KR20180085677A - 젤라틴 정제법 - Google Patents
젤라틴 정제법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180085677A KR20180085677A KR1020177017471A KR20177017471A KR20180085677A KR 20180085677 A KR20180085677 A KR 20180085677A KR 1020177017471 A KR1020177017471 A KR 1020177017471A KR 20177017471 A KR20177017471 A KR 20177017471A KR 20180085677 A KR20180085677 A KR 20180085677A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gelatin
- less
- surfactant
- medium
- lps
- Prior art date
Links
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 title claims abstract description 323
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 title claims abstract description 323
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 title claims abstract description 314
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 title claims abstract description 313
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 title claims abstract description 306
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 34
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 164
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 132
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 116
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 111
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims abstract description 69
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 52
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 47
- -1 lipid polysaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims abstract description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 81
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 66
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 32
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 23
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 21
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 9
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical group OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920004892 Triton X-102 Polymers 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 113
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 15
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 14
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 11
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 11
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 8
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 8
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102220143740 rs760001831 Human genes 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 3
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 3
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 3
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920004893 Triton X-165 Polymers 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- KWHLVBVRNXHSAN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4-nonylphenoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 KWHLVBVRNXHSAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100214695 Staphylococcus aureus aacA-aphD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 208000001871 Tachycardia Diseases 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 229920004921 nonoxynol-15 Polymers 0.000 description 1
- 229940073554 nonoxynol-30 Drugs 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910021647 smectite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- FBWNMEQMRUMQSO-UHFFFAOYSA-N tergitol NP-9 Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 FBWNMEQMRUMQSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009283 thermal hydrolysis Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09H—PREPARATION OF GLUE OR GELATINE
- C09H3/00—Isolation of glue or gelatine from raw materials, e.g. by extracting, by heating
- C09H3/02—Purification of solutions of gelatine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/20—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising free carbon; comprising carbon obtained by carbonising processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
- C08L89/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
- C08L89/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin, e.g. gelatin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
젤라틴과 지질다당류(lipopolysaccharide)를 포함하는 수성 매질로부터 지질다당류를 제거하는 개선된 방법이 기재되며, 상기 방법은 젤라틴과 지질다당류를 포함하는 수성 매질을 제공하는 단계, 상기 수성 매질에 미셀(micelle)-형성 계면활성제를 첨가하는 단계, 상기 매질을 고체 흡착제와 접촉시키는 단계, 고체 흡착제를 매질로부터 분리시키는 단계 및 젤라틴을 포함하는 수성 매질을 회수하는 단계를 포함하며, 이 방법은 상기 계면활성제의 혼탁점보다 낮은 조건에서 수행된다.
Description
본 발명은 젤라틴 및 지질다당류(lipopolysaccharide)를 포함하는 수성 매질로부터 지질다당류를 제거하는 방법 및 지질다당류 함량이 낮은 젤라틴에 관한 것이다.
젤라틴은 콜라겐으로부터 유도되는 수용성 단백질의 혼합물이다. 젤라틴은 예를 들면, 콜라겐의 부분적인 가수분해로 수득하거나, 산 또는 알칼리 조건에서 피부, 힘줄(tendon), 인대(ligament), 뼈 등의 수성 추출법으로 수득하거나, 효소적 가수분해로 수득한다. 산 처리에 의해 수득되는 젤라틴을 타입 A 젤라틴이라 부르는 한편, 타입 B 젤라틴은 알칼리 기반 공정으로부터 유도된다.
젤라틴은 균일한 단백질 분자로 구성되어있지 않지만, 평균 분자량이 200-250 kDa 이하인, 가변 길이의 단백질 분자를 변화될 수 있는 양으로 포함한다. 따라서, 젤라틴의 분자량 분포는 흔히 임계적이고 중요한 젤라틴 특성, 예컨대 점도 및 블룸값(bloom value), 또는 겔 강도의 원인이 되거나 결정하는 중요한 파라미터이다.
젤라틴은 실온에서 열가역성(thermoreversible) 겔을 형성하며, 뜨거운 물에 용해된다. 젤라틴은 통상적으로 다양한 산업, 예를 들면, 식품, 약제 및 화장품 응용분야, 그중에서도, 예를 들면, 과일 검(fruit gum) 및 젤라틴 디저트에서 겔화제(gelling agent) 및 텍스처화제(texturizer)로서 사용되지만, 또한 의학 분야에서, 예를 들면 혈장 대체재 및 젤라틴 기반 임플란트용으로 적용됨을 알 수 있다.
분자량은 그 중에서도 상이한 추출 온도와 조건으로 인하여 변화된다. 그 결과, 블룸 및 점도도 변화된다. 온도는 젤라틴 제조에 있어, 예를 들면, 젤라틴을 식품, 약제, 기계 및 의학적 응용분야에 적용시킬 수 있기 전 정제 조건에서 중요한 파라미터이며 흔히 신중하게 조종할 필요가 있다. 겔화(gelling) 특성 및 점도가 중요한 응용분야에 젤라틴이 사용되게 될 때, 제한된 기간, 예를 들면, 5분 또는 10분 내지 30분 또는 45분간 62℃ 또는 65℃ 이하의 온도가 겔화 능력 및/또는 점도의 일부 상실을 감내할 경우에 허용될 수도 있지만, 60℃의 온도가 최대 조작 온도(handling temperature)인 것으로 생각된다. 65℃보다 높은 온도, 특히 70℃보다 높은 온도에서는 젤라틴의 바람직하지 못한 가수분해가 일어나고, 즉, 단백질 분자가 더 작은 펩티드로 분해되어, 겔 강도가 낮아지거나, 심지어 겔화 능력을 상실하게 된다. 따라서, 소위 '가수분해된 젤라틴'은 젤라틴이 70 kDa 이하, 통상적으로 20 kDa 이하, 통상적으로는 100에서 15000 Da 사이의 평균 분자량을 갖는 펩티드 분자로 가수분해되는 것으로부터 기원하는 펩티드 제제이다. 상대적으로 작은 분자이기 때문에, 가수분해된 젤라틴은 젤리화(jellifying) 특성이 없다. 가수분해된 젤라틴은 예를 들면, 국소용 크림에서 텍스처 컨디셔너(texture conditioner) 및 모이스처라이저로 사용되며, 또한 글리신, 프롤린 및 하이드록시프롤린 함량이 높기 때문에 영양 제품에 사용되고 헬스 효과와도 관련되지만 생체의학 응용분야에도 사용될 수 있다. 또한, 콜라겐이 먼저 젤라틴으로 가수분해된 다음 추가로 비-겔화 가수분해물로 가수분해되기 때문에 '가수분해된 콜라겐'으로도 불리운다.
젤라틴의 분자량 분포는 통상적으로 크기 배제 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피) 기법으로 측정되며, 용출된 분획을 UV 흡착법으로 검출하여 측정된 데이터를 적합한 소프트웨어로 평가하며, 당해 분야에 알려져 있는 모든 기법에 대해서는 예를 들어, 문헌: Olijve et.al., Journal of Colloid and Interface Science (2001) 243, 476-482를 참고한다. 평균 분자량이 70 kDa보다 작은, 예컨대 20 kDa보다 작은, 가수분해된 젤라틴에 대해서, 동일한 방법이 사용될 수 있지만, 높은 해상도를 얻기 위하여 (Zhang et.al., Food Hydrocolloids 23 (2009) 2001-2007) 분리 컬럼, 예컨대 TSKgel2000SVVXL (Tosoh BioScience, Japan)를 사용하는 것이 더 좋다.
젤라틴의 점도 (동점성계수: dynamic viscosity)는 통상적으로 60℃에서 표준 흐름(standard flow) 피펫을 통하여 젤라틴의 6.67 w/w% 용액의 흐름 시간(flow time)을 측정함으로써 측정하며, 문헌: GME Monograph Standardized Methods for the testing of Edible Gelatin, version 10, 2014 (GME, Brussels, Belgium)을 참조하며, 본 명세서에서 'GME10', chapter 2.4.2, p. 81-86으로도 언급된다.
6.67 w/w% 젤라틴 겔의 겔 강도는 표준화된 장치 (GME10 참조), 예컨대 QTS 25 Texture Analyzer (Brookfield Viscometers) 또는 Texture Analyzer TA-XT2 (Stable Micro Systems Ltd., London, United Kingdom)으로 측정할 수 있으며, 블룸 번호(bloom number) (본 명세서에서 '블룸 값'으로도 언급됨, GME10 참조)로 표시한다.
젤라틴 제조 공정에서, 원료 물질은 흔히 세균에 감염되며, 그 결과, 통상의 젤라틴 제제에는 지질다당류(LPS)가 포함될 수 있다.
지질다당류는 그램-음성균의 외피 막에서 발견되며 잠재적 독소이다. LPS는 또한 지질다당류가 세균에 의해 분비되는 것이 아니라 막 구조의 일부이기 때문에 "내독소(endotoxin)"로 알려져 있다. 따라서, 지질다당류는 주로 세균 세포의 사멸 및 용해(lysis) 후 방출된다.
LPS는 가변적인 다당류 쇄와 지질 모이어티(moiety)인 지질 A로 이루어져 있다. LPS 분자는 크기가 약 10 kDa이지만, 수성 매질에서 커다란 응집체를 형성할 수 있는데, 이는 1000 kDa 이하의 분자량을 갖는 "미셀(micelle)"로도 불리워진다.
LPS는 대부분의 포유동물에게 독성이며 동물 숙주는 흔히 넓은 스펙트럼의 비-특이적 병리생리학적 반응, 예컨대, 열, 빈맥, 기관 기능장애(organ dysfunction)를 앓게 되며 심지어 사망에 이를 수 있다.
특정 LPS 함량이 수많은 젤라틴 응용분야에서 용인될 수 있지만, 특정 응용분야, 예컨대 의학적 목적 (예, 젤라틴 기반 혈장 대체, 장치(device) 및 임플란트)의 경우, 바람직하게는, 내독소 수준이 20 미만, 바람직하게는 10 EU/g 미만 또는 훨씬 더 적어야 한다. 예를 들어, 미국 식품의약국(Food and Drug Administration: FDA)의 USA 정부의 규정은 심혈관 및/또는 림프계와 접촉하는 제품에 대해서는 최대 0.5 EU/ml 또는 20 EU/장치를 허용한다. 뇌척수액과 접촉하는 장치에 대해서는, 한계가 심지어 0.06 EU/ml 또는 2.15 EU/장치 (∼2 EU/g 젤라틴)이다. 안내(intraocular) 환경과 직접 또는 간접적으로 접촉하는 장치에 대해서는, 훨씬 더 낮은 내독소 제한치가 적용될 수 있다.
투구게 분석법(Limulus assay: LAL)은 LPS의 서브-피코그램 양까지 측정하기 위한 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 생검법이다. 투구게 유주세포 용해물(Limulus amebocyte lysate: LAL)은 투구게, Limulus polyphemus로부터의 혈액 세포(유주세포)의 수성 추출물이다. LAL은 세균성 내독소와 또는 그램 음성균의 막 성분인, 지질다당류(LPS)와 반응한다. 이 반응이 LAL 테스트의 기본이며, LAL 테스트는 이후 세균의 내독소의 검출 및 정량화에 사용된다. LPS 수준을 정량하는데, US-FDA, USP 2011, chapter <85> 허용되고 권장되는 LAL 방법은 색소생산성 Endosafe 방법, 예를 들면, Charles River USA로부터의 방법이 있다. 기타 허용되고 권장되는 방법으로 Hyglos GmbH (Germany)로부터의 EndoZyme 재조합 인자 C 방법이 있다. 상기 두 방법 모두 유사하거나 동일한 측정값을 산출하며, 따라서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
당해 기술 분야에서는, Triton과 같은 세제를 사용하여 단백질 용액으로부터 LPS 함량을 감소시키는 방법이 예를 들면, Hirayama와 Sakata에 의해 문헌: Journal of Chromatography B, 781 (2002) pp.419-432에 기재되어 있다. 상기 세제는 미셀로부터 내독소 모노머를 방출시키며 상기 모노머는 흡착제에 의해 흡착되는 것으로 기재되어 있다. 하지만, Hirayama와 Sakata는 내독소뿐만 아니라 단백질이 활성탄 및 음이온-교환제와 같은 비-선택적 흡착제에 결합하는 경향이 있기 때문에 단백질-함유 용액으로부터 내독소를 제거할 때 상기 비-선택적 흡착제를 사용할 것을 강력히 충고하였다.
WO 2009/154440에는 LPS 함유 바이오폴리머(biopolymer) 물질, 예컨대 알기네이트 또는 젤라틴 수용액 중 LPS 함량을 감소시키는 방법이 기재되어 있다. WO 2009/154440의 방법은 상기 용액 중에서, 계면활성제, 고체 흡착제의 사용, 및 사용되는 계면활성제의 혼탁점(cloud point)보다 높게, 상기 용액의 온도에서의 상승에 따르며, 그 결과, 계면활성제의 용해성과 응집성이 상실되어 3상(phase) 추출 공정이 되며 여기에서 흡착제에 결합된, 응집된 계면활성제 뿐만 아니라 LPS 둘다 정제된 바이오폴리머를 포함하는 수상(aqueous phase)으로부터 원심분리에 의해 제거된다. 이 목적을 위하여, 바이오폴리머, 계면활성제, 흡착제 및 LPS를 포함하는 용액의 온도가 상기 용액이 처하게 될 조건에서 계면활성제의 혼탁점 온도보다 더 높도록 하여, 계면활성제가 응집되어 응집체가 흡착제에 흡착된 LPS와 함께 원심분리에 의해 제거되도록 하는 것이 중요하다.
