CN1802388B - Cd20特异抗体及使用它们的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性结合CD20的单克隆抗体和其抗原结合片段，以及包含它们的药物组合物。本发明进一步提供了如在消除B细胞的方法中或者在治疗B细胞疾病中使用单克隆抗体、抗原结合片段和药物组合物的方法。还提供了用于生产单克隆抗体的细胞、核酸和方法。

Description

CD20特异抗体及使用它们的方法 
联邦政府基金资助声明 
本发明是在美国国立健康研究院(National Institutes of Health)的国立癌症研究所(National Cancer Institute)的基金号为CA81776、CA96547、Al56363和CA54464的联邦政府基金资助下完成的。美国政府享有本发明的一定权利。 
相关申请信息 
本申请根据美国法典第35卷第119条(e)款(35U.S.C.§119(e))要求2003年5月9日申请的美国临时专利申请系列号60/469,451的优先权的权利，其在本文全文引入作为参考。 
发明领域
本发明涉及抗CD20的单克隆抗体以及制造和使用它们的方法。 
发明背景 
B淋巴细胞是体液免疫的起点，代表了相当大部分的造血恶性肿瘤并且有助于自身免疫。因此，由B细胞和它们的恶性对等物表达的细胞表面分子是免疫治疗的重要靶标。MS4A基因家族的B细胞特异成员CD20在未成熟和成熟B细胞以及它们的恶性对等物的表面表达(Tedder和Engel(1994)Immunol.Today 15：450-454)。 
对小鼠细胞系和组织中CD20转录本的有限分析表明小鼠CD20也是B细胞特异的(Tedder等，(1988)J.Immunol.141：4388)。人和小鼠CD20cDNA都编码膜整合蛋白质，其疏水区足够长以便能够四次穿过膜(Tedder等，(1988)J.Immunol.141：4388；Tedder等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. USA.85：208；Einfeld等，(1988)EMBO J.7：711；Stamenkovic和Seed(1988)J.Exp.Med.167：1975)。小鼠和人CD20的氨基酸序列相当保守(73％)，特别是跨膜结构域和长的氨基末端和羧基末端胞质域(Tedder等，(1988)J.Immunol.141：4388)。胞质域富含丝氨酸和苏氨酸，具有多个用于磷酸化的共有序列。人CD20是非糖基化的，但是三个异形体(分子量(Mr)为33,000、35,000和37,000)是源自单一蛋白质在不同丝氨酸和苏氨酸残基上的差异磷酸化(Tedder等，(1988)Molec.Immunol.25：1321；Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.263：10009；Valentine等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：8085)。 
CD20在人B细胞活化、增殖和Ca2+转运的调节中起作用(Tedder等，(1985)J.Immunol.135：973；Bubien等，(1993)J.Cell Biol.121：1121)。CD20的抗体连接会产生跨膜信号导致增强CD20磷酸化(Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.263：10009)、诱导c-myc和B-myb癌基因表达(Smeland等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：6255；Golay等，(1992)J.Immunol.149：300)、诱导细胞蛋白质的丝氨酸/苏氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化(Deans等，(1993)J.Immunol.151：4494)、增加CD18、CD58和MHC II类分子的表达(White等，(1991)J.Immunol.146：846；Clark和Shu(1987)J.Immunol.138：720)以及发生能够诱导B细胞粘附的蛋白质酪氨酸激酶活化(Kansas和Tedder(1991)J.Immunol.147：4094)。CD20的连接促进Ca2+ 的跨膜转运(Bubien等，(1993)J.Cell Biol.121：1121)，但是通常不导致细胞内钙([Ca2+]i)3水平增加(Bubien等，(1993)J.Cell Biol.121：1121；Tedder等，(1986)Eur.J.Immunol.16：881；Golay等，(1985)J.Immunol.135：3795)，但广范交联之后除外(Deans等，(1993)J.Immunol.151：4494)。抗体与CD20的结合抑制B细胞在促分裂原刺激后由G1期进入S/G2+M阶段的细胞进程，并且抑制促分裂原诱导的B细胞分化和抗体分泌(Tedder等，(1985)J.Immunol.135：973；Tedder等，(1986)Eur.J.Immunol.16；Golay等，(1985)J.Immunol.135：3795；Golay和Crawford(1987)Immunology62：279)。广泛的CD20交联还可以影响程序性细胞死亡(Holder等，(1995) Eur.J.Immunol.25：3160；Shan等，(1998)Blood 91：1644)。这些不同的观察可以通过这样一种发现部分地解释，该发现即CD20是一种寡聚复合物的成分，该寡聚复合物能够形成在细胞周期进展过程中激活的跨膜转运蛋白或Ca2+离子通道(Bubien等，(1993)J.Cell Biol.121：1121；Kanzaki等，(1995)J.Biol.Chem.270：13099；Kanzaki等，(1997)J.Biol.Chem.272：14733；Kanzaki等，(1997)J.Biol.Chem.272：4964)。尽管如此，据报道在CD20缺乏(CD20-/-)的小鼠品系中B细胞的发育和功能是正常的(O′Keefe等，(1998)Immunogenetics 48：125)。 
大多数的人B细胞谱系恶性肿瘤表达CD20(Anderson等，(1984)Blood63：1424)。基于抗CD20嵌合体或放射标记单克隆抗体的疗法已经用于非霍奇金淋巴瘤(Press等，(2001)Hematology：221-240；Kaminski等，(1993)N.Engl.J.Med.329：459-465；Weiner(1999)Semin.Oncol.26：43-51；Onrust等，(1999)Drugs 58：79-88；McLaughlin等，(1998)Oncology12：1763-1769)。临床研究表明抗CD20单克隆抗体治疗还改善类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血以及其它免疫介导的疾病的临床表现(Silverman和Weisman(2002)Arthritis Rheum.48：1484-1492；Edwards和Cambridge(2001)Rheumatology40：1-7)。 
采用竞争性假设解释抗CD20单克隆抗体的体内(in vivo)治疗效果。在一个模型中，CD20作为膜整合的靶标用于通过天然免疫系统的活化或效应子机制的启动产生单克隆抗体介导的B细胞消除(Reff等，(1994)Blood83：435-445；Maloney等，(1997)Blood 90：2188-2195；Maloney等，(1997)J.Clin.Oncol.15：3266-3274)。 
利妥希玛(Rituximab)是一种嵌合体人IgG1抗人CD20单克隆抗体，它能够高效诱导补体(C)激活的经典途径和对新鲜分离的淋巴瘤细胞和B细胞系的补体依赖的细胞毒性(Reff等，(1994)Blood 83：435-445；Golay等，(2001)Blood 98：3383-3389；Cragg等，(2003)Blood 101：1045-1052；DiGaetano等，(2003)J.Immunol 171：1581-1587；Bellosillo等，(2001)Blood98：2771-2777)。利妥希玛还在病人(van der Kolk等，(2001)Br.J.Hematol. 115：807-811)和灵长类(Kennedy等，(2003)Blood 101：1071-1079)体内激活补体。此外，包括CD59在内的补体调节蛋白在肿瘤细胞中的表达与抗CD20治疗的抗性相关(Golay等，(2001)Blood 98：3383-3389；Treon等，(2001)J.Immunotherapy 24：263-271)。虽然许多人认为补体依赖的细胞毒性是利妥希玛抗体在体外( in vitro)和体内消除人淋巴瘤细胞中所使用的主要途径(Golay等，(2001)Blood 98：3383-3389；Cragg等，(2003)Blood101：1045-1052；Di Gaetano等，(2003)J.Immunol 171：1581-1587；Golay等，(2000)Blood 95：3900-3908；Di Gaetano等，2001)Br.J.Hematol.114：800-809；Weiner(2003)Blood 101：788)，但是其它人发现：根据肿瘤细胞对补体介导裂解的易感性以及补体抑制剂CD46、CD55和CD59在肿瘤细胞上的表达不能预测利妥希玛的治疗结果(Weng和Levy(2001)Blood98：1352-1357)。因为与临床使用的同种型不同的嵌合体抗CD20单克隆抗体不能在非人灵长类中消除正常的B细胞(Anderson等，(1997)Biochem.Soc.Transac.25：705-708)并且抗CD20单克隆抗体的抗肿瘤效应部分地依赖通过IgG的Fc受体(FcγR)的免疫激活(Clynes等，(2000)Nature Med.6：443-446)，所以其它的抗体依赖作用也是重要的。备选地，抗CD20单克隆抗体处理改变了跨膜Ca2+转运和B细胞功能，这打乱了细胞周期进程(Tedder和Engel(1994)Immunol.Today 15：450-454)并且能够诱导B细胞的程序性细胞死亡(Shan等，(1998)Blood 91：1644-1652；Demidem等，(1997)Cancer Biother.Radiopharm.12：177-186)。 
因为在经历免疫治疗的人中开展机械研究是复杂的，所以很难在体内区分这些假设(Edwards和Cambridge(2001)Rheumatology 40：1-7)。此外对人类的研究主要集中在血液的变化上，而血液包含＜2％的骨髓外B细胞。因此，很难精确确定抗CD20治疗对大多数B细胞的作用，这些占大多数的B细胞存在于外周淋巴组织中。 
本领域需要改变B细胞(特别是如B细胞恶性肿瘤和自身免疫病的B细胞疾病中的B细胞)功能的改进试剂和方法。还需要与常规抗CD20单克隆抗体免疫反应特性不同的新的抗CD20单克隆抗体。 
发明概述 
本发明部分地基于与CD20反应的具有目的特性的新单克隆抗体的产生和鉴定。 
因此，在一个实施方案中，本发明提供了特异结合CD20的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段结合到B细胞的密度比一种或多种常规mAb如mAb 1F5结合到B细胞和/或它们的恶性对等物的密度高至少2倍。 
作为另一方面，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段与B细胞(和/或它们的恶性对等物)上CD20的结合导致在B细胞上与mAb或抗原结合片段结合的结合位点上调。 
作为进一步的方面，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段与选自HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的mAb结合同一抗原决定簇。在特定的实施方案中，mAb选自HB20-25和MB20-11。在其它实施方案中，抗原结合片段选自HB20-25和MB20-11的抗原结合片段。 
在另一方面，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段包含选自HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的mAb的重链CDR3区或者与HB20-3、HB20-4、HB20-25或MB20-11的重链CDR3区具有至少80％氨基酸序列相似性的重链CDR3区。 
在其它实施方案中，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段包含选自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的轻链CDR3区或者与HB20-3、HB20-4或HB20-25的轻链CDR3区具有至少80％氨基酸序列相似性的轻链CDR3区。 
在进一步的实施方案中，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段包含选自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的CDR3区或者与HB20-3、HB20-4或HB20-25的CDR3区具有至少80％氨基酸相似性的CDR3区。 
在进一步的实施方案中，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段包含选自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的CDR1、CDR2和CDR3区或者与HB20-3、HB20-4或HB20-25的CDR1、CDR2和CDR3分别具有至少80％氨基酸相似性的CDR1、CDR2和CDR3区。 
作为另一个方面，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段选自： 
(a)包含含有SEQ ID NO：3(HB20-3)、SEQ ID NO：5(HB20-4)、SEQ IDNO：9(HB20-25)或SEQ ID NO：21(MB20-11)重链可变区或者与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重链可变区的重链的mAb或抗原结合片段； 
(b)包含含有SEQ ID NO：31(HB20-3)、SEQ ID NO：33(HB20-4)或SEQID NO：37(HB20-25)轻链可变区或者与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的轻链可变区的轻链的mAb或抗原结合片段；和 
(c)包含根据(a)和(b)的重链和轻链的mAb或抗原结合片段。 
作为另一个方面，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段选自： 
(a)包含含有SEQ ID NO：3(HB20-3)重链可变区或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重链可变区的重链和含有SEQ ID NO：31(HB20-3)轻链可变区或者与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的轻链可变区的轻链的mAb或抗原结合片段； 
(b)包含含有SEQ ID NO：5(HB20-4)重链可变区或者与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重链可变区的重链和含有SEQ ID NO：33(HB20-4)轻链可变区或者与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的轻链可变区的轻链的mAb或抗原结合片段；和 
(c)包含含有SEQ ID NO：9(HB20-25)重链可变区或者与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重链可变区的重链和含有SEQ ID NO：37(HB20-25)轻链可变区或者与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的轻链可变区的轻链的mAb或抗原结合片段。 
在其它特定实施方案中，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段包含选自HB20-3(SEQ ID NO：3)、HB20-4(SEQ ID NO：5)、HB20-25(SEQ ID NO：9)和MB20-11(SEQ IDNO：21)的mAb的重链可变区。 
在进一步的实施方案中，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段包含选自HB20-3(SEQ ID NO：31)、HB20-4(SEQ ID NO：33)和HB20-25(SEQ ID NO：37)的mAb的轻链可变区。 
作为进一步的方面，本发明提供了特异结合小鼠CD20的mAb或抗原结合片段。 
本发明还提供了包含本发明mAb和抗原结合片段的药物组合物。 
作为一个实施方案，本发明提供了包含mAb或其抗原结合片段的药物组合物，其中mAb或其抗原结合片段与选自HB20-1、HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb特异结合同一抗原决定簇。 
本发明还提供了用于生产本发明mAb和抗原结合片段的细胞系。 
作为进一步的方面，本发明提供了消除哺乳动物受试者内B细胞的方法，包括以有效消除B细胞和/或它们的恶性对等物的量向哺乳动物受试者施用本发明的mAb或抗原结合片段或药物组合物。 
作为另一个进一步的方面，本发明提供了治疗B细胞疾病的方法，包括向患有B细胞疾病的哺乳动物受试者施用治疗有效量的能够特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段具有能够导致至少75％的循环B细胞和/或它们的恶性对等物被消除的125mg/m2或更低的治疗有效剂量范围。 
作为另一个进一步的方面，本发明提供了治疗B细胞疾病的方法，包括向患有B细胞疾病的哺乳动物受试者施用治疗有效量的本发明mAb或抗原结合片段或药物组合物。 
在前述方法的特定实施方案中，B细胞疾病是B细胞恶性肿瘤或自身免疫病。 
作为进一步的方面，本发明提供了治疗B细胞疾病的方法，包括向患有B细胞疾病的哺乳动物受试者施用治疗有效量的：(i)本发明mAb或抗原结合片段或药物组合物，和(ii)能够增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物。 
作为另一方面，本发明提供了产生特异结合CD20的mAb的方法，包括：(a)在足以引起抗体反应的条件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳动物；(b)从哺乳动物收集抗体产生细胞；(c)将抗体产生细胞与培养的无限增殖化细胞融合以形成产生单克隆抗体的杂交瘤细胞；(d)在足以产生单克隆抗体的条件下培养杂交瘤细胞；和(e)从培养物中回收特异结合CD20的单克隆抗体。 
作为另一个方面，本发明提供了产生特异结合CD20的mAb的方法，包括：(a)在足以引起抗体反应的条件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳动物；(b)从哺乳动物收集产生特异结合CD20的抗体的细胞；(c)从抗体产生细胞中分离免疫球蛋白编码基因；(d)将免疫球蛋白编码基因导入细胞以产生转化的细胞；(e)在足以使免疫球蛋白基因转录和翻译以及单克隆抗体产生的条件下培养转化的细胞；和(f)从培养物中回收特异结合CD20的单克隆抗体。 
本发明进一步提供了本发明核酸、载体、mAb或抗原结合片段或药物组合物用于消除B细胞(和/或它们的恶性对等物)和/或用于治疗B细胞疾病的用途。 
作为另一方面，本发明进一步提供了编码本发明mAb和抗原结合片段重链和轻链的分离的核酸。进一步提供了包含分离核酸的载体和细胞。 
本发明的这些方面和其它方面在本发明下面的描述中更加详细地阐 
附图简述 
图1A-1M图解说明Cd20基因的定向分布。图1A，编码Cd20基因3′末端的基因组克隆。图1B，含有外显子5-8(实心方形)的野生型Cd20的内含子-外显子的组织。外显子的编号基于人CD20结构(Tedder等，(1989)J.Immunol.142：2560-2568)。图1C，寻靶载体结构。图1D，同源重组后Cd20等位基因的结构，在外显子6中的EcoRV限制位点被删除了。图1E，来自两了野生型和四个CD20-/-的同窝小鼠的基因组DNA的Southern印迹分析，基因组DNA用EcoRV消化，转移至硝酸纤维素膜并且用图1D中所标出的5′DNA探针杂交。图1F，使用结合外显子6(EcoRV位点的5′端)和7的引物从野生型和CD20-/-的同窝小鼠基因组DNA的PCR扩增。G3PDH扩增作为阳性对照显示。图1G，从野生型和CD20-/-的同窝小鼠脾脏RNA产生的cDNA的PCR扩增。每个反应混合物包含一个与外显子3所编码序列杂交的有义链引物和与外显子6或Neor基因启动子序列杂交的两个反义引物。用外显子3和6的引物扩增的DNA长度为445bp，而用外显子3和Neo引物扩增一个749bp的片段。图1H，MB20-13单克隆抗体与CD20 cDNA转染的(粗线)或非转染的(虚线)300.19细胞或CHO细胞的反应性。细线代表单独用次级抗体或同种型对照单克隆抗体染色的CD20cDNA转染的细胞。免疫荧光染色通过流式细胞术分析显示。图1I来自CD20-/-或野生型同窝小鼠的脾细胞用MB20-7(使用藻红蛋白缀合的抗小鼠IgG2b抗体显色)和抗CD19(FITC缀合的)单克隆抗体免疫荧光染色的流式细胞术分析。通过方形描绘的象限表示为使用不反应的单克隆抗体对照确定的阴性和阳性细胞群体。图1H和图1I结果代表着从12个抗小鼠CD20单克隆抗体得到的结果。图1J，CD20-/-和野生型同窝小鼠中B淋巴细胞的分布。门内细胞群体对应着表4所述的细胞并且代表着使用10个同窝小鼠所得到的结果。图1K，CD20-/-B细胞的促细胞分裂原反应。来自CD20-/- 和野生型同窝小鼠的纯化脾脏B细胞(2×105/孔)与抗IgM F(ab′)2抗体片段、 抗IgM抗体+IL-4或者LPS培养。数值是三次重复培养的平均值(±SEM)并且代表4次独立实验的结果。图1L，通过同种型特异ELISA测定的6个CD20-/-(实心直方图)和野生型(空心直方图)同窝小鼠的平均(±SEM)血清Ig水平。图1M，T细胞依赖的体液免疫反应。在第0天和第21天，用DNP-KLH免疫2只CD20-/-(实心环，实线)和野生型(空心方形，虚线)小鼠，在指定的时间收集血清。通过同种型特异ELISA测定血清抗DNP抗体。显示平均的CD20-/-(实线)和野生型(虚线)抗体水平。 
图2A-2I显示在B细胞发育中CD20表达。图2A，使用MB20-7(粗线)或同种型对照(虚线)单克隆抗体对小鼠类淋巴母细胞系的免疫荧光染色。通过使用流式细胞术分析的双色免疫荧光染色测定来自野生型C57BL/6小鼠的骨髓(图2B)、血液(图2C)、外周淋巴结(PLN；图2D)、脾脏(图2E)和腹膜腔(图2F)的淋巴细胞单细胞悬液。图2G，用四色流式细胞术分析评价的骨髓B细胞亚群的CD20表达。祖B细胞鉴定为淋巴细胞中具有前向和侧向散射特性的CD43+B220lo细胞。前B细胞是IgM-CD43-B220lo细胞。根据相对的IgM和B220密度将未成熟和成熟CD43-B细胞分成3个部分(I、II和III)。使用同种型匹配的对照单克隆抗体作为阴性对照(斑点线)评价背景的荧光染色。图2H，如通过相对热稳定抗原(HAS)和CD21表达密度定义的T1、T2或成熟(M)脾脏B细胞的CD20表达。图2I，通过CD23表达和相对IgM和CD21密度定义的T1、T2、边缘区(MZ)和成熟(M)脾脏B细胞的CD20表达。所有结果是从≥3个两月龄野生型小鼠得到的典型结果。 
图3A-3C显示小鼠CD20和CD20-/-B细胞的生物化学特征。图3A，分别使用HB20-8(PB4；人CD20)和MB20-1(小鼠CD20)单克隆抗体从表面生物素化Raji(人)和A20(小鼠)B细胞系免疫沉淀的CD20(箭头)。显示了用同种型匹配对照单克隆抗体(C抗体)的免疫沉淀。在还原凝胶图中的垂直虚线表示平行电泳的各个凝胶的结果。图3B，CD20表达的Western印迹分析。将Raji(1×106个细胞/泳道)、A20和300.19 B细胞系或纯化小鼠脾脏B细胞(5×106个细胞/泳道)的裂解物在还原条件下煮沸，通过 SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上，然后用MB20-1单克隆抗体杂交。图3C，使用和不使用PMA孵育的原代B细胞和B细胞系中CD20的磷酸化。在无磷酸盐培养基中培养的A20细胞(2×107)、LPS活化的小鼠脾脏B细胞(2×107)和Raji细胞(1×107)用包含32PO4的培养基孵育90分钟。将每一培养物的一半用PMA(200ng/mL)孵育30分钟，然后用去污剂裂解细胞。 
图4A-4D显示在CD20-/-B细胞中改变的Ca2+反应。来自CD20-/-和野生型同窝小鼠的indo-1负载B细胞通过IgM(图4A)、CD19连接(图4B)或毒胡萝卜素(图4C)诱导的Ca2+反应。在1分钟(箭头)，在EGTA存在或不存在情况下，加入最适浓度的山羊抗IgM F(ab′)2抗体片段、抗CD19单克隆抗体或毒胡萝卜素。增加的indo-1荧光比值指示增加的[Ca2+]i。结果是至少6次实验的代表性结果。图4D，通过流式细胞术分析的使用藻红蛋白缀合的抗CD19单克隆抗体的免疫荧光染色评价来自CD20-/-(细线)和野生型(粗线)同窝小鼠脾细胞的CD19表达。虚线表示用对照单克隆抗体对野生型脾细胞的染色。 
图5A-5B显示CD20-/-和野生型同窝小鼠的纯化脾脏B细胞中蛋白质的酪氨酸磷酸化。图5A，B细胞(2×107/样品)用F(ab′)2抗IgM抗体片段孵育到达所显示的时间并用去污剂裂解。蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上并且用抗磷酸化酪氨酸(抗pTyr)抗体免疫印迹。将印迹膜洗掉探针并用抗SHP-1抗体重新杂交作为蛋白质上样量相同的对照。图5B，信号分子被CD20-/-B细胞的酪氨酸磷酸化。来自野生型和CD20-/-同窝小鼠的纯化脾脏B细胞用F(ab′)2抗小鼠IgM抗体(40μg/mL)刺激达所标明的时间。用去污剂裂解细胞并将裂解物用抗磷酸化酪氨酸抗体进行Western印迹分析以评价蛋白质的磷酸化。接着将印迹膜洗掉探针并用抗ERK2抗体重新杂交以证实样品间蛋白质上样量相同。对于每幅图显示了分子量标准(kDa)的迁移。所有结果是至少三次单独实验的代表性结果。 
图6A-6C显示抗CD20单克隆抗体与小鼠脾脏B细胞的反应性。图6A，用代表性抗CD20(实线)或同种型匹配对照(虚线)单克隆抗体(10μg/mL) 染色的CD19+细胞的荧光强度。图6B，用一段范围单克隆抗体浓度的抗CD20单克隆抗体染色的平均荧光强度(MFI)。箭头表示当使用0.5μg/mL时单克隆抗体染色的平均强度。图6C，用抗CD20(实线)或同种型匹配对照(虚线)单克隆抗体(0.5μg/mL)染色的CD19+细胞的荧光强度。在所有情况下，单克隆抗体染色通过使用PE缀合的同种型特异次级抗体的流式细胞术分析。结果是从≥3个实验所得到的代表性结果。 
图7A-7D显示体内B细胞消除。图7A，用MB20-11或同种型匹配对照单克隆抗体处理的野生型或CD20-/-小鼠血液(第2天)和脾脏(第7天)典型的B细胞消除，它是通过使用流式细胞术分析的免疫荧光染色确定的。数目表示门内B220+B细胞的百分数。图7B，用MB20或同种型对照单克隆抗体处理的≥2个野生型同窝小鼠后血液(第2天或第7天，每mL)和脾脏(第7天)B细胞的总数(±SEM)。标明了从MB20或同种型对照单克隆抗体处理小鼠所得到的平均值结果之间的显著性差异；＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。图7C，用MB20-11单克隆抗体以不同剂量(对于每个数据点≥2只小鼠)处理野生型同窝小鼠7天后血液和脾脏B细胞数(±SEM)。标明了未处理(0)和单克隆抗体处理小鼠之间的显著性差异；＊＊p＜0.01。图7D，用MB20-11(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体在第0天处理后野生型小鼠血液和脾脏B细胞数(±SEM)(每组≥5只小鼠)。在时间0之后所显示数值代表着在1小时内得到的数据。 
图8A-8E显示FcγR依赖的B细胞消除。图8A，在第0天用MB20-11(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理FcRγ-/-、FcγRI-/-、FcγRII-/-和FcγRIII-/-小鼠后血液B细胞的消除。数值表示在单克隆抗体处理之前(时间0)和之后1小时或2、4或7天后平均循环B细胞的数量(±SEM，每mL)(每个时间点≥5只小鼠)。图8B，在单克隆抗体处理7天后典型的脾脏B细胞消除。数字表示所显示的门内B220+淋巴细胞的百分数。图8C，用MB20-11(实心条)或同种型对照(空心条)单克隆抗体处理7天后平均脾脏B细胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)。数字表示与对照单克隆抗体处理的同窝小鼠相比用抗CD20单克隆抗体处理的小鼠内B220+淋巴细胞的平均相 对百分数。图8D，与在第0天用MB20-1(实心正方形)或同种型对照(空心正方形)单克隆抗体处理的野生型同窝小鼠相比，在第0天用MB20-1(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理的FcRγ-/-同窝小鼠的B细胞消除。在MB20-1或对照单克隆抗体处理FcRγ-/-同窝小鼠7天后典型的肾脏B细胞消除。数字表示B220+淋巴细胞的百分数。柱形图表示用MB20-1或同种型对照单克隆抗体处理FcRγ-/-(实心条)或野生型(空心条)小鼠7天后的平均脾脏B细胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)。图8E，与在第0天用MB20-18(实心正方形)或同种型对照(空心正方形)单克隆抗体处理的野生型同窝小鼠相比，在第0天用MB20-18(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理的FcRγ-/-同窝小鼠的血液和脾脏(第7天)B细胞的消除。柱状图表示用MB20-18或同种型对照单克隆抗体处理FcRγ-/-(实心条)或野生型(空心条)小鼠7天后的平均脾脏B细胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)。图8A-E，指出了在MB20或者同种型对照单克隆抗体处理小鼠之间的显著性差异；＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。 
