になった重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の分析により、異なる抗CD20モノクローナル抗体は構造的に異なる群に分類され、従って、異なる分子相互作用を介してヒトまたはマウスCD20に結合することをさらに確認した。2B8、B9E9、1F5、1H4およびLeu−16モノクローナル抗体は、それぞれAAと称される、構造的に類似の重鎖および軽鎖を用いた(図19、表1)。2H7モノクローナル抗体重鎖は、他の既知の抗CD20モノクローナル抗体によって用いられる重鎖とは構造的に異なったが、類似の軽鎖と対を形成したので、このモノクローナル抗体をBAモノクローナル抗体として群化した。群CCモノクローナル抗体であるHB20−03、−04および−25は、構造的に異なる抗CD20モノクローナル抗体の固有のクラスを表す。同様に、固有の重鎖および軽鎖の利用、ならびに重鎖および軽鎖の種々の組み合わせを用いて達成される組み合わせの多様性により、他の抗CD20モノクローナル抗体の各々を、既知の抗CD20モノクローナル抗体とは構造的に別個のものとして分類することが可能になった(図19)。
(実施例14)
(抗CD20モノクローナル抗体結合密度およびB細胞枯渇)
CD20発現は、種々のリンパ腫タイプにおいて、ならびに個々の腫瘍試料の細胞間で全く異質であり、抗CD20モノクローナル抗体治療結果に影響を及ぼし得る(Smith(2003)Oncogene 22:7359〜7368)。代表的には、慢性リンパ性白血病細胞および小リンパ球性リンパ腫細胞は、より高いレベルでCD20を発現している濾胞性リンパ腫細胞よりも低いリツキシマブ応答速度に対応して、低レベルでCD20を発現する(McLaughlinら(1998)J.Clin.Oncol.16:2825〜2833)。従って、CD20密度は、B細胞に結合してそれらを枯渇のための標的にすることが可能な抗CD20モノクローナル抗体の数を決定するので、CD20発現密度は、抗CD20治療効力に影響を及ぼす重要な要因であり得る。CD20発現密度が治療効力に影響を及ぼすか否かを評価するために、および、密度変化がB細胞枯渇に影響を及ぼす程度を決定するために、ヘテロ接合CD20+/−マウスを高用量(250μg)および低用量(10μg)のMB20−11モノクローナル抗体で処置した。CD20+/−マウス由来のB細胞は、野生型同腹仔で検出される半分の密度でCD20を発現する。高い抗CD20モノクローナル抗体用量では、野生型またはハプロ不全のCD20発現は、7日目までに循環または脾臓B細胞枯渇に検出可能な影響を及ぼさず、93〜97%のB細胞が脾臓から取り除かれた(図20Aおよび図20B)。対照的に、低用量の抗CD20モノクローナル抗体は、7日目までに野生型マウスから93〜98%の循環および脾臓B細胞を効率的に枯渇させたが、CD20+/−マウスからはわずかに30〜41%の循環または脾臓B細胞を除去したにすぎなかった(図20Aおよび図20B)。従って、抗CD20モノクローナル抗体処置の有効性は、CD20のB細胞発現をわずかに50%減少させることによって、有意に変化した。さらに、標的B細胞の表面に結合する抗CD20モノクローナル抗体の密度は、特により低いモノクローナル抗体濃度であった場合、細胞表面のCD20密度によって大いに影響を受けた。
(抗CD20モノクローナル抗体結合密度およびB細胞枯渇)
CD20発現は、種々のリンパ腫タイプにおいて、ならびに個々の腫瘍試料の細胞間で全く異質であり、抗CD20モノクローナル抗体治療結果に影響を及ぼし得る(Smith(2003)Oncogene 22:7359〜7368)。代表的には、慢性リンパ性白血病細胞および小リンパ球性リンパ腫細胞は、より高いレベルでCD20を発現している濾胞性リンパ腫細胞よりも低いリツキシマブ応答速度に対応して、低レベルでCD20を発現する(McLaughlinら(1998)J.Clin.Oncol.16:2825〜2833)。従って、CD20密度は、B細胞に結合してそれらを枯渇のための標的にすることが可能な抗CD20モノクローナル抗体の数を決定するので、CD20発現密度は、抗CD20治療効力に影響を及ぼす重要な要因であり得る。CD20発現密度が治療効力に影響を及ぼすか否かを評価するために、および、密度変化がB細胞枯渇に影響を及ぼす程度を決定するために、ヘテロ接合CD20+/−マウスを高用量(250μg)および低用量(10μg)のMB20−11モノクローナル抗体で処置した。CD20+/−マウス由来のB細胞は、野生型同腹仔で検出される半分の密度でCD20を発現する。高い抗CD20モノクローナル抗体用量では、野生型またはハプロ不全のCD20発現は、7日目までに循環または脾臓B細胞枯渇に検出可能な影響を及ぼさず、93〜97%のB細胞が脾臓から取り除かれた(図20Aおよび図20B)。対照的に、低用量の抗CD20モノクローナル抗体は、7日目までに野生型マウスから93〜98%の循環および脾臓B細胞を効率的に枯渇させたが、CD20+/−マウスからはわずかに30〜41%の循環または脾臓B細胞を除去したにすぎなかった(図20Aおよび図20B)。従って、抗CD20モノクローナル抗体処置の有効性は、CD20のB細胞発現をわずかに50%減少させることによって、有意に変化した。さらに、標的B細胞の表面に結合する抗CD20モノクローナル抗体の密度は、特により低いモノクローナル抗体濃度であった場合、細胞表面のCD20密度によって大いに影響を受けた。