따라서, WO 2009/154440에는 Triton X-114 (혼탁점이 23℃임)와 고체 흡착제를 포함하는 알기네이트 수용액을 상기 혼탁점 바로 아래 온도에서 제조한 다음, 70℃, 즉, 상기 혼탁점보다 훨씬 더 높은 온도로 가열하여 계면활성제의 응집체를 형성시키는 것이 기재되어 있다. 응집체와 흡착제 둘 다 원심분리에 의해 침전되어, 알기네이트 수상의 LPS 함량이 감소하게 된다. 또한, Triton X-100 (혼탁점이 68-69℃임)과 흡착제로서 활성탄을 포함하는 젤라틴 용액을 상기 혼탁점 온도 바로 아래에서 다시 제조한 다음, 90℃로 가열하여 상 분리, 즉, 계면활성제의 응집체를 형성시키는 것이 기재되어 있다. 원심분리에 의해, 상기 응집된 계면활성제와 활성탄 (여기에 LPS가 결합되어 있다)이 침전된다. 하지만, Triton X-100의 혼탁점보다 높은 온도, 즉, 70℃ 이상, 경우에 따라 90℃로 가열하게 되면 젤라틴의 현저한 가수분해가 일어나고 점도와 겔 강도와 같은 기능성의 본질적인 상실이 발생하게 된다. 그러한 고온에서는, 젤라틴에서의 Maillard 반응으로 인하여 젤라틴의 바람직하지못한 변색이 또한 일어날 수 있다. WO 2009/154440의 교시에는, 젤라틴이 가열 단계에 의해 파괴되어 젤라틴 가수분해물이 생산되어, 겔화될 수 없게 된다. 또한, 상기 원심분리 단계는 상기 방법을 산업용으로 적용시키는 것을 어렵게 만든다.
JP 2005/289841에는 내독소 함량이 감소된 타입 B 젤라틴의 생산 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 동물 조직을 수산화칼륨과 4급 암모늄염의 용액으로 pH 12에서 적어도 5 일동안 처리함을 특징으로 한다. 그러한 염기성 조건에서, 젤라틴의 탈아미노화(deamination)가 일어나면, 등전점(isoelectric point)이 5 - 6으로 감소되며, 즉, 타입 B 젤라틴만 수득될 수 있다. 이어서, 상기 젤라틴 용액을 산으로 약 4.5-5의 pH로 중화시키고, 적어도 65℃의 온도에서 추출함으로써 젤라틴이 수득된다. 상기 수득한 젤라틴은 내독소를 5 EU/g 미만으로 함유하는 0.2 마이크로미터 멤브레인을 통하여 여과시킴으로써 추가로 멸균시킬 수 있다. 하지만, 이 방법은 상기 여과 단계에 사용되는 멤브레인의 기공 크기 때문에 분자량이 200 kDa보다 큰 커다란 젤라틴 분자에는 적합하지 않다.
JP 2004/300077에는 콜라겐 단백질을 10-12의 pH에서 염기성 알코올 및/또는 아세톤으로 처리하고, 이에 의해 콜라겐 단백질에 포함되어 있는 내독소를 분해시킴을 특징으로 하는, 콜라겐 단백질로부터 내독소를 제거하는 방법이 기재되어 있다. LPS가 1000 EU/g 미만인 상기 생성된 단백질은 침전에 의해 회수된다. 상기와 같은 높은 pH 값에서는, 탈아미노화의 결과로 단백질의 등전점이 약 5-6으로 떨어지게 된다.
EP 1829946에는 평균 분자량이 100,000 Da 이하인 젤라틴 용액을 한외여과(ultrafiltration)시켜 젤라틴의 내독소 함량을 감소시키는 방법이 기재되어 있다. 상기 문헌에 컷오프(cut-off)가 300,000인 멤브레인을 사용할 수 있는 것으로 기재되어 있지만, 그러한 크기의 젤라틴은 용액의 점도 때문에 이 방법으로 효율적으로 가공될 수 없다. 그러한 젤라틴의 매우 희석된 용액만 한외여과시킬 수 있어, 이 방법이 매우 비효율적이고 비싸게 만든다. 한외여과에 의해서는, 평균 분자량이 100,000 Da 이하인 젤라틴만이 적합하고 한외여과용인 것으로 기재되어 있다.
WO 2012/031916에는 불용성 콜라겐을 용해시키지 않고, 상기 콜라겐을 알칼리, 산 및 산화제 수용액으로 처리함을 특징으로 하여, 상기 콜라겐의 내독소 함량을 10 EU/g 미만으로 감소시키는 방법이 기재되어 있다.
본 발명에 이르러 놀랍게도, 본 발명자들은 한외여과 또는 원심분리 단계가 필요없이, 젤라틴에 대한 비-가수분해 조건하에서, 계면활성제의 효율적인 제거가 가능하도록 계면활성제의 불용성 응집체를 형성시킬 필요없이, Triton X-100과 같은 미셀 형성 계면활성제를 사용하여 수성 젤라틴 제제로부터 LPS가 매우 효과적으로 제거될 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 이르러, 젤라틴 용액으로부터 LPS의 제거가 미셀 형성 계면활성제를 사용하여 상기 계면활성제의 혼탁점보다 낮은 조건하에서 수행되어, 상기 혼탁점보다 높은 추출 기법과 비교하여 LPS의 감소를 훨씬 더 향상시킴을 발견하였다. 임의의 설명에 국한시키고자 함이 아니라, 활성탄과 같은 고체 흡착제에 의한 계면활성제와 LPS의 효과적인 흡착은 놀랍게도 계면활성제의 불용성 응집체 형성에 따르는 것이 아니라, 이에 의해 계면활성제가 매질 중의 LPS와 반응하지 않도록 하는 단계 후 온도를 더이상 필요치않은 계면활성제의 혼탁점보다 높은 온도로 상승시키고, 이에 따라 더욱 온화한 조건하에서 LPS가 제거될 수 있도록 하는 것으로 생각된다. 따라서, LPS 제거 전의 젤라틴과 비교하여 실질적으로 손상되지 않은 점도와 같은 젤라틴의 특성을 보존하면서, 비-가수분해 조건하에서 젤라틴으로부터 LPS를 제거하는데 적합한 방법이 제공된다.
이를 위하여, 본 발명은 젤라틴과 지질다당류를 포함하는 수성 매질로부터 지질다당류를 제거하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계:
1) 적어도 2 w/w% 젤라틴과 지질다당류를 포함하는 수성 매질을 제공하는 단계,
2) 상기 수성 매질에 0.01 - 1.5 w/w%의 미셀(micelle)-형성 계면활성제를 첨가하는 단계,
3) 상기 단계 2)의 매질을 고체 흡착제와 접촉시키는 단계,
4) 상기 매질로부터 단계 3)의 고체 흡착제를 분리시키는 단계,
5) 젤라틴을 포함하는 수성 매질을 회수하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 1)-5) 각각은 68℃ 이하의 온도에서 수행되고, 상기 온도는 미셀-형성 계면활성제의 혼탁점(cloud point)보다 낮으며, 적어도 단계 2)와 3)은 적어도 30℃의 온도에서 수행된다.
상기 용어 "수성 매질"에 물, 수-혼화성 용매와 물의 혼합물을 포함시키고자 하며, 상기 혼합물에는 물이 주로 존재하고, 임의의 용액은 물 또는 그러한 혼합물이 용매이다. 하지만, 상기 매질은 수-혼화성 용매가 없는 것이 바람직하다. 상기 수성 매질은 임의의 타입의 젤라틴, 예를 들면, 소, 돼지, 가금류 또는 어류 기원의, 예를 들면, 타입 A 또는 타입 B 젤라틴을 포함할 수 있다. LPS를 제거하고자 하는 젤라틴의 블룸(bloom), 분자량 및 점도 값에 대한 제한은 없다. 특히, 상기 젤라틴을 수성 매질에, 예를 들면, 젤라틴을 용매, 예컨대 물과, 실온 또는 상승된 온도, 하지만, 젤라틴의 가수분해를 피하기 위하여, 바람직하게는 68℃보다 높지 않은, 바람직하게는 65℃보다 높지 않은, 더욱 바람직하게는 60℃보다 높지 않은 온도에서, 젤라틴 용액이 매질에서 젤라틴이 팽윤되어 매질이 젤라틴 용액이 되도록 약 30 내지 60분간 혼합시킴으로써 용해시킨다. 60-68℃ 이하에서는 젤라틴의 열적 가수분해와 바람직하지 못한 가능한 화학 반응을 피할 수 있어, 블룸값, 평균 분자량 및 점도와 같은 젤라틴의 특성과 기능성이 단계 1)에서 제공되는 바와 같은 젤라틴과 비교하여 손상되지 않고 유지된다. 여기에서, 상기 기능성(functionality)은 젤라틴의 분자량이 본 발명의 방법의 결과로, 많아야 15%, 바람직하게는 많아야 10%, 가장 바람직하게는 많아야 5%까지 감소되지 않을 때 손상되지 않고 유지하는 것으로 정의된다.
상이한 단계를 상이한 온도에서 수행하는 것이 매우 가능하지만, 상기 단계들 각각은 최대 68℃에서 수행된다.
젤라틴을 용액으로 만들기 위해서는, 상기 매질을 68℃보다 높은 온도로 가열할 수 있지만, 그러한 단계는 특허청구되는 방법을 선행하는 것임을 알아야 한다. 하지만, 바람직하게는, 젤라틴이 수용액으로 제공되고, 여기서 수성 용매, 특히 물은 68℃보다 높은 온도로 가열되지 않았으며, 기능성을 상실하지 않기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 온도보다 높은 온도로 가열되지 않는다.
상기 매질에, 미셀-형성 계면활성제를 첨가하며, 그 결과, LPS가 모노머화되고 상기 모노머는 상기 계면활성제와 반응하지 않아, 계면활성제와 LPS의 미셀 복합체를 형성하는 것으로 생각된다.
미셀-형성 계면활성제는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, WO 2009/15440에 기재되어 있고, 이의 내용은 본 명세서에 이와 함께 포함된다. 미셀-형성 계면활성제는 용액에서 미셀 (가용성 응집체)을 형성할 수 있다. 이를 위하여, 소위 임계적 미셀 농도(CMC)는 미셀이 형성되고 시스템에 첨가된 모든 추가의 계면활성제가 미셀로 가는 농도보다 높은 계면활성제의 농도로 정의된다. 상기 CMC에서 인터페이스(interface) 상에 존재하는 계면활성제와 미셀 상태 중의 계면활성제가 평형을 이룬다. 상기 CMC는 온도 의존적으로; 비-이온성 계면활성제의 경우 CMC 값은 온도가 낮아짐에 따라 증가한다 (M.J. Schick J. Phys. Chem., 1963, 67 (9) 1796-1799). 또한, 온도가 상승하면 계면활성제의 용해도가 상실되고, 계면활성제는 거의 불용성 응집체로만 존재하게 되어, 상기 용액이 불투명하거나 혼탁해진다. 상기 현상이 일어나는 온도가 소위 혼탁점(cloud point)이다. 염 농도가 증가하면 혼탁점은 낮아진다. 예를 들어, 9-23%의 (NH4)2SO4 또는 16%-25% (즉, 2.74 - 4.27M)의 NaCl을 첨가함으로써, 1 w/w% Triton X-100 용액의 혼탁점이 68℃로부터 실온으로 감소하게 된다 (Arnold and Linke, BioTechniques, 43 (2007), 427-440). 또한, 알코올을 사용하여 혼탁점을 저하시킬 수 있다 (Gu and Galera-Gomez; Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 147 (1999) 365-370).
따라서, 본 명세서에서, 상기 용어 "혼탁점"은 계면활성제가 매질에서 불용성 응집체를 형성하는 온도를 표시하는 것으로 하고자 한다. 상기 온도는 염 농도와 같은, 매질의 조건에 따른다. 특이적인 조건이 제시되지 않을 경우, 본 명세서에서 혼탁점은 1 w/w% 수용액이 불용성 응집체를 형성하는 온도로 정의된다. 그러므로, 상기 온도가 계면활성제의 혼탁점보다 낮은 것으로 기재될 경우, 상기 온도는 68-69℃ (즉, 1 w/w% Triton X-100 용액의 경우)이지만, 16-25 w/w% NaCl 용액의 경우, 상기 혼탁점은 실온이다. 본 발명에 따라서, 상기 방법 단계들의 온도가 혼탁점 아래에서 머무르는 것, 즉, 계면활성제가 용액의 혼탁 또는 불투명화를 일으키지 않도록 하는 온도인 것이 본 방법에 있어 중요하다.
혼탁점은 통상적으로 주어진 환경하에서, 계면활성제를 첨가하지 않고 620 nm에서 용액의 광 흡광도를 측정하고, 구상중인 양의 계면활성제가 첨가되었을 때 상기 흡광도가 증가되는지 여부를 체크함으로써 측정될 수 있다. 혼탁점보다 높을 때, 흡광도는 증가한다. 흡광도의 측정은 GME2014의 챕터 2.4.5 (p. 96-99)의 프로토콜에 따라서 수행될 수 있다.
놀랍게도, 혼탁점보다 더 높은 온도의 상승이 필수적이지 않음을 발견하였다. 더더욱 놀랍게도, 단계 1)-5)는 미셀 형성 계면활성제의 혼탁점보다 낮은 온도에서 수행될 때 더욱 효율적이다.
본 발명의 경우, 상기 설명한 바와 같이 상승한 온도에서 불용성 응집체를 형성시킬 필요없이, 미셀, 즉, 가용성 응집체를 형성시키는데 상기 계면활성제로 충분하다.