图9A-9D显示体内B细胞消除是补体依赖的。图9A，MB20单克隆抗体对于脾脏B细胞的体外补体依赖细胞毒性。数值代表在≥3次实验中碘化丙啶阳性(Pl+)的B220+细胞的平均百分数(±SEM)。图9B，在第0天用MB20-11(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理C3-/-、C4-/-或C1q-/-小鼠后的B细胞消除。血液中的数值表示用单克隆抗体处理之前(时间0)和之后1小时或2、4或7天平均循环B细胞数量(±SEM，每mL)(每个时间点≥5只小鼠)。在MB20-11(实心条)和同种型对照(空心条)单克隆抗体处理7天后典型的脾脏B细胞频度和平均B细胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)。图9C-D，与在第0天用MB20-1或MB20-18(实心正方形)或同种型对照(空心正方形)单克隆抗体处理野生型小鼠相比，在第0天用MB20-1或MB20-18(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理的C3-/- 小鼠后血液和脾脏B细胞的消除。在MB20-1或对照单克隆抗体处理C3-/- 同窝小鼠7天后典型的脾脏B细胞消除。数字表示所标明门内B220+淋巴细胞的百分数。柱形图表示MB20-1或同种型对照单克隆抗体处理C3-/-(实 心条)或野生型(空心条)小鼠7天后平均脾脏B细胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)。图9A-D，指出了在MB20或者同种型对照单克隆抗体处理小鼠之间的显著性差异；＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。 
图10A-10B显示单核细胞介导的B细胞消除。如所示(箭头)用氯膦酸盐(CLOD)处理野生型小鼠以消除巨噬细胞，而其它小鼠具有白细胞亚群遗传缺陷。图10A，MB20-11(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理0天后血液B细胞的消除。对于氯膦酸盐处理的小鼠，单克隆抗体处理1小时和2、4和7天后确定血液B细胞数，其中垂直虚线指示单克隆抗体处理时间0。对于CSF1OP小鼠，由于这些小鼠个体小且有死亡危险，单克隆抗体处理1小时后未对循环的B细胞数进行定量。对于其他小鼠遗传型显示了在单克隆抗体处理1小时的时间点处的B细胞数。图10B，MB20-11(实心条)或同种型对照(空心条)单克隆抗体处理7天后代表性的流式细胞术分析和平均脾脏B细胞数(±SEM)(每组≥5只小鼠)。显示了同种型对照或MB20单克隆抗体处理细胞的平均结果之间的显著性差异； ＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。 
图11A和11B显示已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体的氨基酸序列比对(表1)。图11A，重链氨基酸编号和每个单克隆抗体V、D和J区编码序列起始端的指定是按照常规方法进行的(Kabat等，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest.U.S.Government Printing Office，Bethesda，MD)，其中氨基酸位置1-94和互补决定区CDR1和2由VH基因编码。破折号显示序列中所插入缺口以便对相似氨基酸序列进行最大程度比对。为了清楚显示在VH、D和J片段之间引入缺口。图11B，抗CD20单克隆抗体的轻链Vκ氨基酸序列分析。氨基酸编号和每个单克隆抗体编码序列起始端的指定是按照常规方法进行的(Kabat等，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest.U.S.Government Printing Office，Bethesda，MD)。将预测信号序列剪切位点之后的氨基酸编号为1。破折号显示序列中所插入缺口以便对相似氨基酸序列进行最大程度比对。为了清楚显示在Vκ和J片段序列之间引入缺口。 
图12描述显示于图11中的已知小鼠抗人CD20单克隆抗体所推导的单克隆抗体重链和轻链序列的UPGMA(使用算术平均数的不加权配对组方法(unweighted pair group method using arithmetic averages))树。为了比较的目的，显示了三种小鼠抗人CD20单克隆抗体，即HB20-03、HB20-04和HB20-25单克隆抗体。相对水平树枝长度是序列亲缘关系的量度。例如，已知小鼠抗人CD20单克隆抗体的重链和轻链彼此之间相比比它们与HB20-03、HB20-04和HB20-25单克隆抗体的序列相比更加相似，而HB20-03、HB20-04和HB20-25单克隆抗体的序列彼此最相似。在第三栏，在序列分析之前，将重链和轻链序列连接形成连续的H+L链序列。该分析表明已知的抗CD20单克隆抗体和HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体之间的重链和轻链的组合是不相关的。使用Geneworks版本2.0(IntelliGenetics，Inc.，Mountain View，CA)产生UPGMA树。 
图13显示了图11中所示的已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体(表1)所推导出的单克隆抗体重链V(D)J序列的氨基酸序列比较。数据显示为所推导出的单克隆抗体重链序列的UPGMA树。相对水平树枝长度是序列亲缘关系的量度。基于右侧所标明的序列相似性将重链分组(A-G)。 
图14A-14N显示能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体(表1)重链VH-D-JH接合序列的核苷酸和预测氨基酸序列。图14A，HB20-01、HB20-02和HB20-06的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和核苷酸序列(SEQ ID NO：2)；图14B，HB20-03的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)和核苷酸序列(SEQ ID NO：4)；图14C，HB20-04的氨基酸(SEQ ID NO：5)和核苷酸(SEQ ID NO：6)序列；图14D，HB20-05的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)和核苷酸序列(SEQ ID NO：8)；图14E，HB20-25的氨基酸序列(SEQ IDNO：9)和核苷酸序列(SEQ ID NO：10)；图14F，MB20-01和MB20-13的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)和核苷酸序列(SEQ ID NO：12)；图14G，MB20-02的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)和核苷酸序列(SEQ ID NO：14)；图14H，MB20-07的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)和核苷酸序列(SEQ ID NO：16)；图 14I，MB20-08的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)和核苷酸序列(SEQ IDNO：18)；图14J，MB20-10的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)和核苷酸序列(SEQ ID NO：20)；图14K，MB20-11的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)和核苷酸序列(SEQ ID NO：22)；图14L，MB20-14的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)和核苷酸序列(SEQ ID NO：24)；图14M，MB20-16的氨基酸序列(SEQ IDNO：25)和核苷酸序列(SEQ ID NO：26)；和图14N，MB20-18的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)和核苷酸序列(SEQ ID NO：28)。双下划线表示与5′PCR引物重叠的序列，并且由于使用冗余引物扩增每个序列所以该序列可以不同于实际DNA序列(表1)。在序列中用垂直条 
Figure G04816092719960328D000161
指定出V、D和J序列之间的邻近接合边缘。所推导出的与已知D区DNA序列同源的序列用单下划线表示。小写字母核苷酸显示接合边缘的核苷酸加入或体细胞高变的潜在位点。 
图15显示已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体重链VH-D-JH接合序列的氨基酸序列比对。相对于与其他单克隆抗体序列的同源性将每个单克隆抗体分组。所显示的序列相对等级次序基于与2B8(利妥希玛)单克隆抗体序列的亲缘关系。按照常规方法对重链氨基酸编号并指定每个单克隆抗体V、D和J区编码序列的起点(Kabat等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest.U.S.Government Printing Office，Bethesda，MD)，其中氨基酸位置1-94和CDR1和2由VH基因编码。圆点表示每个单克隆抗体之间是相同的以及全部单克隆抗体的共有氨基酸序列。破折号表示在序列中所插入的缺口以便对相似氨基酸序列进行最大化比对。为了清楚显示在VH和D片段之间的序列中引入缺口。为了清楚显示CDR区加框表示。 
图16显示图11所示的已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体所推导出的单克隆抗体轻链VJ序列的氨基酸序列比对。数据显示为所推导出的单克隆抗体轻链V和J序列的UPGMA树。相对水平树枝长度是序列亲缘关系的量度。 基于右侧所标明的序列相似性将轻链分组(A-G)。 
图17A-17N显示能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体(表1)轻链V-J序列的核苷酸和预测氨基酸序列。双下划线表示与5′PCR引物重叠的序列，并且由于使用冗余引物扩增每个序列所以该序列可以不同于实际DNA序列(表1)。图17A，HB20-01、HB20-02和HB20-06的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)和核苷酸序列(SEQ ID NO：30)；图17B，HB20-03的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)和核苷酸序列(SEQ ID NO：32)；图17C，HB20-04的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)和核苷酸序列(SEQ IDNO：34)；图17D，HB20-05的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)和核苷酸序列(SEQ ID NO：36)；图17E，HB20-25的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)和核苷酸序列(SEQ ID NO：38)；图17F，MB20-01的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)和核苷酸序列(SEQ ID NO：40)；图17G，MB20-02的氨基酸序列(SEQ IDNO：41)和核苷酸序列(SEQ ID NO：42)；图17H，MB20-03的氨基酸序列(SEQ ID NO：43)和核苷酸序列(SEQ ID NO：44)；图17I，MB20-07的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)和核苷酸序列(SEQ ID NO：46)；图17J，MB20-08的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)和核苷酸序列(SEQ ID NO：48)；图17K，MB20-10的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)和核苷酸序列(SEQ ID NO：50)；图17L，MB20-13的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)和核苷酸序列(SEQ IDNO：52)；图17M，MB20-14的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)和核苷酸序列(SEQ ID NO：54)；和图17N，MB20-18的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)和核苷酸序列(SEQ ID NO：56)。小写字母核苷酸显示接合边缘的核苷酸加入或体细胞高变的潜在位点。“N”表示序列中的核苷酸是不确定的并且因此相应氨基酸是未知的。 
图18显示已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体(表1)轻链VJ序列的氨基酸序列比对。相对于与其它单克隆抗体序列的同源性将每个单克隆抗体分组。所显示的序列相对等级次序基于与全部抗CD20单克隆抗体的共有轻链序列的亲缘关系。按照常规方法对轻链氨基酸编号并指定每个单克隆抗体V和J 区编码序列的起点(Kabat等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest.U.S.Government Printing Office，Bethesda，MD)。圆点表示每个单克隆抗体之间是相同的和全部单克隆抗体的共有氨基酸序列。破折号表示序列中所插入的缺口以便对相似氨基酸序列进行最大化比对。为了清楚显示在V和J片段的序列之间引入缺口。为了清楚显示CDR区加框表示。 
图19描述已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体所推导出的单克隆抗体重链和轻链序列的UPGMA分析。在序列分析之前将重链V(D)J和轻链(VJ)序列结合形成连续的H+L链序列。基于右侧所标明的重链和轻链之间的序列相似性(图13和图16)将重链和轻链对分组。 
图20A-B显示结合至B细胞表面的抗CD20单克隆抗体密度调控着抗CD20单克隆抗体诱导的B细胞消除效率。检测了杂合CD20+/-小鼠的B细胞消除并与野生型同窝小鼠相比较，在杂合CD20+/-小鼠中所表达的细胞表面CD20为正常密度的50％。用10或250μg MB20-11单克隆抗体(实心条)或者同种型匹配对照(空心条)静脉注射处理两组同窝小鼠(n≥3小鼠/组)，并在7天时通过流式细胞术定量血液(每mL)(图20A)和脾脏(总数)(图20B)的B220+B细胞数。数值表示为B细胞数平均值(±SEM)，并显示了与对照单克隆抗体处理的同窝小鼠相比在MB20-11单克隆抗体处理的同窝小鼠中剩余B细胞的百分数。指出了每组小鼠平均值之间的显著性差异； ＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。当使用250μg MB20-11单克隆抗体时能够有效消除CD20+/-和野生型同窝小鼠中循环B细胞和脾脏B细胞。然而，当使用10μgMB20-11单克隆抗体时，在CD20+/-小鼠中仅消除部分B细胞，而在野生型同窝小鼠中消除了绝大部分B细胞。 
图21A-21B显示MB20-11单克隆抗体与CD20的结合增加细胞表面CD20密度(图21A)。通过对纯化的小鼠脾脏B细胞进行间接免疫荧光染色显示增加的MB20-11单克隆抗体结合，在用荧光染料缀合的山羊抗小鼠IgG2a次级抗体染色之前，用同种型对照(C)或MB20-11单克隆抗体 (10μg/mL)将纯化的小鼠脾脏B细胞孵育所标明的时间，随后用流式细胞仪分析。对于0时间点，在洗涤和用次级抗体染色之前，在冰上将细胞与单克隆抗体孵育30分钟。图21B，与MB20-18单克隆抗体相比，MB20-11单克隆抗体结合细胞表面CD20的典型时间过程。每个值表示为如图21A中所描述的纯化脾脏B细胞荧光染色的平均荧光通道数目。这些结果代表在≥3次独立实验中所获得的结果。 
图22A-B显示HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体以比已知抗CD20单克隆抗体更高的密度结合细胞表面CD20。显示了人血液淋巴细胞(图22A)和Raji B类淋巴母细胞系(图22B)与1F5、HB20-3和B1抗CD20单克隆抗体的反应性(实线)或单独与次级抗体的反应性(虚线)。使用预先测定的饱和的且呈现最佳染色的浓度的抗CD20单克隆抗体：1F5为以1∶200稀释的腹水；HB20-3为HB20-3杂交瘤的组织培养上清液；或者为10μg/mL纯化单克隆抗体或者组织培养上清液的B1单克隆抗体。在所有情况下，使用PE缀合的同种型特异次级抗体通过流式细胞仪分析观察单克隆抗体染色。结果代表在≥3次实验中所获得的结果。 
图23A-23B显示静脉注射(图23A)或皮下注射(图23B)施用MB20-11单克隆抗体有效地在体内消除循环B细胞和组织B细胞。用MB20-11单克隆抗体以所示剂量皮下或静脉注射处理野生型小鼠。数值表示为通过流式细胞仪估计的第7天时血液(每mL)或者脾脏(总数)B220+B细胞数平均值(±SEM)(n≥2)。指出了每组小鼠平均值之间的显著性差异；＊p＜0.05， ＊＊p＜0.01。 
发明详述 
本发明部分地基于能够结合人CD20的一组单克隆抗体(mAb)的产生，其中与传统抗CD20 mAb(例如1F5或2B8)相比该组单克隆抗体具有独特的结合特性和其它特征。具体而言，本发明的mAb和抗原结合片段在分子水平能够与传统抗CD20抗体区别开来，例如通过轻链和/或重链可变区或可变区的特定片段如互补决定区(“CDR”)的核苷酸和氨基酸序列。 
在特定的实施方案中，本发明的mAb和抗原结合片段能够以比传统mAb更高的密度结合B细胞，该特性对于消除B细胞的方法、对于治疗或诊断方法或用作实验试剂(例如鉴定B细胞或纯化B细胞)是有利的。 
本发明还提供能够特异结合小鼠CD20的mAb和抗原结合片段。 
本发明还提供了从分离自CD20-/-哺乳动物(例如小鼠)的抗体产生细胞(例如B细胞)产生的抗CD20单克隆抗体。 
现在本发明描述有关附图，其中显示了本发明的优选实施方案。本发明能够以不同方式体现并且不应该解释为本发明局限于本文列出的实施方案。更确切地说，提供了这些实施方案以致于本公开能够彻底和全面并且完全地向本领域技术人员传递本发明的范围。例如，至于一个实施方案阐明的特征可以整合到另一个实施方案中，并且特定实施方案阐明的特征可以从那个实施方案中删除。此外，根据目前公开，文中所建议的对实施方案的多种变更和补充对于本领域技术人员是显而易见的，其不脱离目前的发明。 
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与该发明所属领域普通技术人员所通常理解相同的意义。在本发明描述中使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的并且不是旨在对本发明进行限制。 
如在本发明描述和后附权利要求书中所使用，单数形式“a”、“an”和“the”旨在也包括复数形式，除非在上下文中另外明确指出。   
所有公开、专利申请、专利和本文提到的其它文献全部整合作为参考。 
除非另外指出，可以使用标准方法用于本发明的抗体或其抗原结合片段生产、核酸序列操作、转化细胞生产等。此种技术对本领域技术人员是已知的。见例如SAMBROOK等，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第2版，(Cold Spring Harbor，NY，1989)；F.M，.AUSUBEL等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.，New York)。 
抗CD20mAb、抗原结合片段和细胞系
作为一方面，本发明提供了能够特异结合CD20的mAb和其抗原结合片段。如本文所使用，术语“特异结合CD20的mAb”和“抗CD20 mAb”和相似语句是可互换的。在特定实施方案中，mAb或抗原结合片段特异结合人CD20和/或小鼠CD20。mAb或抗原结合片段能够结合CD20蛋白质的任何区域，但是在代表性实施方案中其结合CD20的细胞外区域。 
如在本文所使用的多种语法形式的术语“抗体”或“抗体分子”指免疫球蛋白分子(包括IgG、IgE、IgA、IgM、IgD)和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分即包含抗体结合部位或互补位并能结合抗原的分子。“抗体结合部位”或“抗原结合部位”是特异结合抗原的包含重链和轻链可变区和高可变区(CDR)的抗体分子的结构部分。如本领域已知，抗体的特定特性涉及免疫球蛋白同种型。在代表性实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG2a、IgG1或IgG2b同种型分子。抗体或片段还可以来自包括鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等)和哺乳动物(例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫等)种的任何来源的物种。 
如本文所使用，术语“单克隆抗体”或“mAb”指从基本上同质的抗体群体得到的抗体，即群体中包含的单个抗体是相同的，除了少量存在的天然发生突变的可能性以外。mAb是高度特异的并且直接针对抗原上的单一抗原决定簇(即表位)。这种特性与多克隆抗体制品形成对照，多克隆抗体一般包括针对不同抗原决定簇的抗体。 
术语“抗体”和“mAb”在本文以最广的意义使用并且具体而言涵盖多特异抗体(例如双特异抗体)、裸抗体、抗体缀合物和抗体片段，只要它们表现出目的生物学活性即可。此外，术语“抗体”和“mAb”包含完整(即完全)免疫球蛋白分子或包含互补位的抗体的抗原结合片段，包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、双抗体、线形抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异抗体。 
单链Fv或“sFv”抗体片段包含抗体重链和轻链可变区，其中这些结构域存在于单一多肽链上。通常，Fv多肽还包含位于重链可变区和轻链可变区之间的多肽接头，它保证sFv能够形成目的结构用于抗原结合。对于 sFv的综述见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第133卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，269-315页(1994)。本领域描述了单链抗体的产生，见例如美国专利号5,260,203，其公开在本文整合作为参考。在生产单链抗体的一个代表性方法中，使用从所免疫动物的脾脏分离的RNA制备组合免疫球蛋白噬菌粒文库，并且通过内皮组织淘选选择表达适当抗体的噬菌粒。该方法相对常规杂交瘤技术的优点是能够产生大约104倍的抗体并且通过一轮进行筛选，并且通过在单链中组合H和L链产生了新的特异性，这进一步增加了发现适当抗体的机会。 
术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，其中片段包含与同一多肽链中的轻链可变区连接的重链可变区。接头太短以致于不允许在同一条链的两个结构域之间配对，通过这种接头迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。双抗体在本领域是已知的，见例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci90：6444-6448(1993)。 
如本文使用的词语“线形抗体”指包含能够形成一对抗原结合部位的一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的抗体。线形抗体可以是双特异性的或单特异性的并且更加详细描述于Zapata等，Protein Eng.8：1057-1062(1995)。 
已经开发了多种技术用于抗体片段的生产。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生的(见例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，这些片段可以通过重组核酸技术在转化宿主细胞中直接产生。例如，可以从大肠杆菌(E.coli)直接回收Fab′-SH片段并且化学连接形成F(ab′)2 片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。备选地，通过使用能够促进F(ab′)2分子装配的亮氨酸拉链GCN4形成了F(ab′)2。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离Fv、Fab或F(ab′)2片段。产生抗体片段的其它技术对于技术人员是显而易见的。 
如本文所公开，本发明代表性的mAb包括HB20-1、HB20-2、HB20-3、HB20-4、HB20-5、HB20-6、HB20-25、MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-6、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-13、MB20-14、MB20-16和MB20-18。HB20-1、HB20-2、HB20-3、HB20-4、HB20-5和HB20-6以前分别叫做HB13a、HB13b、HB13c、HB13d、HB13e和HB13f。 
本发明还包含本文明确公开的mAb和抗原结合片段的功能等效物，其中功能等效物与本文明确描述的抗体的相应链或区域相比具有基本相似的重链、轻链、重链可变区、轻链可变区和/或CDR1、CDR2和/或CDR3区核酸和/或氨基酸序列(如下面更详细的描述)并且特异地结合CD20，并且任选地表现出本文明确描述的抗体和抗体片段的一种或多种其它功能特性(例如结合密度、B细胞消除效率)。在一个例证性实施方案中，本发明的mAb和抗原结合片段与本文明确描述的mAb和抗原结合片段结合同一抗原决定簇(即表位)。 
对于技术人员而言，常规通过表位作图(没有过多的实验)确定一种抗体是否具有本文公开的单克隆抗体的特异性。例如核酸和/或氨基酸序列可以确定所述抗体的一种或多种重链和/或轻链CDR区或者重链和/或轻链可变区。在这些区域具有相同(或者功能等效)的氨基酸残基序列的抗体分子具有相同或相似结合特异性。评定和比较可变区和CDR区相似性以确定功能等效的方法是本领域技术人员已知的。 
确定一种单克隆抗体是否与本文所述抗体具有相同特异性的另一种方法是通过比较抗体互补位的三维结构(如通过基于氨基酸序列的计算机模型预测)。表位-抗体互补位之间的相互作用一般涉及四种力：范德瓦尔斯力(偶极-偶极相互作用)、氢键、疏水相互作用和离子(库仑)键。非共价结合稳定了抗体-抗原复合物并且将复合物维持在一起。相互作用是通过两个分子的三维结构确定的。因此，对抗体互补位、表位和/或表位-抗体互补位复合物的三维结构的预测允许与其它抗体进行免疫特异性比较。 
备选地或另外地，通过使用基于抗原片段化(抗体随机或通过特异遗传构造与其结合)的技术并且通过确定所得到片段与抗体的反应性实现表位 作图。也可以在核酸水平实现片段化，例如通过PCR技术接着通过在放射性氨基酸存在下体外转录和翻译成蛋白质。对于进一步的细节见例如Harlow和Lane，Using Antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999，390-392页。 
根据表位作图的进一步的方法，合成了一组重叠的肽并且在固相上排成阵列，其中每一个肽对应着蛋白质抗原的小的线性片段。然后用测试抗体探测肽的板并且使用酶标记的次级抗体检测所结合的抗体(Harlow和Lane，同上，393-396页)。 
本领域众所周知的表位作图的另外方法是从随机合成肽文库或噬菌体展示肽文库中选择抗体。例如，可以通过将编码肽的寡核苷酸的复杂混合物克隆入f1型ssDNA噬菌体的小外壳蛋白基因的氨基末端来构建噬菌体展示文库。此种噬菌体展示文库是商业可得的，例如可以从New EnglandBiolabs得到。文库可以作为原种扩增，然后将足以代表每一独立克隆的多拷贝的等分试样与目的抗体混合。通过称作“生物淘洗(biopanning)”的步骤收集抗体结合的噬菌体并且去除未结合的噬菌体。洗脱结合的噬菌体并用于感染细菌，并将所选择的原种进行扩增。使最终选择原种的单个噬菌斑生长并通过例如ELISA检查特异的抗体反应性，并且对插入位点附近的DNA进行测序。对抗体结合的肽的编码序列的分析阐述了抗体的特异性。对于进一步的细节见例如Smith和Scott，Methods Enzymol.217：228-257(1993)和Harlow和Lane，同上，397-398页。 
确定mAb是否与本文描述的mAb具有相同的特异性的另一种方法(虽然可靠性较差)是通过确定前者能否阻止后者与靶分子(例如CD20)的结合。如果被测试的mAb与本文描述的mAb竞争，如通过在用于结合靶分子的标准竞争测定中mAb结合降低所示，则两个mAb结合同一表位或密切相关的表位。然而，这不是权威性测试。即使所测试的抗体能够降低本文所公开抗体与靶分子的结合，所测试mAb和本文公开的mAb结合的真实表位仍然可以是不同的。例如，所测试mAb与其抗原决定簇的结合遮蔽了 本文描述的mAb的抗原决定簇并且由于所测试mAb的物理体积而不是由于结合同一表位简单地阻止其结合。因此，为了证实特异性常常采用与竞争方法联合使用的更精确的方法(例如可变区的氨基酸测序和建立三维模型)。 
确定mAb可能具有本文描述mAb特异性的另一种方法是：将本文公开的mAb与靶分子(例如CD20)预孵育然后加入被测试的mAb以确定被测试的mAb结合靶分子的能力是否被抑制了。如果被测试mAb被抑制了，则它可能具有与本文公开的mAb相同的或功能等效的表位特异性。然而，该方法受到了如上面讨论的竞争研究相同的限制，并且同样也不是相同特异性的必要决定性条件。 