(実施例15)
(MB20−11モノクローナル抗体結合および細胞表面CD20発現)
細胞表面のCD20発現密度は、抗CD20治療効力のための重要な要因である(Smith(2003)前出)。従って、患者をG−またはGM−CSFで処置するなど、治療中にCD20発現をアップレギュレートして、抗CD20モノクローナル抗体効力をインビボで高めようとする試みがなされてきた。しかしながら、CD20アップレギュレーション以外のメカニズムが、観察されてきた効果の増強の原因である可能性が高い(RavetchおよびLanier(2000)Leukemia 16:693〜699;van der Kolkら(2002)Leukemia 16:693〜699)。本明細書において、MB20−11モノクローナル抗体が、インビボにおけるマウスB細胞の枯渇に非常に有効であることを立証してきた(図7〜10)。MB20−11モノクローナル抗体のインビボでの有効性は、IgG2aアイソタイプに由来するという事実に一部起因するようであるが、他の要素も治療効力に寄与する可能性が高い。従って、脾臓B細胞による細胞表面CD20発現に対するMB20−11モノクローナル抗体結合の影響を、インビトロで評価した。予想外に、37℃で培養B細胞にMB20−11モノクローナル抗体を結合させることにより、氷上に保持した細胞、または類似のもしくは異なるアイソタイプの他のMB20モノクローナル抗体と共にインキュベートした細胞と比較して、より多くのMB20−11モノクローナル抗体の長期間にわたる結合を誘導した(図21;データは示さず)。平均して、MB20−11モノクローナル抗体結合は、30分〜8時間にわたって97±29%(n=4、p<0.05)増加した(図21)。MB20−11モノクローナル抗体結合の経時的な増加は、低いモノクローナル抗体親和性に関連してはいないようであった。なぜなら、MB20−11モノクローナル抗体は、細胞表面上のCD20発現の増加を誘導しなかった他のMB20モノクローナル抗体と類似したモノクローナル抗体濃度で、染色の飽和レベルに達したためである(図6)。他の抗マウスCD20モノクローナル抗体はこの性質を示さなかったので(図21;データは示さず)、MB20−11モノクローナル抗体は、CD20上の固有の領域またはエピトープに結合し得る。CD20へのMB20−11モノクローナル抗体の結合は、B細胞上の細胞表面CD20発現の増加を誘導し得るか、または新生MB20−11モノクローナル抗体結合部位を露出する細胞表面CD20分子における高次構造変化を誘導し得る。
(MB20−11モノクローナル抗体結合および細胞表面CD20発現)
細胞表面のCD20発現密度は、抗CD20治療効力のための重要な要因である(Smith(2003)前出)。従って、患者をG−またはGM−CSFで処置するなど、治療中にCD20発現をアップレギュレートして、抗CD20モノクローナル抗体効力をインビボで高めようとする試みがなされてきた。しかしながら、CD20アップレギュレーション以外のメカニズムが、観察されてきた効果の増強の原因である可能性が高い(RavetchおよびLanier(2000)Leukemia 16:693〜699;van der Kolkら(2002)Leukemia 16:693〜699)。本明細書において、MB20−11モノクローナル抗体が、インビボにおけるマウスB細胞の枯渇に非常に有効であることを立証してきた(図7〜10)。MB20−11モノクローナル抗体のインビボでの有効性は、IgG2aアイソタイプに由来するという事実に一部起因するようであるが、他の要素も治療効力に寄与する可能性が高い。従って、脾臓B細胞による細胞表面CD20発現に対するMB20−11モノクローナル抗体結合の影響を、インビトロで評価した。予想外に、37℃で培養B細胞にMB20−11モノクローナル抗体を結合させることにより、氷上に保持した細胞、または類似のもしくは異なるアイソタイプの他のMB20モノクローナル抗体と共にインキュベートした細胞と比較して、より多くのMB20−11モノクローナル抗体の長期間にわたる結合を誘導した(図21;データは示さず)。平均して、MB20−11モノクローナル抗体結合は、30分〜8時間にわたって97±29%(n=4、p<0.05)増加した(図21)。MB20−11モノクローナル抗体結合の経時的な増加は、低いモノクローナル抗体親和性に関連してはいないようであった。なぜなら、MB20−11モノクローナル抗体は、細胞表面上のCD20発現の増加を誘導しなかった他のMB20モノクローナル抗体と類似したモノクローナル抗体濃度で、染色の飽和レベルに達したためである(図6)。他の抗マウスCD20モノクローナル抗体はこの性質を示さなかったので(図21;データは示さず)、MB20−11モノクローナル抗体は、CD20上の固有の領域またはエピトープに結合し得る。CD20へのMB20−11モノクローナル抗体の結合は、B細胞上の細胞表面CD20発現の増加を誘導し得るか、または新生MB20−11モノクローナル抗体結合部位を露出する細胞表面CD20分子における高次構造変化を誘導し得る。
(実施例16)
(HB20−3、−4および−25モノクローナル抗体の結合密度)
モノクローナル抗体結合密度は、インビボにおける最適な抗CD20モノクローナル抗体媒介性のB細胞枯渇にとって重要であり(図20)、これは、より高い結合密度でB細胞に結合するモノクローナル抗体ほど、治療的に有効であり得ることを示す。このMB20−18モノクローナル抗体は、特にモノクローナル抗体濃度が限定されていた場合、MB20群のモノクローナル抗体の最高密度でB細胞の表面に結合した(図6)。これは、インビボにおけるB細胞枯渇のための他のIgG2b抗CD20モノクローナル抗体の中でもとりわけMB20−18モノクローナル抗体の特有の有効性に寄与している可能性がある(図7B)。それらのアミノ酸配列における有意差に基づいて、群CCのHB20−3、−4および−25モノクローナル抗体(表1)が、既知の抗CD20モノクローナル抗体の共通の特性とは別個の生物学的特性を共有していることが企図される(図12)。これらの差異の中で、HB20−3、−4および−25モノクローナル抗体は、間接的免疫蛍光染色アッセイにおいて既知の抗CD20モノクローナル抗体よりも有意に高いレベルでCD20を発現している、初代B細胞およびBリンパ腫細胞株に結合した(図22)。平均して、これらのHB20−3、−4および−25モノクローナル抗体は、1F5、B9E9および1H4モノクローナル抗体よりも3.7倍高いレベルで、ヒト血液B細胞に結合した(表6)。同様に、これらのHB20−3、−4および−25群のモノクローナル抗体は、1F5、B9E9および1H4群のモノクローナル抗体よりも、B細胞株であるRaji、BJABおよびDHL−4に、それぞれ4.5倍、3.1倍および4.3倍高いレベルで結合した。初めて記載された抗CD20モノクローナル抗体であった、B1モノクローナル抗体(Stashenkoら(1980)J.Immunol.125:1678)がB細胞を染色すること、および他の公開された抗CD20モノクローナル抗体と比較した場合、高密度でB細胞に特徴的に結合することが、一貫して観察された(表6)。それでもなお、これらのHB20−3、−4および−25群のモノクローナル抗体は、B1モノクローナル抗体よりも高いレベルで初代B細胞およびB細胞株と反応した(表6)。具体的には、このHB20−3モノクローナル抗体は、B1モノクローナル抗体よりも、初代B細胞、Raji細胞、BJAB細胞およびDHL−4細胞に、それぞれ69%、130%、71%および57%高いレベルで結合した。従って、群CCモノクローナル抗体の固有の特性は、他の既知の抗CD20モノクローナル抗体と比較して、細胞表面CD20に対するその特徴的でない高い結合活性である。
(HB20−3、−4および−25モノクローナル抗体の結合密度)
モノクローナル抗体結合密度は、インビボにおける最適な抗CD20モノクローナル抗体媒介性のB細胞枯渇にとって重要であり(図20)、これは、より高い結合密度でB細胞に結合するモノクローナル抗体ほど、治療的に有効であり得ることを示す。このMB20−18モノクローナル抗体は、特にモノクローナル抗体濃度が限定されていた場合、MB20群のモノクローナル抗体の最高密度でB細胞の表面に結合した(図6)。これは、インビボにおけるB細胞枯渇のための他のIgG2b抗CD20モノクローナル抗体の中でもとりわけMB20−18モノクローナル抗体の特有の有効性に寄与している可能性がある(図7B)。それらのアミノ酸配列における有意差に基づいて、群CCのHB20−3、−4および−25モノクローナル抗体(表1)が、既知の抗CD20モノクローナル抗体の共通の特性とは別個の生物学的特性を共有していることが企図される(図12)。これらの差異の中で、HB20−3、−4および−25モノクローナル抗体は、間接的免疫蛍光染色アッセイにおいて既知の抗CD20モノクローナル抗体よりも有意に高いレベルでCD20を発現している、初代B細胞およびBリンパ腫細胞株に結合した(図22)。平均して、これらのHB20−3、−4および−25モノクローナル抗体は、1F5、B9E9および1H4モノクローナル抗体よりも3.7倍高いレベルで、ヒト血液B細胞に結合した(表6)。同様に、これらのHB20−3、−4および−25群のモノクローナル抗体は、1F5、B9E9および1H4群のモノクローナル抗体よりも、B細胞株であるRaji、BJABおよびDHL−4に、それぞれ4.5倍、3.1倍および4.3倍高いレベルで結合した。初めて記載された抗CD20モノクローナル抗体であった、B1モノクローナル抗体(Stashenkoら(1980)J.Immunol.125:1678)がB細胞を染色すること、および他の公開された抗CD20モノクローナル抗体と比較した場合、高密度でB細胞に特徴的に結合することが、一貫して観察された(表6)。それでもなお、これらのHB20−3、−4および−25群のモノクローナル抗体は、B1モノクローナル抗体よりも高いレベルで初代B細胞およびB細胞株と反応した(表6)。具体的には、このHB20−3モノクローナル抗体は、B1モノクローナル抗体よりも、初代B細胞、Raji細胞、BJAB細胞およびDHL−4細胞に、それぞれ69%、130%、71%および57%高いレベルで結合した。従って、群CCモノクローナル抗体の固有の特性は、他の既知の抗CD20モノクローナル抗体と比較して、細胞表面CD20に対するその特徴的でない高い結合活性である。
1F5モノクローナル抗体よりも初代B細胞およびB細胞株と高い密度で結合すること、ならびに高いレベルで反応することに加えて、HB20−3、HB20−4およびHB20−25は、重鎖CDR3およびCDR1領域中に、ならびに軽鎖CDR3領域中に、共通のアミノ酸モチーフを共有する。この共通のモチーフは、重鎖については図15において、そして軽鎖については図18において明らかである。例えば、この重鎖CDR3領域は、アミノ酸配列モチーフFYXYXXX1YGAX2XXYを含み、ここで、Xは任意のアミノ酸であり得、そしてここで、X1は任意のアミノ酸であり得、好ましくはYまたはSであり、そしてここで、X2は任意のアミノ酸であり得、好ましくはMまたはLであり、そしてここでFはフェニルアラニンであり、Yはチロシンであり、Gはグリシンであり、Aはアラニンであり、Mはメチオニンであり、Lはロイシンであり、そしてSはセリンである。
この重鎖CDR1領域は、アミノ酸配列モチーフNXXXXを含み、ここで、Xは任意のアミノ酸であり得、そしてNはアスパラギンである。
さらに、この軽鎖CDR3領域は、アミノ酸配列モチーフXHFWXX3XWXを含み、ここで、Xは任意のアミノ酸配列であり得、Hはヒスチジンであり、Fはフェニルアラニンであり、Wはトリプトファンであり、そしてX3は任意のアミノ酸であり得、好ましくはTまたはIであり、ここでTはトレオニンであり、そしてIはイソロイシンである。
(実施例17)
(抗CD20モノクローナル抗体の治療有効性)
2.5μg用量で静脈内投与したMB20−11モノクローナル抗体は、循環および組織B細胞を効率的に枯渇させたので(図7C)、皮下(s.c.)投与した類似の小用量の抗CD20モノクローナル抗体が、B細胞を同程度に枯渇させたか否かを決定した。圧倒的多数の循環および組織B細胞が、抗CD20モノクローナル抗体を静脈内または皮下のいずれかの5μg用量として投与したマウスにおいて枯渇した(図23Aおよび図23B)。リツキシマブは、通常375mg/m2用量でヒトに静脈内投与され、これは2,500μg/マウスの用量に相当する(表7)。マウスにおける効率的なB細胞枯渇は、単回5〜10μg用量のMB20−11モノクローナル抗体を皮下投与することによって得られ、この用量は、一般に患者に静脈内投与されるリツキシマブの量よりも250〜500倍低い量の抗体に相当する。最新のマウスにおける知見に基づいて、MB20−11モノクローナル抗体に治療上匹敵した抗CD20モノクローナル抗体は、ヒトに1.3〜2.6mgの皮下注射として投与した場合、循環および組織B細胞の両方を効率的に枯渇させ得た。
* 仮体重0.02kg。
# 仮体重65kg、体表面積として1.71m2。
リソース:www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htmが提供しているDose Calculator
前記のものは本発明の例証であって、本発明の限定と解釈されるべきではない。本発明は以下の特許請求の範囲によって規定され、この特許請求の範囲の中には特許請求の範囲の等価物が含まれる。
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