효율적인 LPS 제거를 위하여, 상기 미셀-형성 계면활성제가 바람직하게는 CMC와 대등하거나 더 높은 농도로 존재하여, 흡착제에 결합할 수 있는 가용성 응집체가 형성된다. Triton X-100의 경우, CMC가 0.015 w/w%이다.
LPS와 계면활성제 둘의 혼합된 응집체가 용액 중에 있을 때, 즉, 불용성 응집체를 형성시킬 필요 없이, 상기 매질을 계면활성제와 LPS의 가용성 응집체 및 이들의 모노머를 결합시킬 수 있는, 고체 흡착제와 접촉시킨다. 이는 입자성 흡착제를 상기 매질에 첨가하거나, 예를 들면 상기 흡착제를 포함하는 필터 부재를 통하여 상기 매질을 통과시킴으로써, 또는 상기 매질을 담체의 외부 표면상에 존재하는 흡착체를 가지는 담체와 배양시킴으로써 수행될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 수성 매질을 고체 흡착제와 접촉시키고 흡착제를 매질로부터 분리시키는데 적합한 방법을 알고 있다. 상기 분리는 예를 들면, 흡착제가 입자로 매질에 첨가되는 경우 원심분리 또는 여과를 포함할 수 있으며, 산업적 적용가능성 측면에서는 여과가 바람직하다. 바람직한 실시양태로, 상기 흡착제가 필터에 존재할 수 있으며, 상기 매질을 상기 필터를 통하여, 또는 일련의 그러한 필터를 통하여 통과시키고, 이때 상기 필터는 여액의 수율을 최적화하기 위하여 선택적으로 세척할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은, 이 방법의 단계 3), 4) 및 5)는 단일 여과 단계로 합할 수 있다. 달리, 더 큰 바디(body), 예컨대, 흡착제로 코팅된, 로드(rod), 또는 비드(bead)를 상기 매질에 침지시켜, LPS-계면활성제 복합체가 흡착제에 결합하도록 할 수 있으며, 이후 매질로부터 제거할 수 있다. 또한, 상기 흡착제를 칼럼에 쌓아, 젤라틴 용액을 상기 칼럼 위에 통과시켜 계면활성제와 LPS를 제거할 수 있다.
적어도 단계 2)와 3), 즉, 계면활성제의 첨가 단계 및 흡착제와의 접촉 단계, 하지만, 바람직하게는 단계 1)-5)의 모든 단계를 적어도 30℃, 즉, 젤라틴의 용융 온도보다 높은 온도에서 수행한다. 수성 매질은 자유 유동 용액, 즉, 측정가능한 동점성계수를 갖는 (즉, G" 우세 행태를 갖는) 용액인 것이 유리하다. 점도와 겔화 온도가 상이한 젤라틴에 대해 변화되지만, 젤라틴 용액을 자유 유동하여서 적어도 30℃의 온도에서 잘 가공될 수 있다. 흡착제와 접촉시킬 때 매질과 흡착제 사이에 최적의 접촉이 되도록 하고, 매질로부터 흡착제의 적합한 분리가 확실하도록 하기 위해서는 자유 유동 용액이 유리하다.
수성 매질을 회수하고, 필요에 따라, LPS 카운트를 예를 들면, 상기 기재된 바와 같은 LAL 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
젤라틴의 평균 분자량은 바람직하게는 1500 Da 내지 250 kDa의 범위, 또는 300 kDa 또는 275 kDa와 같은 더 높은 범위 내에 있으며, 상기 범위 내의 임의의 값은 예를 들어, 2000 Da, 4000 Da, 5000 Da, 15 kDa 또는 20 kDa의 하한 제한치, 및 200 kDa, 180 kDa 또는 170 kDa의 상한 제한치와 같은 더 작은 범위를 정의하기 위한 상한 또는 하한 제한치로 채택될 수 있다. 예를 들어, 중간 또는 높은 블룸 값의 젤라틴이 구상될 경우, 평균 분자량이 120 kDa보다 크다. 젤라틴 가수분해물이 구상될 경우, 평균 분자량은 70 또는 80 kDa 미만일 수 있다.
미셀-형성 계면활성제가 이온성 계면활성제, 예컨대 양이온성 또는 음이온성 계면활성제일 수 있지만, 상기 계면활성제는 바람직하게는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 이온성 계면활성제와 비교하여 더 낮은 농도에서 미셀을 형성하는 경향이 있는 계면활성제이다. 또한, 이온성 계면활성제는 이온 결합에 의해 젤라틴과 반응하지 않을 수 있으며, 제거하기가 더욱 어렵다. 바람직하게는, 미셀-형성 비-이온성 계면활성제가 에톡실화된 계면활성제, 바람직하게는 알킬페놀 에톡실레이트이며, 알킬페놀 에톡실레이트는 바람직하게는 화학식 CxH2x-1-C6H4-O-(C2H4O)nH (여기서 x는 4 - 12이고 n은 7.5 - 14이며, x가 바람직하게는 8이고 n이 바람직하게는 8 - 13, 더욱 바람직하게는 8.5 - 12.5, 가장 바람직하게는 9 - 12이다)로 표시되는 것, 특히 Triton X-100, Triton X-102, 또는 이들의 혼합물이다. 매력적인 결과는 Triton X-100 과 Triton X-102로 수득되는 것으로 밝혀졌다. n의 경우 더 높은 값일 때, 더 높은 용해도와 더 높은 혼탁점을 갖는 계면활성제가 되지만, 그러한 더 긴 계면활성제가 LPS 제거에 있어서 덜 효율적인 것으로 나타났다. 하지만, 적합한 다른 비-이온성 계면활성제는 노닐페녹시폴리에톡시에탄올 C15H24O(C2H4O)n (n은 3 - 40임), 예컨대 논옥시놀-4, 논옥시놀-15 및 논옥시놀-30, 또는 C12-C18 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 솔비탄 모노에스테르, 예컨대 TWEEN을 포함한다. CHAPSO (3-([3-콜아미도프로필]디메틸 암모니오)-2-하이드록실-1-프로판술포네이트가 다른 적합한 비-이온성 계면활성제이다.
고체 흡착제는 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있는, 계면활성제, 및 바람직하게는 LPS를 또한 결합시킬 수 있는, 임의의 적합한 흡착제, 예컨대 소수성 흡착제일 수 있다. 상기 흡착제는 바람직하게는 불용성이며, 적합한 흡착제에는 클레이(clay), 예컨대 (활성화된) 규조토 또는 클레이, 필로실리케이트, 예컨대 알루미늄 필로실리케이트, 스멕타이트 미네랄(smectite mineral) 및 소수성 흡착제, 예컨대 활성탄, 예를 들면, Norit SX Plus 또는 Norit ROX 0.8 (Cabot, the Netherlands), 또는 예를 들어, R55S 또는 R30L3S (3M, USA) 타입의 3M ZetaCarbon 필터 카트리지가 있다. 1종 이상의 흡착제의 혼합물이 또한 적용될 수 있다. 고체 흡착제는 예를 들어, 젤라틴 함유 수성 매질에 첨가될 수 있으며, 계면활성제와 바람직하게는 LPS도 상기 계면활성제에 결합하도록 한 후, 흡착제는 예를 들어, 여과, 침강 또는 원심분리 등에 의해 제거할 수 있다. 접촉 단계는 계면활성제가 적절하게 흡착하도록 하기에 충분한 시간 동안 수행되어, 계면활성제와 계면활성제 및 선택적으로 흡착제에도 결합된 LPS 둘 다 제거되도록 한다. 바람직하게는, 상기 흡착제를 수성 매질과 5분 내지 1시간, 더욱 바람직하게는 10 - 30분간 접촉시킨다. 더 긴 기간이 가능하지만, 공정의 효율성과 특히 60℃ 또는 65℃보다 높은 온도가 사용되는 경우 젤라틴의 가수분해 위험성이 더 높아진다는 관점에서 덜 바람직하다. 5분 미만의 기간이 가능하지만, 바람직한 계면활성제 제거를 완성하기 위해서 더 긴 기간의 배양과 비교할 때 더 많은 흡착제를 사용할 필요가 있을 수 있다. 매력적인 실시양태로, 흡착 단계를 회수한 단계 5의 매질을 단계 2)에서 수행된 바와 유사한 방법으로 고체 흡착제와 다시 접촉시킴으로써, 적어도 1회 반복할 수 있다.
바람직하게는, 각각의 단계 1) - 5)가 65℃ 이하, 더욱 바람직하게는 62℃ 이하, 더더욱 바람직하게는 60℃ 이하의 온도에서 수행된다. 상기 표시된 바와 같이, 68℃보다 높은 온도로의 상승은 효율적인 계면활성제의 흡착 및 수성 매질로부터의 LPS의 제거를 수득하는데 있어서 필수적인 것이 아니다. 놀랍게도, 계면활성제의 효율적인 제거는 65℃, 62℃, 60℃, 58℃ 또는 55℃의 훨씬 더 낮은 온도에서 수득됨을 또한 발견하였다. 다른 단계들이 또한 다른 온도에서 수행될 수 있지만, 30℃ - 68℃의 범위 내 및 사용되는 계면활성제의 혼탁점보다 높은 온도에서 수행된다. 젤라틴의 기능성 유지 측면에서, 바람직한 온도는 55 내지 65℃ 사이, 예컨대 57℃-60℃, 또는 58℃이다.
적어도 단계 2)와 3), 하지만, 바람직하게는 단계 1)-5)의 모든 단계를 적어도 35℃, 더욱 바람직하게는 적어도 40℃, 더더욱 바람직하게는 적어도 45℃, 적어도 50℃, 가장 바람직하게는 적어도 55℃의 온도에서 수행한다. 젤라틴 용액은 더욱 액체, 즉, 더 높은 온도에서 점성이 덜하며, 이는 용액의 취급성과 흡착제와의 접촉을 증가시킨다.
매질의 pH는 바람직하게는 3.5 내지 9.0, 더욱 바람직하게는 3.5 내지 8.0, 4.0 내지 8.0, 4.0 내지 6.0, 더더욱 바람직하게는 4.5 내지 5.5 사이이다. pH 3.5 - 4보다 낮을 경우, 젤라틴은 가수분해되기 쉬우며, 특히 젤라틴의 융점보다 높은 온도에서 가수분해되기 쉽다. 따라서, 매질의 pH는 이러한 pH 값 보다 높은 것이 바람직하다.
당해 분야의 전문가는 젤라틴이 이의 기능성을 크게 상실하지 않으면서 낮은 pH에서 배양되거나 보존될 수 있지만, 이는 온도와 배양 시간에 따른다는 것을 알고 있다. pH가 낮아지면 낮아질수록, 온도도 더 낮아야 하며/하거나, 기능성을 상실하지 않기 위해서는 배양 시간이 더 짧아져야 한다. 하지만, 당해 분야의 전문가는 젤라틴의 가수분해를 피하기 위한, pH, 시간 및 온도에 관한 적절한 조건을 결정할 수 있다. 매우 놀랍게도, 본 방법을 낮은 pH에서 수행할 때, LPS가 더더욱 효율적으로 제거됨을 발견하였다. 물론, 본 방법을 낮은 pH에서 수행할 때, 즉, 본 방법을 예를 들어, 58℃, 60℃ 또는 65℃를 넘지 않는 온화한 온도에서 수행함으로써 젤라틴의 가수분해를 피하기 위하여 주의하였다. 이를 위하여, 젤라틴을 포함하는 수성 매질의 pH가 바람직하게는 본 방법 단계를 통하여 4.0 내지 6.0, 더욱 바람직하게는 4.5 내지 5.5이다. 그러한 pH에서, 온도는 바람직하게는 약 57 - 58℃이다. 매질이 본 방법 중에 그러한 낮은 pH에 있는 전체 시간은 바람직하게는 2시간 이하, 더욱 바람직하게는 1시간 이하, 더더욱 바람직하게는 30분 이하이다.
단계 1)에서의 수성 매질은 임의의 젤라틴 농도를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태로, 단계 1)에서의 수성 매질이 용해된 젤라틴을 적어도 2 w/w%, 바람직하게는 적어도 8 w/w%, 더욱 바람직하게는 적어도 12 w/w%, 더더욱 바람직하게는 젤라틴을 적어도 20 w/w% 포함한다. 상기 수성 매질은 젤라틴 분자의 크기에 따라서, 용해된 젤라틴을 30 w/w% 이하로 또는 훨씬 더 높게, 예컨대 37 w/w% 포함할 수 있다. 젤라틴 농도가 낮은 수성 매질은 젤라틴 농도가 높은 매질보다 더 낮은 겔화 온도를 가지게 되어, 본 방법이 더 낮은 온도에서 수행될 수 있도록 하는데, 이는 배양이 낮은 pH에서 수행되어야 하는 경우 유리할 수 있다. 30-37 w/w%보다 높은 경우에서는, 수성 매질이 적합한 가공, 특히 흡착제의 접촉과 제거에 있어서 너무 점성이 될 수 있다. 젤라틴 가수분해물과 같이, 상대적으로 작은 크기의 젤라틴이 사용되는 경우에만, 상기 농도를 약 40 w/w%로 증가시킬 수 있다. 그러한 높게 농축된 젤라틴 용액의 점도를 감소시키기 위하여 온도를 상승시키면 바람직하지 못한 젤라틴 가수분해와 분자량, 점도 및 블룸값이 상실될 수 있다.