在本发明特定的实施方案中，mAb或其抗原结合片段特异结合CD20，其中结合CD20和/或B细胞的mAb或抗原结合片段的密度与传统抗CD20mAb(例如2H7、B9E9、1H4、2B8、1F5和/或Leu-16抗体)结合CD20和/或B细胞相比高至少大约30％、40％、50％、60％、75％、85％、2倍、3倍、4倍或甚至5倍。此外，本发明的mAb在消除低密度表达CD20的恶性B细胞中具有更好的治疗效果。这些传统的抗体对于本领域技术人员是可得的(见例如Shan等，(1999)J.Immunol.162：6589-6595；Schultz等，(2000)Cancer Res.60：6663-6669；Haisma等，(1998)Blood 92：184-190；Stashenko等，(1980)J.Immunol.125：1678)。不希望受本发明的任何特定理论限制，抗体结合的密度可归于抗体结合表位的可接近性或可得性。因此，根据该实施例，看来与上述的一种或多种传统抗体相比，本发明的抗体和抗原结合片段针对的是在细胞表面可接近性增加的表位。与传统抗体相比，本发明该实施方案中的抗体和抗原结合片段能够以较低剂量诱导B细胞消除，所以它们对于治疗应用是有利的。本领域技术人员可以理解与传统抗体相比，结合密度增加的程度会按照靶标例如所使用细胞系的不同而变化。在一个例证性的实施方案中，单克隆抗体或抗原结合片段上调B细胞上的结合部位(即表位的可接近性)，这导致mAb或抗原结合片段与B细胞和/或它们的恶性对等物结合的较高密度。 
确定结合到细胞的抗体密度的方法是本领域已知的(见例如Sato等，J.Immunology 165：6635-6643(2000)；其公开了估计细胞表面CD19的密度的方法)。其它标准的方法包括斯卡查德分析法(Scatchard analysis)。例如，对抗体或片段进行分离和放射性标记并且测定放射性标记抗体的特异活性。然后将抗体与表达CD20的靶细胞接触。测定与细胞结合的放射性并且基于特异的活性确定结合到细胞的抗体或抗体片段的量。 
备选地，可以采用荧光激活细胞分选(FACS)分析。通常，抗体或抗体片段结合到表达CD20的靶细胞上。然后加入结合抗体的第二种试剂，例如荧光染料标记的抗免疫球蛋白抗体。然后测定荧光染料染色并且用来确定结合到细胞的抗体或抗体片段的密度。 
作为另一个适宜的方法，抗体或抗体片段用可检测标记如荧光团直接标记并结合到靶细胞上。确定标记到蛋白质的比率并且与以已知标记数量结合到其上的标准珠相比较。对结合到细胞的标记的数量与已知的标准的比较用于计算结合到细胞的抗体的量。 
在本发明的另一个实施方案中，功能等效抗体或片段对于消除B细胞和/或治疗B细胞疾病方面与本文描述的抗体或片段具有相同或相似的效力。本发明的该方面在下面更详细描述。为了图解说明，在代表性实施方案中，功能等效的抗体或片段实现以大约125mg/m2、75mg/m2、37.5mg/m2、10mg/m2、3.75mg/m2、1mg/m2、0.75mg/m2、0.375mg/m2、0.1mg/m2、0.05mg/m2、0.001mg/m2、0.0005mg/m2或更低的剂量消除至少大约25％、35％、50％、75％、85％、90％、95％或98％或更多的循环和/或组织B细胞达至少大约5、7、14、21、30、45、60、120或180天或更长时间。其它特定的剂量、消除程度和消除时间在下面更详细描述。 
在本发明的代表性实施方案中，本发明的mAb或抗原结合片段包含如本文所描述的mAb的重链或轻链。在其它代表性实施方案中，本发明的mAb或抗原结合片段包含来自如本文所描述的mAb的重链可变区和/或轻链可变区。在另外的其它实施方案中，mAb或抗原结合片段包含来自本文所公开mAb的重链V和/或D和/或J区和/或轻链V和/或J区。在另 外的其它代表性实施方案中，mAb或抗原结合片段包含本文所述mAb的重链CDR1和/或CDR2和/或CDR3区和/或轻链CDR1和/或CDR2和/或CDR3区。根据该实施方案，mAb或抗原结合片段可以包含来自如本文所述mAb的CDR1、CDR2和CDR3区(重链和轻链)。 
在特定实施方案中，抗人CD20抗体或其抗原结合片段特异结合CD20并且具有包含氨基酸序列FYXYXXX1YGAX2XXY的重链CDR3区，其中X可以是任意氨基酸，并且其中X1可以是任意氨基酸且优选地是Y或S，并且其中X2可以是任意氨基酸且优选地是M或L，并且其中F是苯丙氨酸，Y是酪氨酸，G是甘氨酸，A是丙氨酸，M是蛋氨酸，L是亮氨酸并且S是丝氨酸。如图15和18所示定义CDR。 
在某些实施方案中，抗人CD20抗体或其抗原结合片段还包含含有氨基酸序列NXXXX的重链CDR1区，其中X可以是任意氨基酸并且N是天冬酰胺。 
在另一个实施方案中，抗人CD20抗体或其抗原结合片段还包含含有氨基酸序列XHFWXX3XWX的轻链CDR3区，其中X可以是任意氨基酸序列，H是组氨酸，F是苯丙氨酸，W是色氨酸并且X3可以是任意氨基酸且优选地是T或I，其中T是苏氨酸并且I是异亮氨酸。 
此外，本发明的mAb和抗原结合片段包含与上面指定的氨基酸序列(例如重链或轻链、重链和/或轻链可变区、V、D和/或J区或一个或多个CDR)具有相当大的序列同源性例如至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高氨基酸序列相似性的氨基酸序列。备选地，编码这些区域的核酸与本文描述的抗体的相应区域的核苷酸序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高核苷酸相似性。 
本领域技术人员应当理解在本发明的范围内可以对本文公开的氨基酸序列和核苷酸序列进行一定的修改。例如，通过克隆或扩增方法或其它核酸分子或蛋白质分子的实验室操作能够修饰序列，以提供与CD20和/或B细胞结合的提高了的亲合力和/或密度，和/或增强与Fc受体的相互作用。 
在特定实施方案中，mAb或抗原结合片段(a)包含含有本文明确公开的 mAb重链可变区或与本文明确公开的mAb重链可变区氨基酸序列具有相当大的氨基酸序列相似性(如上所述)的重链可变区的重链；(b)包含含有本文所公开的mAb轻链可变区或与本文明确公开的mAb轻链可变区氨基酸序列具有相当大的氨基酸序列相似性(如上所述)的轻链可变区的轻链；或者(c)包含如上面(a)和(b)所述重链和轻链的mAb或抗原结合片段。在特定实施方案中，本发明mAb或抗原结合片段包含含有本文明确公开的mAb重链可变区或与其具有相当大的氨基酸序列相似性的重链可变区的重链，并且还包含含有本文所公开的相同mAb轻链可变区或与其具有相当大的氨基酸序列相似性的轻链可变区的轻链。 
如本领域中已知，大量不同的程序用于鉴定核酸或多肽是否与已知序列具有序列同一性或相似性。使用本领域已知的标准技术可以确定序列同一性和/或相似性，这些技术包括但不限于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2，482(1981)的局部序列同一性算法、通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48，443(1970)的序列同一性比对算法、通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444(1988)的相似性查找方法、通过这些算法的计算机化执行法(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，WI)、Devereux等，Nucl.Acid Res.12，387-395(1984)所描述的Best Fit序列程序，优选地使用缺省设置，或者通过检查确定序列同一性和/或相似性。 
有用算法的例子是PILEUP。PILEUP使用渐进配对比对从一组相关序列创建多重序列比对。它还可以绘制成树以显示用于创建比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35，351-360(1987)的简化的渐进比对方法；该方法与Higgins和Sharp，CABIOS 5，151-153(1989)所描述的方法相似。 
有用算法的另一个例子是BLAST算法，它描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90，5873-5787(1993)。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，该 程序是从Altschul等，Methods in Enzymology，266，460-480(1996)得到的。WU-BLAST-2使用几个查找参数，这些参数优选地设置为缺省值。这些参数是动态的值并且是依赖于特定序列的组成以及特定数据库(目的序列所检索的数据库)的组成由程序自身确立的；然而，这些值可以调整以增加灵敏度。 
另外有用的算法是Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25，3389-3402所报道的缺口BLAST。 
通过相匹配的相同残基数除以所对齐区域内“较长”序列的残基总数可以确定氨基酸序列同一性值的百分数。“较长”序列是在对齐区域内具有最多实际残基的序列(忽略了为了最大化比对分值而通过WU-Blast-2所引入的缺口)。 
比对可以包括在被比对的序列中引入缺口。另外，对于比本文特定公开的多肽含有更多或更少氨基酸的序列，应该理解在实施方案中序列同一性的百分数将基于与氨基酸总数相关的相同氨基酸的数目来确定。因此，例如在一个实施方案中，使用较短序列中氨基酸的数目来确定比本文明确公开序列更短的序列的序列同一性。在同一性百分数的计算中，对于序列变体的各种表现形式如插入、缺失、替换等不指定相对加权。 
在一个实施方案中，仅同一性分值赋予正值(+1)并且将包括缺口在内的所有形式的序列改变指定为“0”值，这避免了在序列相似性计算中需要如下所描述的加权范围或参数。例如，通过用匹配的相同残基数除以对齐区域内“较短”序列的总残基数并乘以100来计算序列同一性的百分数。“较长”序列是在对齐区域内具有最多实际残基的序列。 
在其它实施方案中，mAb、抗原结合片段或与本文明确描述的mAb或相应抗原结合片段或特异区具有“相当大的序列相似性”的特异区域是由如下的核酸编码的，该核酸能够在本领域技术人员已知的标准条件下与文中明确公开的核酸的相应片段杂交并且编码如本文所定义的功能性等效的mAb或抗原结合片段。 
为了举例说明，此类核酸序列与本文所明确公开序列的杂交可以在低 严格性、中严格性或者甚至严格性条件(例如分别为以下代表性条件：于37℃用含有5×Denhardt溶液的35-40％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗涤的严格条件；于42℃用含有5×Denhardt溶液的40-45％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗涤的严格条件；和/或于42℃用含有5×Denhardt溶液的50％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗涤的严格条件)下进行。见，例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第二版，1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)。 
本领域技术人员应当理解由于遗传密码的简并性编码本发明mAb和抗原结合片段的核酸可以存在变化。遗传密码简并性允许不同的核酸序列编码相同的多肽，这在本领域中是众所周知的。 
通过存在(或缺乏)非翻译序列如内含子序列和5’和3’非翻译序列，可以向核酸序列中进一步引入的变异。 
既然发明者已经产生并表征了具有预期特性的一组抗CD20的mAb，对于本领域那些技术人员而言可以常规产生相似或改良的抗体或片段。例如，可以以重链和/或轻链可变区(或其部分，如一个或多个CDR)序列作为起点来鉴定具有预期特性的其它抗体。作为一种方法，可以产生包含本文所公开序列变体的噬菌体文库。可以基于任意预期特性对噬菌体文库进行筛选，特性如CD20反应性、结合密度、B细胞消除效率、治疗B细胞疾病的效率等。 
而且，为了修饰本文明确公开的mAb和其抗原结合片段的氨基酸和核酸序列，可以基于本领域已知的任意特性进行氨基酸替代，这些特性包括氨基酸侧链取代基的相对相似性和差异，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。在特定实施方案中，在氨基酸序列中进行保守替代。如本文所使用，“保守氨基酸替代”是这样一种替代，即其天然发生机率比偶然发生替代的机率高大约10倍的替代(例如，通过Dayhoff等，Atlas ofProtein Sequence and Structure，1971，95-96页和图9-10所描述的计算方法所定义)。 
在进行氨基酸替代时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数 在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性在本领域中是普遍理解的(见Kyte和Doolittle，(1982)J.Mol.Biol.157：105；本文整体引用作为参考)。人们公认氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，反过来，这又限制蛋白质与其它分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。 
基于其疏水性和电荷特性已经指定了每个氨基酸的亲水指数(Kyte和Doolittle，同前)，并且它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。 
在本领域中还应当理解，可以基于亲水性进行氨基酸取代。在美国专利号4,554,101(本文整体引用作为参考)中叙述了由其相邻氨基酸的亲水性所控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学特性相关。 
如在美国专利号4,554,101中所详细描述，已经指定了氨基酸残基的亲水性数值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(±3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。 
在其它实施方案中，本发明的功能等效mAb和抗原结合片段包括那些包含一个或多个来自本文所公开的mAb或抗原结合片段的上面所指定区域(例如重链或轻链、重链和/或轻链可变区或其部分)的mAb和抗原结合片段，其中本文所公开的mAb或抗原结合片段具有不超过14、12、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸替代、缺失和/或插入。在特定实施方案中，本发明的mAb或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和/或CDR3区，其中每个CDR区包含不超过5、4、3、2或1个氨基酸替代、缺失和/或插入。在代表性的实施方案中，CDR1、CDR2和/或CDR3区各自包含不超过5、 4、3、2或1个保守氨基酸替代。 
抗体或片段还可以具有多于一个抗原特异性，例如可以是双特异性抗体。双特异性抗体还可以结合另一个CD20表位。另外，双特异性抗体还可以对其它抗原如CD19、CD22、CD52、CD3、CD28或HLA-DR10(Lym-1)；或者Fc受体如CD16、CD64和CD89；T细胞受体(例如T细胞受体复合物的ζ链)或者其它细胞表面分子如诸如细胞因子受体、激素或生长因子受体的受体具有结合特异性。 
抗体和其片段还还可以是“嵌合”抗体。嵌合抗体和抗原结合片段包含来自两个或多个不同物种(例如小鼠和人)的部分。将具有目的特异性的小鼠可变区剪接入人恒定区基因片段中可以产生嵌合抗体(见，例如美国专利号4,816,567)。以这种方式，能够修饰非人(例如小鼠)抗体以使得它们更加适合于人的临床应用。 
本发明mAb还可以是“人源化的”或“CDR移植”形式的非人(例如小鼠)mAb，这使其作为用于人的治疗剂比鼠mAb具有更多的优点，特别是它们不会象小鼠抗体一样很快地从人体循环中消除，并且当施用于人受试者时通常不会引发不良免疫反应。一般而言，人源化抗体具有一个或多个从非人类来源引入其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入”残基，这些“输入”残基一般取自“输入”可变区。制备人源化抗体的方法在本领域中通常是众所周知的，并且能够容易地应用于本文所公开的mAb。例如，按照Winter和其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))的方法通过将啮齿类CDR序列替换人抗体中相应序列基本上可以实现人源化。在特定实施方案中，非人类(例如小鼠)抗体的人源化形式是人抗体(接受者抗体)，其中接受者抗体的高变区(CDR)残基由来自非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物并具有目的特异性、亲和性和结合容量的高变区残基所替换。在一些情况下，人免疫球蛋白骨架区残基也由相应非人类的残基替换(所谓的“回复突变”)。通过序列和结构分析，或者通过使用计算机模型进行的可变区三维结构分 析，能够确定此类回复突变的位置。另外，噬菌体展示文库也可以用于改变抗体序列中所选则位置的氨基酸。还可以通过人抗体的骨架区的选择影响人源化抗体的特性。此外，为了进一步改进抗体特性如亲和性，可以修饰人源化和嵌合抗体使其包含在接受者抗体或供者抗体中均未发现的残基。一般而言，人源化抗体将包含全部或基本上全部的对应非人免疫球蛋白CDR区的至少一个、两个或者甚至三个CDR区，并且全部或基本上全部骨架区残基是人免疫球蛋白序列的残基。人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白恒定区。对于更加详细的内容，见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；和Reichmann等，Nature 332：323-329(1988)。因此，本发明的一个实施方案中提供的mAb是通过移植以引入人免疫球蛋白成分而实现人源化的，基本上不妨碍抗体结合抗原(即CD20)的能力。 
本发明mAb或抗原结合片段可以是没有缀合其它试剂如治疗剂的裸抗体或抗原结合片段。备选地，可以将mAb或抗原结合片段缀合上治疗剂(即形成免疫连接物)例如细胞毒剂、小分子化合物、激素、生长因子、细胞因子、酶、RNA酶、核酶或包含编码序列、反义RNA和RNAi的核酸分子。 
举例说明的细胞毒剂包括但不限于蛋白质毒素如蓖麻毒素、白喉毒素、葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、相思豆毒素或其它核糖体失活蛋白(ribosomal inactivating proteins)。通过使用化学交联剂的化学方法或者通过构建编码全部或部分蛋白质毒素的融合蛋白质构建体的重组核酸技术，能够将这些蛋白质连接至抗体或抗体片段。其它例证性的细胞毒剂包括高能放射性同位素如90Y、131I或111In。其它细胞毒剂包括细胞毒性药物和细胞抑制药物如氨甲喋呤、苯丁酸氮芥、阿霉素、柔红霉素和长春花新碱。 
备选地，mAb或抗原结合片段可以用可检测标记进行标记。代表性的可检测标记包括放射性标记、重金属、发色团、荧光团和酶，其中酶的终产物是可检测的。例如用可检测标记进行标记的抗体和抗原结合片段可以 用于诊断方法和实验室方法。 
抗CD20的mAb可以通过本领域已知的任何标准方法制备，例如通过杂交瘤方法(Koehler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)；和Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，59-103页，(AcademicPress，1986))或者通过如美国专利号4,816,567和Wood等，Nature314：446-9(1985)所公开的重组技术。 
一般通过单个细胞如杂交瘤细胞的克隆产生单克隆抗体，其中杂交瘤细胞能够产生具有相同抗体结合部位的抗体分子的同质群体。杂交瘤细胞是通过抗体产生细胞与骨髓瘤细胞或自永生化细胞系融合形成的。此类抗体制备首先由Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)描述，本文整体引用作为参考。另外的方法描述于Zola，Monoclonal Antibodies：aManual of Techniques，CRC Press，Inc.(1987)。筛选如此制备的杂交瘤培养上清液，证实是否存在能够结合CD20和/或具有本文所描述的其它目的特征的抗体分子。 
一般地，为了产生能够生产抗CD20mAb的杂交瘤，将骨髓瘤或其它自永生化细胞系与来自CD20超免疫哺乳动物脾脏、淋巴结的淋巴细胞或其它抗体产生细胞融合(见，例如Kearney等，J.Immunol.，123：1548-50(1979))。 
在一个实施方案中，用于制备杂交瘤的骨髓瘤细胞系与淋巴细胞来自同一物种。本发明中使用的适当的小鼠骨髓瘤是NS-1骨髓瘤细胞系，NS-1骨髓瘤细胞系可从美国典型培养物保藏中心Manassas，Virginia，UnitedStates of America得到。 
一般使用聚乙二醇(PEG)1500将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过它们对HAT的敏感性选择出融合的杂交细胞。通过使用本文所述的酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACS)鉴定能够生产所公开单克隆抗体的杂交瘤。 
抗体产生细胞可以从近交小鼠品系例如C57BL/6品系得到。在其它实施方案中，抗体产生细胞来自CD20-/-哺乳动物例如CD20-/-小鼠。在一个 代表性的实施方案中，CD20-/-小鼠最初衍生于129品系小鼠。使用本领域技术人员已知并且如本文所描述的技术可以产生CD20-/-小鼠，见例如Hogan等，(1986)Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.。 
本发明的抗CD20 mAb可以是完全的人类抗体。制备完全的人类抗体的方法是本领域已知的并且包括对转基因动物和噬菌体展示技术的使用。 
还可以产生转基因动物(例如小鼠)，当免疫时，这些转基因动物能够在缺乏内源性免疫球蛋白产生的情况下产生全部人类抗体。例如，已经描述过在嵌合体突变和生殖系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人类生殖系免疫球蛋白基因排列转移进入此种生殖系突变的小鼠中会导致在抗原激发的情况下产生人类抗体。见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，2551-255(1993)；Jakobovits等，Nature 362，255-258(1993)。 
Mendez等(Nature Genetics 15：146-156(1997))进一步改进了技术并且产生了命名为“Xenomouse II”的转基因小鼠品系，当用抗原激发时，Xenomouse II转基因小鼠产生了高亲和性的完全人类抗体。这可以通过将兆碱基的人类重链和轻链基因座通过生殖系整合进入上述内源JH片段缺失的小鼠中实现。Xenomouse II含有1,020kb的人重链基因座并且还含有800kb的人κ基因座，其中重链基因座包含大约66个VH基因、完整的DH和JH区和三个不同的恒定区(μ、δ和χ)，κ基因座基因座包含32个Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。在包括基因重排、装配和抗体谱在内的所有方面，这些小鼠产生的抗体十分像人类的抗体。因为内源的JH片段的缺失阻止了在鼠内基因座的重排，所以相对于内源抗体而言人类抗体是优选表达的。 
产生mAb的其它方法也是已知的。见例如Sastry等，Proc Natl AcadSci USA 86：5728-5732(1989)和Huse等，Science 246：1275-1281(1989)所描述的从免疫球蛋白库分离mAb的方法。 
备选地，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348，552-553 (1990))从非免疫供体的免疫球蛋白可变区(V)全套基因中体外生产人类抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V区基因按阅读框架克隆入丝状噬菌体如M13或fd的小外壳蛋白或者主要外壳蛋白基因上并且作为功能抗体片段在噬菌体颗粒表面上展示。由于丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的筛选也导致对表现这些特性的抗体编码基因的筛选。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式开展；见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3，564-571(1993)。 
几种来源的V基因片段可以用于噬菌体展示。Clackson等，Nature352，624-628(1991)从来源于免疫小鼠脾脏的V基因的小的随机整合文库中分离了多组抗噁唑酮抗体。可以将来源于非免疫供体的全套V基因进行构建并且基本上可以按照Marks等，J.Mol.Biol.222，581-597(1991)或者Griffith等，EMBO J.12，725-734(1993)描述的技术分离针对多组抗原(包括自身抗原)的抗体。在自然免疫反应中，抗体基因以高频率积累突变(体细胞高变)。所导入的一些变化赋予了较高的亲和性，并且在后来的抗原激发中表现出高亲和性表面免疫球蛋白的B细胞优先复制和分化。通过采用已知称为“链改组”的技术模拟了这种天然过程(Marks等，Bio/Technol.10，779-783)。在该方法中，通过噬菌体展示得到的“初级的”人类抗体可以通过将重链和轻链V区基因的序列替换成非免疫供体V区基因全套天然变体(天然变体库)进行改进。这种技术允许产生具有nM范围的亲和性的抗体和抗体片段。构建十分庞大的噬菌体抗体库的策略已由Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21，2265-2266(1993)描述。 
关于产生单克隆抗体的进一步的信息还可见Goding，J.W.，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第3版，AcademicPress，Inc.，London，San Diego，1996；Liddell和Weeks：AntibodyTechnology：A Comprehensive Overview，Bios Scientific Publishers：Oxford，UK，1995；Breitling和Dubel：Recombinant Antibodies，JohnWiley & Sons，New York，1999和Phage Display：A Laboratory Manual，Barbas等编著， Cold Springs Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，2001。 
本发明者意外发现可以从CD20-/-哺乳动物产生不同特性(例如CDR区、结合密度等)的新的抗体。因此，在一个代表性的实施方案中，本发明提供了产生能够特异结合CD20的单克隆抗体的方法，包括：(a)在足以引起抗体反应的条件下，用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳动物(例如小鼠)；(b)从哺乳动物收获抗体产生细胞(例如B细胞)；(c)将抗体产生细胞与培养的无限增殖化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合以形成产生单克隆抗体的杂交瘤细胞；(d)在足以产生单克隆抗体的条件下培养杂交瘤细胞；和(e)从培养物中回收特异结合CD20的单克隆抗体。方法任选地可以包括分离产生抗CD20mAb的杂交瘤细胞系。 
在另一个实施方案中，本发明提供了产生特异结合CD20的mAb的方法，包括：(a)在足以引起抗体反应的条件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳动物；(b)从哺乳动物收集产生特异结合CD20的抗体的细胞；(c)从抗体产生细胞中分离免疫球蛋白编码基因；(d)将免疫球蛋白编码基因导入不同的细胞以产生转化的细胞；(e)在足以使免疫球蛋白基因转录和翻译以及单克隆抗体产生的条件下培养转化的细胞；和(f)从培养物中回收特异结合CD20的单克隆抗体。在特定的实施方案中，从抗体产生细胞或者从不同的抗体产生细胞中分离重链和轻链基因并且将其导入转化的细胞。转化的细胞可以是任意适宜细胞，例如哺乳动物细胞或细胞系如CHO或BHK细胞。 
如上所述，本发明还提供了产生本发明mAb的杂交瘤细胞、杂交瘤细胞系和杂交瘤细胞培养物。本发明的代表性的杂交瘤细胞系包括杂交瘤HB20-1、HB20-2、HB20-3、HB20-4、HB20-5、HB20-6、HB20-25、MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-6、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-13、MB20-14、MB20-16和MB20-18。 
按照布达佩斯条约，在2004年5月5日将杂交瘤细胞系HB20-3、HB20-4、HB20-25、MB20-1、MB20-11和MB20-18保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA，USA，并且ATCC登录号分别为 PTA-5943(HB20-3)、PTA-5944(HB20-4)、PTA-5945(HB20-25)、PTA-5946(MB20-1)、PTA-5947(MB20-11)和PTA-594(MB20-18)。 
本发明还提供了编码本发明mAb、抗原结合片段、抗体重链和/或抗体轻链或其部分(例如可变区，CDR区)的核酸。核酸可以是DNA、RNA或其嵌合分子，可以是单链的或者双链的，并且可以是完全或部分合成的或天然的。核酸包含修饰核苷酸或核苷酸类似物。此外，核酸可以来源于任何物种，包括哺乳动物物种例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫等。 
在特定的实施方案中，核酸是分离的核酸。如本文所使用，“分离的”核酸意思是从天然存在生物的至少一些其它成分分离的核酸或者基本上不含有这些成分的核酸，其中所述的其它成分如通常与核酸结合的细胞结构成分或者其它多肽或核酸。 
本发明还提供了包含本发明核酸的载体，包括表达载体和基因递送载体。适宜的载体包括细菌表达载体、真菌表达载体、哺乳动物载体、酵母表达载体和植物表达载体。代表性的载体包括细菌人工染色体、粘粒、酵母人工染色体、噬菌体、质粒、脂载体和病毒载体(例如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、杆状病毒等)。 
可以设计表达载体用于在原核或真核细胞中表达多肽。例如，可以在细菌细胞例如大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞(例如在杆状病毒表达系统中)或者哺乳动物细胞中表达多肽。一些适宜的宿主细胞在Goeddel，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，Calif.(1990)中有进一步讨论。用于在酿酒酵母(S.cerevisae)中表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari等，(1987)EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)。用于在培养的昆虫细胞(例如Sf 9细胞)中表达核酸以产生蛋白质的可得到的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell.Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.和Summers，M.d.(1989)Virology 170：31-39)。 
哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等，(1987)，EMBO J.6：187-195)。 
载体通常包含与本发明核酸有效连接的表达控制元件(例如启动子)。应当理解依赖于目的表达水平和组织特异表达可以使用多种表达控制元件。此外，启动子可以是组成型的或者可诱导的(例如金属硫蛋白启动子或者激素诱导启动子)。表达控制元件可以是宿主细胞自身的或者外来的并且可以是天然序列或者人工合成序列。通常选择能够在目的靶细胞内具有功能的启动子。核酸还可以进一步与其它适当的表达控制序列相连，例如转录/翻译控制信号和多聚腺苷酸信号。在哺乳动物细胞中常常采用病毒调节元件。例如在哺乳动物表达载体中经常使用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。 
此外，一般需要特异起始信号以便有效翻译所插入的蛋白质编码序列。这些翻译控制序列包括ATG起始密码子和邻近序列，它可以是多种来源的，可以是天然的和合成的。 
本发明进一步提供了包含本发明分离核酸和载体的宿主细胞(例如酵母、细菌、哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞)。细胞可以是用本发明核酸或载体瞬时或稳定转化的。在特定的实施方案中，核酸稳定整合入宿主细胞的基因组中。此外，细胞可以是培养的细胞(即分离的)或者活的生物体内的原位(in situ)细胞。 
使用方法
本发明的抗体、抗原结合片段、核酸和药物组合物可以在多种研究、诊断和/或治疗应用中使用。为了举例说明，本发明的抗体和抗原结合片段能够特异结合B细胞特异标志物-CD20。因此，这些试剂可以用于鉴定B细胞的方法、研究CD20功能的方法以及用于免疫亲和纯化CD20或B细胞的方法。分离B细胞的方法可以用于实验室研究、治疗或诊断方法。例如，从患有B细胞恶性肿瘤的受试者中取出组织或细胞，使用本发明的抗体或抗原结合片段纯化B细胞，并且将已经消除了B细胞的组织或细胞重新导入受试者。此外，本发明的抗体、抗原结合片段和组合物可以用于诊 断目的，例如为了鉴定淋巴瘤。本发明方法还提供了使用缀合有治疗剂(如上所述)的抗体或抗原结合片段将分子进行B细胞特异递送。此外，本发明还提供了消除B细胞的治疗方法，例如治疗B细胞疾病如B细胞恶性肿瘤和自身免疫病。 
在一个特定的实施方案中，本发明提供了在动物受试者体内(例如哺乳动物受试者)消除B细胞的方法，包括以有效消除B细胞的量向哺乳动物受试者施用本发明的mAb、抗原结合片段或者组合物。通过“有效消除B细胞的量”意思是达到至少大约25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的B细胞减少(即消除)的有效量。在一些实施方案中，这里没有或基本上没有可检测的B细胞。检测B细胞和测量B细胞消除的方法是本领域已知的(见，例如实施例9-12，14和17)。在代表性实施方案中，在外周循环和/或组织(例如脾脏和淋巴结)B细胞中实现了至少大约25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者更高的消除。本领域技术人员应当理解，为了临床应用测量/监测了外周循环的B细胞，该方法一般比估计组织中B细胞消除的方法侵害性小。 
本发明进一步提供了治疗B细胞疾病的方法，包括将患有B细胞疾病的动物(例如哺乳动物)施用治疗有效量的本发明的一种或多种单克隆抗体、抗原结合片段或者药物制剂。在特定的实施方案中，B细胞疾病是B细胞恶性肿瘤或者自身免疫病。 
术语“B细胞恶性肿瘤”和其语法变体具有有关B细胞恶性肿瘤或者赘生物的最广的意义，其中B细胞恶性肿瘤或者赘生物一般在淋巴组织如骨髓或者淋巴结中产生，但是也可以在非淋巴组织例如甲状腺、胃肠道、唾液腺和结膜中产生。本发明的治疗方法特别是涉及CD20阳性B细胞恶性肿瘤，其包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(NHL)的B细胞亚型、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、多毛细胞白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和幼淋巴细胞白血病。非霍奇金淋巴瘤B细胞亚型是一个用于包括由恶性B淋巴细胞产生的一大组(超过29种类型)淋巴瘤的术语，并且它代表着已知类型淋巴瘤的大部分亚型，包括但不限于低度恶性/滤泡 型NHL、小淋巴细胞(SL)NHL、中度恶性/滤泡型NHL、中度恶性弥漫型NHL、高度恶性免疫母细胞NHL、高度恶性原始淋巴细胞性NHL、高度恶性小无裂细胞NHL和巨大肿块NHL。 
自身免疫病部分地起因于自身耐受的损坏，这导致了后来的针对自身的免疫反应，包括自身抗体的产生和免疫球蛋白在受影响组织中的沉积。自身抗体形成了免疫复合物，促进了补体和Fc受体介导的组织炎症反应和破坏。大多数自身免疫病起因于能够与正常身体组织反应的抗体的产生或者其产生加重病情。由于B淋巴细胞是自身抗体的来源，因此它们正当地成为了治疗这些类型免疫介导疾病的靶标。B淋巴细胞还可以递呈抗原并且调节效应子T淋巴细胞的发育。 
已经鉴定出超过80种自身免疫病。在美国国立健康研究院的自身免疫病协调委员会(Autoimmune Diseases Coordinating Committee)出版的自身免疫病研究计划(Autoimmune Diseases Research Plan)中广泛讨论了自身免疫病、其病原学和治疗。根据本发明能够治疗的代表性的自身免疫病包括但不限于免疫复合物病，例如导致肾小球肾炎、古德帕斯丘综合症、坏死性血管炎、淋巴结炎、结节性动脉外膜炎和系统性红斑狼疮的那些免疫复合物病。其它例证性的自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、溃疡性结肠炎、系统性硬化病、皮肌炎/多发性肌炎、抗磷脂抗体综合征、硬皮病、寻常性天疱疮、ANCA相关性血管炎(例如韦格纳肉芽肿病、显微镜下多动脉炎)、葡萄膜炎、舍格伦综合征、克隆病、赖特尔综合征、强直性脊椎炎、莱姆关节炎、吉-巴综合征、桥本甲状腺炎和心肌病。能够根据本发明治疗的其它与抗体产生相关的疾病包括但不限于多发性硬化、特应性皮炎、血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏、自身免疫性溶血性贫血、针对外来抗原如妊娠过程中的胎儿A-B-O血型的免疫反应、重症肌无力、I型糖尿病、格雷夫斯病和过敏性反应。 
本发明方法可以用于治疗涉及B细胞或者抗体的任何其它疾病或不良状况，包括例如免疫排斥。 
“治疗有效”量是足以对受试者的不良状况产生一些改善或者缓解或者预防或延迟不良状况再发或复发的抗CD20抗体或者抗原结合片段的量。 
可以通过本领域已知的标准技术监测受试者以便跟踪B细胞恶性肿瘤或者特定自身免疫病的临床指标(clinical indicia)。例如，在B细胞恶性肿瘤的情况下，使用抗CD20抗体可以监测肿瘤进程(例如在实体瘤的情况下肿瘤的大小)、循环B细胞或活检组织的表型。 
本领域技术人员应当理解可以根据多种因素包括年龄、性别、受试者的种类和状况、预期消除的程度、所治疗的疾病和/或所使用的特定抗体或抗原结合片段来选择剂量，并且剂量可通过本领域技术人员确定。例如，如本文所述非霍奇金淋巴瘤病人或者患有自身免疫病的病人可以接受从大约0.0005至大约1500mg/m2/周、具体而言从大约0.001至大约150mg/m2/周、更加具体而言从大约0.25至大约75mg/m2/周、更加具体而言从大约2.5至大约50mg/m2/周的抗CD20抗体。 
在本发明的实施方案中，抗体和抗原结合片段能够以比传统的抗CD20抗体更高的密度结合B细胞，并且因此能够更有效地(即在较低的剂量)消除B细胞(如上面所定义)。备选地或者另外地，更有效的消除是抗体与之反应的特定表位的结果。在代表性的实施方案中，抗体或者抗原结合片段(任选地以作为药物组合物部分的可药用载体中)的剂量至少大约0.0005、0.001、0.05、0.075、0.1、0.25、0.375、0.5、1、2.5、5、10、20、37.5、50或100mg/m2和/或少于大约200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、15、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.1、0.075或0.01mg/m2。在另一个例证性的实施方案中，剂量为大约0.0005和200mg/m2之间、大约0.001和150mg/m2之间、大约0.075和125mg/m2之间、大约0.375和100mg/m2之间、大约2.5和75mg/m2之间、大约10和75mg/m2之间、大约20和50mg/m2之间。 
在本发明方法的一些实施方案中，可以以低于大约375mg/m2的剂量、低于大约37.5mg/m2的剂量、低于大约0.375mg/m2的剂量和/或在大约 0.075mg/m2和大约125mg/m2之间的剂量施用本发明的mAb、抗原结合片段和/或组合物。 
所指定的剂量能够导致B细胞消除(如上面所述)达到至少大约3、5、7、10、14、20、30、45、60、75、90、120、150或180天或者更长的时间阶段。 
在本发明的代表性的实施方案中，大约125mg/m2或更低剂量的抗体或抗原结合片段导致B细胞消除(如上面所述)达至少大约7、14、21、30、45、60、90或120天。在另一个代表性的实施方案中，大约37.5mg/m2或更低的剂量消除B细胞达至少大约7、14、21、30、45、60、90或120天。在其它实施方案中，大约0.375mg/m2或更低的剂量导致B细胞消除达至少大约7、14、21、30、45或60天。在另一个实施方案中，大约0.075mg/m2 或更低的剂量导致B细胞消除达至少大约7、14、21、30、45或60天。在另外的其它实施方案中，大约0.01mg/m2、0.005mg/m2或者甚至0.001mg/m2或更低的剂量导致B细胞消除达至少大约3、5、7、10、14、21或30天。根据这些实施方案，剂量可以通过任何适宜的途径施用(如下所述），但是任选地通过皮下途径施用。 
作为另一方面，本发明提供了这样一种发现，即以比当前可得方法中采用的剂量更低的抗体或者抗体片段的剂量可以实现B细胞消除和/或B细胞疾病的治疗。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了消除B细胞和/或治疗B细胞疾病的方法，包括向动物受试者(例如哺乳动物受试者)施用有效量的能够特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中大约200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.25、0.1、0.075、0.05、0.001、0.0005mg/m2或更低的剂量导致至少大约25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的B细胞(循环和/或组织B细胞)消除达至少大约3、5、7、10、14、21、30、45、60、75、90、120、150或180天或更长。在代表性的实施方案中，大约125mg/m2或75mg/m2或更低的剂量导致至少大约50％、75％、85％或90％的B细胞消除达至少大约7、14、21、30、60、75、90、120、150 或180天。在其它实施方案中，大约50、37.5或10mg/m2的剂量导致至少大约50％、75％、85％或90％的B细胞消除达至少大约7、14、21、30、60、75、90、120或180天。在另外的其它实施方案中，大约0.375或0.1mg/m2 的剂量导致至少大约50％、75％、85％或90％的B细胞清除达至少大约7、14、21、30、60、75或90天。在进一步的实施方案中，大约0.075、0.01、0.001或0.0005mg/m2的剂量导致至少大约50％、75％、85％或90％的B细胞消除达至少大约7、14、21、30或60天。根据这些实施方案，剂量可以通过任何适宜的途径施用(如下所述)，但是任选地通过皮下途径施用。 
根据该实施方案，抗体或抗原结合片段是如本文所述的抗体或抗原结合片段(包括功能等效抗体和抗原结合片段)。 
在其它特定实施方案中，抗体或抗原结合片段以与传统抗体相比更高的密度结合CD20或者B细胞(如上所述)。 
本发明的抗体、抗原结合片段和药物组合物可以与其它治疗剂或者疗法联合使用。例如在B细胞恶性肿瘤的情况下，此种疗法或治疗包括单独的化学疗法、放射免疫疗法(RIT)、化学疗法和体外放射疗法(联合模式治疗，CMT)或者联合模式放射免疫疗法(CMRIT)或者它们的联合等。因此，本发明的抗CD20抗体和抗体片段可以与CHOP(环磷酰胺-羟基阿霉素-硫酸长春新碱(长春新碱)-泼尼松龙)联合进行，CHOP是治疗非霍奇金淋巴瘤最常用的化学治疗策略。此外，本文的抗CD20抗体可以与包括抗CD19、抗CD22(例如在美国专利号5,484,892、美国申请系列号10/371,797的美国专利出版物号2004/0001828、美国申请系列号10/372,481的美国专利出版物号2003/0202975和美国临时申请系列号60/420,472中所述，其每一个的全部内容在本文整合作为CD22抗原和抗CD22抗体教导方面的参考)和诸如RituxanTM(C2B8；利妥希玛；IDEC药物)的其它抗CD20抗体在内的其它抗体联合施用。 
因此，在一些实施方案中，本发明提供了消除哺乳动物受试者中B细胞的方法，其包括施用本发明的mAb和/或其抗原结合片段，并且进一步包括向受试者施用一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段。在一些实 施方案中，额外的抗体可以是抗CD22抗体、抗CD19抗体或者两者。一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段可以以与本发明抗体或抗原结合片段的施用相关的任何顺序进行施用。例如，一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段可以在向受试者施用本发明的抗体和/或抗原结合片段之前、同时和/或之后施用。一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段可以与本发明的抗体和/或抗原结合片段存在于同一种药物组合物中，和/或存在于不同的药物组合物中。按照如本申请所提供和如本领域所熟知的施用剂量和方式的任何教导，本发明的抗体和/或抗原结合片段施用的剂量和方式和一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段的剂量可以是相同的或者不同的。 
在一个特定的实施方案中，除了向受试者施用本发明的抗体以外还施用了能够增强单核细胞或巨噬细胞功能(例如至少大约25％、50％、75％、85％、90％、9％或更多)的化合物。此种化合物是本领域已知的并且包括(没有限制)细胞因子如白细胞介素(例如IL-12)和干扰素(例如α或γ干扰素)。能够增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物或者增强剂可以与抗体或抗原结合片段配制在同一种药物组合物中。当单独施用时，抗体/片段和化合物可以同时施用(相互间隔几小时阶段内)，可以在治疗的同一疗程内施用或者顺序施用(即病人首先接受抗体/片段治疗疗程然后接受能够增强巨噬细胞/单核细胞功能的化合物的疗程，或者反之亦然)。 
可以将本发明的抗体和抗体片段与本发明中已知的其它抗体一起使用来开展本发明的该实施方案，并且该实施方案特别适用于对抗CD20单克隆抗体治疗(例如使用已经存在的抗体如C2B8的治疗)抵抗的受试者、当前正在进行或者先前已经使用化学疗法治疗的受试者、已经有过复发的B细胞疾病受试者、无免疫应答的受试者或者另外巨噬细胞或单核细胞功能受损的受试者。本发明者已经发现，主要通过单核细胞介导的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)在B细胞消除中的作用比先前认为的更重要。对抗CD20治疗产生抗性或者患有B细胞疾病复发的病人的普遍存在归因于(至少部分归因于)巨噬细胞或者单核细胞功能的损害。因此，本发明提供了能够与 抗CD20抗体和抗原结合片段施用方法联合使用的增强ADCC和/或巨噬细胞和/或单核细胞功能的方法。 
根据本发明，尽管本发明可以用于兽医的目的以治疗非人类哺乳动物和鸟类，受试者还可以是人类受试者。可以开展本发明诊断和治疗方法的哺乳动物受试者的非限定性实例包括小鼠、大鼠、豚鼠、猪、山羊、绵羊、非人灵长类、马、狗、猫、牛、兔和人类。禽类包括鸡、火鸡、鹌鹑、鹅和鸭。 
虽然如本领域众所周知，在任何给定的情况下最适宜的途径会取决于此类因素如物种、年龄、性别或受试者总体状况、被治疗疾病的性质和严重程度和/或被施用的特定组合物的性质(即剂量、剂型)，但是本发明的抗体组合物可以使用任何施用方式进行施用，施用方式包括但不限于吸入(例如通过气雾剂)、颊内(例如舌下)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气管表面)、鞘内、关节内、胸膜内、大脑内、静脉内、动脉内、腹膜内、口腔内、淋巴管内、肌内、真皮内、皮下、经皮、鼻内、直肠或者阴道施用，并且可以通过蠕动的方式或者以贮存库的形式递送。在特定的实施方案中，施用途径是通过大丸剂或者在一段时间内连续灌注，一周一次或两次。 
施用的适宜策略会随着被治疗的受试者和疾病而变化，但是典型地是在初次施用后通过随后的注射或其它施用方式以一个以上间隔重复给药。给药之间的间隔可以短至几小时或者长至一周或几周。备选地，可以采用连续静脉灌注以维持血液中的有效浓度。 
本文所公开的抗体还可以在体外方法中使用。抗体选择性结合CD20，CD20表达于B淋巴细胞并且在B淋巴细胞发育的特异阶段表达。照这样，本发明的抗体可以用于从细胞的混合样品如全血中特异消除B淋巴细胞。然后，富集的B淋巴细胞组分或者已消除B淋巴细胞的组分可以在需要的实验中使用，而没有其它细胞类型干扰或与其相互作用的危险。利用本文公开的抗体从混合的细胞群体体外分离B淋巴细胞的方法是本领域众所周知的。作为非限定性的实例，FACS、淘选和磁性分离技术可以用来使用本文所公开的抗体从混合的细胞群体中分离B淋巴细胞。 
本文公开的抗体还可以用来区分B淋巴细胞发育亚群。CD20在祖B淋巴细胞中不表达。在前B淋巴细胞中可以看到一些表达。未成熟、T1和T2过渡的B淋巴细胞中表达较高数量的CD20。成熟的B淋巴细胞表达较低水平的CD20。综合该信息和上面讨论的技术或者本领域技术人员已知的其它技术，可以用于确定所研究的B淋巴细胞正处于发育的何种阶段。 
药物组合物
本发明还提供了包含本发明抗体或抗体片段的药物组合物。本发明的药物组合物包含可药用载体与本文描述的一种或多种抗体或抗体片段，抗体或抗体片段作为活性成分溶解或分散于可药用载体中。 
如本文所使用，关于组合物、载体、稀释剂和试剂的术语“可药用”指能够施用于动物并且不产生不良生理效应或毒性的材料。 
药物组合物制剂是药物化学领域众所周知的。见例如Remington’sPharmaceutical Sciences，(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1975)，特别是由Blaug，Seymour编写的第87章)。药物组合物包括但不限于粉末、糊剂、软膏、胶冻剂、蜡、油类、脂类、无水吸收性碱、水包油或油包水乳剂、聚乙二醇乳剂(多种分子量大小的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含聚乙二醇的半固体混合物。一般的剂量形式是适于通过肠胃外(例如静脉施用或者皮下施用)途经施用的无菌等渗的水溶液。本发明的抗体或抗体片段在药物制剂中的浓度可以很大程度地变化，例如体积比从少于大约0.01％、0.1％、0.5％、1％或2％的量至5％、10％、20％或50％或更多的量，并且可以根据所选择施用的特定剂型通过液体体积、粘滞度等初步选择。 
本发明的药物组合物还可以通过脂质体施用。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶解的单层、液态结晶、磷脂分散剂、薄片层(lamella layers)等。 
在制备中，将本发明的欲递送的组合物作为脂质体的一部分单独混合，或者与结合目的靶标的分子例如抗体或其它治疗或免疫原组合物一起混合。在本发明中使用的脂质体可以从标准的形成囊泡的脂形成，其中形成 囊泡的脂一般包括中性和带负电荷的磷脂和固醇如胆固醇。一般通过考虑脂质体的大小、脂质体在血流中的酸不稳定性和稳定性来指导脂的选择。制备脂质体的多种方法是可得的，如在例如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述。 
包含溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备是本领域众所周知的。一般此种组合物制备成液体溶液或悬浮液；然而，也可以制备成适于在使用前用液体制成溶液或悬浮液的固体形式。还可以将制剂制成乳化的。 
活性成分可以与赋形剂以适宜在本文所述方法中使用的量相混合，其中赋形剂是可药用的并且是可与活性成分配伍的。适宜的赋形剂例如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。此外，如果需要，组合物可以包含少量的能够增强有效成分效果的辅助物质例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等。 
药物组合物可以包括其组分的可药用盐。可药用盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成的)，其中酸加成盐是与无机酸如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等形成的。与游离的羧基形成的盐也可以从无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因的有机碱衍生而来。 
代表性的液体载体是无菌水溶液，其中所述的无菌水溶液除了活性成分和水以外不包含其它物质，或者包含如在生理pH值处的磷酸钠的缓冲液、生理盐水或者两者如磷酸缓冲盐。含水的载体还可以进一步包含一种以上的缓冲液盐以及如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。 
液体组合物除包含水外还包含与水排斥的液相。此种额外的液相的代表是甘油、如棉籽油的植物油和水油乳剂。 
在本发明中已经叙述的内容将在下面的实施例中更加详细地解释，本文包括的实施例仅仅是为了说明的目的并且它们不旨在限制本发明。 
实施例1：材料和方法 
CD20-/-小鼠的产生 
将编码Cd20基因3’末端的DNA从129/Sv品系的小鼠DNA噬菌体文库中分离、作图并且测序以鉴定内含子/外显子边界(图1A和图1B)(Tedder等，(1989)J.Immunol.142：2560)。基因寻靶使用包含位于pMC1-HSV基因下游的从PstI(第5外显子)至EcoRV(第6外显子，～1.8kb)的DNA片段的基于pBluescript SK的载体(p594)。将大约10kb的KpnI DNA片段插入到新霉素抗性(Neor)标记的下游(图1C)。根据标准的方法使用单一的SalI限制性位点将质粒线性化并且将其转染进入129品系来源的可以使用G418进行选择的胚胎干(ES)细胞中(Koller和Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932)。在115个新霉素抗性ES细胞克隆中有6个携带着靶向的等位基因(图1D)。通过使用同一探针对用BamHI(大于12kb的片段减小至6.5kb的带)、KpnI(7.2kb变成5.5kb)和SspI(5.6kb变成7.0kb)消化的DNA进行Southern分析进一步证实了正确的靶向。一个ES细胞克隆的细胞产生80-100％嵌合的雄性后代，这些后代与C57BL/6小鼠杂交≥7代。杂合的后代进行杂交以产生纯合的CD20-/-和野生型同窝小鼠(图1E)。在多数情况下，使用CD20-/-小鼠和(C57BL/6×129)F1小鼠的野生型同窝小鼠得到的结果是相同的，因此，将结果混在一起。使用了不同年龄的3-10个同窝小鼠开展脾脏和腹膜腔亚群分析，因此只有野生型和CD20-/- 小鼠之间的比较是有效的。将小鼠饲养于无特异抗原的具有屏障的设备中并且在2-3月龄时使用。 
敲除小鼠 
如所述制备FcγRI-/-和FcγRIII-/-小鼠(Bruhns等，(2003)Immunity18：573-581)。C57BL/6，FcγRII-/-(B6，129S-Fcgr2tm1Rav)，FcγRIII-/-(C57BL/6-Fcgr3tm1Sjv)，Beige(C57BL/6-Lystbg/bg)，Perforin(穿孔蛋白)-/-(C57BL/6-Pfptm1Sdz)，CSF1op(Csf1op)和nude(C57BL/6-Hfh11nu) 小鼠来自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。FcR通用γ链(FcRγ)缺乏的小鼠(FcRγ-/-，B6.129P2-Fcerg1tm1)来自Taconic农场(Germantown，NewYork)。如所述的(Botto等，(1998)Nat.Genet.19：56-59)C1q-/-小鼠经MarkWalport(imperial College，London，UK)允许由Garnett Kelsoe(杜克大学)提供，如所述(Zhang等，(1999)Immunity 10：323-332)的LAT-/-小鼠来自Weiguo Zhang(杜克大学)，并且如所述(Wessels等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：11490-11494)的C3-/-和C4-/-小鼠来自Michael Carroll(Centerfor Blood Research，Boston，MA)。使用标准的方法(Van Rooijen和Sanders(1994)J.Immunol.Methods 174：83-93)在第-2、1和4天通过尾静脉注射脂质体包封的氯膦酸盐(0.1mL/10g体重；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)产生了巨噬细胞缺乏的小鼠。将所有的小鼠饲养于无特异抗原的具有屏障的设备中并且在2-3月龄时使用 
免疫荧光分析 
使用建立的良好方法(Zhou等，(1994)Mol.Cell.Biol.14：3884)将单细胞的白细胞悬浮液用预先确定的最适浓度的每种抗体在冰上染色20-60分钟。在FACScan or FACScalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)上分析细胞的前向和侧向散射特性。使用不发生反应的对照单克隆抗体(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)并使用将≥98％的细胞排斥的门设置来确定背景染色。使用的抗体包括CD19单克隆抗体(MB19-1)(Tedder等，(1988)Mol.Immunol.25：1321；Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.263：10009；Valentine等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：8085)；B220克隆抗体(RA3-6B2)(DNAX Corp.，Palo Alto，CA)；Thy1.2(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)；与IgM、I-A、CD5、CD11b、CD23和CD43反应的抗体(BD PharMingen，Franklin Lakes，NJ)和抗小鼠IgG3、IgM和IgD的抗体(Southern Biotechnology Associates Inc.，Birmingham，AL)。 
抗体 
使用标准方法(Steeber等，(1997)J.Immunol.159：952-963)用转染有编码人CD20的cDNA的小鼠前B细胞系免疫BALB/c小鼠，产生了HB20-1至HB20-6的单克隆抗体。HB20-25小鼠抗人CD20单克隆抗体是在具有C57BI/6×129遗传背景的CD20-/-小鼠中产生，使用类似于先前描述(Steeber等，(1997)，同上)的方法用转染有编码人CD20的cDNA的小鼠前B细胞系300.19免疫该种CD20-/-小鼠。如上所述，所有MB20单克隆抗体均在具有C57BI/6×129遗传背景的CD20-/-小鼠中产生。 
通过将NS-1骨髓瘤细胞与来自CD20-/-小鼠的脾细胞融合产生了能够生产CD20特异性小鼠单克隆抗体的杂交瘤，其中用鼠CD20-绿色荧光蛋白(GFP)转染的300.19细胞免疫该CD20-/-小鼠(Kearney等，(1979)J.Immunol.123：1548)。抗CD20单克隆抗体MB20-1、MB20-2和MB20-14是IgG1同种型的；MB20-6、MB20-11和MB20-16是IgG2a同种型的；MB20-7、MB20-8、MB20-10和MB20-18是IgG2b同种型的并且MB20-3和MB20-13是IgG3单克隆抗体。通过用编码融合蛋白的cDNA转染每一个细胞系，产生表达与GFP融合的小鼠CD20的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和300.19前B细胞系(Tedder等，(1988)J.Immunol.141：4388)。通过基于荧光的细胞分选根据GFP的表达分离转染的细胞。 