단계 2)에서, 젤라틴 대 첨가되는 비-이온성 계면활성제의 중량비가 바람직하게는 2000:1 이하, 더욱 바람직하게는 500:1 이하, 더더욱 바람직하게는 250:1 이하, 가장 바람직하게는 50:1 이하이다. 젤라틴 대 첨가되는 비-이온성 계면활성제의 중량비가 바람직하게는 50 -5:1이다. 더 높은 중량비, 즉, 상대적으로 젤라틴이 더 많은 경우, 계면활성제에 의해 LPS가 모두 결합되는 것은 아니다. 한편, 더 낮은 비율에서는, 젤라틴의 수율이 손상되거나, 높은 수준의 계면활성제에서 흡착이 최적치 이하(suboptimal)가 된다. 그런 경우, 계면활성제를 최적으로 제거하기 위해서는 더 많은 라운드(round)의 흡착이 필요할 수 있다. 하지만, LPS가 흡착제, 특히 활성탄의 경우 더 강하게 결합하는 경향이 있기 때문에, 통상적으로 단일 단계로 가능한 많은 양의 계면활성제를 제거하기 위해서는 계면활성제와 비교하여 과량의 흡착제를 사용하는 것을 선택한다.
본 방법의 단계 2)에서, 계면활성제는 바람직하게는 0.015 - 1.0 w/w%, 더욱 바람직하게는 0.020 - 0.50 w/w%의 농도로 첨가하여, 매질 중의 LPS를 결합시킨 후 이들이 적합하게 제거될 수 있도록 하고, 또한 효율적인 가공-가능성을 위하여 높은 젤라틴 함량이 허용되도록 한다. 계면활성제의 적합한 농도는 또한 젤라틴 중의 LPS 함량에 대해 조정될 수 있다. 출발 젤라틴 물질이 이미 상대적으로 낮은 LPS 함량을 가지는 경우, 상대적으로 낮은 농도 (CMC 값을 크게 초과하지 않는 농도)의 계면활성제가 필요할 수 있으며, 이는 계면활성제의 제거가 더욱 용이하게 만든다.
본 방법의 단계 2)가 바람직하게는, 계면활성제 첨가 후 매질을 적어도 1분 동안, 더욱 바람직하게는 2분 내지 1시간, 더더욱 바람직하게는 5 - 30분, 가장 바람직하게는 15 - 30분 동안 배양시켜, LPS가 계면활성제에 적합하게 결합하도록 하는 단계를 포함한다. 너무 장시간 배양, 특히 60℃보다 높은 온도에서의 장시간 배양은 젤라틴 가수분해와 기능성 (블룸, 점도) 상실의 위험을 증가시킨다.
계면 활성제와 LPS를 매질로부터 최적으로 제거하기 위해서는, 단계 3)과 4)가 바람직하게는 단계 2) 이후 수득한 매질을 고체 흡착제를 포함하는 필터 부재 1개 이상을 통하여 통과시키는 단계를 포함한다. 활성탄을 함유하는 필터 시스템, 예를 들면, 3M ZetaCarbon 카트리지 필터 타입 R55S 또는 R30L3S (3M, USA)가 매우 적합한 것으로 증명되었다. 젤라틴은 필요에 따라, 예를 들면, 단리(isolation)에 의해 여액으로부터 추가로 회수될 수 있다. 그러한 여과 단계는 구상된 형태로 내독소 함량이 감소된 젤라틴의 회수를 위하여, 즉, 추가의 회수 단계에 대한 필요성이 없이, 이미 제공될 수 있다. 그런 경우, 단계 3), 4) 및 5)는 단계 2) 이후 수득된 매질을 고체 흡착제를 포함하는 필터 부재 1개 이상을 통하여 통과시키는 단계를 포함한다.
다른 실시양태로, 본 방법의 단계 3)에서 고체 흡착제가 바람직하게는 매질에 적어도 2.5:1의 계면활성제에 대한 중량비로, 더욱 바람직하게는 적어도 3.0:1, 가장 바람직하게는 적어도 3.5:1의 중량비로 첨가된다. 고체 흡착제가 바람직하게는 0.1 - 3 w/w%, 바람직하게는 0.5 - 1 w/w%의 농도로 매질에 첨가된다. 필터 부재 또는 시스템이 사용되는 경우, 필터 시스템에 유사한 양의 흡착제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 회수 단계 5)는 바람직하게는, 여과, 매질로부터 고체 흡착제의 분리 단계를 포함한다. 상기 실시양태는 흡착제 물질이 혼합되었을 때, 예를 들면, 입자상 물질로서, 젤라틴과 계면활성제를 포함하는 수성 매질에 존재할 때 유리하다. 상기 표시한 바와 같이, 흡착제는 덜 바람직하지만, 또한 원심분리되거나, 담체 등에 결합될 수 있다. 상기 표시한 바와 같이, 여과 단계는 또한 흡착제 물질을 포함하는 필터 부재를 사용함으로써 단계 3) 및 4)와 합해질 수 있다.
본 발명에 따라서, 염의 존재가 본 발명을 수행하는데 필수적인 것이 아니기 때문에, 낮은 염 조건에서의 작업이 가능하다. 염을 포함시켜, 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용하고자 구상중인 계면활성제의 혼탁점을 낮출 수 있지만, 이는 필수적인 것이 아니다. 대조적으로, 본 방법 단계의 조건은 사용되는 계면활성제의 혼탁점 아래에서 수행되어야, 상기 혼탁점을 낮출 필요가 없다. 또한, 계면활성제의 혼탁점에 대한 효과를 갖는데 필수적인, 높은 염 농도가 최종 정제된 젤라틴에서는 바람직하지 못하며 이의 기능성에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 본 발명의 매력적인 실시양태로, 수성 매질이 단계 1)-5) 중에 100 mM 이하, 바람직하게는 80, 70, 60 또는 50 mM 이하, 가장 바람직하게는 40, 30 또는 20 mM 이하의 염 함량을 갖는다. 따라서, 임의의 탈염 단계를 포함시킬 필요없이, 염 함량이 낮고, 낮은 내독소 함량을 갖는 젤라틴 용액을 제공할 수 있다. 이를 위하여, 단계 5)의 회수된 매질이 바람직하게는 100 mM 이하, 더욱 바람직하게는 80, 70, 60 또는 50 mM 이하, 가장 바람직하게는 40, 30 또는 20 mM 이하의 염 함량을 갖는다.
본 발명의 방법은 원심분리 단계가 필요없이도 낮은 내독소 함량을 갖는 젤라틴을 생성시키기 때문에, 본 발명의 방법은 바람직하게는 원심분리 단계가 없다. 그러한 원심분리 단계는 내독소 함량이 낮은 젤라틴을 큰 규모로 회수하는 것을 어렵고 비용이 많이 들게 한다. 본 발명의 방법은 예를 들면, 여과에 의해 낮은 내독소 함량의 젤라틴을 제공할 수 있기 때문에, 원심분리 단계를 바람직하게 피하게 된다.
본 발명의 방법은 노동력이 많이 소요되는 한외여과 단계가 필요없이 낮은 내독소 함량을 갖는 젤라틴을 생성시키기 때문에, 본 발명의 방법은 바람직하게는 한외여과 단계가 없다. 이는 비용 효과 측면에서 유리할 뿐만 아니라, 큰 크기의, 예를 들면, 평균 분자량이 100 kDa 이상, 예컨대 150 kDa 또는 200 kDa 또는 250 kDa 이상을 갖는 높은 블룸 젤라틴을 수득할 수 있으며, 이런 젤라틴은 한외여과막을 통과하지 못한다.
또한, 한외여과를 사용할 때 수율이 크게 작다. 다른 실시양태로, 상기 수용액이 실질적으로 아세톤이 없으며, 바람직하게는 단계 1)-5) 중에 어떠한 케톤도 없다. 당해 분야에 알려져 있는 방법과는 대조적으로, 본 발명의 방법은 어떠한 케톤도 첨가할 필요가 없는데, 케톤은 사실 바람직하지 못한 불순물이다. 다른 실시양태로, 상기 수용액이 실질적으로 알코올, 특히 에탄올이 없다.
특정의 실시양태로, 본 방법이 수성 매질을 산화제와 함께 배양시키는 단계를 추가로 포함한다. 놀랍게도, 산화제가 특허청구되는 방법 중, 특히 단계 1), 2) 또는 3) 중 임의의 단계 중, 바람직하게는 단계 2) 중 매질에 첨가될 때 LPS 함량이 추가로 감소될 수 있음을 발견하였다.
상기 산화제가 바람직하게는, 과산화수소 및 과아세트산 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 과산화수소가 가장 바람직하다.
산화제가 바람하게는 0.5-2.5 w/w%의 농도로 첨가된다.
특허청구되는 방법에서, 단계 1)에서의 수성 매질이 바람직하게는 1000 EU/젤라틴의 무수 중량 g 이하의 지질다당류 함량을 갖는다. LPS 함량이 더 높은 경우, 매질을 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 단계로, 예를 들어, EP0739630에서 전혈(whole blood)로부터 내독소 제거에 대해 기재된 바와 같거나, 또는 Hirayama와 Sakata, supra에 의해 더욱 일반적으로 기재된 바와 같이, 미리 처리할 수 있다. LPS 함량이 더 높은 젤라틴 제제로 시작하여 단계 2)-5)를 반복함으로써 반복되는 단계 2)와 3)에서는 신선한 물질을 사용하여 수행하는 것이 또한 가능하다. 이어서, 단계 5)의 수성 매질을 사용하여 필요에 따라 새로운 단계에서 상기 매질을 제공할 수 있다.
단계 1)에서 출발 물질이 1500-1000 EU/g보다 낮은 LPS 함량을 가지는 경우, 젤라틴 그램 당 지질다당류 100 EU 미만, 50 미만, 20 미만, 10 미만, 5 미만 또는 심지어 2 미만 또는 심지어 1 EU 미만(EU/g)을 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 5개 단계의 단일 라운드로 정제된 젤라틴을 수득할 수 있다. 본 발명에 따르는 방법은 단계 1)의 출발 물질 중의 LPS 함량과 비교하여 적어도 50배 적은 LPS, 바람직하게는 적어도 100배, 더욱 바람직하게는 적어도 150배, 더더욱 바람직하게는 적어도 200배 및 가장 바람직하게는 적어도 250배 적은 LPS를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 5개 단계의 단일 라운드로 정제된 젤라틴을 제공한다. 상기 용어 EU는 당해 분야에 공지되어 있으며 '내독소 단위(endotoxine unit)'를 반영한다. 1 EU는 대략 100 pg의 이. 콜리(E. coli) 지질다당류와 등가이며, 이 양은 약 104-105 마리의 세균에 존재하는 양이다. 본 명세서에서, 용어 EU/g은 젤라틴 무수 중량 당 EU 개수(count)를 반영한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 수득할 수 있는 젤라틴에 관한 것으로, 4급 암모늄 염이 실질적으로 없으며, 분자량이 100,000 Da보다 큰, 가장 바람직하게는 120,000 Da보다 큰 분자로부터 유도되고, 지질다당류 함량이 100 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 10 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 5 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게는 1 EU/g 미만인 젤라틴을 포함한다. 본 발명이 완성되기까지, 상기와 같이 낮은 내독소 젤라틴을 제조할 수 없었다. 공지의 한외여과 방법은 젤라틴 분자가 100,000 Da보다 크지 않으며, 따라서, 그러한 젤라틴은 100 kDa보다 큰 분자량을 갖는 젤라틴 유도된 분자를 포함하지 않는다. 그러한 젤라틴은 기껏해야, 낮은 블룸 젤라틴이거나 가수분해물이다. 고농도의 4급 암모늄 염을 사용한 처리에 의해서만 내독소 함량이 낮은 타입 B의 젤라틴이 수득될 수 있는 것으로 나타났다. 하지만, 염의 존재는 젤라틴의 기능성에 영향을 줄 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 4급 암모늄 염을 사용할 필요없이 높은 분자량을 가지며, 내독소 함량이 낮은 젤라틴을 제공한다. 용어 "젤라틴 유도된 분자"에는 예를 들어, 당해 기술 분야에 알려진 바와 같이, 젤라틴 제조용으로 가공된, 원료 물질 중의 콜라겐 매트릭스의 일부인 단백질 및 펩티드 분자가 포함되도록 한다.
다른 실시양태로, 본 발명은 지질다당류 함량이 2 EU/g 미만, 바람직하게는 1 EU/g 미만인, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 젤라틴을 제공한다. 상기와 같은 낮은 LPS 함량을 갖는, 예를 들어, 타입 A 및 B의 젤라틴은 본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있는 한편, 당해 기술 분야의 방법은 LPS 함량이 더 높은 젤라틴을 제공한다.
특정의 실시양태로, 본 발명은 A 타입의 젤라틴, 즉, 등전점이 7보다 큰, 바람직하게는 8보다 크며, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있고, 분자량이 100,000 Da보다 큰, 가장 바람직하게는 120,000 Da보다 큰 젤라틴 유도된 분자를 포함하며, 지질다당류 함량이 100 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 10 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 5 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게는 1 EU/g 미만인 젤라틴에 관한 것이다. 당해 기술 분야에서는, 상기와 같이 내독소 함량이 낮은 타입 A 젤라틴만이 한외여과에 의해 제조되어, 젤라틴 분자가 100 kDa보다 작았다. 하지만, 본 발명은 더 큰 젤라틴 분자를 포함하면서도 내독소 함량이 매우 낮은 A 타입 젤라틴을 최초로 제공한다.
본 발명의 젤라틴은 바람직하게는, 1500 Da 내지 250,000 Da, 더욱 바람직하게는 2000 내지 200,000 Da, 더더욱 바람직하게는 5000 내지 180,000 Da, 가장 바람직하게는 20,000 Da 내지 170,000 Da의 평균 분자량을 갖는다. 본 젤라틴은 바람직하게는 80,000 Da보다 큰, 바람직하게는 100,000 Da보다 큰, 가장 바람직하게는 120,000 Da보다 큰 평균 분자량을 갖는다.