通过第5届人类白细胞分化抗原国际讨论会和会议(FifthInternational Workshop and Conference on Human LeukocyteDifferentiation Antigens)(Boston，MA；November 3-7，1993)得到抗CD20单克隆抗体1F5(Shan等，(1999)J.Immunol.162：6589-6595)、B9E9(Schultz等，(2000)Cancer Res.60：6663-6669)和1H4(Haisma，etat.(1998)Blood92：184-190)。从Beckman-Coulter(Miami，FL)得到的B1抗CD20单克隆抗体(Stashenko等，(1980)J.Immunol.125：1678)用作纯化的单克隆抗体或稀释的腹水。 
细胞内Ca2+的测定 
在用山羊F(ab’)2抗IgM抗体(5-40μg/mL；Cappel/ICNPharmaceuticals，Inc.，Aurora，OH)、抗小鼠CD19单克隆抗体(MB19-1；40μg/mL)、毒胡萝卜素(1μM；Sigma，St.Louis，MO)或者离子霉素(2.67μg/mL；CALBIOCHEM
Figure G04816092719960328D000521
Biosciences，Inc.，La Jolla，CA)处理细胞之后，使用标准方法(Shan等，(1998)Blood 91：1644)通过流式细胞术检测[Ca2+]i水平的变化。在一些情况下，在上述的试剂处理之后向细胞悬浮液中加入EGTA(终浓度5mM)。 
B细胞活性测定 
通过使用Thy1.2抗体包被的磁珠(DYNALInc.，Lake Success，NY)去除T细胞来纯化脾脏B细胞(＞93％B220+)。为了进行信号转导研究，在加入F(ab’)2抗小鼠IgM抗体片段(40μg/mL)之前将B细胞于37℃在含有5％胎牛血清的RPMI 1640培养基中孵育(2×107/mL)5分钟。在加入含有400μM EDTA和100μM正钒酸钠的冷的盐溶液后，使用建立的良好的方法(Bradbury等，(1992)J.Immunol.149：2841；Fujimoto等，(1999)J.Immunol.162：7088)用去污剂裂解细胞。对于CD20的结构研究，用EZ-LINKTM硫代-NHS-生物素(0.5mg/mL；Pierce，Rockford，IL)将B细胞进行表面生物素化，然后用去污剂裂解。将细胞裂解液用IgG1单克隆抗体(1μg)和50μL 50％的G蛋白-SEPHAROSETM悬浮液(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)预清除，并且使用2μg单克隆抗体和G蛋白-SEPHAROSETM将蛋白质免疫沉淀。将珠子用高盐和低盐RIPA缓冲液洗涤两次，用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤两次，然后在上样缓冲液(含有或不含有10％的β-巯基乙醇)中煮沸、电泳并转移至硝酸纤维素膜上。将全细胞裂解液的印迹膜用MB20-1单克隆抗体、过氧化物酶缀合的4G10抗体(UpstateBiotechnology，Lake Placid，NY)或者用抗磷酸化CD19(Y513)、抗磷酸化PLCγ(Y783)、抗磷酸化Syk(Y525/Y526)、抗磷酸化BTK(Y223)、抗磷酸化Src家族激酶抗体(Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，MA)或者抗活化MAPK抗体(PROMEGA
Figure G04816092719960328D000523
，Madison，WI)杂交。将膜洗掉探针并用兔 抗SHP-1多克隆抗体(Upstate Biotechnology)、或者抗Lyn(lyn-44)、抗Fyn(Fyn3)和抗ERK2(C-14)抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)再次杂交。使用链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(SouthernBiotechnology Assoc.，Birmingham，AL)和增强化学发光试剂盒(ECLTM；Pierce，Rockland，IL)检测生物素化的蛋白质或抗体。 
为了研究CD20的磷酸化，将原代B细胞(107/mL)在脂多糖(LPS)(大肠杆菌血清型0111:B4，10μg/mL，Sigma，St.Louis，MO)存在的条件下培养48小时。然后将原代B细胞和细胞系在无磷酸盐培养基中培养1小时，在含有200μCi/mL[32P]正磷酸盐(PerkinElmer，Boston，MA)的培养基中培养90分钟，洗涤，裂解，免疫沉淀并通过SDS-PAGE分离，然后按照标准的方法进行放射自显影(Kansas和Tedder(1991)J.Immunol.147：4094；Leveille等，(1999)Eur.J.Immunol.29：65)。 
功能测定 
通过[3H]胸腺嘧啶核苷参入的标准方法(Engel等，(1995)Immunity3：39)测定脾脏B细胞增殖。用2，4-二硝基苯酚缀合的匙孔血蓝蛋白(100μg，DNP-KLH；CALBIOCHEM 
Figure G04816092719960328D000531
-Novabiochem，La Jolla，CA)免疫8周龄小鼠，或者用按照众所周知的方法(Jacob等，(1991)J.Exp.Med.173：1165)在铝中沉淀的(4-羟基-3-硝基苯基乙酰基)缀合的鸡丙种球蛋白(50μg，NP18-CGG)免疫8周龄小鼠两次。通过ELISA(Engel等，(1995)Immunity 3：39；Takahashi等，(1998)J.Exp.Med.187：885)测定血清DNP和NP特异抗体的水平，使用标准方法(Takahashi等，(1998)J.Exp.Med.187：885)评价了抗体反应的相对亲和性/亲和力。 
免疫治疗 
将200μL PBS中的无菌抗小鼠CD20和同种型对照单克隆抗体(0.5-250μg)通过外侧尾部静脉注射。除非另外指出，所有实验均使用250μg单克隆抗体。在治疗后1小时和2、4、7、28、48、50、52、54、56或58 天收集血液和肾脏。在红细胞裂解后通过血细胞计数器定量血液白细胞的数量，通过使用免疫荧光染色和流式细胞术分析确定B220+B细胞的频度。使用Oncology Tool Dose Calculator(www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)比较了在人和小鼠中的抗体剂量(表7)。 
补体测定 
通过使用Thy1.2抗体包被的磁珠(DYNAL
Figure G04816092719960328D000541
，Lake Success，NY)去除T细胞来纯化野生型小鼠脾脏B细胞(＞93％B220+)。按照标准的方法(Gazzano-Santoro等，(1997)J.Immunol.Methods 202：163-171)定量了补体介导的体外杀B细胞作用。用每一抗CD20单克隆抗体(0.5μg/mL)和幼兔补体(稀释50倍；GIBCO-BRL，Grand Island，NY)与脾脏B细胞于37℃孵育2小时。向每一管中加入PBS并于37℃孵育4小时，然后洗涤细胞并用碘化丙啶(PI)和抗B220单克隆抗体染色，通过流式细胞术分析测定碘化丙啶的排斥。 
重链和轻链基因的利用 
使用RNEASY
Figure G04816092719960328D000542
小提试剂盒(QIAGEN
Figure G04816092719960328D000543
，Chatsworth，CA)从1-10×105 个杂交瘤细胞中提取胞质RNA。使用oligo-dT引物(dT18)和SUPERSCRIPTTM试剂盒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)从胞质RNA合成第一链cDNA。使用1μL的cDNA溶液作为模板用于VH基因的PCR扩增。PCR反应在100μL体积的反应混合物中进行，反应混合物由10mMTris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP(Perkin Elmer，Foster City，CA)、50pmol的每一引物和5单位Taq DNA聚合酶(ISCBioexpress，Kaysville，UT)组成。扩增30个循环(94℃1分钟，58℃1分钟，72℃ 1分钟；循环变温器，PerkinElmer)。使用本领域众所周知(Kantor等，(1996)J.Immunol.158：1175-1186)的混杂的正义5’VH引物(MsVHE；5’GGG AAT TCG AGG TGC AGC TGC AGG AGT CTG G 3’；SEQ ID NO：110)和与Cμ编码区互补的反义引物(引物Cμ-in；5’GAG GGG GAAGAC ATT TGG GAA GGA CTG 3’；SEQ ID NO：111)、与Cγ区互补的反义引物(引物Cγ1；5’GAG TTC CAG GTC ACT GTC ACT GGC 3’；SEQID NO：112)或者与Cα区互补的反义引物(引物Cα；5’GTG AAT TCA GGCGGC CGC TAA 3’；SEQ ID NO：113)扩增VH基因。使用Vκ正义引物(表1)和Cκ反义引物(5’ACT GGA TGG TGG GAA GAT G 3’；SEQ IDNO：114)扩增轻链cDNA。使用QIAQUICK凝胶纯化试剂盒(QIAGEN
Figure G04816092719960328D000552
)从琼脂糖凝胶中纯化扩增的PCR产物，并且在使用具有AMPLITAQ
Figure G04816092719960328D000553
 DNA聚合酶的Perkin Elmer染料终止测序系统和首次PCR扩增中的相同引物扩增之后使用ABI 377 PRISM
Figure G04816092719960328D000554
DNA测序仪双向直接测序。所有VH 和轻链区均在正义和反义DNA链上完全测序(图14和图17)。 
表1 
Figure G04816092719960328D000561
Leu-16也叫做L27。 
#8和10的氨基酸序列相同，不同之处是重链中有一对碱基不同且轻链中有三对碱基不同。 
抗人和抗小鼠CD20单克隆抗体的重链和轻链CDR序列分别列于表2和表3。 
表2 
  抗体   CDR1   CDR2   CDR3
  HB20-1，2，6   HB20-03     HB20-04   HB20-05   HB20-25   SYNMH  SEQ ID NO：57  NYNMH  SEQ ID NO：58  NYNMH  SEQ ID NO：58  SYNMH  SEQ ID NO：57  NYNLH  SEQ ID NO：59   AIYPGNGDTSYNQKFKG  SEQ ID NO：65  AIYPENGDTSYNQKFKG  SEQ ID NO：66  AIYPENGDTSYNQRFKG  SEQ ID NO：67  AIYPGNGDTSYNQKFKG  SEQ ID NO：65  AIYPGNGETSYNQKFKG  SEQ ID NO：68   WDYYGSSYVGFFDY  SEQ ID NO：75  FYYYGSYYGAMDY  SEQ ID NO：76  FYYYGSYYGALDY  SEQ ID NO：77  WDYYGSSYVGFLTT  SEQ ID NO：78  FYYYGSSYGAMDY  SEQ ID NO：79
  MB20-1，13   MB20-02   MB20-07     MB20-8，10   MB20-11     MB20-14   MB20-16   MB20-18   DYGMA  SEQ ID NO：60  DYYIK  SEQ ID NO：61  DYYMK  SEQ ID NO：62  DYYMK  SEQ ID NO：62  DYNMH  SEQ ID NO：63  DYYIK  SEQ ID NO：61  DYNLH  SEQ ID NO：64  DYYMK  SEQ ID NO：62   FISNLAYSIYYADTVTG  SEQ ID NO：69  DINPNNGDTIYNQKFKG  SEQ ID NO：70  DINPNNGDTTYNQKFEG  SEQ ID NO：71  DINPNNGDIIYNQKFEG  SEQ ID NO：72  YIAPYNGGTTYNQKFKG  SEQ ID NO：73  DINPNNGDTIYNQKFKG  SEQ ID NO：70  YINPNNGGATYNQKFTG  SEQ ID NO：74  DINPNNGDIIYNQKFEG  SEQ ID NO：72   TGYYALFDY  SEQ ID NO：80  ERFAY  SEQ ID NO：81  ERFAY  SEQ ID NO：81  ERFAY  SEQ ID NO：81  ALDY  SEQ ID NO：82  ERFAY  SEQ ID NO：81  IYDGYY  SEQ ID NO：83  ERFAY  SEQ ID NO：81
表3 
  抗体   CDR1   CDR2   CDR3
  HB20-1，2，6   HB20-03     HB20-04   HB20-05   HB20-25   KASQNVGTNVA  SEQ ID NO：84  RASGNIHNYLA  SEQ ID NO：85  RASGSIHNYLA  SEQ ID NO：86  KASQNVGTNVA  SEQ ID NO：84  RASENIYSNLA  SEQ ID NO：87   SASYRNS  SEQ ID NO：94  NAKTLAD  SEQ ID NO：95  NAKTLAD  SEQ ID NO：95  SASYRYS  SEQ ID NO：96  AATNLAD  SEQ ID NO：97   QQYNSSPFT  SEQ ID NO：101  QHFWSTPWT  SEQ ID NO：102  QHFWSIPWT  SEQ ID NO：103  QQYNSSPFT  SEQ ID NO：101  QHFWGIPWT  SEQ ID NO：104
  MB20-1     MB20-2，14     MB20-03   MB20-07   MB20-8，10   MB20-13   MB20-18   KSSQSVLYSSKRKNYLA  SEQ ID NO：88  SVSSSIRSNYLH  SEQ ID NO：89  SASSSISSNYLH  SEQ ID NO：90  SVSSSIRSNYLH  SEQ ID NO：89  SVSSNIRSNYLH  SEQ ID NO：91  SASSSITSNYLH  SEQ ID NO：92  KASQTVTNDLA  SEQ ID NO：93   WASTRES  SEQ ID NO：98  RTSNLAS  SEQ ID NO：99  RTSNLAS  SEQ ID NO：99  RTSNLAS  SEQ ID NO：99  RTSNLAS  SEQ ID NO：99  RTSNLAS  SEQ ID NO：99  YASNRYT  SEQ ID NO：100   HQYLSSFT  SEQ ID NO：105  QQGSSIPLT  SEQ ID NO：106  QQGSSIPLT  SEQ ID NO：106  QQGSSLPLT  SEQ ID NO：107  QQGSSIPLT  SEQ ID NO：106  QQGSSKTLT  SEQ ID NO：108  QQDYSSPLT  SEQ ID NO：109
抗体序列比对 
来自产生抗CD20单克隆抗体的已知杂交瘤的重链和轻链序列是来自1F5(Shan等，(1999)J.Immunol.162：6589-6595)、B9E9(Schultz等，(2000)Cancer Res.60：6663-6669)、2H7(美国专利号6,120,767)、2B8(美国专利号5,843,439)、1H4(Haisma等，(1998)Blood 92：184-190)、Leu-16(Wu等，(2001)Protein Eng.14：1025-1033)。 
统计学分析 
所有的数据显示为平均值±SEM。使用Student t-检验确定种群平均值间的显著性差异。 
实施例2：CD20-/-小鼠的产生 
打靶载体用新霉素抗性基因取代了CD20中编码部分第二胞外环、第四跨膜结构域和大的羧基末端胞质结构域的外显子(图1A-1D)。使用靶向ES细胞产生建立者小鼠，将建立者的杂合后代杂交，按照孟德尔的频率产生了Cd20基因破坏的纯合小鼠。对纯合后代基因组DNA的Southern印迹和PCR分析进一步证实了正确的Cd20基因靶向和外显子6-8的基因组 缺失(图1E和图IF)。如通过对CD20-/-小鼠脾细胞cDNA的PCR扩增所证实，在CD20-/-小鼠中缺乏野生型的CD20mRNA(图1G)。通过PCR在CD20-/-小鼠中检测到低水平的CD20-Neor融合基因转录本，该转录本翻译出一个与Neor基因启动子序列所编码的88个氨基酸的肽融合的在第157位氨基酸截短的异常CD20肽。使用一组12个小鼠抗小鼠CD20单克隆抗体证实在CD20-/-小鼠中缺乏细胞表面CD20的蛋白质表达，该组单克隆抗体与用CD20-GFP cDNA转染的300.19和CHO细胞发生免疫反应，但是不与非转染细胞发生免疫反应(图1H)。这些单克隆抗体与来自野生型小鼠的CD19+脾细胞所表达的细胞表面CD20表位反应，但不与来自CD20-/- 小鼠的CD19+脾细胞发生反应(图1I)。因此，靶向Cd20基因的突变消除了细胞表面CD20的表达。 
实施例3：CD20-/-小鼠中B细胞的发育 
在所观察的9年内，CD20-/-小鼠同它们的野生型同窝小鼠一样能够正常生长和繁殖，并且在第一年不存在任何明显的解剖学和形态学异常或易于感染。CD20-/-小鼠在骨髓中具有正常频度的IgM-B220lo祖/前B细胞、IgM+B220lo未成熟B细胞和IgM+B220hi成熟B细胞(图1J，表4)和正常数量的AA4.1+或HSAhi B220lo未成熟/过渡B细胞。在CD20-/-小鼠和它们的野生型同窝小鼠中，血液、脾脏和淋巴结IgM+B220+B细胞的数量没有显著差异(表4)。 
表4 
Figure G04816092719960328D000601
a数值代表来自3-10个野生型和CD20-/-2月龄同窝小鼠的表达所指明细胞表面标记物的淋巴细胞(根据侧向和前向散射特性)数目或百分数的平均值(±SEM)。 
b根据从每一组织获得的细胞总数计算出的B细胞数。 
c数值表示每毫升的细胞数。 
d一对腹股沟淋巴结的数值。 
＊意味着与野生型同窝小鼠具有显著性差异，p＜0.05；＊＊p＜0.01。 
与野生型同窝小鼠的未成熟和成熟B细胞相比，在CD20-/-小鼠中B细胞IgM表达显著较低(表4，图1J)。此外，在CD20-/-同窝小鼠脾脏中，IgMhi B220lo B细胞数降低～50％。降低的IgMhi B220lo B细胞数反映在大多数B细胞中降低的IgM表达，但是由于在CD20-/-和野生型同窝小鼠中CD1dhiCD21+表型的细胞数没有显著的差异(表4)，所以降低的IgMhi B220lo B细胞数并不导致边缘区B细胞的损失。同样，代表从骨髓新近迁移来的过渡T1(CD21loHSAhi)和T2(CD21hiHSAint)B细胞数没有减少(表4)。相反，通常在CD20-/-小鼠中T1细胞数的频度和数量较高，这与在CD20-/-小鼠骨髓中观察到的成熟IgM+B220hi B细胞的频度增加相似。因为在CD20-/-小鼠腹膜腔中CD5+B220lo B1a细胞数降低64％，所以IgMhiB220lo B细胞数的降低部分地助于脾脏B1细胞的减少。在CD20-/- 和野生型同窝小鼠中腹腔IgM+B220+B细胞的总数相似是因为CD5-B220hi B细胞数的增加(表4，图1J)。在CD20-/-和野生型同窝小鼠中B1b B细胞(CD11b+CD5-B220lo)数相似(表4)。从CD20-/-小鼠骨髓、血液、淋巴结或者脾脏分离的B细胞大小(光散射特性)与来自野生型同窝小鼠的B细胞相 比没有明显的差别。对脾脏组织切片的免疫组织化学分析表明B220+B细胞具有正常的结构和组织。因此，CD20表达除了导致降低IgM表达、减少脾脏IgMhiB220lo B细胞亚型以及降低腹膜腔内B1细胞数以外，CD20表达对于B细胞发育和组织定位是不需要的。 
实施例4：CD20-/-B细胞功能 
将纯化的CD20-/-B细胞对一定范围抗体浓度(1-40μg/mL)的表面IgM连接的增殖反应与野生型的B细胞进行比较(图1K)。当B细胞通过一定浓度(0.1-10μg/mL)LPS(图1K)活化或者使用IL-4(10-100U/mL)和亚最佳浓度(5μg/mL)抗IgM抗体活化时，增殖仍然正常。因此，CD20的丧失对促细胞分裂原诱导的增殖没有可检测的影响。在CD20-/-小鼠的血清中所有Ig的同种型均为正常水平(图1L)。CD20-/-小鼠还可以产生所有同种型的初次和二次抗体应答，这与在用T细胞依赖抗原DNP-KLH免疫野生型同窝小鼠后所观察到的结果相似(图1M)。此外，在用NP-CGG(每组5只小鼠)免疫后，CD20-/-小鼠和它们的野生型同窝小鼠产生相当的初次和二次IgM和IgG1抗NP的抗体应答。而且，在CD20-/-小鼠中产生的初次和二次IgG1抗NP抗体应答的亲和性与它们的野生型同窝小鼠中产生的相似。因此，在体液免疫反应产生过程的T-B细胞的相互作用、同种型转换或亲和力成熟中不需要CD20的功能。 
实施例5：B细胞发育过程中CD20的表达 
使用一组小鼠抗小鼠CD20单克隆抗体在两种前B细胞系(300.19和38B9)和两种T细胞系(BW5147和BL4)没有见到细胞表面蛋白质CD20的表达，而70Z前B细胞系、A20和AJ9成熟B细胞系和NS-1浆细胞瘤细胞为CD20+的(图1H和图2A)。同样，骨髓中只有一些B220+细胞的亚型表达CD20(图2B)；30±3％的B220lo淋巴细胞为CD20+，而所有的B220hi B细胞为CD20+(n＝6只小鼠)。在骨髓CD19+细胞中，CD20+细胞具有相似的组成比例(51±2％；n＝6)。与此相一致，CD43+B220+祖B细胞不表达CD20， 而10±1％(n＝3)的CD43-IgM-B220lo前B细胞以低密度表达CD20(图2G)。根据其光散射特性可见所有的CD20+前B细胞(CD43-IgM-B220lo)是小的，这表明CD20的表达主要起始于重链表达之时或附近时间。与此相一致，大多数未成熟的IgM+B220lo B细胞表达CD20(76±9％，n＝3；组分I，图2G)。骨髓中未成熟IgMhi B220+B细胞(组分II，图2G)或者CD19lo B细胞的亚群表达的CD20比成熟B220hi B细胞(组分III，图2G)或者CD19hi B细胞(图2B)表达的密度高277±53％(n＝3)。因此，在小的前B细胞向未成熟B细胞过渡过程中CD20第一次表达，随着B细胞的成熟CD20表达增加并且此后随着进入再循环B细胞的成熟B220hi池CD20表达降低。 
在脾脏、血液、外周淋巴结和腹膜腔中，绝大多数的IgM+或B220+B细胞表达CD20(图2C-2F)。在血液(9±1％，n＝3)和脾脏(7±2％，n＝3)B细胞中观察到小部分CD20hi B220lo细胞亚群的(图2C和图2E)。脾脏中的CD20hiB220lo B细胞主要是过渡T1和T2 B细胞(图2H)并且很可能是从骨髓新近迁移进入的细胞。T1细胞(CD21loHSAhi)表达的CD20比成熟B细胞表达的CD20的密度高139±23％(n＝3)，而T2细胞(CD21hiHSAhi)表达的CD20的密度比其高58±11％(n＝3)。T1细胞(CD21-CD23-IgMhi)和边缘区B细胞(CD21+CD23-IgMhi)(Loder等，(1999)J.Exp.Med.190：75)也以比大多数脾脏B细胞表达水平更高的水平表达CD20(图2I)。在一些小鼠中观察到少量的CD20-外周B细胞，但是数量一般小于B220+细胞的2％。在腹膜腔中，CD5+和CD5-B细胞表达的CD20相似(图2F)。在所检测的任何组织中，其它亚群的淋巴细胞没有可检测水平的CD20表达。因此，小鼠CD20专一表达于B细胞中并且其表达在小的前B细胞成熟晚期开始。 
实施例6：CD20的结构特征 
通过使用与小鼠CD20反应的MB20-1单克隆抗体和与人CD20的细胞质表位反应的PB4单克隆抗体，从表面标记的B细胞系中沉淀小鼠和人CD20分子从而对它们进行比较。在非还原条件下，小鼠CD20比人CD20迁移更快，但是它们仍然以至少两个分子量(Mr)为33,000和35,000的不同 分子迁移(图3A)。在还原条件下，小鼠CD20以至少两个分子量为40,000和42,000的分子迁移(图3A)。如人CD20分子一样(Tedder等，(1988)Molec.Immunol.25：1321；Deans等，(1993)J.Immunol.151：4494)，多种细胞表面分子与小鼠CD20共沉淀。在共沉淀人CD20相关分子方面，PB4单克隆抗体比能够与CD20细胞外结构域反应的单克隆抗体更好。因为在western印迹分析中MB20-1单克隆抗体只与小鼠CD20反应并且MB20-1单克隆抗体不能从CD20-/-小鼠B细胞裂解液中沉淀出CD20或其它蛋白质(图3B)，所以在小鼠中CD20相关分子的共沉淀不是因为单克隆抗体的交叉反应。出乎意料的是，甚至在佛波酯(PMA)处理后，在静息的原代小鼠B细胞、抗IgM抗体或者LPS活化的B细胞、或B细胞系中小鼠CD20不是主要的磷蛋白(图3C)，这与人B细胞是一样的(Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.263：10009；Genot等，(1993)J.Immunol.151：71)。如人CD20的特征一样(Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.263：10009；Valentine等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：8085)，在LPS活化的未成熟细胞或B细胞系中，PMA诱导的CD20的磷酸化没有明显导致CD20蛋白质分子量从迁移较快的分子向迁移较慢的分子的改变。因此，除了几个不同的特征外，小鼠和人CD20具有许多相同的结构特征。 
实施例7：在CD20-/-B细胞中降低的[Ca2+]i反应 
尽管在CD20-/-小鼠中，B细胞发育正常，但是在使用最佳浓度(40μg/mL；图4A)和亚最佳浓度(5μg/mL)的抗IgM抗体进行IgM连接之后，与野生型B细胞相比CD20-/-小鼠脾脏B220+B细胞对[Ca2+]i反应降低。在CD20-/-B细胞中即刻[Ca2+]i反应的动力学没有改变。然而，在CD20-/-B细胞中最大[Ca2+]i增加的幅度低34±4％(p＜0.001，n＝9)，同样地，在以后的时间点观察到的所维持的升高水平也较低。在CD20-/-和野生型B细胞中，通过EGTA螯合细胞外的Ca2+降低了IgM交联后的[Ca2+]i增加的动力学和幅度。与野生型B细胞相比，在CD20-/-B细胞中EGTA存在条件 下[Ca2+]i反应的最大幅度降低了38±7％(p＜0.002，n＝7)。 
与野生型B细胞相比，在CD20-/-B细胞中CD19诱导的[Ca2+]i反应显著降低(70±4％，p＜0.001，n＝5)(图4B)。较低的[Ca2+]i反应不是源自CD20-/-B细胞中降低的CD19表达(图4D)。在野生型和CD20-/-两种B细胞中，使用EGTA将细胞外的Ca2+螯合大部分消除了CD19诱导的[Ca2+]i反应。由于与野生型B细胞相比，在CD20-/-B细胞中毒胡萝卜素和离子霉素诱导的[Ca2+]i反应的平均值略高(图4C)，所以CD20-/-B细胞在IgM或者CD19连接之后[Ca2+]i反应的降低可能不是源自内部的Ca2+储存或者外部Ca2+ 浓度的不同。在CD20-/-B细胞中[Ca2+]i反应的降低也不可能源自遗传背景的不同。CD20-/-小鼠和它们的野生型同窝小鼠是从129品系的ES细胞产生的，但是与C57BL/6小鼠回交至少7代。在对照实验中，对于C57BL/6、(C57BL/6×129)F1和129 B细胞(n＝4)而言，如果IgM诱导和CD19诱导的[Ca2+]i反应不是相同的话，则它们也是相似的。因此，CD20-/-小鼠中降低的[Ca2+]i反应很可能来自CD20功能的缺乏，而不是背景的差异。由于在CD19交联之后所观察到的[Ca2+]i反应主要取决于Ca2+流量并且在CD20-/- 小鼠中CD19诱导的[Ca2+]i反应明显地被扰乱，所以CD20的功能对于跨膜Ca2+转运特别重要。 
实施例8：CD20-/-B细胞中的信号转导作用 
通过确定IgM连接后纯化B细胞总的胞内蛋白酪氨酸磷酸化来鉴定CD20缺失对B细胞跨膜信号转导作用的影响。虽然在个别实验的个别小鼠B细胞中观察到一些变异，但是来自CD20-/-和野生型同窝小鼠的静息脾脏B细胞中酪氨酸磷酸化的总体水平是相似的(图5A)。在IgM连接后，来自CD20-/-和野生型同窝小鼠的B细胞中的蛋白质酪氨酸磷酸化也是相似的。在来自CD20-/-和野生型同窝小鼠的B细胞中，IgM下游的单个信号分子的磷酸化也是相似的，这些信号分子包括Lyn和其它Src激酶、PLCγ、CD19、BTK和MAP激酶(图5B)。因此，CD20的缺乏不可能明显改变基础的或者IgM诱导的跨膜信号。 
实施例9：抗CD20单克隆抗体体内消除B细胞 
评价了代表每种IgG同种型的12种小鼠抗小鼠CD20单克隆抗体体内结合B细胞并消除它们的能力。每一单克隆抗体一致地与CD19+原代B细胞反应，并且具有不依赖单克隆抗体同种型的特征性平均荧光强度(图6A)。当使用一定范围的单克隆抗体浓度评价单克隆抗体与原代B细胞的反应性时，在1-10μg/mL浓度范围内时大多数抗体达到了染色的饱和水平(图6B)。当平均后，在大约0.5μg/mL的单克隆抗体浓度时达到了单克隆抗体染色最大对数刻度的50％(箭头，图6B)。当所有单克隆抗体以0.5μg/mL使用时，每一单克隆抗体与CD19+原代B细胞一致反应，并且具有低或高的特征性平均荧光强度(图6C，表5)。使用小鼠CD20 cDNA转染的前B细胞系并使用抗小鼠Ig级次抗体得到了相似的结果。基于该分析，MB20-1单克隆抗体是具有最低相对亲和力/亲和性的抗体，而MB20-18单克隆抗体与B细胞强烈反应并且染色B细胞的水平是12种抗CD20单克隆抗体中最高的(表5)。因此，每一单克隆抗体与B细胞特异反应，并且如通过流式细胞术所评价，它们表现出比较好的结合特性。 
表5 
Figure G04816092719960328D000651
a数值代表用0.5μg/mL的每种MB20单克隆抗体对脾脏CD19+B细胞免疫荧光染色的平均线性荧光强度(图6C)。使用同种型特异的次级抗体显示脾细胞的染色。在所有情况下对照染色≤6。 