매력적인 실시양태로, 본 젤라틴은 아세톤, 바람직하게는 임의의 케톤이 실질적으로 없다. 또한, 본 젤라틴은 바람직하게는 알코올, 특히 염기성 알코올(basic alcohol)이 실질적으로 없으며, 또한, 바람직하게는 4급 암모늄 염이 실질적으로 없다.
또 다른 실시양태로, 본 발명은 본 발명의 젤라틴을 적어도 2 w/w% 포함하는 수성 매질에 관한 것으로, 상기 매질은 염 함량이 100 mM 이하, 바람직하게는 50 mM 이하, 가장 바람직하게는 20 mM 이하이다. 상기 수성 매질은 바람직하게는 아세톤 및/또는 4급 암모늄 염 및/또는 알코올, 특히 염기성 알코올이 실질적으로 없다. 상기 수성 매질은 바람직하게는 젤라틴을 적어도 6 w/w%, 바람직하게는 적어도 10 w/w%, 더욱 바람직하게는 적어도 15 w/w%, 가장 바람직하게는 적어도 20 w/w% 포함한다.
이제, 본 발명을 비-제한 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명하고자 한다.
도 1은 25℃에서 젤라틴 수용액의 표면장력에 대한 계면활성제 농도의 효과를 보여주는 그래프이다. Triton X-100의 CMC는 0.015 - 0.018인 것으로 밝혀졌는데, 이는 수(water)중에서 상기 CMC와 등가이다.
도 2는 젤라틴 수용액으로부터 Triton X-100 계면활성제를 제거하기 위한 흡착제 비율의 함수로서 상기 용액의 표면장력을 보여주는 그래프이다.
도 3은 정제에 사용되는 상이한 Triton 종류에서 폴리옥시에틸렌 모이어티의 길이의 효과를 보여주는 그래프이다. X축은 C8H15-C6H4-O-(C2H4O)nH에서 n 숫자를 나타내고, Y축은 정제 후 LPS를 함유하는 젤라틴 중 EU/g으로 표시되는 LPS 함량을 나타낸다.
도 2는 젤라틴 수용액으로부터 Triton X-100 계면활성제를 제거하기 위한 흡착제 비율의 함수로서 상기 용액의 표면장력을 보여주는 그래프이다.
도 3은 정제에 사용되는 상이한 Triton 종류에서 폴리옥시에틸렌 모이어티의 길이의 효과를 보여주는 그래프이다. X축은 C8H15-C6H4-O-(C2H4O)nH에서 n 숫자를 나타내고, Y축은 정제 후 LPS를 함유하는 젤라틴 중 EU/g으로 표시되는 LPS 함량을 나타낸다.
실시예
상이한 실시예에서 사용되는 젤라틴에 대한 전체적인 개요는 표 1에 게시되어있다.
젤라틴 특성을 측정하기 위한 분석 방법은 GME10에 기재되어 있다.
실시예에서, Triton X-100과 같은 계면활성제가 LAL 분석 결과를 차폐시킬 수 있으므로, 계면활성제의 제거를 모니터하였다. 추가적인 세부사항에 대해서는 실시예 4를 참조한다.
달리 표시되지 않는 한, 혼합은 IKA Werke Germany로부터의 수조(water-bath) 혼합기인, 모델 R015 파워와 4-5 cm 길이의 표준 자기 교반 막대를 사용하여 750 rpm의 속도로 수행하였다.
달리 표시되지 않는 한, 표시된 젤라틴 중량은 10-13 w/w%의 수분 함량을 포함한다.
실시예 1
LPS 함량이 다른 젤라틴 수용액으로부터 내독소 정제
초기 LPS 함량이 상이한, ∼1000 내지 약 34,000 EU/g 젤라틴으로 변화되는 (표 1.1 참조), 50 g의 젤라틴 배치 1,3,4,5,6 및 8,15,16 및 17을 물 700 mL와 함께 칭량하여 6.66 w/w% 젤라틴 용액을 제조하였다. 표 1에 나타낸 젤라틴은 10.3 내지 12.6 w/w%의 수분함량을 갖는다. 따라서, 실제의 젤라틴 함량은 무수물 기준으로 87.5 - 89.7%이다.
상기 혼합물을 주위 온도에서 30분간 보존하여 젤라틴이 팽윤/수화되도록 하였다. 이어서, 750 rpm의 속도로 30 내지 45분간 일정한 혼합 하에서 온도를 최대 60℃로 상승시켜 젤라틴을 용액으로 만들었다. 상기 젤라틴 용액의 pH는 5.2 내지 5.6이 되도록 측정하였으며, 추가적인 pH 조정을 하지 않았다. 샘플을 채취하고 초기 LPS 함량을 측정하였다. Charles River USA로부터의 Endosafe LAL 방법 및 Hyglos GmbH (Germany)로부터의 EndoZyme 재조합 인자 C 방법을 둘 다 사용하여 정제 전 및 후의 젤라틴 중 LPS 수준을 분석하였다.
두 방법은 제조업자의 지침에 따라서 사용하여 LPS 함량을 측정하였다.
LPS 분석을 위하여 1000 mg 젤라틴을 40.0 mL 탈이온화된, 파이로겐이 없는 물에 용해시켰다. 상기 용액을 30-45분간 55℃로 가열하여 젤라틴이 완전히 용해되도록 하고, 40℃로 조정한 다음 LPS 분석을 수행하기 전에 적합하게 희석시켰다.
다음, 1.4 g (0.18 w/w%) Triton X-100 (Carl-Roth, Germany, 제품 번호 3051.4)을 상기 젤라틴 용액에 첨가하고 젤라틴-Triton X100 용액을, 750 rpm의 속도를 사용한 일정한 혼합 하에, 75℃에서 30분간 놓았다.
표 1.1: 젤라틴 출발 물질
*점도는 GME10에 따라서 측정하였으나, 6.67 w/w% 용액 대신, 20 w/w% 용액을 25℃에서 사용하였다. **G: Rousselot bvba, Gent, Belgium; A: Rousselot AS, Angouleme, France; P: Rousselot Inc., Peabody, USA; I: Rousselot SASIal, Isle sur la Sorgue, France
이어서, 최소 5.0 g의 활성탄 (Norit SX-Plus, Cabot, the Netherlands)을 첨가하고 (0.7 w/w%), 이어서 추가로 30분간 60℃에서 혼합 (500-1000 rpm)하였다. 다음, 상기 용액을 0.45 ㎛ 필터 (Phenex RC 26 mm, 0.45 ㎛ (Phenomenex, The Netherlands) 상에서 여과하여 활성탄을 제거하고 정제된 용액에 대한 직접적인 LPS 분석을 위하여 40℃로 냉각시키거나, -20℃로 동결시키고 Christ Alpha 2-4LD Plus 동결-건조기 (MartinChrist, Germany)를 사용하여 동결 건조시켰다. 동결-건조 진공 조건: 용액의 수분 함량이 대략 4-6%로 건조될 때까지 적어도 24-48시간 동안 0.04 mbar 및 -87℃. 내독소 분석 전에 수분 보정을 하지 않았다.
초기 (비-정제된) 젤라틴 용액을 Phenex 0.45 ㎛ 필터 상에 여과시키는 것은 젤라틴 중 초기 LPS 수준에 영향을 주거나 감소시키지 않았다.
매우 효율적인 LPS 제거가 출발 물질로부터 수득될 수 있음을 표 1.2로부터의 데이터로부터 발견할 수 있다. 내독소 함량이 2 EU/g 이하 정도로 낮은 젤라틴을 수득하기 위해서는, 내독소 함량이 1500 EU/g 이하인 젤라틴 용액으로 시작하는 것이 바람직하다.
표 1.2: 상이한 젤라틴 배치에서 LPS 감소
실시예 2:
계면활성제 농도의 변화
3개의 6.66 w/w% 젤라틴 용액을 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이, 거의 유사한 평균 분자량과 점도를 갖는, 젤라틴 배치 1, 2 및 15를 사용하여 제조하였으며, 표 1을 참조한다. 상이한 양의 Triton X-100 (Carl-Roth, 제품 번호 3051.4)을 상기 용액 (표 3 참조)에 가한 다음, 최대 60℃에서 30분간 혼합시킨다. 이어서, 5.0 g (0.7 w/w%)의 활성탄 (Norit SX-Plus)을 테스트 2-3-4-5에 첨가하였다. 최대 60℃에서 30분간 500-1000 rpm에서 혼합한 다음, 0.45 ㎛ 필터 (Phenex RC 26mm, 0.45 ㎛)를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제거하였다. 테스트 6의 경우 활성탄의 양을 각각 20g으로 증가시켜 모든 Triton X100이 정제된 젤라틴 용액으로부터 제거되도록 하였다. 표면 장력 분석으로 Triton X100 농도가 정말로 CMC보다 낮은 값으로 감소되는지 확인하였다.
정제 후, 젤라틴을 -20℃에 보관하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결-건조시켰다. 상기 동결-건조된 젤라틴을 LAL LPS 분석용으로 사용하였다.
표 2는 Triton의 CMC보다 높은 이의 농도가 내독소 제거에 유리한 것으로 나타남을 표시한다.
표 2: 상이한 수준의 Triton X100에 대한 LPS 감소
실시예 3
LPS 정제제로서 규조토
6.66 w/w% 젤라틴 1 및 9 용액 600 mL를 pH 5.5에서 제조하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 Triton X100으로 처리하였다. 60℃의 최대 온도에서 30분간의 배양 단계 후, 활성탄 대신, 탈이온수로 미리-세척한 규조토 (Claracel CBL) 70 그램을 첨가한 다음 4시간 동안 연속해서 50℃에서 혼합하였다. 4시간 후, 규조토를 여과 (Whatman Glass microfiber GF/C 등급, 55 mm 직경, 2 mm. Schleicher & Schuell, Germany)에 의해 제거하였다. 여과된 젤라틴 용액을 밤새 -20℃에서 보관한 다음, 동결-건조시켰다 (동결-건조 조건에 대해서는 실시예 1을 참조). 비-정제된 6.67% 젤라틴 1 및 9 샘플을 또한 -20℃에 보관하여 동결-건조시켰다. 정제 및 비-정제된 동결-건조 젤라틴 샘플에 대해 LPS 함량을 분석하였으며, 표 3을 참조한다.
흡착제로서 규조토를 사용하면 젤라틴으로부터 상당한 양의 내독소가 제거될 수 있다. 하지만, LPS 정제는 활성탄을 사용할 때와 비교하여 약간 덜 효율적이며, 젤라틴 1을 참조한다. 하지만, 예비-정제 단계에 규조토를 또한 적용시킬 수 있다.
표 3: 흡착제로서 규조토를 사용한 LPS 감소
실시예 4:
흡착제의 양의 변화
젤라틴을 포함하는 매질에 계면활성제를 첨가하기 전 샘플의 표면장력을 측정하고, 흡착제로 처리하여 이를 제거한 후 측정한 표면장력과 비교함으로써 흡착제에 의한 계면활성제의 제거의 효율성을 분석한다. 계면활성제, 예를 들면, Triton X100의 존재하에서 표면장력이 떨어진다. 도 1은 65-67 mN/m인 1 w/w% 젤라틴 용액의 초기 표면장력이 용액의 중량을 기준으로, 0.001 w/w%의 Triton 농도에서 시작하여 현격하게 떨어짐을 보여준다. Triton X100의 임계적 미셀 농도는 0.014 내지 0.018 w/w%이다.
표면장력은 Digidrop (GBX, France) 접촉각/표면장력 분석 장비를 사용하여 분석하였다. 니들 직경은 0.81 mm였으며 드롭 형성 속도는 0.384 ㎕/s였다. 최대 드롭 용적은 9.900 ㎕이다. 표면장력은 ds/de 방정식을 사용하여 계산하였다.
많은 양의 계면활성제가 사용되는 경우, 상기 계면활성제를 용액으로부터 제거하는데 상응하는 더 많은 양의 흡착제가 필요할 수 있다. 또한, 순수 젤라틴과 대등한 65-67 mN/m의 표면장력 값이 수득될 때까지, 제1 라운드의 흡착에서 제거되지 않은, 임의의 잔류 계면활성제를 제거하기 위하여 흡착 단계를 반복할 수 있다.
물 700 mL 중 50, 60 및 100g의 젤라틴 7(표 1 참조)의 용액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하여, 각각 6.66, 8.0 및 12.5 w/w%의 젤라틴 농도를 생성시켰다. 첨가되는 Triton X100 (Carl-Roth) 양은 6.67% 젤라틴 용액의 경우 1.4 g (0.18 w/w%), 8% 젤라틴 용액의 경우 1.7 g(0.216 w/w%) 및 12.5% 젤라틴 용액의 경우 2.8 g(0.36 w/w%)이었다. 혼합은 500-1000rpm의 속도로 60℃에서 수행하였다.
첨가되는 활성탄 (Norit SX-Plus)의 양은 변화되며 또한 Triton X100 농도 증가에 따라 함께 증가하였다. (표 4 참조). 활성탄 첨가 후, 상기 혼합물을 추가로 30분간 60℃에서 500-1000 rpm의 속도로 혼합하였다. 최종적으로 상기 용액을 실시예 1과 대등하게 0.45 ㎛ 필터(Phenex RC 26mm, 0.45 ㎛)를 사용하여 여과하였다. 상기 여과된 용액을 사용하여 표면장력을 측정하였다. (표 4 참조). 표 4 및 도 2로부터 활성탄:Triton X100의 중량비 2.5 이상에서 표면장력이 계면활성제를 첨가하지 않은 초기 젤라틴 용액에 가깝게 됨을 관찰할 수 있다. 3 이상, 특히 3.5 이상의 중량비에서는, 표면장력이 초기 젤라틴 용액의 것과 등가였는데, 이는 계면활성제가 실질적으로 완전히 제거되었음을 나타낸다. 더 높은 (3.5보다 큰) 활성탄:Triton 비율은 더더욱 효율적으로 Triton X100을 감소시킨다. 도 2를 또한 참조한다.
표 4: 표면장력에 대한 활성탄/Triton 비율과 효과
실시예 5
온도 변화, LPS 제거와 기능성에 대한 영향
실시예 2에 기재된 바와 동일한 테스트를 젤라틴 1에 대하여 수행하였다. pH는 5.5의 값으로 조정하였다. Triton X100 첨가 후, 상기 용액을 60℃에서 15분간 혼합하고, 이어서, 온도를 표 5에 게시된 온도로 조정한 다음, 추가로 최대 30분간 500-1000 rpm으로 혼합하였다. 2개의 상이한 Triton X100 농도, 0.18 및 0.026 w/w%를 사용하였다.
이어서, 활성탄을 사용한 처리 및 용액 여과를 실시예 1에 따라서 수행하였다. LPS 분석 외에, 용액의 점도뿐만 아니라 젤라틴의 평균 분자량의 분석도 처리 후 젤라틴의 기능성의 지표로서 수행하였다.
점도는 GME10에 기재된 방법에 따라서 분석하였다. 분자량 분포는 Olijve 등, supra에 따라서 측정하였다.
LPS 분석 전에 이전에 기재된 바와 같이 젤라틴을 동결-건조시켰다.
표 5: pH 5.5에서 온도 변화 - 젤라틴 1
90℃의 온도에서, 젤라틴은 가수분해되어 이의 기능성을 상실하게 됨을 명백하게 관찰할 수 있다. 점도는 4.4의 초기 값에서 0.8 mPas로 감소하며 평균 분자량은 130에서 46 kDa로 감소, 즉, 분자량의 65%가 상실된다. 또한, 80℃의 온도에서, 분자량과 점도에서의 감소가 또한 현저하다. 하지만, 65℃ 이하의 온도 (Triton X100의 혼탁점보다 낮은 온도)에서는 현저한 가수분해가 방지되고, 기능성이 유지되는데, 놀랍게도, 매우 효율적인 LPS 제거가 관찰되며, 이는 더 낮은 Triton X100 농도와 대등하거나, 더 낮은 Triton X100 농도에서는 더 높은 온도에서보다 약간 더 좋다.
실시예 6
pH 및 온도 변화, LPS 제거 및 기능성에 대한 영향
본 실시예는 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 젤라틴 1, 2, 3, 7, 8 및 10을 정제용으로 사용하였다. 온도 외에, 정제 용액의 pH도 조정하였으며 변화시켰다. Triton X100 (0.026 및 0.18 w/w%) 첨가 후, 온도를 표 6.1에 표시된 바와 같이 57.5에서 90℃로 조정하였으며 500-1000 rpm에서 30분간 혼합하였다. 이어서, 5.0 그램의 활성탄 (Norit SX-Plus)을 첨가하고 용액을 추가로 15-30분간 500-1000 rpm에서 혼합하였다. 다음, 상기 용액을 선행 실시예에 기재된 바와 같이 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. 이전에 기재된 바와 같이 LPS 분석 전에 젤라틴을 동결-건조시켰다. 표 6.1에서, 젤라틴 7에 대해서 온도 변화를 수행하였으며 pH를 pH 4.5로 조정하였다. 더 낮은 pH 값에서 젤라틴 가수분해와 관련하여 온도가 훨씬 더 임계적으로 된다. 내독소 (LPS) 분석 외에, 또한 분자량과 점도 값을 정제 후 측정하여 가능한 젤라틴 가수분해와 젤라틴 특성의 상실을 관찰하였다. 점도와 분자량 분포 분석은 실시예 5에 언급된 방법을 사용하여 측정하였다.
표 6.1: 4.5의 pH에서 온도 변화 - 젤라틴 7
65℃보다 높은 온도, 특히 80 및 90℃, 및 4.5의 낮은 pH에서는 사용되는 테스트 조건하에서 분자량과 점도를 상실하는 것을 관찰하였다. (표 6.1 참조). 따라서, 젤라틴은 15분 이하의 본 방법의 단계 중에 65℃ 이하에서 유지시키는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, pH가 4.5 이하, 예컨대 4.0일 경우 본 방법의 단계 중 온도가 60℃를 넘지 않는 것이다.
표 6.1의 결과를 확인하기 위하여, 젤라틴 2, 3 및 7을 사용하여 57.5℃의 온도, 즉, 젤라틴이 가수분해되는 온도(60℃)보다 낮고 높은 온도에서 더 넓은 범위의 pH를 테스트하였다.
적용되는 pH 범위가 표 6.2에 게시되어 있다. 젤라틴 용액의 pH 조정은 Triton X100 첨가 전에 0.1M 염산 (Sigma Aldrich, 258148-500ML) 또는 0.1M NaOH (Sigma-Aldrich, USA, 221465-500G)로 수행하였다. 염산 대신, 다른 산, 예컨대 황산 (Sigma-Aldrich)을 또한 사용하여 상기 pH를 낮출 수 있다. pH 조정 후 클로라이드 농도는 50 mM보다 낮은 것으로 관찰되는데, 이 농도는 사용되는 계면활성제의 혼탁점에 영향을 주지 않는 농도이다.
젤라틴 용액 제조 및 Triton X100 (0.18 w/w%), 활성탄 첨가 (5 그램, 0.7 w/w%), 혼합 및 젤라틴 샘플의 여과는 선행 실시예에 기재된 방법과 같다. 전술한 바와 같이 LPS 분석 전에 젤라틴을 동결-건조시켰다. 57.5℃에서의 LPS 정제 결과와 정제 후 측정된 분자량 및 점도가 표 6.2에 제공된다.
57.5℃에서 pH의 변화는 미셀 수상의 상분리를 일으키기 않았다.
표 6.2: 57.5℃에서 pH 변화, Triton X100 0.18%(w/w)
57.5℃에서 pH를 변화시키면 4.5보다 높은 pH 값에서 분자량과 점도에서 제한된 상실이 발생한다. (표 6.2 참조). 4.5와 5.6 사이의 pH 값에서 분자량/점도의 상실 없이 현저한 LPS 정제가 수득된다. 특히 젤라틴 7의 경우.
여러 가지 젤라틴 (1,2,3,7,8,10)을 57.5℃의 온도에서 pH 4.5 및 5.5에서 테스트하여 분자량 및 점도를 상실하지 않고 정제 효율성을 비교하였다. (표 6.3 참조). 젤라틴 용액 제조는 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 필요에 따라, 0.1M 염산 (Sigma Aldrich, 258148-500ML) 또는 0.1M NaOH (Sigma-Aldrich, 221465-500G)를 사용하여 pH를 4.5 및 5.5로 조정하였다. 염산 대신, 다른 산, 예컨대 황산 (Sigma-Aldrich)을 또한 사용할 수 있다.
사용되는 Triton X100 농도는 0.18 w/w%이며 최소 5 g의 활성탄을 혼합하였다. 젤라틴 용액을 선행 실시예에 기재된 바와 같이 LPS 분석 전에 여과하였다. 상기 기재된 바와 같이 LPS 분석 전에 젤라틴을 동결-건조시켰다.
개선된 LPS 정제는 5.5와 비교되는 4.5의 pH 값에서 볼 수 있다. 더 낮은 pH에서 개선된 LPS 정제의 영향은 더 높은 초기 LPS 값에서 더 커지는 것 같다. 낮은 LPS 수준 (<20 EU/g)이 요구되는 경우 더 낮은 pH가 바람직하다. 57.5℃에서 테스트한 젤라틴의 경우 pH 4.5와 5.5 사이에서 분자량 분포에서의 현격한 변화는 관찰되지 않았으며, 값이 게시되지 않는다.
표 6.3: 상이한 젤라틴에 대한 57.5℃에서 pH 4.5와 5.5에서의 LPS 제거
실시예 7
계면활성제의 혼탁점보다 더 높은 온도 및 더 낮은 온도에서의 LPS 제거
목적은 사용되는 계면활성제의 혼탁점보다 더 높은 온도 조건과 비교하여, 상기 혼탁점보다 더 낮은 온도 조건에서 젤라틴 용액으로부터 LPS 제거를 측정하는 것이었다. 조건을 유사하게 유지하기 위하여, 계면활성제로서 Triton X-100 (68℃의 혼탁점)뿐만 아니라 Triton X-114 (Sigma-Aldrich, 23℃의 혼탁점)을 사용하면서 57.5℃의 온도 조건을 사용하였다.
젤라틴 7을 사용하여 선행 실시예에 기재된 바와 같이 젤라틴 용액을 제조하였다. 적용되는 pH는 4.7이었다. Triton X-100, Triton X-114 또는 이들의 혼합물을 계면활성제로서 0.18 w/w%의 농도로 사용하였다. 계면활성제를 수성 젤라틴 매질에 첨가한 후, 온도를 57.5℃로 조정한 다음, 15-30분간 혼합하였다. 활성탄을 적어도 5 그램 (0.7 w/w%)의 양으로 첨가하고 추가로 15-30분간 혼합하였다. 선행 실험에 기재된 바와 같이, 여과 후, 상기 기재된 바와 같이 LPS 분석 전에 젤라틴을 동결-건조시켰다.
결과가 표 7에 제시되어 있다. Triton X-100을 이의 혼탁점보다 높은 온도에서, 즉, 75℃에서 사용할 때, 57.5℃, 즉, 상기 혼탁점보다 낮은 온도에서 본 방법을 수행하였을 때 단지 15 EU/g인 것과 비교하여, 여전히 27 EU/g LPS를 함유하는 젤라틴 용액이 수득된다. 이는 본 방법을 계면활성제의 혼탁점보다 낮은 온도에서 수행할 때 LPS 제거가 더욱 효율적임을 의미한다. 또한, 75℃에서는, 젤라틴의 현격한 가수분해가 일어나, 점도와 기능성의 바람직하지 못한 상실이 일어난다. (예를 들면, 실시예 6 참조). 75℃에서, 점도가 5.8 mPas에서 약 4.9 mPas로 감소하는 한편, 57.5℃에서는, 점도가 5.8 mPas를 유지하였다. 57.5℃에서 Triton X-114를 사용하면 114 내지 150 EU/g LPS를 여전히 갖는 젤라틴 용액이 생성되는데, 이는 75℃에서의 Triton X-100과 비교하여, 즉, 두 계면활성제 각각의 혼탁점보다 더 높은 조건에서, Triton X-100이 더 양호하게 LPS를 제거하였음을 나타낸다. 동일한 온도 (57.5℃, 즉, Triton X-100의 혼탁점보다 낮지만 Triton X-114의 혼탁점보다는 높은 온도)에서는 LPS 제거에서의 차이가 더욱더 두드러진다.
혼합 실험으로부터, Triton X-114와 비교하여 Triton X-100의 상대적인 양이 많으면 많을수록 LPS 제거가 더욱더 양호함이 명백하다.
표 7: 계면활성제로서 Triton X114 및 Triton X100
*총 0.18 w/w% 계면활성제 용액을 수득하기 위한 Triton X100과 Triton X114의 혼합비.
**Triton X100 혼탁점 (즉, 57.5℃)보다 75℃는 높고 <60℃ 는 낮다.
실시예 8
LPS 제거에 대한 젤라틴 농도의 효과
실시예 1에 기재된 바와 같은 테스트를 젤라틴 7을 사용하여 수행하였는데 여기서는 젤라틴 농도를 6.66 w/w%에서 10 w/w% 및 15 w/w%로 변화시켰다. (표 8 참조). Triton X100 농도를 젤라틴 농도에 대해 대등한 비율로 증가시켰다. 6.67% 젤라틴 농도일 경우 1.4 g(0.18 w/w%) Triton X100을 적용시켰다. 10 w/w% 젤라틴 용액의 경우, 2.1 g (0.27 w/w%)를, 15 w/w% 젤라틴 용액의 경우, 3.2 g(0.40 w/w%) Triton X100을 사용하였다. Triton X100과 함께, 첨가되는 활성탄 양을 또한 6.66% 젤라틴 용액의 경우 5 그램 (0.7 w/w%)에서 10 및 15% (w/w) 젤라틴 용액의 경우, 각각 7.5 그램 (1.05 w/w%) 및 11.3 그램 (1.6 w/w%)로 증가시켰다. 여러 가지 정제 단계 중 혼합은 500-1000 rpm으로 15-30분간 수행하였다. 2㎛ 필터 (Whatman® Glass microfiber filters GF/C 등급, 55mm 직경, 2㎛ (Schleicher & Schuell)상에서 여과법을 이용하여, Buchner 깔때기를 사용하여 젤라틴을 여과하였다. 젤라틴은 전술한 바와 같이 LPS 분석 전에 동결-건조시켰다.
더 높은 젤라틴 농도에서는 활성탄을 제거하기 위한 여과 단계에 더 많은 노력이 필요할 수 있다. LPS/LAL 분석에 영향을 줄 수 있는 남아 있을 수 있는 미량의 Triton X100을 확인하기 위하여, 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 표면장력을 측정하였다. 표면장력 결과는 Triton X100을 함유하지 않는 원래의 젤라틴과 대등/가까웠다.