b数值(±SEM)显示与同种型匹配对照单克隆抗体处理相比，用单克隆抗体处理(n≥3)7天后从血液或脾脏中消除的B220+B细胞的％。 
以每只小鼠250μg的量将每一抗小鼠CD20单克隆抗体给与小鼠，该单一剂量相当于比375mg/m2的剂量低大约10倍的量，其中375mg/m2的剂量是在人类抗CD20治疗中给与四次的剂量(Press等，(2001)Hematology：221-240；Kaminski等，(1993)N.Engl.J.Med.329：459-465；Weiner(1999)Semin.Oncol.26：43-51；Onrust等，(1999)Drugs58：79-88；McLaughlin等，(1998)Oncology 12：1763-1769)。在这些条件下，多重单克隆抗体对外周B细胞数量具有有效和持久的作用，而其它单克隆抗体具有异质的体外作用(图7)。单克隆抗体在2天内诱导B细胞从循环中的消除和在7天内诱导B细胞从脾脏中消除的效果与单克隆抗体的同种型密切相关(表5，图7A和图7B)，次序为IgG2a＞IgG1＞IgG2b＞IgG3。MB20-11和其它IgG2a单克隆抗体(MB20-6和MB20-16)消除＞95％的血液B细胞和大约93％的脾脏B细胞。少量的剩余外周B细胞主要代表着从骨髓迁移入的表型上不成熟的细胞。当给与如0.5μg/小鼠的较低的单一剂量时，MB20-11单克隆抗体消除了显著数量的循环B细胞，而要在7天内显著消除脾脏B细胞则需要5倍的mAb量(2.5μg/小鼠)(图7C)。同样惊人的发现是单一注射MB20-11单克隆抗体能够在单克隆抗体处理1小时之内消除循环B细胞，持续的作用可以维持B细胞开始重新进入循环和脾脏之前的大约57天时间(图7D)。通过比较，没有一种单克隆抗体能够处理CD20-/-小鼠时具有显著的作用，并且在同样的条件下用同种型对照单克隆抗体处理不影响B细胞数量(图7)。同样，在抗CD20单克隆抗体治疗的小鼠中，循环和组织Thy1.2+T细胞数没有变化(图7A)，这与限制B细胞表达CD20时的结果一致。 
实施例10：FcγR在B细胞消除中的作用 
使用FcγR缺失小鼠(Takai等，(1994)Cell 76：519-529)确定了先天免疫系统在抗CD20单克隆抗体处理的B细胞消除中的作用。小鼠效应细胞表达IgG的三类不同FcγR：高亲和性的FcγRI(CD64)和低亲和性的FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)分子(Ravetch和Clynes(1998)Ann.Rev.Immunol.16：421-432)。FcγRI和FcγRIII是异源寡聚复合物，其中各自的结合配体的γ链与共同的γ链(FcRγ)结合。在FcγR装配中和效应细胞功能(包括巨噬细胞的吞噬作用和NK细胞的细胞毒作用(Takai等，(1994)Cell76：519-529))的FcγR激发中需要FcRγ链的表达。高亲和性的FcγRI优先结合单体的次序为IgG2a＞IgG2b＞IgG3/IgG1，而两个低亲和性的受体结合不同同种型的多聚体IgG(Fossati-Jimack等，(2000)J.Exp.Med.191：1293-1302)。FcγRIII结合次序是IgG2a＞IgG1＞IgG2b＞＞IgG3(Fossati-Jimack等，(2000)J.Exp.Med.191：1293-1302)。 
与在野生型小鼠中几乎完全消除B细胞(图7)相比，在FcRγ-/-小鼠中MB20-11单克隆抗体处理后4天后仅减少了20-35％的循环B细胞数(图8A)，并且从第7天至第18天没有作用。而且，与用对照单克隆抗体处理的同窝小鼠相比，在FcRγ-/-小鼠中MB20-11单克隆抗体处理实际上增加了脾脏B细胞数(图8B和图8C)，这主要是由于未成熟的B细胞数增加了。同种型匹配对照单克隆抗体在FcRγ-/-小鼠中没有明显的作用。在FcγRI-/- 小鼠中MB20-11单克隆抗体在1小时时开始诱导B细胞数的降低，但是在第2天不完全地消除了循环B细胞。在FcγRI-/-小鼠中，MB20-11单克隆抗体只是部分地消除B细胞，并且与对照单克隆抗体处理的同窝小鼠相比，还有21％的脾脏B细胞维持到第7天。通过比较，MB20-11单克隆抗体能够在7天内消除野生型、FcγRII-/-和FcγRIII-/-小鼠中≥95％的循环和组织B细胞。使用两个独立的FcγRIII-/-小鼠系(Bruhns等，(2003)Immunity 18：573-581；Hazenbos等(1996)Immunity 5：181-188)得到了与本文所观察一样的结果。FcRγ链的缺乏能够对IgG1 MB20-1和IgG2bMB20-18单克隆抗体导致的B细胞消除产生相似的作用。MB20-1单克隆 抗体处理FcγR-/-小鼠后没有导致循环B细胞显著降低，而在野生型小鼠中循环B细胞被消除了(图8D)。同样，MB20-1单克隆抗体处理FcRγ-/-小鼠后没有导致脾脏B细胞显著降低，而在野生型小鼠中脾脏B细胞数降低93％。MB20-18单克隆抗体处理FcRγ-/-小鼠后导致循环B细胞显著降低，但是没有达到在野生型小鼠中出现的程度(图8E)。然而，MB20-18单克隆抗体处理FcRγ-/-小鼠后没有导致脾脏B细胞显著降低，而在野生型小鼠中脾脏B细胞数降低74％。因此，抗CD20单克隆抗体治疗主要通过需要FcRγ链表达的途径消除B细胞。 
实施例11：补体在B细胞消除中的作用 
由于认为补体活化是抗CD20单克隆抗体治疗过程中B细胞消除的主要机制，所以使用补体缺乏(Wessels等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：11490-11494))和C1q缺乏(Zhang等，(1999)Immunity10：323-332)小鼠确定了补体在抗CD20单克隆抗体处理所导致的B细胞消除中的作用。首先在体外确定了每个抗CD20单克隆抗体的补体激活能力。在补体存在的情况下，大多数抗CD20单克隆抗体诱导显著的B细胞裂解，如通过相对于同种型匹配对照单克隆抗体的碘化丙啶摄入所显示，但不同的抗体其细胞毒性能力会有所变化(图9A)。在这些体外分析中，如果没有补体存在，则没有一种抗CD20单克隆抗体能够诱导B细胞发生PI摄入或者程序性细胞死亡。虽然MB20-11单克隆抗体也能有效的体外诱导显著的补体介导的B细胞裂解，但是MB20-18单克隆抗体启动了最有效的补体依赖的B细胞裂解。然而，每一单克隆抗体体外诱导补体依赖的杀B细胞的能力与每一单克隆抗体体内消除B细胞的能力是不相关的(图7B)。然而，MB20-11单克隆抗体有效地清除了C3-/-和C4-/-小鼠中的全部血液B细胞和≥90％的脾脏B细胞(图9B)。该观察结果不是单克隆抗体同种型特异的，因为MB20-1和MB20-18单克隆抗体在C3-/-和野生型小鼠中以相似的程度有效消除了血液和脾脏B细胞(图9C和图9D)。因此，抗CD20单克隆抗体的治疗主要通过FcγR依赖和C3、C4和C1q不依赖机制消除B细胞。 
实施例12：单核细胞介导的体内B细胞消除 
由于抗CD20单克隆抗体治疗的消除能力与单克隆抗体同种型和FcγR表达直接相关，所以确定了NK细胞、T细胞和巨噬细胞对FcγR介导的B细胞消除的贡献。通过用脂质体包封的氯膦酸盐处理会产生呈现巨噬细胞缺乏的小鼠，在用MB20-11单克隆抗体处理该种小鼠1小时没有显著消除循环B细胞，并且在到达7天时仍具有正常数量的循环B细胞(图10A)。同样地，与对照单克隆抗体处理的同窝小鼠相比，在氯膦酸盐处理的小鼠中脾脏B细胞数量在第7天仅降低39％(图10B)。由于CSF-1缺乏(CSF-1op)导致产生了巨噬细胞亚群发生组织特异性缺失的小鼠(Cecchini等，(1994)Development 120：1357-1372)，在用MB20-11单克隆抗体处理后该小鼠也表现出循环B细胞的清除并且在第7天只有84％的表型成熟的脾脏B细胞被消除(图10)。通过比较，缺乏功能性T细胞的无胸腺裸鼠和LAT-/-小鼠(Zhang等，(1999)Immunity 10：323-332)消除＞96％的血液和脾脏B细胞。同样，在NK细胞功能缺陷的beige和perforin-/-小鼠(Kagi等，(1994)Nature369：31-37)中抗CD20单克隆抗体处理去除了大约95％的循环B细胞和脾脏B细胞(图10)。这些发现表明CSF-1依赖和不依赖的巨噬细胞亚型是体内CD20+B细胞消除的主要效应细胞，并且基本上排除了T细胞、NK细胞和穿孔蛋白依赖的机制。 
实施例13：单克隆抗体的序列分析 
在大多数B淋巴细胞的细胞表面分子中CD20是独特的，因为只有相对小部分的分子表达于细胞表面，据估计大约为42个氨基酸。因此，由于空间的限制大多数抗CD20单克隆抗体阻断了与其它抗CD20单克隆抗体的结合。因此这就留给人们一种印象，即大多数抗CD20单克隆抗体结合CD20蛋白质的相似(如果不是相同的话)的区域或表位，但这仍然没有证明。然而，蛋白质抗原和能够结合这些抗原特异表位的单克隆抗体之间的相互作用是复杂的，并且对于每一单克隆抗体和其特异氨基酸序列几乎是 唯一的。该水平的抗原和抗体相互作用复杂性有助于产生针对大多数抗原的多种抗体库。然而，小鼠也表达作为自身抗原的CD20这一事实限制了抗CD20抗体的多样性。因此，在正常情况下，小鼠不能产生针对人CD20中小鼠也具有的抗原决定簇的抗体，因为这些单克隆抗体会发生自身反应。因此，在正常小鼠中产生的抗CD20单克隆抗体可能结合有限数量的人CD20中存在且独特的所述表位。 
与能够针对大多数蛋白质抗原产生的多种抗体库相比，小鼠的近交品系通过产生相当多的同质抗体而对半抗原或结构简单抗原发生反应(Blier和Bothwell(1988)Immunol.Rev.105：27-43)。限制体液反应的最好实例之一是C57BL/6(Ighb)小鼠对(4-羟基-3-硝基苯基)乙酰基(NP)半抗原的反应(Imanishi和 
Figure G04816092719960328D000701
(1975)J.Exp.Med.141：840-854)。用NP偶联的蛋白质载体免疫的C57BL/6小鼠产生了具有稀有λ1轻链的血清抗体，而单独用载体蛋白质免疫实际上没有产生λ1抗体或λ1+B细胞(Imanishi和 
Figure G04816092719960328D000702
(1975)，同上； 和Karjalainen(1977)Immunol.Rev.34：119-138；Reth等，(1978)Eur.J.Immunol.8：393-400；Reth等，(1979)Eur.J.Immunol.9：1004-1013；Karjalainen等，(1980)J.Immunol.125：313-317；Weiss和Rajewsky(1990)J.Exp.Med.172：1681-1689；Jacob等，(1991)J.Exp.Med.173：1165-1175；Cumano和Rajewsky(1986)EM80J.5：2459-2466)。在抗NP反应的早期(免疫后4-8天)，大比例的抗原活化λ1+ B细胞表达与VH基因大的J558(V1)家族中所选择成员结合的多种D基因片段，其中所述的成员包括V186.2(V1S2)、C1H4、CH10、V23(V1S4)、24.8、V102(V1S7)和V583.5(Jacob和Kelsoe(1992)J.Exp.Med.176：679-687；Bothwell等，(1981)Cell 24：625-637；Allen等，(1988)EMBOJ.7：1995-2001；Jacob等，(1993)J.Exp.Med.178：1293-1307)。在免疫后10天，多数λ1+ B细胞表达V1S2至DFL16.1的重排基因，该重排基因编码具有YYGS(SEQ ID NO：115)共有氨基酸基序的富含酪氨酸的CDR3区(Weiss和Rajewsky(1990)，同上；Bothwell等，(1981)，同上；Jacob等，(1993)，同上；Cumano和Rajewsky(1985)Eur.J.Immunol.15：512-520； McHeyzer-Williams等，(1993)J.Exp.Med.178：295-305)。与λ1轻链配对的V1S.2至DFL16.1重链重排分子称作规范的抗NP B细胞抗原受体(Reth等，(1978)，同上；Reth等，(1979)，同上)，其支配着C57BL/6小鼠对NP的初级和二次体液免疫反应。因此，这些特异抗体基因片段的利用认为能够预测单克隆抗体的抗原特异性。 
在Ighb小鼠中抗NP抗体反应的同质性(Imanishi和 (1975)，同上)反映了BALB/c小鼠对磷酸胆碱的反应(Crews等，(1981)Cell 25：59-66)；在品系A的小鼠中产生抗p-azophenylarsonate抗体的反应(Pawlak等，(1973)J.Exp.Med.137：22-31)；在BALB/c和DBA/2小鼠中的2-苯基噁唑酮反应( 
Figure G04816092719960328D000712
等，(1978)J.Exp.Med.148：1644-1656)和BALB/c小鼠对多聚(Glu60-Ala30-Tyr10)的反应(Thèze和Sommé(1979)Eur.J.Immunol.9：294-301)。在这些抗体反应中低遗传变异的原因仍不清楚。限制的抗体反应与单一V基因片段(Siekevitz等，(1983)Eur.J.Immunol.13：123-132)或Igh等位基因(Siekevitz等，(1982)Eur.J.Immunol.12：1023-1032)的关联表明存在一种抗原互补性的偶然的单一最佳解决方案，这导致了具有同源V(D)J重排的少数B细胞克隆的扩大。在这种情况下，种系VH基因库中品系特异的差异将调节对结构类似分子的抗体反应。备选地，限制的抗体反应可以通过自我耐受来约束(Manser等，(1987)Immunol.Rev.96：141-162；Hande等，(1998)Immunity 8：189-198)或者取决于表达能够强有力耐受突变变化的V(D)J重排基因的淋巴细胞克隆(Manser等，(1984)Science 226：1283-1288)。不管机制如何，对所定义结构进行的抗体反应可以是同质的并且反映了抗体库内有限的反应，其中这也反映了这样一种事实，即抗体通过相似(如果不是相同的话)的分子相互作用结合同一靶抗原，其中所述的相互作用是通过抗体可变区内特异的保守氨基酸介导的。当单克隆抗体与靶抗原的相互作用主要通过抗体分子的互补决定区(CDR)内的氨基酸介导时，则骨架氨基酸对于抗原结合活性也是重要的。因此，结构相似的抗体可能结合同一抗原或者靶分子的相同区，而具有不同V区的结构相异抗体可能通过不同的分子相互作用与抗原的不同区域发生相互作 用。 
由于能够结合靶抗原同一区域的结构相似的抗体更可能结合靶抗原的同一分子部位，所以确定了所公布的抗人CD20单克隆抗体的氨基酸序列。1F5(Shan等，(1999)，同上)、B9E9(Schultz等，(2000)，同上)、2H7(美国专利号6,120,767)、2B8(美国专利号5,843,439)、1H4(Haisma等，(1998)，同上)和Leu-16(Wu等，(2001)，同上)单克隆抗体的重链和轻链V区在氨基酸序列上是同源的(图11)。这种水平的保守反映了这样一种事实，即这些单克隆抗体的每一个在核苷酸水平也是相似的。通过相似的V(D)J基因片段的组合产生了这些抗CD20单克隆抗体的重链，其中V区来自V1S121＊01基因片段，D区来自L16、Q52或SP2基因片段并且J区来自J1或J2基因片段(表1)。相似地，从V4-72＊01基因片段与来自J1＊02或J5＊01基因片段的J区产生了轻链。已知的抗CD20单克隆抗体间同质性的水平表明，这些单克隆抗体中的每一个结合人CD20上的相似或相同部位。 
通过与更大的一组抗人CD20和抗小鼠CD20单克隆抗体的比较，显示了已知的抗CD20单克隆抗体间的氨基酸序列同源性水平。为了比较，首先将已知的抗CD20单克隆抗体与具有同源核苷酸和氨基酸序列的第二组抗人CD20单克隆抗体(HB20-03、HB20-04和HB20-25)进行对比。如图12所示，使用UPGMA树(使用算术平均数的不加权配对组方法)显示重链和轻链V区间的可比较的相似性。在这些图中，树枝尖之间的水平距离是序列亲缘关系的度量。例如，已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体的重链和轻链彼此之间比与HB20-03、HB20-04和HB20-25单克隆抗体的序列之间更相似，其中在HB20-03、HB20-04和HB20-25单克隆抗体中彼此最相似。在轻链V区序列中，1H4和B9E9的序列最相似，但是与2H7、1F5和2B8单克隆抗体的序列也相当相似。同样地，HB20-3和HB20-4单克隆抗体具有相当相似的氨基酸序列，这与HB20-25单克隆抗体的相应序列相比相似性相对较小。然而，HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体的轻链序列甚至更不同于已知抗CD20单克隆抗体的序列。当将每一单克隆抗体之间 配对的重链和轻链的序列同源性进行比较时，可见已知的抗CD20单克隆抗体与HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体之间的序列同源性水平相当不同(图12)。这表明这两组单克隆抗体是不同的并且很可能通过不同的分子相互作用结合人CD20或者结合到CD20蛋白质的不同部位。还可预计，HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体将享有不同于已知抗CD20单克隆抗体所共享生物学特性的生物学特性。 
通过与更大一组的抗人CD20和抗小鼠CD20单克隆抗体的比较，进一步显示了已知抗CD20单克隆抗体之间的氨基酸序列同源性水平。一般地，2B8、B9E9、1F5、1H4和Leu-16重链与HB20-01、HB20-02和HB20-06单克隆抗体的重链在序列上是相似的(图13和图15)。基于序列相似性，将这些重链VoJ片段指定为A组序列(图13)。2H7单克隆抗体的氨基酸序列是相似的，但是与其它的A组重链不同，所以该重链被指定为B组重链。HB20-03、HB20-04和HB20-25结构相似并且被指定为C组重链。HB20-05单克隆抗体同样也是结构不同的并且被指定为D组重链。许多抗小鼠CD20单克隆抗体(MB20-08、MB20-10、MB20-18、MB20-07、MB20-02和MB20-14)具有结构相似的重链并且把它们指定为E组重链。MB20-11和MB20-16单克隆抗体的重链是十分不同的并且代表着F组。MB20-01和MB20-13单克隆抗体的重链与所有其它抗CD20单克隆抗体的重链结构上十分不同，将它们指定为G组重链。重链氨基酸序列的这些不同的组与用于产生每一抗CD20重链的不同V(D)J基因片段的使用密切相关(表1)。因此，已知的抗CD20单克隆抗体重链在结构上不同于本文所公开的大多数抗CD20单克隆抗体重链。 
通过对一组抗人CD20和抗小鼠CD20单克隆抗体轻链的比较，进一步显示了已知抗CD20单克隆抗体间氨基酸序列同源性的显著水平。2B8、B9E9、1F5、1H4、Leu-16和2H7轻链序列相当相似，但是与其它抗CD20单克隆抗体的轻链不同(图16和图18)。基于序列相似性，将这些轻链指定为A组序列(图16)。多种抗小鼠CD20单克隆抗体轻链的氨基酸序列最相似，但与A组轻链不同，因此将这些轻链指定为B组。HB20-03、HB20-04 和HB20-25结构不同并且被指定为C组轻链。HB20-01、HB20-02和HB20-06单克隆抗体使用相似的轻链，该相似的轻链被指定为E组。MB20-18和MB20-01使用结构不同的轻链并且因此分别指定为F组和G组。轻链氨基酸序列的这些不同的组与用于产生每一抗CD20单克隆抗体的不同VJ基因片段的使用密切相关(表1)。因此，已知的抗CD20单克隆抗体轻链在结构上不同于本文所公开的抗CD20单克隆抗体所使用的轻链。 
对配对的重链和轻链氨基酸序列的分析进一步证实：不同的抗CD20单克隆抗体处于结构不同的组并且因此通过不同的分子相互作用结合人或小鼠CD20。2B8、B9E9、1F5、1H4和Leu-16单克隆抗体使用结构相似的重链和轻链，因此分别指定为AA(图19，表1)。由于2H7单克隆抗体重链结构上不同于其它已知的抗CD20单克隆抗体的重链，但能够与相似的轻链配对，所以将该单克隆抗体指定为BA组单克隆抗体。CC组单克隆抗体即HB20-03、HB20-04和HB20-25代表着结构独特的一类抗CD20单克隆抗体。同样地，通过使用不同的重链和轻链对实现唯一重链和轻链的利用和重组多样性，不同的重链和轻链对使得将每一抗CD20单克隆抗体归为与已知抗CD20单克隆抗体结构不同的类(图19)。 
实施例14：抗CD20单克隆抗体的结合密度和B细胞消除 
在不同的淋巴瘤类型以及各个肿瘤样品的细胞中，CD20的表达是相当异质的，这会影响抗CD20单克隆抗体治疗的效果(Smith(2003)Oncogene 22：7359-7368)。一般地，与较高水平表达CD20的滤泡型淋巴瘤细胞相比，低水平表达CD20的慢性淋巴性白血病和小淋巴细胞性淋巴瘤细胞对利妥希玛反应速度相应较低(McLaughlin等，(1998)J.Clin.Oncol.16：2825-2833)。因此，CD20的表达密度是影响抗CD20治疗功效的重要因素，因为CD20的密度指示了能够与B细胞结合并靶向消除它们的抗CD20单克隆抗体的数量。为了确定CD20表达密度是否影响治疗功效并且为了确定密度变化影响B细胞消除的程度，使用MB20-11单克隆抗体 以高剂量(250μg)和低剂量(10μg)处理杂合CD20+/-小鼠。CD20+/-小鼠B细胞表达的CD20是野生型同窝小鼠B细胞中表达密度的一半。在高剂量的抗CD20单克隆抗体处理情况下，野生型的CD20表达或杂合型不充足的CD20表达对7天内循环或脾脏B细胞的消除没有可检测水平的影响，其中93-97％的B细胞从脾脏中清除了(图20A和图20B)。与之相对照，低剂量的抗CD20单克隆抗体有效地从野生型小鼠中消除了93-98％的循环和脾脏B细胞，但是在7天内仅有30-40％的循环或脾脏B细胞从CD20+/- 小鼠中去除(图20A和图20B)。因此，虽然B细胞表达的CD20只是降低50％，但是通过这种50％的降低使得抗CD20单克隆抗体处理的效果显著地改变。而且，通过细胞表面CD20的密度严重影响结合到靶B细胞表面的抗CD20单克隆抗体的密度，特别是当存在较低的单克隆抗体密度时。 
实施例15：MB20-11单克隆抗体结合和细胞表面CD20表达 
细胞表面CD20的表达密度是抗CD20治疗效果的重要因素(Smith(2003)，同上)。因此，尝试在治疗过程中上调CD20的表达以便增强抗CD20单克隆抗体的体内功效，例如用G-CSF或者GM-CSF刺激病人。然而，CD20上调之外的机制可能具有所观察到的增强效果(Ravetch和Lanier(2000)Leukemia 16：693-699；van der Kolk等，(2002)Leukemia16：693-699)。本文已经证明MB20-11单克隆抗体能够特别有效的体内消除小鼠B细胞(图7-10)。虽然MB20-11单克隆抗体的体内功效似乎部分地源自它是IgG2a同种型的事实，但是其它因素也可能有助于提高治疗效果。因此，在体外评估了MB20-11单克隆抗体结合脾脏B细胞表面表达的CD20的效果。出乎意料的是，与置于冰上的细胞相比或者与用其它的相似或不同同种型的MB20单克隆抗体孵育相比，MB20-11单克隆抗体与在37℃培养的B细胞的结合在一段时间内诱导了更多的MB20-11单克隆抗体的结合(图21；数据未显示)。当平均以后，在30分钟至8小时的时间阶段内，MB20-11单克隆抗体的结合增加97±29％(n＝4，p＜0.05)(图21)。随着时间增加MB20-11单克隆抗体结合的增加似乎与低的单克隆抗体亲和 力无关，因为在与其它MB20相似的浓度下，MB20-11单克隆抗体达到染色饱和水平，而该浓度的其它MB20不能够诱导细胞表面增加CD20表达(图6)。由于其它抗小鼠CD20单克隆抗体没有该特性(图21，数据未显示)，所以MB20-11单克隆抗体可以结合至CD20上的独特区域或表位。MB20-11单克隆抗体与CD20的结合或者诱导B细胞上增强CD20的细胞表面表达，或者诱导细胞表面CD20分子的构象变化，其中该CD20分子暴露了新的MB20-11单克隆抗体结合部位。 
实施例16：HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体的结合密度 
单克隆抗体结合密度对于抗CD20单克隆抗体体内介导的最佳B细胞消除是至关重要的(图20)，这表明以高密度结合至B细胞的单克隆抗体可能是在治疗上更加有效的。在MB20单克隆抗体组中，MB20-18单克隆抗体以最高密度结合至B细胞表面，特别是当单克隆抗体浓度有限时(图6)。这可能有助于在其它IgG2b抗CD20单克隆抗体当中MB20-18单克隆抗体特别有效地消除体内B细胞(图7B)。基于它们氨基酸序列中的显著差异，可以预计CC组中的HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体(表1)具有共同的生物学特性，这不同于已知抗CD20单克隆抗体的共有特性(图12)。在这些差异，在间接免疫荧光染色测定中发现HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体以显著高于已知抗CD20单克隆抗体的水平结合至表达CD20的原代B细胞和B淋巴瘤细胞系(图22)。当平均后，HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体以比1F5、B9E9和1H4单克隆抗体高3.7倍的水平结合人血液B细胞(表6)。同样，HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体组以分别比1F5、B9E9和1H4单克隆抗体组高4.5、3.1和4.3倍的水平结合B细胞系Raji、BJAB和DHL-4。B1单克隆抗体，首先描述的抗CD20单克隆抗体(Stashenko等，(1980)J.Immunol.125：1678)，一致观察到B1单克隆抗体能够染色B细胞并与其它公开的抗CD20单克隆抗体相比更高密度特异性结合B细胞(表6)。虽然如此，HB20-3、HB20-4和HB20-25组单克隆抗体仍以比B1单克隆抗体更高的水平与原代B细胞和B细胞系 反应(表6)。具体而言，HB20-3单克隆抗体分别以高于B1单克隆抗体69％、130％、71％和57％的水平结合至原代B细胞、Raji细胞、BJAB细胞和DHL-4细胞。因此，CC组单克隆抗体的独特特性是与其它已知抗CD20单克隆抗体相比其对细胞表面CD20的不典型地高结合活性。 
除了以比1F5单克隆抗体更高密度结合以及以更高水平与原代B细胞和B细胞系反应之外，HB20-3、HB20-4和HB20-25在重链CDR3和CDR1区和轻链CDR3区中具有共同氨基酸基序。重链共同基序显示于图15并且轻链共同基序显示于图18。例如，重链CDR3区包含氨基酸序列基序FYXYXXX1YGAX2XXY，其中X可以是任意氨基酸并且优选地为Y或S，并且其中X2可以是任意氨基酸并且优选地为M或L，并且其中F是苯丙氨酸、Y是酪氨酸、G是甘氨酸、A是丙氨酸、M是蛋氨酸、L是亮氨酸且S是丝氨酸。 
重链CDR1区包含氨基酸序列基序NXXXX，其中X可以是任意氨基酸并且N是天冬酰胺。 
另外，轻链CDR3区包含氨基酸序列基序XHFWXX3XWX，其中X可以是任意氨基酸序列，H是组氨酸、F是苯丙氨酸、W是色氨酸并且X3可以是任意氨基酸且优选地为T或I，其中T是苏氨酸且I是异亮氨酸。 
表6 
Figure G04816092719960328D000771
Figure G04816092719960328D000781
人血液淋巴细胞和Raji、BJAB或DHL-4 B类淋巴母细胞系与抗CD20单克隆抗体在饱和浓度下的反应性或者与单独次级抗体(对照)的反应。抗CD20单克隆抗体使用经确定为饱和的且产生最佳染色的浓度。1F5、B9E9和1H4(IgG2a)单克隆抗体使用1∶200稀释的腹水。HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体使用的是组织培养上清液。B1单克隆抗体使用10μg/mL的纯化单克隆抗体或使用组织培养上清液。在所有情况下，使用PE缀合的同种型特异性次级抗体通过流式细胞术分析观察单克隆抗体染色。数值代表通过流式细胞仪测定的每种B细胞群体的平均线性荧光强度。结果代表在≥3次实验中所获得的数据。 
实施例17：抗CD20单克隆抗体的治疗效果 
由于以2.5μg剂量静脉注射MB20-11单克隆抗体有效消除了循环和组织B细胞(图7C)，因此确定了以相似的小剂量通过皮下注射(s.c.)MB20-11单克隆抗体是否导致相当程度的B细胞消除。在以5μg剂量通过静脉或皮下注射抗CD20单克隆抗体的小鼠中，绝大多数循环和组织B细胞被消除了(图23A和图23B)。正常情况下，以375mg/m2的剂量给人静脉注射利妥希玛，这将对应着2,500μg/小鼠的剂量(表7)。通过皮下注射5-10μg的单一剂量MB20-11单克隆抗体导致小鼠B细胞的有效消除，这比目前给病人静脉注射利妥希玛的量低250-500倍。基于目前在小鼠中的发现，当以1.3-2.6mg皮下注射施用于人时，与MB20-11单克隆抗体治疗上可比的抗CD20单克隆抗体能够有效消除循环和组织B细胞。 
表7 
    小鼠    μg/小鼠     小鼠＊     mg/kg     人#        mg/kg     人剂量#        mg     人#        mg/m2
    0.5     0.025     0.0020     0.128     0.075
    1     0.05     0.0039     0.257     0.15
    2.5     0.125     0.0099     0.641     0.375
    5     0.25     0.0197     1.28     0.75
    10     0.5     0.039     2.57     1.5
    25     1.25     0.099     6.41     3.75
    50     2.5     0.197     12.8     7.5
    100     5     0.395     25.7     15
    250     12.5     0.987     64.1     37.5
    2500     124     9.9     641     375
＊假定重量0.02kg。 
#假定重量65kg，身体表面积1.71m2。 
来源：来自www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm的Dose Calculator。 
上述实施例作为例证说明本发明，并且不构成本发明的限制。通过以下权利要求定义本发明，权利要求的对等要求包括于其中。 
序列表
<110>杜克大学
 
<120>CD20特异抗体及使用它们的方法
<130>5405.342WO
 
<150>US 60/469,451
<151>2003-05-09
 
<160>119
 
<170>PatentIn version 3.2
 
<210>1
<211>123
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
 
<400>1
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Lys Lys Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Trp Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Phe Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
          115                  120
 
<210>2
<211>369
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>2
gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg    60
tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagaagaca    120
cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac    180
aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac    240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagatgggat    300
tactacggta gtagctacgt tgggtttttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca    360
gtctcctca                                                            369
 
<210>3
<211>122
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>3
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ala Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp
            100                 105                  110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
 
<210>4
<211>366
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>4
gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg  60
tcctgcaagg cttctggctt cacatttacc aattacaata tgcactggtt aaagcagacg  120
cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag aaaatggtga tacttcctac  180
aatcagaaat ttaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aagcctccag cacagcctac  240
atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagattttat  300
tactacggta gttattacgg tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc  360
tcctca                                                             366
 
<210>5
<211>122
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>5
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>6
<211>366
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>6
gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg    60
tcctgcaagg cttctggctt cacatttacc aattacaata tgcactgggt aaagcagacg    120
cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag aaaatggtga tacttcctac    180
aatcagaggt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac    240
atgcacctca gcagcctgac atctgaggac actgcggtct atttctgtgc aagattttat    300
tattacggta gttattacgg tgctttggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc    360
tcctca                                                               366
 
<210>7
<211>123
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>7
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Trp Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Phe Leu Thr Thr
            100                 105                 110
Gly Ala Lys Ala Pro Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>8
<211>369
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>8
gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg    60
tcctgcaagg cttctggcta cacatttatt agttacaata tgcactgggt aaagcagaaa    120
cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac    180
aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac    240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatgggat    300
tactacggta gtagctacgt tgggtttttg actactgggg ccaaggcacc actcgtcaca    360
gtctcctca                                                            369
 
<210>9
<211>122
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>9
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Arg Phe Thr Asn Tyr
           20                  25                  30
Asn Leu His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>10
<211>366
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>10
gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg    60
tcctgcaagg cttctggctt cagatttacc aattacaatt tgcactgggt aaaacagaca    120
cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga aacttcctac    180
aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag tacagcctac    240
atgcagctca gaagcctgac atctggggac tctgcggtct attactgtgc aagattttat    300
tactacggta gtagctacgg tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc    360
tcctca                                                               366
 
<210>11
<211>117
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>11
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Thr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>12
<211>351
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>12
gaggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc    60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactacggaa tggcgtgggt tcgacaggct    120
ccaaggaagg ggcctgagtg ggtagcattc attagtaatt tggcatatag tatctactat    180
gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tctagagaga atgccaagaa caccctgtac    240
ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt atttctgtac aagaactggg    300
tactatgctt tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a             351
<210>13
<211>114
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>13
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ala
 
<210>14
<211>342
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>14
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata    60
tcctgtaagg cttctggata catgttcact gactactata taaagtgggt gaagcagagc    120
catggaaaga gtcttgagtg gattggagat attaatccta ataatggtga tactatctac    180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccaa cacagcctac    240
atggacctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagagcgg    300
tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca                       342
 
<210>15
<211>114
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>15
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ala
 
<210>16
<211>342
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>16
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata    60
tcctgtaagg cttctggata catgttcact gactactaca tgaagtgggt gaagcagagc    120
catggaaaga gccttgagtg gataggggat attaatccta acaatggtga tactacctac    180
aaccagaagt tcgagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacggcctac    240
atggagcttc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagaacgg    300
tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca                       342
 
<210>17
<211>114
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>17
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ala
 
<210>18
<211>342
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>18
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata    60
tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaagtgggt gaagcagagc    120
catggaaaga gccttgactg gataggggat attaatccta acaatggtga tattatttac    180
aaccagaagt tcgagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacggcctac    240
atggagcttc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagaacgg    300
tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca                       342
 
<210>19
<211>114
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>19
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ala
 
<210>20
<211>342
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>20
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata  60
tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaagtgggt gaagcagagc  120
catggaaaga gccttgactg gataggggat attaatccta acaatggtga tattatttac  180
aaccagaagt tcgagggcaa ggccacattg actgtggaca agtcctccag cacggcctac  240
atggagcttc gtagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagaacgg  300
tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca                     342
 
<210>21
<211>113
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>21
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser ValLys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Ile Thr Asp Tyr
           20                  25                  30
Asn Met His Trp ValLys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ala Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
 
<210>22
<211>339
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>22
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg  60
tcctgcaagg cttctggata taaaatcact gactacaaca tgcactgggt gaagcagagt  120
catggaaaga gccttgagtg gattggatac attgcccctt acaatggtgg tactacctac  180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtaaaca agtcctccag cacagcctat  240
atggagctcc gcagtctgac atcggaggat tctgcagtct attattgtgc aggtgctttg  300
gactattggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctct                         339
 
<210>23
<211>114
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>23
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Asp Leu Arg Ile Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ala
 
<210>24
<211>342
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>24
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata    60
tcctgtaagg cttctggata catgttcact gactactata taaagtgggt gaagcagagc    120
catggaaaga gtcttgagtg gattggagat attaatccta ataatggtga tactatctac    180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccaa cacagcctac    240
atggacctcc gcatcctgac atcagaggac tctgcagtct attactgtgc aagagagcgg    300
tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca                       342
 
<210>25
<211>115
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>25
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Asn Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Glu Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
 
<210>26
<211>345
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>26
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaaatg    60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaact tgcactgggt gaagcagagc    120
catggacaga gccttgagtg gattggatat attaacccta acaatggtgg tgctacatac    180
aatcagaagt tcactggcaa ggccacattg actgtaaaca ggtcctccag cacagcctac    240
atggagctcc gcagcctgac atcggacgat tctgcagtct attactgtgc agaaatctat    300
gatggttact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca                    345
<210>27
<211>114
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>27
 
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Leu Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
        100                 105                 110
Ser Ala
 
<210>28
<211>342
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>28
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacttgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata  60
tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaagtgggt gaaacagagc  120
catggaaaga gccttgactg gataggggat attaatccta acaatggtga tattatttac  180
aaccagaagt tcgagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacggcctac  240
atggagcttc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagaacgg  300
tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca                     342
<210>29
<211>139
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>29
 
Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu
1               5                   10                  15
Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln
            20                  25                  30
Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys
        35                  40                  45
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu
    50                  55                  60
Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Asn Ser
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Gln Gln Tyr Asn Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>30
<211>419
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>30
atgggcatca agatggagtc acagacccag gtctttgtat acatgttgct gtggttgtct    60
ggtgttgatg gagacattgt gatgacccag tctcaaaaat tcatgtcaac atcagttgga    120
gacagggtca gcgtcacctg caaggccagt cagaatgtgg gtactaatgt agcctggtat    180
caacagaaac tagggcaatc tcctaaacca ctgatttatt cggcatccta ccggaacagt    240
ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc    300
aatgtgcagt ctgaagactt ggcagagtat ttctgtcagc aatataacag ttctccattc    360
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatc     419
 
<210>31
<211>130
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>31
 
Met Trp Gly Ser Val Phe Asn Phe Ser Ile Val Gly Ala Arg Cys Asp
1               5                   10                  15
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu
            20                  25                  30
Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu
        35                  40                  45
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr
    50                  55                  60
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
65                  70                  75                  80
Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu
                85                  90                  95
Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
        115                 120                 125
Thr Val
    130
 
<210>32
<211>392
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>32
atgtggggat ctgttttcaa tttttcaatt gtaggtgcca gatgtgacat ccagatgact  60
cagtctccag cctccctatc tgcatctgtg ggggaaactg tcaccatcac atgtcgagca  120
agtgggaata ttcacaatta tttagcatgg tatcagcaga aacagggaaa atctcctcaa  180
ctcctggtct ataatgcaaa aaccttagca gatggtgtgc catcaaggtt cagtggcagt  240
ggatcaggaa cacaattttc tctcaagatc aacagcctgc agcctgaaga ttttgggagt  300
tattactgtc aacatttttg gagtacgccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa  360
atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta tc                                392
 
<210>33
<211>130
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>33
 
Met Trp Gly Ser Val Phe Asn Phe Ser Ile Val Gly Ala Arg Cys Asp
1               5                   10                  15
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu
            20                  25                  30
Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser Ile His Asn Tyr Leu
        35                  40                  45
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr
    50                  55                  60
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
65                  70                  75                  80
Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu
                85                  90                  95
Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ile Pro Trp Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
        115                 120                 125
Thr Val
    130
 
<210>34
<211>392
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>34
atgtggggat ctgttttcaa tttttcaatt gtaggtgcca gatgtgacat ccagatgact    60
cagtctccag cctccctatc tgcatctgtg ggggaaactg tcaccatcac atgtcgagca    120
agtgggagta ttcacaatta tttagcatgg tatcagcaga aactgggaaa atctcctcaa    180
ctcctggtct ataatgcaaa aaccttagca gatggtgtgc catcaaggtt cagtggcagt    240
ggatcaggaa cacaattttc tctcaagatc aacagcctgc agcctgaaga ttttgggagt    300
tattactgtc aacatttttg gagtattccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa    360
atcaagcggg ctgatgctgc accaactgta tc                                  392
 
<210>35
<211>139
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>35
 
Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu
1               5                   10                  15
Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln
            20                  25                  30
Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys
        35                  40                  45
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Gln Gln Tyr Asn Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>36
<211>419
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>36
atgggcatca agatggagtc acagacccag gtctttgtat acatgttgct gtggttgtct  60
ggtgttgatg gagacattgt gatgacccag tctcaaaaat tcatgtccac atcagtagga  120
gacagggtca gcgtcacctg caaggccagt cagaatgtgg gtactaatgt agcctggtat  180
caacagaaac cagggcaatc tcctaaagca ctgatttact cggcatccta ccggtacagt  240
ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc  300
aatgtgcagt ctgaagactt ggcagagtat ttctgtcagc aatataacag ctctccattc  360
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatc   419
 
<210>37
<211>130
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>37
 
Met Trp Gly Ser Val Phe Asn Phe Ser Ile Val Asp Ala Arg Cys Asp
1               5                   10                  15
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu
            20                  25                  30
Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu
        35                  40                  45
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr
    50                  55                  60
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
65                  70                  75                  80
Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu
                85                  90                  95
Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Ile Pro Trp Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
        115                 120                 125     
Thr Val
    130
 
<210>38
<211>392
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>38
atgtggggat ctgttttcaa tttttcaatt gtagatgcca gatgtgacat ccagatgact    60
cagtctccag cctccctgtc tgtatctgtg ggagaaactg tcaccatcac atgtcgagca    120
agtgaaaata tttacagtaa tttagcatgg tatcagcaga aacagggaaa atctcctcag    180
ctcctggtct atgctgcaac aaacttagca gatggtgtgc catcaaggtt cagtggcagt    240
ggatcaggca cacagtattc cctcaagatc aacagcctgc agtctgaaga ttttgggagt    300
tattactgtc aacatttttg gggtattccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa    360
atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta tc                                  392
 
<210>39
<211>144
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>39
 
Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Trp Val Ser Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro
            20                  25                  30
Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys
        35                  40                  45
Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Lys Arg Lys Asn Tyr Leu Ala
    50                  55                  60
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Trp
65                  70                  75                  80
Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
                85                  90                  95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Gln Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Phe Thr Phe Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135                 140
 
<210>40
<211>432
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>40
atgggcatca agatggagtc acagacccag gtcttcctct ccctgctgct ctgggtatct  60
ggtacctgtg ggaacattat gatgacacag tcgccatcat ctctggctgt gtctgcagga  120
gaaaaggtca ctatgagatg taagtccagt cagagtgttt tatatagttc aaagcggaag  180
aactacttgg cctggtacca gcagaaacca gggaagtctc ctacattatt gatctattgg  240
gcatccacta gggaatctgg tgtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat  300
tttactctta ccatcaccag tgtacaagct gaagacctgg cagtttatta ctgtcatcaa  360
tacctctcct cgttcacgtt cggagggggg accaaactgg aaataaaacg ggctgatgct  420
gcaccaactg ta                                                      432
 
<210>41
<211>138
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>41
 
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Val Ser Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr
            20                  25                  30
Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
    50                  55                  60
Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65                  70                  75                  80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
                85                  90                  95
Thr Val Ala Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
            100                 105                 110
Gln Gly Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
        115                 120                 125
Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>42
<211>416
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>42
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt catagtgtct    60
aatggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca accaccatgg ctgcatctcc cggggagaag    120
atcactatca cctgcagtgt cagctcaagt ataaggtcca attatttaca ttggtatcag    180
cagaagccag gattctcccc taaactcttg atttatagga catccaatct ggcttctgga    240
gtcccagctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac agttgccacc    300
atggaggctg aagatgttgc cacttactac tgccagcagg gtagtagtat accgctcacg    360
ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatc 416
 
<210>43
<211>137
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>43
 
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Val Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met
            20                  25                  30
Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
        35                  40                  45
Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe
    50                  55                  60
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Val Ala Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
            100                 105                 110
Gly Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
        115                 120                 125
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>44
<211>416
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(59)..(59)
<223>n是a，c，g或t
 
<400>44
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt catagtgtnt    60
aatggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca accaccatgg ctgcatctcc cggggagaag    120
atcactatca catgcagtgc cagctcaagt ataagttcca attatttgca ttggtatcag    180
cagaagccag gattctcccc taaactcttg atttacagga catccaatct ggcttctgga    240
gtcccagctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt acactctcac agtcgccacc    300
atggaggctg aagatgttgc cacttactac tgccagcagg gtagtagtat accgctcacg    360
ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatc        416
 
<210>45
<211>136
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>45
 
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ser Asn Gly Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Lys Ala
            20                  25                  30
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser
        35                  40                  45
Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Phe Ser
    50                  55                  60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65                  70                  75                  80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
                85                  90                  95
Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
        115                 120                 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>46
<211>410
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>46
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt gtctaatgga  60
gaacttgtgc tcacccagtc tccaaccacc aaggctgcat ctcccgggga gaagatcact  120
atcacctgca gtgtcagctc aagtatacgt tccaattact tgcattggta tcagcagagg  180
ccaggattct cccctaagct cttgatttat aggacatcca atctggcttc tggagtccca  240
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaattgg caccatggag  300
gctgaagatg ttgccactta ctactgccag cagggtagta gtttaccgct cacgttcggt  360
gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc             410
 
<210>47
<211>136
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>47
 
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ser Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala
            20                  25                  30
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Asn
        35                  40                  45
Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser
    50                  55                  60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65                  70                  75                  80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
                85                  90                  95
Gly Thr Met Lys Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
        115                 120                 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>48
<211>410
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>48
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt gtctaatgga    60
gaaattgtgc tcacccagtc tccaaccacc atggctgcat ctcccgggga gaagatcact    120
atcacctgta gtgtcagttc aaatatacgt tccaattact tgcattggta tcagcagaag    180
ccaggattct cccctaaact cttgatttat aggacatcca atctggcttc tggagtccca    240
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaattgg caccatgaag    300
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<210>49
<211>136
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>49
 
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ser Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala
            20                  25                  30
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Asn
        35                  40                  45
Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser
    50                  55                  60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65                  70                  75                  80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
                85                  90                  95
Gl y Thr Met Lys Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
             100                 105                 110
Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
        115                 120                 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>50
<211>410
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>50
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt gtctaatgga    60
gaaattgtgc tcacccagtc tccaaccacc atggctgcat ctcccgggga gaagatcact    120
atcacctgta gtgtcagttc aaatatccgt tccaattact tgcattggta tcagcagaag    180
ccaggattct cccctaaact cttgatttat aggacatcca atctggcttc tggagtccca    240
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaattgg caccatgaag    300
gctgaagatg ttgccactta ctactgccag cagggtagta gtataccgct cacgttcggt    360
gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc               410
 
<210>51
<211>138
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>51
 
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Val Ser Asn Gly Glu Ile Val Leu Ala Gln Ser Pro Thr Thr
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Thr Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
    50                  55                  60
Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65                  70                  75                  80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
            100                 105                 110
Gln Gly Ser Ser Lys Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
        115                 120                 125
Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>52
<211>416
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>52
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt catagtgtct  60
aatggagaaa ttgtgctcgc ccagtctcca accaccacgg ctgcatctcc cggggagaag  120
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ttcggtgctg ggaccaagct ggagttgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatc      416
 
<210>53
<211>138
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>53
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Val Ser Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr
             20                  25                  30
Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
    50                  55                  60
Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65                  70                  75                  80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
                85                  90                  95
Thr Val Ala Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
            100                 105                 110
Gln Gly Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
        115                 120                 125
Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>54
<211>416
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>54
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt catagtgtct  60
aatggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca accaccatgg ctgcatctcc cggggagaag  120
atcactatca cctgcagtgt cagctcaagt ataaggtcca attatttaca ttggtatcag  180
cagaagccag gattctcccc taaactcttg atttatagga catccaatct ggcttctgga  240
gtcccagctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac agttgccacc  300
atggaggctg aagatgttgc cacttactac tgccagcagg gtagtagtat accgctcacg  360
ttcggtgctg ggaccaagct ggagttgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatc      416
<210>55
<211>139
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>55
 
Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Cys Val Ser Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro
             2                  025                  30
Lys Phe Leu Leu Val Ser Thr Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Lys
        35                  40                  45
Ala Ser Gln Thr Val Thr Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
    130                 135
 
<210>56
<211>417
<212>DNA
<213>小家鼠
 
<400>56
atgggcatca agatggagtc acagacccag gtcttcgtat ttctactgct ctgtgtgtct    60
ggtgctcatg ggagtattgt gatgacccag actcccaaat tcctgcttgt atcaacagga    120
gacagggtta ccattacctg caaggccagt cagactgtga ctaatgattt agcttggtac    180
caacagaagc cagggcagtc tcctaaactg ctgatatact atgcatccaa tcgctacact  240
ggagtccctg atcgcttcac tggcagtgga tatgggacgg acttcacttt caccatcaac  300
actgtgcagg ctgaagacct ggcagtttat ttctgtcagc aggattatag ctctcctctc  360
acgttcggtg ctgggaccaa gctggaactg aaacgggctg atgctgcacc aactgta     417
 
<210>57
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>57
 
Ser Tyr Asn Met His
1               5
 
<210>58
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>58
 
Asn Tyr Asn Met His
1               5
 
<210>59
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>59
 
Asn Tyr Asn Leu His
1               5
 
<210>60
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>60
 
Asp Tyr Gly Met Ala
1               5
 
<210>61
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>61
 
Asp Tyr Tyr Ile Lys
1               5
 
<210>62
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>62
 
Asp Tyr Tyr Met Lys
1               5
 
<210>63
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>63
 
Asp Tyr Asn Met His
1               5
 
<210>64
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>64
 
Asp Tyr Asn Leu His
1               5
 
<210>65
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>65
 
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>66
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>66
 
Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>67
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>67
 
Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>68
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>68
 
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>69
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>69
Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>70
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>70
 
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>71
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>71
 
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Glu
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>72
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>72
 
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>73
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>73
Tyr Ile Ala Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>74
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>74
 
Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Thr
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>75
<211>14
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>75
 
Trp Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Phe Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>76
<211>13
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>76
 
Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>77
<211>13
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>77
 
Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>78
<211>14
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>78
 
Trp Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Phe Leu Thr Thr
1               5                   10
 
<210>79
<211>13
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>79
 
Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>80
 
Thr Gly Tyr Tyr Ala Leu Phe Asp Tyr
1               5
 
<210>81
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>81
 
Glu Arg Phe Ala Tyr
1               5
 
<210>82
<211>4
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>82
 
Ala Leu Asp Tyr
1
<210>83
<211>6
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>83
 
Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr
1               5
 
<210>84
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>84
 
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1               5                   10
 
<210>85
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>85
 
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
 
<210>86
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>86
 
Arg Ala Ser Gly Ser Ile His Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
 
<210>87
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>87
 
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
 
<210>88
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>88
 
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Lys Arg Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
 
Ala
 
<210>89
<211>12
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>89
 
Ser Val Ser Ser Ser Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His
1               5                   10
 
<210>90
<211>12
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>90
 
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His
1               5                   10
 
<210>91
<211>12
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>91
 
Ser Val Ser Ser Asn Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His
1               5                   10
 
<210>92
<211>12
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>92
 
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Thr Ser Asn Tyr Leu His
1               5                   10
<210>93
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>93
 
Lys Ala Ser Gln Thr Val Thr Asn Asp Leu Ala
1               5               10
 
<210>94
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>94
 
Ser Ala Ser Tyr Arg Asn Ser
1               5
 
<210>95
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>95
 
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1               5
 
<210>96
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>96
 
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1               5
 
<210>97
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>97
 
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1               5
<210>98
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>98
 
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
 
<210>99
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>99
 
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
 
<210>100
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>100
 
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1               5
 
<210>101
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>101
 
Gln Gln Tyr Asn Ser Ser Pro Phe Thr
1               5
 
<210>102
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>102
 
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>103
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>103
 
Gln His Phe Trp Ser Ile Pro Trp Thr
1               5
 
<210>104
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>104
 
Gln His Phe Trp Gly Ile Pro Trp Thr
1               5
 
<210>105
<211>8
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>105
 
His Gln Tyr Leu Ser Ser Phe Thr
1               5
 
<210>106
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>106
 
Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Leu Thr
1               5
 
<210>107
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>107
 
Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro Leu Thr
1               5
 
<210>108
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>108
 
Gln Gln Gly Ser Ser Lys Thr Leu Thr
1               5
 
<210>109
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>109
 
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr
1               5
 
<210>110
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>110
gggaattcga ggtgcagctg caggagtctg g    31
 
<210>111
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>111
gagggggaag acatttggga aggactg    27
 
<210>112
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>112
gagttccagg tcactgtcac tggc    24
<210>113
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>113
gtgaattcag gcggccgcta a    21
 
<210>114
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>114
actggatggt gggaagatg    19
 
<210>115
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>CDR3区共有序列
 
<400>115
 
Tyr Tyr Gly Ser
1
 
<210>116
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>116
atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg    30
 
<210>117
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>117
atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc    30
 
<210>118
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>118
atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g    31
 
<210>119
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物
 
<400>119
atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g    31

Claims (40)

1.特异性结合CD20的单克隆抗体mAb或其抗原结合片段，其中所述抗体具有125mg/m2或更低的治疗有效剂量范围，其中该剂量范围能够导致受试者中至少75％的循环B细胞、组织B细胞或两者被消除，其中抗原结合片段是F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段，且其中该mAb或其抗原结合片段包含来自以保藏号PTA-5943、PTA-5944、PTA-5945或PTA-5947保藏的杂交瘤产生的mAb的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
2.权利要求1的mAb或抗原结合片段，其中所述抗体具有选自如下的治疗有效剂量范围：37.5mg/m2或更低、10mg/m2或更低、0.375mg/m2或更低或者0.075mg/m2或更低。
3.权利要求1的mAb或抗原结合片段，其中所述治疗有效剂量导致受试者中至少80％、至少85％或者至少90％的循环B细胞、组织B细胞或两者被消除。
4.权利要求1的mAb或抗原结合片段，其中在至少7天、至少30天或至少60天的期间观察到了所述消除。
5.权利要求1的mAb或抗原结合片段，其中所述消除是正常B细胞的消除。
6.权利要求1的mAb或抗原结合片段，其中所述消除是恶性B细胞的消除。
7.权利要求1的mAb，它是裸抗体。
8.权利要求1的mAb或抗原结合片段，其为人源化mAb或抗原结合片段。
9.权利要求1的mAb或抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段特异性结合人CD20。
10.特异性结合CD20的单克隆抗体mAb或其抗原结合片段，其与如下杂交瘤产生的mAb结合同一抗原决定簇，其中所述杂交瘤选自以保藏号PTA-5943、PTA-5944、PTA-5945和PTA-5947保藏的杂交瘤。
11.权利要求10的mAb或抗原结合片段，其由如下杂交瘤产生，其中所述杂交瘤选自以保藏号PTA-5943、PTA-5944、PTA-5945和PTA-5947保藏的杂交瘤。
12.权利要求10的mAb或抗原结合片段，其中mAb由具有保藏号PTA-5943的杂交瘤产生或者抗原结合片段由具有保藏号PTA-5943的杂交瘤产生。
13.在可药用载体中包含权利要求1-12之任一项的mAb或抗原结合片段的药物组合物。
14.选自具有保藏号PTA-5943、PTA-5944、PTA-5945和PTA-5947的杂交瘤细胞系的细胞系。
15.特异性结合CD20的单克隆抗体mAb或其抗原结合片段，其包含来自如下杂交瘤产生的mAb的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中所述杂交瘤选自：以保藏号PTA-5943、PTA-5944、PTA-5945和PTA-5947保藏的杂交瘤，其中抗原结合片段是F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段。
16.权利要求15的mAb或抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段特异性结合人CD20。
17.权利要求15的mAb或抗原结合片段，其为人源化的mAb或抗原结合片段。
18.在可药用载体中包含权利要求15-17之任一项的mAb或抗原结合片段的药物组合物。
19.特异性结合CD20的单克隆抗体mAb或其抗原结合片段，其中所述抗体以比利妥希玛(Rituximab)的剂量低至少250倍的剂量施用时，其与利妥希玛在治疗上是可比的，其中抗原结合片段是F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段，且其中该mAb或其抗原结合片段包含来自以保藏号PTA-5943、PTA-5944、PTA-5945或PTA-5947保藏的杂交瘤产生的mAb的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
20.治疗有效量的特异性结合CD20的单克隆抗体mAb或其抗原结合片段在制备治疗哺乳动物受试者中B细胞疾病的药物中的用途，其中所述mAb或抗原结合片段具有125mg/m2或更低的治疗有效剂量范围，所述剂量范围导致至少75％的循环B细胞、组织B细胞或两者被消除，其中抗原结合片段是F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段，且其中该mAb或其抗原结合片段包含来自以保藏号PTA-5943、PTA-5944、PTA-5945或PTA-5947保藏的杂交瘤产生的mAb的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
21.权利要求20的用途，其中mAb或抗原结合片段具有37.5mg/m2或更低、10mg/m2或更低、0.375mg/m2或更低或者0.075mg/m2或更低的治疗有效剂量范围。
22.权利要求20的用途，其中所述治疗有效剂量导致循环B细胞、组织B细胞或两者至少80％消除、85％消除或者90％消除。
23.权利要求20的用途，其中在至少7天、至少30天或至少60天的期间观察到了所述消除。
24.权利要求20的用途，其中所述消除是正常B细胞的消除。
25.权利要求20的用途，其中所述消除是恶性B细胞的消除。
26.权利要求20的用途，其中B细胞疾病是B细胞恶性肿瘤或自身免疫病。
27.权利要求20的用途，其中所述消除是FcγR依赖的。
28.权利要求20的用途，其中哺乳动物受试者是人。
29.权利要求20的用途，其中哺乳动物受试者对抗CD20mAb治疗具有抗性。
30.权利要求20的用途，其中哺乳动物受试者对使用mAb利妥希玛的治疗具有抗性。
31.权利要求20的用途，其中哺乳动物受试者已经或目前正在使用化学疗法进行治疗。
32.权利要求20的用途，其中哺乳动物受试者已经有过B细胞疾病的复发。
33.特异性结合CD20的单克隆抗体，其中单克隆抗体对B细胞的结合密度比单克隆抗体1F5的结合密度高至少两倍，并且其中所述单克隆抗体是IgG2a、IgG1或IgG2b同种型分子，且其中该mAb包含来自如下杂交瘤产生的mAb的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中所述杂交瘤选自：以保藏号PTA-5943、PTA-5944、PTA-5945和PTA-5947保藏的杂交瘤。
34.权利要求10或33的单克隆抗体的抗原结合片段，其中抗原结合片段是F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段。
35.权利要求10、19或33的mAb或抗原结合片段，其特异性结合人CD20。
36.权利要求10、19或33的mAb或抗原结合片段，其是人源化mAb或抗原结合片段。
37.权利要求1、10、15、19或33的mAb或抗原结合片段，其中该mAb或其抗原结合片段包含来自杂交瘤PTA-5943产生的mAb的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
38.权利要求20的用途，其中所述mAb或抗原结合片段特异性结合人CD20。
39.权利要求20的用途，其中所述mAb或抗原结合片段是人源化mAb或抗原结合片段。
40.权利要求20的用途，其中所述mAb或抗原结合片段包含来自杂交瘤PTA-5943产生的mAb的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
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