표 8: LPS 제거에 대한 젤라틴 농도의 효과, 젤라틴 7, pH 4.7 및 57.5℃
LPS 정제는 젤라틴 농도에 거의 영향을 받지 않는다. 또한, 높은 농도, 15 w/w% 젤라틴 용액에서도 효과적인 정제가 측정되었다.
실시예 9:
상이한 Triton의 비교
젤라틴 배치 5를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 6.66 w/w% 젤라틴 용액을 제조하였다. 0.18 w/w%의 상이한 Triton 종류를 상기 젤라틴 용액에 첨가한 다음 55℃에서 30분간 혼합하였다. 이어서, 5.0 g (0.7 w/w%)의 활성탄 (Norit SX-Plus)을 첨가하고, 55℃에서 30분간 500-1000 rpm으로 혼합하고 실시예 1에 기재된 바와 같이, 0.45㎛ 필터(Phenex RC 26mm, 0.45㎛)를 사용하여 제거하였다. 정제 후 젤라틴을 -20℃에 보관하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결-건조시켰다. 정제 및 비-정제된 액체 젤라틴 샘플을 -20℃에 보관하고 LPS 분석 전에 동결-건조시켰다.
화학식 C8H15-C6H4-O-(C2H4O)nH (여기서 n은 8 내지 13임)을 갖는 Triton 종류의 경우, 20 EU 이하의 낮은 LPS 함량이 성취될 수 있음이 관측되었다. 정제된 젤라틴은 정제 전 초기 젤라틴에 필적하는 분자량과 점도를 가지고 있었다.
표 9: 상이한 Triton을 사용한 55℃에서의 LPS 감소
도 3은 Triton X100, Triton X102, Triton X114 및 Triton X165를 젤라틴 정제에 사용하는 그래프를 보여준다. 상기 그래프는 n 값이 8과 13 사이, 구체적으로 8.5와 12.5 사이에 있을 때 약 20 EU/g 이하의 더욱 양호한 정제가 수득됨을 보여준다. Triton X-114 (7.5의 n)와 Triton X165 (16의 n) 둘 모두 사용시 젤라틴-함유 LPS 중 LPS 함량의 수준을 감소시켰으나 Triton X-100 및 Triton X-102와 같이 "n" 값이 8과 13 사이에 있는 Triton을 사용하여 수득한 수준은 아니었음을 알아야 한다.
실시예 10:
타입 B 뼈 젤라틴의 정제
테스트 조건은 이전에 기재된 실시예와 대등하다.
6.66%(w/w) 젤라틴 12, 13 및 14 용액을 제조하여 온도를 57.5℃에서 유지하였다. 젤라틴 용액의 pH는 조정하지 않았다. Triton X100을 0.18 w/w%의 농도로 첨가하고 30분간 혼합하였다. 이어서, 5.0g(0.7 w/w%) 양의 활성탄을 가한 다음 추가로 15분간 혼합하였다. 최종적으로 젤라틴 용액을 전술한 바와 같이 여과하였다. 온도는 57.5℃로 유지하였다. 여과된 젤라틴 용액의 LPS 수준을 직접 측정하거나 -20℃로 먼저 동결시킨 다음 선행 실시예에 기재된 바와 같이 동결-건조시켰다.
Triton X100 정제 방법은 또한 타입 B 젤라틴을 20 EU/g 보다 낮은 수준으로 정제하는데 매우 효과적이다. 출발 젤라틴 중 LPS 수준이 더 낮은 경우 더 낮은 정제된 LPS 수준이 수득된다.
표 10: 타입 B 젤라틴의 정제
실시예 11:
상이한 pH 값에서 타입 B 뼈 젤라틴의 정제
조건은 실시예 10에서 사용되는 조건과 대등하였다. 젤라틴 12 용액을 제조하여 0.1M 염산 또는 0.1M 수산화나트륨 (이들 모두 Sigma-Aldrich로부터 입수)을 사용하여 pH를 4와 6 사이의 값으로 조정하였다. 상기 기재된 바와 같이 LPS 분석 전에 젤라틴을 동결-건조시켰다.
표 11: 타입 B 젤라틴 15, 57.5℃에서 상이한 pH 값에서의 정제
pH 효과가 관찰된다. 특히, 6.0보다 낮은 pH에서 개선된 LPS 정제가 관찰되었다.
실시예 12:
타입 A 어류 젤라틴의 정제
테스트 조건은 실시예 10 및 11에 대해 기재된 바와 같았다.
6.66%(w/w) 젤라틴 11 용액을 57.5℃에서 제조하고 Triton X100을 0.18 w/w%의 농도로 첨가하였다. 이어서, 5.0g 양의 활성탄을 가한 다음 추가로 15분간 혼합하였다. 최종적으로 상기 용액을 전술한 바와 같이 여과하였다. 온도는 57.5℃로 유지하였다. 젤라틴 용액의 pH는 조정하지 않았으며 5.7에서 유지하였다. 젤라틴은 LPS 분석 전에 전술한 바와 같이 동결-건조시켰다.
표 12: 타입 A 어류 젤라틴 정제:
Triton X100 정제는 높은 LPS를 함유하는 어류 젤라틴을 정제하는데 매우 효율적이다. 타입 A 어류 젤라틴에 대한 정제 수준은 어류 젤라틴 용액의 pH를 4.5와 5.5 사이의 값으로 감소시킴으로써 추가로 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 단계 2)-5)를 반복함으로써 추가적인 정제를 수행하여 초기 높은 LPS 수준의 결과로, <20 /<10/<5 EU/g 수준을 수득할 수 있다.
실시예 13:
상이한 활성탄 제거 방법
젤라틴 7 용액을 선행 실시예에서 언급된 바와 같이 제조하였다.
Triton X100 농도 0.18 w/w%를 적용시켰다. 상기 용액을 30분간 750 rpm으로 57.5℃에서 혼합하였다. 다음, 5 그램 (0.7 w/w%)의 활성탄을 첨가한 다음 추가로 15-30분간 57.5℃에서 혼합하였다. 배양시킨 후, 활성탄을 3가지 다른 방법으로 제거하였다:
1.
선행 실시예에 기재된 바와 같이, 0.45㎛ 필터 상에서 여과
2.
2㎛ 필터 (Whatman® Glass microfiber filters GF/C 등급, 55mm 직경, 2㎛ (Schleicher & Schuell)상에서, Buchner 깔때기를 사용하여 여과. 필터 기공이 더 큰 것이 가공에 유리하다.
3.
비-활성화된 규조토 (Clarcel CBL, Ceca Chemicals, France, 또는 Sigma-Aldrich D3877, Sigma-Aldrich, USA)상에서, Buchner 깔때기를 사용하여 여과. 0.18 w/w% Triton X100과 0.7 w/w% 활성탄을 함유하는 6.67% 젤라틴 용액 125 그램 당 7.5-10 그램의 규조토를 사용하였다. 규조토는 잘 알려져 있는 여과 보조제로, 예를 들면 젤라틴 생산 공정에 사용된다.
젤라틴을 전술한 바와 같이 LPS 분석 전에 동결-건조시켰다.
표 13에 언급된, 여과된 젤라틴 용액의 표면장력은 66-67 mN/m이며, 이는 비-처리된 젤라틴 대조 용액 (데이터는 나타나 있지 않음)과 대등하다.
모두 3가지 여과 방법을 사용하여 활성탄과 흡착된 Triton X100 및 LPS를 효율적으로 제거할 수 있다. 결과는 규조토 상에서의 여과가 0.45㎛ 및 2㎛ 필터와 비교하여 더욱 효과적임을 제시하며 규조토에 의한 추가의 LPS 정제를 제시한다.
표 13: 상이한 활성탄 제거 방법
다른 실험으로, 활성탄을 젤라틴 용액에 도입시키기 않지만, 젤라틴과 계면활성제를 모두 포함하는 수성 매질을 R55S 타입의 3M ZetaCarbon 필터 카트리지 (3M, USA)를 통하여 통과시켜, 상기 방법 2와 비교하여 개선된 LPS 제거를 달성하였다. 또한, 상기 필터에 통과시킨 후 용액의 표면장력은 66-67 mN/m로, 이는 비-처리된 젤라틴 대조 용액과 등가였으며, 이는 계면활성제가 필터에 실질적으로 모두 남아있음을 나타낸다. 실시예 4를 또한 참조한다. 표면장력이 대조 용액과 유사하지 않을 경우, 2개 또는 필요에 따라 더 많은 수의 필터 카트리지를 연속해서 사용할 수 있다. R55S 필터 대신, R30L3S 타입 (3M, USA)의 필터를 사용하였을 때, 유사한 결과가 관찰되었다.
실시예 14
Triton X100의 효과, 산화 및 조합한 Triton X100-산화
3개의 상이한 6.66% 젤라틴 1 및 젤라틴 10 용액을 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 제조하였다. 한 용액에 Triton X100을 0.18 w/w%의 농도로 첨가하였다. 두번째 용액에 H2O2를 1.5 w/w% 의 농도로 첨가하였다. 세번째 용액에 Triton X100과 H2O2를 각각 0.18 w/w% 및 1.5% w/w%의 농도로 첨가하였다. 용액의 pH는 조정하지 않았으며 젤라틴 1 및 젤라틴 10의 경우, 각각 5.5 및 5.3이었다. 혼합 및 배양을 57.5℃에서 30분간 수행하였다. 최소 5 그램 (0.7 w/w%)의 활성탄을 젤라틴 용액에 첨가한 다음 추가로 15-30분간 혼합하였다. 이어서, 실시예 1에 기재된 바와 같이 0.45㎛ 필터 (Phenex RC 26mm, 0.45㎛)를 사용하여 젤라틴 용액을 여과하였다. 상기 기재된 바와 같이 LPS 분석 전에 젤라틴을 동결-건조시켰다. 잔류하는 H2O2는 GME10에 기재된 방법을 사용하여 분석하였으며 <20 ppm이었으며, 이는 LAL 분석 방법 간에 인터페이스가 발생하지 않았음을 확인해 준다.
표 14: 젤라틴 1 및 젤라틴 10에 대한 산화제 - Triton X100 효과
Hirayama와 Sakata, supra, US8133269 및 WO2012031916으로부터, H2O2가 젤라틴 중의 LPS를 감소시키거나 불활성화시킴을 알 수 있다. 하지만, 본 발명자들은 본 발명에 이르러 Triton X100과 H2O2의 놀라운 시너지 효과를 관찰하였다.
실시예 15:
LPS 정제에 대한 젤라틴과 Triton X100 변화 및 효과
용해되어 있는 젤라틴의 농도가 상이한 젤라틴 용액을 Triton X-100의 상이한 농도에서 일정한 혼합 하에 750 rpm의 속도로 55 내지 57.5℃의 온도에서 30분간 혼합하였다. 이후, 혼합물을 2개의, 타입 R55s의 3M ZetaCarbon 필터 카트리지 상에서 여과하였다. 여액을 직접적인 LPS 분석을 위하여 수집하거나, -20℃에서 동결시키고 Christ Alpha 2-4LD Plus 동결-건조기 (MartinChrist, Germany)를 사용하여 동결 건조시켰다. 동결-건조 진공 조건: 용액의 수분 함량이 대략 4-6%로 건조될 때까지 적어도 24-48시간 동안 0.04 mbar 및 -87℃. 내독소 분석 전에 수분 보정은 하지 않았다.
표 15: LPS 정제에 대한 젤라틴과 Triton X100 변화 및 효과
Claims (43)
- 젤라틴과 지질다당류(lipopolysaccharide)를 포함하는 수성 매질로부터 지질다당류를 제거하는 방법으로, 이 방법은 다음 단계:
1) 적어도 2 w/w% 젤라틴과 지질다당류를 포함하는 수성 매질을 제공하는 단계,
2) 상기 수성 매질에 0.01 - 1.5 w/w%의 미셀(micelle)-형성 계면활성제를 첨가하는 단계,
3) 상기 단계 2)의 매질을 고체 흡착제와 접촉시키는 단계,
4) 상기 매질로부터 단계 3)의 고체 흡착제를 분리시키는 단계,
5) 젤라틴을 포함하는 수성 매질을 회수하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 1)-5) 각각은 68℃ 이하의 온도에서 수행되고, 상기 온도는 미셀-형성 계면활성제의 혼탁점(cloud point)보다 낮으며, 적어도 단계 2)와 3)은 적어도 30℃의 온도에서 수행함을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서, 젤라틴의 평균 분자량이 1500 Da 내지 250,000 Da, 바람직하게는 2000 내지 200,000 Da, 더욱 바람직하게는 5000 내지 180,000 Da, 가장 바람직하게는 20,000 Da 내지 170,000 Da인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미셀-형성 계면활성제가 비-이온성 계면활성제를 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제가 에톡실화된 계면활성제, 바람직하게는 알킬페놀 에톡실레이트인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬페놀 에톡실레이트가 화학식 CxH2x-1-C6H4-O-(C2H4O)nH (여기서 x는 4 - 12이고 n은 7.5 - 14임)으로 표시되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, x가 8이고 n이 8 - 13, 바람직하게는 8.5 - 12.5, 가장 바람직하게는 9 - 12인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제가 Triton X-100 또는 Triton X-102, 또는 이들의 혼합물인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 흡착제가 소수성 흡착제인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 소수성 흡착제가 활성탄을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 단계 1)-5)를 65℃ 이하, 바람직하게는 62℃ 이하, 가장 바람직하게는 60℃ 이하의 온도에서 수행하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 단계 2)와 3)을 적어도 35℃, 바람직하게는 적어도 40℃, 더욱 바람직하게는 적어도 45℃, 가장 바람직하게는 적어도 50℃의 온도에서 수행하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 단계 1)-5)를 적어도 30℃, 바람직하게는 적어도 35℃, 더욱 바람직하게는 적어도 40℃, 더더욱 바람직하게는 적어도 45℃, 가장 바람직하게는 적어도 50℃의 온도에서 수행하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 매질의 pH가 3.5에서 9.0 사이, 바람직하게는 4.0에서 8.0 사이, 더욱 바람직하게는 4.0에서 6.0 사이, 가장 바람직하게는 4.5에서 5.5 사이인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1)에서 수성 매질이 용해된 젤라틴을 적어도 8 w/w%, 바람직하게는 적어도 12 w/w%, 더더욱 바람직하게는 적어도 20 w/w% 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 매질이 용해된 젤라틴을 37 w/w% 까지, 바람직하게는 30 w/w% 까지 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 2)에서, 젤라틴 대 첨가되는 계면활성제의 중량비가 2000:1 이하, 더욱 바람직하게는 500:1 이하, 더더욱 바람직하게는 250:1 이하, 가장 바람직하게는 50:1 이하인 방법.
- 제16항에 있어서, 젤라틴 대 첨가되는 미셀 형성 계면활성제의 중량비가 50-5:1인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 2)에서, 계면활성제를 0.015 - 1.0 w/w%, 바람직하게는 0.02 - 0.50 w/w%의 농도로 첨가하는 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 이의 임계적인 미셀 농도보다 높게 첨가하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 2)가 계면활성제 첨가 후 적어도 1분간 매질을 배양시키는 것을 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 매질을 2분 내지 1시간, 바람직하게는 5 - 30분간 배양시키는 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 3)에서, 상기 고체 흡착제를 매질에 적어도 2.5:1, 바람직하게는 적어도 3.0:1, 더욱 바람직하게는 적어도 3.5:1, 더더욱 바람직하게는 0.1 - 3 w/w%, 가장 바람직하게는 0.5 - 1 w/w%의 계면활성제에 대한 중량비로 첨가하는 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 3) 및 4)가 고체 흡착제를 포함하는 필터 부재 1개 이상을 통하여 단계 2) 후에 수득되는 매질을 통과시키는 것을 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 단계 3), 4) 및 5)가 고체 흡착제를 포함하는 필터 부재 1개 이상을 통하여 단계 2) 후에 수득되는 매질을 통과시키는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 5)에서의 단계가 여과, 매질로부터 고체 흡착제를 분리시키는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이 방법이 원심분리 단계가 없는 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 이 방법이 한외여과(ultrafiltration) 단계가 없는 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1) - 5) 중에 수성 매질의 염 함량이 100 mM 이하, 바람직하게는 80, 70, 60 또는 50 mM 이하, 가장 바람직하게는 40, 30 또는 20 mM 이하인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1) - 5)에서 수용액에 아세톤 및/또는 알코올이 없는 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 매질을 산화제와 함께 배양시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제30항에 있어서, 산화제를 단계 1), 2) 또는 3) 중 임의의 단계 중에, 바람직하게는 단계 2) 중에 첨가하는 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 산화제가 과산화수소 및 과아세트산 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 산화제를 0.5 - 2.5 w/w%의 농도로 첨가하는 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1) 중의 수성 매질의 지질다당류 함량이 1500 EU/젤라틴 무수 중량 g 이하, 바람직하게는 1000 EU/젤라틴 무수 중량 g인 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 젤라틴으로, 4급 암모늄 염이 실질적으로 없으며, 분자량이 100,000 Da 보다, 가장 바람직하게는 120,000 Da보다 큰, 젤라틴 유도된 분자를 포함하고, 지질다당류 함량이 100 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 10 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 5 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게는 1 EU/g 미만인 젤라틴.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 젤라틴으로, 지질다당류 함량이 2 EU/g 미만, 바람직하게는 1 EU/g 미만인 젤라틴.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 젤라틴으로, 분자량이 100,000 Da 보다, 가장 바람직하게는 120,000 Da 보다 큰, 젤라틴 유도된 분자를 포함하고, 지질다당류 함량이 100 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 10 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 5 EU/g 미만, 더더욱 바람직하게는 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게는 1 EU/g 미만인, 타입 A인 젤라틴.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, 젤라틴의 평균 분자량이 1500 Da에서 250,000 Da 사이, 바람직하게는 2000에서 200,000 Da 사이, 더욱 바람직하게는 5000에서 180,000 Da 사이, 가장 바람직하게는 20,000 Da에서 170,000 Da 사이인 젤라틴.
- 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 젤라틴이 80,000 Da 보다 큰, 바람직하게는 100,000 Da 보다 큰, 가장 바람직하게는 120,000 Da 보다 큰 평균 분자량을 갖는 젤라틴.
- 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 아세톤 및/또는 4급 암모늄 염 및/또는 알코올이 없는 젤라틴.
- 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항의 젤라틴을 적어도 2 w/w% 포함하는 수성 매질로, 염 함량이 100 mM 이하, 바람직하게는 50 mM 이하, 가장 바람직하게는 20 mM 이하인 수성 매질.
- 제41항에 있어서, 아세톤 및/또는 4급 암모늄 염이 실질적으로 없는 수성 매질.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 젤라틴을 적어도 6 w/w%, 바람직하게는 적어도 10 w/w%, 더욱 바람직하게는 적어도 15 w/w%, 가장 바람직하게는 적어도 20 w/w% 포함하는 수성 매질.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL2013880A NL2013880B1 (en) | 2014-11-26 | 2014-11-26 | Gelatin purification. |
| PCT/NL2015/050832 WO2016085345A1 (en) | 2014-11-26 | 2015-11-26 | Gelatin purification |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180085677A true KR20180085677A (ko) | 2018-07-27 |
| KR102626805B1 KR102626805B1 (ko) | 2024-01-22 |
Family
ID=52463078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177017471A KR102626805B1 (ko) | 2014-11-26 | 2015-12-18 | 젤라틴 정제법 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10155805B2 (ko) |
| EP (1) | EP3223869B1 (ko) |
| JP (2) | JP6860766B2 (ko) |
| KR (1) | KR102626805B1 (ko) |
| CN (1) | CN107580608B (ko) |
| AR (1) | AR102853A1 (ko) |
| AU (1) | AU2015354868B2 (ko) |
| BR (1) | BR112017010929A2 (ko) |
| CA (1) | CA2968672C (ko) |
| DK (1) | DK3223869T3 (ko) |
| ES (1) | ES2881951T3 (ko) |
| HU (1) | HUE056139T2 (ko) |
| NL (1) | NL2013880B1 (ko) |
| PL (1) | PL3223869T3 (ko) |
| PT (1) | PT3223869T (ko) |
| WO (1) | WO2016085345A1 (ko) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11473004B2 (en) | 2016-12-02 | 2022-10-18 | University Of Wyoming | Microemulsions and uses thereof to displace oil in heterogeneous porous media |
| EP3489314A1 (en) * | 2017-11-23 | 2019-05-29 | Rousselot B.V. | Method for the preparation of gelatin hydrolysate having a low endotoxin content |
| BE1028324B1 (nl) | 2020-05-19 | 2021-12-22 | Rousselot | Ge(meth)acryleerd gelatine laag in endotoxines |
| AR126103A1 (es) | 2021-06-10 | 2023-09-13 | Rousselot Bv | Gelatina funcionalizada reticulable con baja actividad pirogénica |
| CN115739031B (zh) * | 2021-09-02 | 2024-05-28 | 中国科学院理化技术研究所 | 壳聚糖或其衍生物在脱除明胶中内毒素的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005289841A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Nippi:Kk | 無菌ゼラチンの製造方法 |
| JP2007231225A (ja) * | 2006-03-03 | 2007-09-13 | Jellice Co Ltd | エンドトキシン含有量を低減したゼラチンの製造方法および低エンドトキシンゼラチン |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4808314A (en) * | 1987-09-18 | 1989-02-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Method for reducing bacterial endotoxin contamination in solutions of macromolecules |
| NO942733L (no) * | 1993-07-26 | 1995-01-27 | Duphar Int Res | Fremgangsmåte for separering av bakterielle lipopolysakkarider fra proteininneholdende opplösninger |
| DE19549420A1 (de) | 1995-04-27 | 1997-09-18 | Braun Melsungen Ag | Verfahren zur simultanen extrakorporalen Elimination von Tumor-Nekrose Faktor alpha (TNF alpha) und bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS) aus Vollblut oder/und Blutplasma |
| EP2011874A1 (en) * | 1999-11-12 | 2009-01-07 | Fibrogen, Inc. | Recombinant gelatin in vaccines |
| JP4351461B2 (ja) * | 2003-03-31 | 2009-10-28 | 新田ゼラチン株式会社 | コラーゲンタンパク質からのエンドトキシン除去方法 |
| DE102007024256A1 (de) | 2007-05-16 | 2008-11-20 | Gelita Ag | Gefäßstent |
| AU2008281332A1 (en) | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Aquatrek Pty Ltd | Liquid diverter |
| EP2294092B1 (en) * | 2008-06-19 | 2017-02-22 | Bender Analytical Holding B.V. | Method for removing impurities from biopolymer material |
| DE102010037469A1 (de) * | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Gelita Ag | Verfahren zur Reduzierung des Endotoxingehalts in einem kollagenhaltigen Material |
-
2014
- 2014-11-26 NL NL2013880A patent/NL2013880B1/en active
-
2015
- 2015-11-26 JP JP2017528968A patent/JP6860766B2/ja active Active
- 2015-11-26 WO PCT/NL2015/050832 patent/WO2016085345A1/en active Application Filing
- 2015-11-26 AU AU2015354868A patent/AU2015354868B2/en active Active
- 2015-11-26 ES ES15830899T patent/ES2881951T3/es active Active
- 2015-11-26 PT PT158308999T patent/PT3223869T/pt unknown
- 2015-11-26 HU HUE15830899A patent/HUE056139T2/hu unknown
- 2015-11-26 BR BR112017010929A patent/BR112017010929A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-11-26 CN CN201580074669.8A patent/CN107580608B/zh active Active
- 2015-11-26 US US15/531,272 patent/US10155805B2/en active Active
- 2015-11-26 PL PL15830899T patent/PL3223869T3/pl unknown
- 2015-11-26 EP EP15830899.9A patent/EP3223869B1/en active Active
- 2015-11-26 DK DK15830899.9T patent/DK3223869T3/da active
- 2015-11-26 CA CA2968672A patent/CA2968672C/en active Active
- 2015-11-30 AR ARP150103903A patent/AR102853A1/es active IP Right Grant
- 2015-12-18 KR KR1020177017471A patent/KR102626805B1/ko active IP Right Grant
-
2020
- 2020-09-29 JP JP2020163957A patent/JP7009586B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005289841A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Nippi:Kk | 無菌ゼラチンの製造方法 |
| JP2007231225A (ja) * | 2006-03-03 | 2007-09-13 | Jellice Co Ltd | エンドトキシン含有量を低減したゼラチンの製造方法および低エンドトキシンゼラチン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL3223869T3 (pl) | 2021-11-15 |
| US10155805B2 (en) | 2018-12-18 |
| CA2968672A1 (en) | 2016-06-02 |
| HUE056139T2 (hu) | 2022-01-28 |
| DK3223869T3 (da) | 2021-08-02 |
| NL2013880B1 (en) | 2016-10-11 |
| AU2015354868A1 (en) | 2017-06-15 |
| ES2881951T3 (es) | 2021-11-30 |
| PT3223869T (pt) | 2021-07-29 |
| CA2968672C (en) | 2021-05-04 |
| EP3223869A1 (en) | 2017-10-04 |
| AR102853A1 (es) | 2017-03-29 |
| US20170342130A1 (en) | 2017-11-30 |
| BR112017010929A2 (pt) | 2018-02-14 |
| JP6860766B2 (ja) | 2021-04-21 |
| WO2016085345A1 (en) | 2016-06-02 |
| JP7009586B2 (ja) | 2022-01-25 |
| CN107580608B (zh) | 2020-12-29 |
| JP2021008480A (ja) | 2021-01-28 |
| CN107580608A (zh) | 2018-01-12 |
| JP2018502066A (ja) | 2018-01-25 |
| EP3223869B1 (en) | 2021-06-09 |
| AU2015354868B2 (en) | 2020-03-12 |
| KR102626805B1 (ko) | 2024-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7009586B2 (ja) | ゼラチン精製 | |
| US20080268127A1 (en) | Gelation of Anionic Polysaccarides Using Protein Hydrolysates | |
| RU2769739C2 (ru) | Волокнистая структура на основе картофельного белка и содержащий ее пищевой продукт | |
| WO2011155352A1 (ja) | 高粘弾性かつ高強度寒天及びその製造法 | |
| Omar et al. | Upgrading the preparation of high-quality chitosan from Procambarus clarkii wastes over the traditional isolation of shrimp chitosan | |
| KR100679365B1 (ko) | 알긴산의 제조방법 | |
| US20240034909A1 (en) | Method for the preparation of gelatin hydrolysate having a low endotoxin content | |
| Li et al. | Complexation of pea albumins with anionic polysaccharides and purification of PA1a | |
| US20070265434A1 (en) | Simplified method to retrieve chitosan from acidic solutions thereof | |
| RU2765951C1 (ru) | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов | |
| WO2018066595A1 (ja) | コラーゲン組成物 | |
| CN116253809A (zh) | 一种去除壳聚糖中内毒素的方法 | |
| EP4085072A1 (en) | Protein separation | |
| Marques | Antimicrobial assessment of phages entrapped in bio-based structures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |