CN107580608B - 明胶纯化 - Google Patents
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Abstract
一种从包含明胶和脂多糖的水性介质中去除脂多糖的改进方法,所述改进方法包括以下步骤:提供包含明胶和脂多糖的水性介质,向所述水性介质添加胶束形成表面活性剂,使所述介质与固体吸附剂接触,将所述固体吸附剂与所述介质分离,以及回收包含所述明胶的水性介质,其中所述方法在低于所述表面活性剂的浊点的条件下进行。
Description
技术领域
本发明涉及从包含明胶和脂多糖的水性介质中去除脂多糖的方法,还涉及具有低脂多糖含量的明胶。
背景技术
明胶是来自胶原的水溶性蛋白质的混合物。明胶可通过例如在酸性或碱性条件下通过对从皮肤、肌腱、韧带、骨骼等的水性提取物获得的胶原进行部分水解获得,或者通过酶促水解来获得。通过酸处理获得的明胶称作A型明胶,而B型明胶来自基于碱的方法。
明胶并非由均一的蛋白质分子构成,而包括不同量的长度不同的、平均分子量达到200-250kDa的蛋白质分子。因此,明胶的分子量分布是产生或确定通常关键且重要的明胶特性如粘度和起霜值(bloom value)或凝胶强度的重要参数。
明胶在室温下形成热可逆性凝胶,并且溶于热水。明胶常用于各种行业,例如食品、药品和化妆品等行业,其中作为例如果胶品(fruit gums)和明胶甜品中的胶凝剂或组织形成剂,明胶还可用于医学领域,例如用于血浆替代物和明胶类植入体。
分子量因不同的提取温度和条件,或其他原因而变化。起霜值和粘度也将随之变化。温度在凝胶制备中,例如在将凝胶用于食品、药品、技术和医学领域之前的纯化条件中是重要参数,通常需要对其小心控制。当使用明胶时,在胶凝性和粘度为重要因素的应用中,60℃被认为是最高处理温度,尽管在容许胶凝特性(gelling characteristic)和/或粘度有些损失的情况下,在62℃或65℃以下的温度下持续例如5或10分钟至30或45分钟的有限时长也是可以接受的。在高于65℃的温度,特别是高于70℃的温度下,发生明胶不期望的水解,即蛋白质分子分解为较小的肽,致使凝胶强度降低,甚至胶凝能力损失。因此,所谓的“水解明胶”是一种源自将明胶水解为平均分子量70kDa以下,通常为20kDa以下,通常在100Da与15000Da之间的肽分子的肽制剂。水解明胶因其相对较小的分子而不具有成凝胶性(jellifying property)。水解明胶例如可在面霜中用作肌理调节剂和润湿剂,还因其高甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸含量而用在营养品中且与保健作用相关,但还可用于生物医学领域。明胶也称作“水解胶原”,这是因为胶原先水解为明胶,再水解为非胶凝水解物。
明胶的分子量分布通常用分子排阻HPLC(高效液相色谱)技术测量,并通过UV吸收检测洗脱组分,以及用适当的软件评价测量数据,这些技术都属于本领域公知,参见例如Olijve等在Journal of Colloid and Interface Science(2001)243的第476-482页的报道。对于平均分子量小于70kDa例如小于20kDa的水解明胶,可使用相同方法,但优选使用分离柱,例如TSKgel2000SWXL分离柱(Tosoh BioScience,日本),来获得高分辨率(Zhang等,Food Hydrocolloids 23(2009)的第2001-2007页)。
明胶的粘度(动态粘度)通常通过测量6.67w/w%的明胶溶液在60℃下通过标准液流管(flow pipet)的流动时间来测量,参见GME的Monograph Standardized Methods forthe testing of Edible Gelatin,第10版,2014(GME,布鲁塞尔,比利时),本文称为“GME10”,第2.4.2章,第81-86页。
6.67w/w%明胶的凝胶强度可通过标准化装置(参见GME10),例如QTS25TextureAnalyzer(Brookfield Viscometers)或Texture Analyzer TA-XT2(Stable MicroSystems Ltd.伦敦,英国)测定,并用起霜数(本文也称作“起霜值”,参见GME10)来表示。
在明胶制备方法中,原料经常被细菌污染,因此常见的明胶制品可包含脂多糖(LPS)。
脂多糖存在于革兰氏阴性菌的外膜中,是潜在的毒素。LPS也称作“内毒素”,这是因为脂多糖不是由细菌分泌的,而是膜结构的一部分。因此,脂多糖主要是在细菌细胞凋亡和溶解后释放的。
LPS由可变多糖链和脂质部分脂质A组成。LPS分子的大小约为10kDa,但在水性介质中可形成还称作“胶束”的、分子量达到1000kDa的大聚集体。
LPS对大多数哺乳动物有毒,动物宿主经常会遭受广泛的非特异性病理生理反应,例如发烧、心跳过速、器官功能性障碍,甚至死亡。
尽管在许多明胶应用中可以接受一定量的LPS,但例如用于医学用途(例如,类似明胶类血浆替代物、设备和植入体)等的特定用途中时,该内毒素水平应优选低于20EU/g,更优选10EU/g以下。例如,美国食品药品监督管理局(FDA)的政府规章允许的与心血管系统和/或淋巴系统接触的产品中的最高含量为0.5EU/ml或20EU/设备。对于与脑脊液接触的设备,其上限甚至为0.06EU/ml或2.15EU/设备(约2EU/g明胶)。对于直接或间接与眼内环境接触的设备,可适用更低的上限。
鲎试验(LAL)是本领域熟知的测量亚皮克量LPS的生物检测法。鲎变形细胞溶解物(LAL)是来自鲎Limulus polyphemus的血细胞(变形细胞)的水性提取物。LAL能与作为革兰氏阴性菌的膜组分的细菌内毒素或LPS反应。该反应是鲎试验的基础,用于对细菌内毒素进行检测和定量。美国FDA的美国药典(USP)第85章中认可和推荐的用来对LPS水平进行定量的方法是显色Endosafe法,例如美国的Charles River的方法。其他认可并推荐的方法有来自Hyglos GmbH(德国)的EndoZyme重组体因子C法(EndoZyme recombinant factor Cmethod)。这两种方法可得到相似或相同的测量值,因此可替换使用。
在本领域中使用洗涤剂例如Triton来降低蛋白质溶液中LPS含量的方法例如可参见Hirayama和Sakata在Journal of Chromatography B,781(2002)的第419-432页中的描述。据该文章描述,这些洗涤剂使内毒素单体从胶束释放出来,并将被吸附剂吸附。然而,Hirayama和Sakata提醒到,在从含蛋白质的溶液中去除内毒素时,不要使用非选择性吸附剂如活性炭和阴离子交换剂,因为不但内毒素而且蛋白质也易于结合到这些非选择性吸附剂上。
WO2009/154440描述了一种降低含LPS的生物聚合物材料如海藻酸盐或明胶水性溶液中LPS含量的方法。WO2009/154440的方法依赖于在该溶液中使用了表面活性剂和固体吸附剂,依赖于将溶液的温度升至高于所用表面活性剂的浊点,使得表面活性剂的溶解性降低且聚集,从而进入三相提取过程,在该过程中,通过离心将表面活性剂聚集体和结合到吸附剂上的LPS从含有纯化的生物聚合物的水性溶液中去除。为此,关键的一点是,将含有生物聚合物、表面活性剂、吸附剂和LPS的溶液的温度升至高于表面活性剂的浊点,以致表面活性剂聚集,从而通过离心将聚集体与吸附到吸附剂上的LPS一起去除。
因此,WO2009/154440描述了先在低于表面活性剂的浊点的温度下制备含TritonX-114(浊点为23℃)和固体吸附剂的海藻酸盐水性溶液,然后将溶液加热到70℃,即高于所述浊点,从而形成表面活性剂的聚集体。通过离心使聚集体和吸附剂沉淀,从而得到LPS含量降低的海藻酸盐水相。此外,还描述了先在低于表面活性剂的浊点的温度下制备含TritonX-100(浊点为68-69℃)和作为吸附剂的活性炭的明胶溶液,然后将溶液加热到90℃引起相分离,即形成表面活性剂的聚集体。通过离心使表面活性剂聚集体和结合有LPS的活性炭沉淀。然而,在高于TritonX-100的浊点(即70℃以上)即90℃下加热,会使明胶显著水解,从而造成功能性如粘度和凝胶强度的固有损失。在如此高的温度,明胶还会因发生在其中的Maillard反应而出现不期望的变色。WO2009/154440教导了明胶通过加热步骤被破坏,产生明胶水解物,即不能胶凝。此外,离心步骤使该方法难以用于工业生产。
JP2005/289841描述了一种生产内毒素含量降低了的B型明胶的方法。该方法包括用氢氧化钙和季铵盐的溶液在pH12下处理动物组织至少5天。在该碱性条件下,明胶发生脱氨基作用,使得等电点降低到5-6,即仅获得B型明胶。然后,将明胶溶液用酸中和到pH约为4.5-5,再通过在至少65℃的温度下提取而得到明胶。因此获得的明胶可通过内毒素含量低于5EU/g的0.2微米的膜过滤而进一步除菌。然而,由于过滤步骤使用的膜的孔径,该方法不适合分子量高于200KDa的大分子明胶。
JP2004/300077描述了从胶原蛋白去除内毒素的方法,其包括将所述蛋白质在pH10-12下经碱性醇和/或酮处理,从而使包含在胶原蛋白中的内毒素分解。所得的LPS含量低于1000EU/g的蛋白质经沉淀回收。在该高pH值下,蛋白质的等电点因为脱氨基作用而降至约5-6。
EP1829946描述了一种通过将平均分子量为100,000Da以下的明胶溶液经超滤处理而降低明胶的内毒素含量的方法。尽管该文献描述了可能使用截留分子量300,000的膜,然而由于溶液的粘度问题,该尺寸的明胶不能用这种方法有效处理。由于只能将这种明胶的很稀的溶液用超滤处理,所以这种方法低效且昂贵。通过超滤表明,仅分子量100,000Da以下的明胶适于超滤并用于描述超滤。
WO2012/031916描述了一种将不溶性胶原的内毒素含量降至低于10EU/g的方法,其包括不溶解胶原而使用碱溶液、酸和氧化剂处理胶原。
发明内容
本发明的发明人惊讶地发现,无需超滤和离心步骤,在不使明胶水解的条件下,使用胶束形成表面活性剂例如TritonX-100,无需为能够有效去除表面活性剂而形成不溶性表面活性剂聚集体,即可将水性明胶制剂中的LPS有效去除。本发明人已经发现,通过在低于所述表面活性剂浊点的条件下,使用胶束形成表面活性剂可实现从明胶溶液去除LPS,与上述浊点提取技术比较,可更提高LPS的降低。不意于受任何解释的限制,发明人认为,固体吸附剂例如活性炭对表面活性剂和LPS的吸附,令人惊异地不取决于表面活性剂的不溶性聚集体的形成,因此在表面活性剂与LPS在介质中相互作用的步骤之后,使表面活性剂的温度升高到高于其浊点,从而可在更温和的条件下去除LPS。因此,可提供一种适于在非水解条件下从明胶去除LPS的方法,能使明胶与LPS去除之前的明胶相比,其特性如粘度基本保持不变。
为此,本发明提供一种从含有明胶和脂多糖的水性介质去除脂多糖的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提供包含至少2w/w%明胶和脂多糖的水性介质,
2)向所述水性介质添加0.01-1.5w/w%的胶束形成表面活性剂,
3)使步骤2)的介质与固体吸附剂接触,
4)将步骤3)的固体吸附剂与介质分离,
5)回收包含所述明胶的水性介质,其中步骤1)至5)的各步骤都在68℃以下的温度下进行,所述温度低于所述胶束形成表面活性剂的浊点,至少步骤2)和3)在至少30℃的温度下进行。
术语“水性介质”意于包括水、水混溶性溶剂与水形成的其中主要是水的混合物、以及任何以水或上述混合物作为溶剂的溶液。然而,该介质优选不含水混溶性溶剂。所述水性介质可含有任何类型的明胶,例如源自牛、猪、禽或鱼等的A型或B型明胶。对于要去除LPS的明胶的起霜值、分子量和粘度值没有限制。特别要说明的是,为了避免明胶水解,在室温或更高的温度,但优选不高于68℃,优选不高于65℃,更优选不高于60℃的温度下,通过使明胶与溶剂例如水混合约30-60分钟而使明胶膨胀,从而使明胶溶解在水性介质中,得到介质中的明胶溶液。低于60-68℃可避免明胶热水解以及可能的不期望的化学反应,从而使明胶的特性和功能性,例如起霜值、平均分子质量和粘度与步骤1)提供的明胶相比保持不变。本文中,当明胶的分子量由于本发明的方法降低最多为15%,优选最多10%,更优选最多5%时,定义为其功能性保持不变。
这些不同的步骤可在不同温度下进行,但各步骤在最高68℃的温度下进行。
需要注意的是,为了使明胶溶解,可将介质加热到高于68℃,该步骤在本发明方法之前进行。但是,优选以水性溶液的形式提供明胶,且所述水性溶液的溶剂,尤其是水未被加热到高于68℃,且未被加热到高于本文描述的温度,从而不造成明胶的功能性损失。
向所述介质添加胶束形成表面活性剂,从而使LPS单体化,并且认为这些单体能与表面活性剂相互作用,形成表面活性剂与LPS的胶束复合物。
胶束形成表面活性剂是本领域已知的,对其描述可见于W02009/15440,其含量也被引入本申请中。胶束形成表面活性剂能够在溶液中形成胶束(可溶性聚集体)。为此,将所谓的临界胶束浓度(CMC)定义为表面活性剂的某一特定浓度,高于此浓度时,胶束形成并且添加到该体系的所有额外表面活性剂都进入到胶束中。在CMC时,存在界面的表面活性剂与胶束态表面活性剂的平衡。所述CMC依赖于温度。对于非离子型表面活性剂,CMC值随温度降低而增加(M.J.Schick,J.Phys.Chem.,1963,67(9),1796-1799)。此外,温度升高导致表面活性剂的溶解性降低,表面活性剂几乎完全以不溶性聚集体存在,使溶液变得不透明或浑浊。该现象发生的温度就是所谓的浊点。盐浓度增加导致浊点降低。例如,通过添加9-23%的(NH4)2SO4或16%-25%(即2.74-4.27M)的NaCl,使1w/w%的TritonX-100溶液的浊点从68℃降至室温(Arnold和Linke,BioTechniques,43(2007),427-440)。此外,还可用醇来降低浊点(Gu和Galera-Gómez,Colloids and Surfaces A:Physicochemical and EngineeringAspects 147(1999),365-370)。
因此,本文术语“浊点”表示表面活性剂在介质中形成不溶性聚集体时的温度。所述温度依赖于介质的条件,例如盐浓度。当未给出具体条件时,本文将浊点定义为1w/w%水性溶液形成不溶性聚集体的温度。因此,如果将温度描述为低于表面活性剂的浊点时,则所述温度为68-69℃(即对于1w/w%的TritonX-100溶液),但对于含16-25w/w%的NaCl溶液,则所述浊点为室温。根据本发明,对于本方法重要的是其方法步骤的温度低于浊点,即该温度为使表面活性剂不会造成溶液浑浊或不透明的温度。
可通过以下方法在给定条件下方便地测量浊点:测定未添加表面活性剂时溶液在620nm的吸光率,然后观察添加预设量的表面活性剂后吸光率是否增加。在高于浊点时,吸光率增加。可根据GME2014的第2.4.5章(第96-99页)给出的方案来测定吸光率。
本发明人惊讶地发现,没必要将温度升至高于浊点。更令人惊讶的是,当步骤1)至5)在低于胶束形成表面活性剂的浊点的温度下进行时更高效。
对于本发明,如上所解释的,表面活性剂形成胶束(即,可溶性聚集体)已足够,无需在更高温度下形成不溶性聚集体。
为了高效去除LPS,胶束形成表面活性剂优选以等于或高于CMC的浓度存在,以形成能结合到吸附剂的可溶性聚集体。对于TritonX-100,CMC为0.015w/w%。
尽管LPS和表面活性剂的混合聚集体存在于溶液中,即无需形成不溶性聚集体,介质也还要与能结合表面活性剂的可溶性聚集体和LPS及其单体的固体吸附剂接触。这可通过以下方法实现:将颗粒吸附剂加到介质中,例如使介质通过含有所述吸附剂的过滤元件,或将介质与外表面具有该吸附剂的载体一同温育。本领域技术人员知晓使水性介质与固体吸附剂接触,并将吸附剂与介质分离的适当方法。在吸附剂以颗粒添加到介质中的情况下,所述分离方法可包括例如离心或过滤,此时对于工业生产,优选过滤。在优选的具体实施方式中,吸附剂可存在于过滤器中,使介质通过所述过滤器或通过一系列这种过滤器,为了优化滤液的产量,可任选地洗涤过滤器。这样,上述步骤3)、4)和5)可组合为单一的过滤步骤。另外,也可将包覆有吸附剂的较大的块体,例如棒或珠,浸渍在所述介质中,使得LPS-表面活性剂的复合体结合到吸附剂上,可以其后将吸附剂从介质除去。也可将吸附剂堆积在柱中,使明胶溶液通过柱,从而去除表面活性剂和LPS。
至少步骤2)和3),即添加表面活性剂的步骤和与吸附剂接触的步骤,但优选所有步骤1)至5)在至少30℃的温度下进行,即在高于明胶的熔融温度下进行。有利的是,水性介质为自由流动液体,即具有可测量的动态粘度值(即具有G”主导行为)。尽管不同明胶的粘度和胶凝温度不同,但明胶溶液在至少30℃的温度下是自由流动的,是可处理的。自由流动液体的优势表现在与吸附剂接触时,可使介质与吸附剂达到最优接触,且能确保吸附剂与介质的适当分离。
将水性介质回收,如需要,可利用例如上述LAL试验测定LPS的量。
明胶的平均分子量优选在1500Da至250kDa的范围内,甚至更高,例如300kDa或275kDa,可将该范围内的任意值作为定义更小范围的上限或下限,例如下限2000Da、4000Da、5000Da、15kDa或20kDa,上限例如200kDa、180kDa或170kDa。当预设明胶为例如中或高起霜值的明胶时,平均分子量高于120kDa。当预设明胶为明胶水解物时,平均分子量可低于70或80kDa。
虽然胶束形成表面活性剂可为离子型表面活性剂,如阳离子或阴离子表面活性剂,但是优选表面活性剂为非离子型表面活性剂,因为该表面活性剂与离子型表面活性剂相比易于在较低浓度形成胶束。此外,离子型表面活性剂可与明胶通过离子键相互作用,从而难以去除。优选地,胶束形成非离子型表面活性剂为乙氧基化表面活性剂(ethoxylatedsurfactant),更优选烷基酚乙氧基化物,该烷基酚乙氧基化物优选是由分子式CxH2x+1-C6H4-O-(C2H4O)nH所表示的,其中x为4-12,n为7.5-14,x优选8,n优选8-13,更优选8.5-12.5,最优选9-12,特别是TritonX-100、TritonX-102、或其混合物。发明人发现,用TritonX-100和TritonX-102可得到优良结果。虽然n值较高将导致表面活性剂的溶解性更高,浊点更高,但这种更长的表面活性剂似乎不利于LPS去除。然而,其他合适的非离子型表面活性剂包括壬基苯氧基聚乙氧基乙醇类C15H24O(C2H4O)n,其中n为3-40,例如壬苯醇醚-4、壬苯醇醚-15和壬苯醇醚-30,或C12-C18脂肪酸的聚乙二醇脱水山梨糖醇单酯,例如TWEEN。CHAPSO(3-([3-胆酰胺丙基]二甲基铵基)-2-羟基-1-丙磺酸盐)是另一种合适的非离子型表面活性剂。
固体吸附剂可为能够结合表面活性剂优选也能结合LPS的任何合适的吸附剂,本领域技术人员所知的,例如疏水性吸附剂。吸附剂优选为不溶的,合适的吸附剂包括:粘土如(活化的)硅藻土或粘土、层状硅酸盐如层状硅酸铝、蒙脱石和疏水性吸附剂如活性炭,例如Norit SX Plus或Norit ROX 0.8(Cabot,荷兰),或3M ZetaCarbon滤芯(filtercartridges),例如其R55S或R30L3S型(3M,美国)。还可使用一种或多种吸附剂的混合物。可将固体吸附剂例如添加到包含明胶的水性介质中,在使表面活性剂结合到,优选LPS也结合到吸附剂后,可通过过滤、沉降或离心等去除固体吸附剂。接触步骤进行足够长的时间,以使表面活性剂适当吸附,从而能去除表面活性剂和结合到表面活性剂的LPS,和任选的结合到吸附剂的LPS。优选地,吸附剂与水性介质接触5分钟至1小时,更优选10-30分钟。可以接触更长时间,但是出于效率和明胶可能水解,特别是在使用高于60℃或65℃的温度时水解的考虑,不期望更长的接触时间。也可以接触少于5分钟的时间,但为了达到希望的表面活性剂去除效果,与长时间温育相比,可能需要使用更多的吸附剂。在优选的具体实施方式中,可通过使步骤5)回收的介质以与步骤2)进行的类似方式再次与固体吸附剂接触来重复吸附步骤至少一次。
优选地,步骤1)至5)的各步骤在65℃以下的温度,更优选在62℃以下的温度,甚至更优选在60℃以下的温度下进行。如上所述,没有必要为了获得表面活性剂的有效吸附和从水性介质去除LPS而升高温度到高于68℃。本发明人惊讶地发现,可甚至在低于65℃、62℃、60℃、58℃或55℃的温度下高效去除表面活性剂。还可在不同的温度下进行不同的步骤,但应在30℃-68℃的范围且在高于所用表面活性剂的浊点下进行。出于保持明胶功能性的考虑,优选的温度在55℃和65℃之间,例如57℃-60℃或58℃。
至少步骤2)和3),优选所有步骤1)至5)在至少35℃的温度,更优选在至少40℃的温度,甚至更优选在至少45℃的温度、至少50℃的温度,最优选在至少55℃的温度下进行。明胶溶液在较高的温度下表现为更加液态,即粘度更低,这使溶液更易处理,且更易与吸附剂接触。
介质的pH优选在3.5和9.0之间,更优选在3.5和8.0之间,4.0和8.0之间,4.0和6.0之间,甚至更优选在4.5和5.5之间。当pH低于3.5-4时,明胶变得易于水解,尤其是在高于明胶熔点的温度时。因此,介质的pH优选高于上述pH值。
本领域技术人员知晓,可在低pH下温育或保存明胶而不会造成其功能性显著损失,但是这依赖于温度和温育时间。为了不造成功能性损失,pH越低,温度也应当越低,和/或温育时间应越短。然而,本领域技术人员能够确定关于pH、时间和温度的适当条件,从而避免明胶水解。本发明人惊讶地发现,当在低pH下使用本发明的方法时,能更高效地去除LPS。当然,在低pH下使用本发明的方法时必须注意避免明胶水解,即应当在不超过例如58℃、60℃或65℃的温和温度下使用本发明的方法。因此,在所有的方法步骤中,含有明胶的水性介质的pH优选在4.0和6.0之间,更优选在4.5和5.5之间。在该pH下,温度优选为约57-58℃。在使用该方法的过程中,介质在该低pH下的总时间优选2小时以下,更优选1小时以下,甚至更优选半小时以下。
步骤1)中的水性介质可包含任何浓度的明胶。在优选的具体实施方式中,步骤1)中的水性介质包含至少2w/w%,优选至少8w/w%,更优选至少12w/w%的溶解的明胶,甚至更优选至少20w/w%的明胶。所述水性介质可包含30w/w%以下,甚至如37w/w%以下溶解的明胶,取决于明胶分子的大小。低明胶浓度的水性介质比高明胶浓度的水性介质的胶凝温度低,从而使该方法能在较低温度下进行,这对要在低pH下进行温育是有利的。当浓度在高于30-37w/w%时,水性介质对于适当的处理来说过于粘稠,尤其是对于与吸附剂接触和去除吸附剂。只有在使用相对较小尺寸的明胶如明胶水解物时,才能将浓度提高到约40w/w%。升高温度来降低这种高浓度明胶溶液的粘度会导致不期望的明胶水解,以及分子量、粘度和起霜值损失。
在步骤2),明胶与所添加的非离子型表面活性剂的重量比优选为2000∶1以下,更优选500∶1以下,甚至更优选250∶1以下,最优选50∶1以下。明胶与所添加的非离子型表面活性剂的重量比优选50-5∶1。重量比较高时,即明胶相对较多时,并非所有的LPS都被表面活性剂结合。另一方面,重量比较低时,明胶产量会受损,或者表面活性剂的量大时,吸附不是最优的。在这种情况下,为了获得最优的表面活性剂去除效果,可进行更多轮吸附。然而,由于LPS趋于与吸附剂较强地结合,特别是在吸附剂为活性炭时,因此通常选择与表面活性剂相比过量的吸附剂,以单一步骤去除尽可能多的表面活性剂。
在本发明方法的步骤2),优选添加表面活性剂到0.015-1.0w/w%的浓度,更优选0.020-0.50w/w%的浓度,从而能在它结合介质中的LPS之后将其适当去除,同时为有效的处理能力而允许使用高明胶含量。也可根据明胶中LPS的含量调节表面活性剂的适当浓度。如果明胶原料的LPS含量本已较低,可添加相对低浓度(不明显超过CMC值)的表面活性剂,这使表面活性剂更易去除。
本发明方法的步骤2)优选包括在添加表面活性剂之后温育介质至少1分钟,更优选2分钟至1小时,甚至更优选5-30分钟,最优选15-30分钟,从而能使LPS适当结合到表面活性剂。过长时间的温育,尤其是温度在高于60℃时,明胶水解和功能性(起霜、粘度)损失的风险增加。
为了能从介质最优地去除表面活性剂和LPS,步骤3)和4)优选包括使步骤2)后获得的介质通过一个或多个包含固体吸附剂的过滤元件。已经证明含有活性炭,例如R55S或R30L3S型3M ZetaCarbon滤芯(3M,美国)的过滤体系非常合适。如需要可从滤液回收明胶,例如可通过分离。这样的过滤步骤可能已能回收含有含量降低的预设形式的内毒素的明胶,也就是说无需额外的回收步骤。在这种情况下,步骤3)、4)和5)包括使步骤2)后获得的介质通过一个或多个包含固体吸附剂的过滤元件。
在另一具体实施方式中,在本发明方法的步骤3)中,优选将固体吸附剂以与与表面活性剂的重量比为至少2.5∶1,更优选至少3.0∶1,最优选至少3.5∶1添加到介质中。优选将固体吸附剂以浓度为0.1-3w/w%,更优选0.5-1w/w%添加到介质中。如果使用过滤元件或过滤体系,可在过滤体系中优选使用相似量的吸附剂。
回收步骤5)优选包括过滤操作,将固体吸附剂与介质分离。吸附材料例如以颗粒材料混入包含明胶和表面活性剂的水性介质中的实施方式是有利的。如上所述,虽然不优选,但可将吸附剂离心,或结合到载体等。如上所述,可使用包含吸附剂材料的过滤元件来使过滤步骤与步骤3)和4)结合。
根据本发明,可在低盐条件下使用,这是因为盐对实现本发明并非是必需的。尽管可以包含盐来例如降低用于本发明方法的预设的表面活性剂的浊点,但这并不是必需的。相反,本发明方法步骤的条件要在低于所用表面活性剂的浊点下进行,因而无需降低浊点。此外,对于对表面活性剂浊点起效所必需的高盐浓度在最终纯化的明胶中是不期望的,而且会影响明胶的功能性。
因此,在本发明优选的具体实施方式中,在步骤1)至5)中,水性介质的盐含量为100mM以下,优选80mM、70mM、60mM或50mM以下,最优选40mM、30mM或20mM以下。从而可以提供内毒素含量低、盐含量低的明胶,而无需包括任何脱盐步骤。为此,步骤5)回收的介质的盐含量优选100mM以下,更优选80mM、70mM、60mM或50mM以下,最优选40mM、30mM或20mM以下。
由于通过本发明的方法无需离心步骤就能得到内毒素含量低的明胶,因此本发明的方法优选不包括离心步骤。离心步骤使大规模回收内毒素含量低的明胶变得困难且昂贵。由于本发明的方法可通过例如过滤提供内毒素含量低的明胶,因而优选避免离心步骤。
用于通过本发明的方法无需费力的超滤步骤就能得到内毒素含量低的明胶,因此本发明的方法优选不包括超滤步骤。这不仅有助于降低成本,还能获得平均分子量100kDa以上如150kDa、200kDa或250kDa以上的大分子尺寸的,例如高起霜的明胶,这种明胶不能通过超滤膜。
而且,当使用超滤时产量显著降低。在另一具体实施方式中,在步骤1)至5)中,水性溶液基本不含丙酮,优选不含任何酮。与本领域已知方法相比,本发明的方法无需添加任何酮,酮事实上是不期望的污染物。在又一具体实施方式中,水性介质基本不含醇,尤其是乙醇。
在特定的具体实施方式中,本发明的方法还包括将水性介质与氧化剂一同温育。本发明人惊讶地发现,在本发明的方法中,尤其是在步骤1)、2)和3)的任一步骤中,优选在步骤2)中添加氧化剂到介质中能进一步降低LPS含量。
氧化剂优选选自过氧化氢、过乙酸和它们的混合物。最优选过氧化氢。
氧化剂优选以0.5-2.5w/w%的浓度添加。
在本发明的方法中,步骤1)的水性介质的脂多糖含量优选基于每g明胶干重为1000EU以下。LPS含量较高时,可通过例如离子交换色谱步骤,例如EP0739630描述的从全血去除内毒素的离子交换色谱步骤,或上文提到的Hirayama和Sakata的方法,对介质预处理。也可以以高LPS含量的明胶制品开始,通过重复本发明的步骤2)至5),且在重复步骤2)和3)时使用新材料来进行本发明的方法。需要时可用步骤5)的水性介质作为新步骤的介质。
如果步骤1)的初始材料的LPS含量低于1500-1000EU/g,可经一轮如上所述的5个步骤而获得基于1g明胶的脂多糖含量低于100EU,低于50EU每1g明胶,低于20EU,低于10EU,低于5EU,甚至低于1EU的纯化的明胶。根据本发明的方法能经一轮如上所述5个步骤而获得脂多糖含量与步骤1)中初始材料的脂多糖含量相比降低了至少50倍,优选至少100倍,更优选至少150倍,甚至更优选至少200倍,最优选至少250倍的纯化的明胶。EU是本领域已知的术语,反映了“内毒素单位”。一单位EU大致相当于100pg大肠杆菌内毒素,是存在于约104-105个菌中的量。本文中术语EU/g反映了每克明胶干重的EU的量。
本发明还涉及可通过本发明的方法获得的明胶,其基本不含季铵盐,包括高于分子量100,000Da,最优选高于120,000Da的明胶衍生分子,其脂多糖含量低于100EU/g,优选低于50EU/g,更优选低于20EU/g,甚至更优选低于10EU/g,甚至更优选低于5EU/g,甚至更优选低于2EU/g,最优选低于1EU/g。在本发明之前,还不可能制备内毒素含量如此低的明胶。已知的超滤法提供的明胶的分子量不大于100,000Da,因此这种明胶不含分子量高于100kDa的明胶衍生分子。这种明胶充其量不过是低起霜明胶或水解物。只有通过高浓度的季铵盐处理才有可能获得低内毒素含量的B型明胶。然而,盐的存在对明胶的功能性有影响。本发明却提供了低内毒素含量、高分子量的明胶,且无需使用季铵盐。术语“明胶衍生分子”意于包括作为原料中胶原基质的一部分的蛋白质和肽分子,它们例如如在本领域已知的那样,用来经处理制备明胶。
在另一具体实施方式中,本发明提供一种可通过本发明的方法获得的明胶,其具有低于2EU/g,优选低于1EU/g的脂多糖含量。能通过本发明的方法制备具有如此低LPS含量的明胶,例如A型和B型明胶,而现有技术中的方法仅能提供LPS含量较高的明胶。
在一个具体实施方式中,本发明涉及可通过本发明的方法获得的A型明胶,即等电点高于7,优选高于8的明胶,该明胶包括分子量高于100,000Da,最优选高于120,000Da的明胶衍生分子,该明胶的脂多糖含量低于100EU/g,更优选低于50EU/g,甚至更优选低于20EU/g,甚至更优选低于10EU/g,甚至更优选低于5EU/g,甚至更优选低于2EU/g,最优选低于1EU/g。在本领域中,内毒素含量如此低的A型明胶仅能通过超滤制备,导致小于100kDa的明胶分子。然而,本发明首次提供了一种包含较大明胶分子且内毒素含量低的A型明胶。
本发明的明胶具有优选在1500Da与250,000Da之间,更优选在2000Da与200,000Da之间,甚至更优选在5000Da与180,000Da之间,最优选在20,000Da与170,000Da之间的平均分子量。该明胶具有优选高于80,000Da,更优选高于100,000Da,最优选高于120,000Da的平均分子量。
在优选的具体实施方式中,明胶基本不含丙酮,优选不含任何酮。此外,该明胶优选基本不含醇,尤其是碱性醇,还优选基本不含季铵盐。
在另一具体实施方式中,本发明涉及一种水性介质,其含有至少2w/w%本发明的明胶,所述介质具有100mM以下,优选50mM以下,最优选20mM以下的盐含量。所述水性介质优选基本不含丙酮和/或季铵盐和/或醇,尤其是碱性醇。所述水性介质包含优选至少6w/w%,优选至少10w/w%,更优选至少15w/w%,最优选至少20w/w%的明胶。
以下将通过非限制性实施例和附图来进一步描述本发明。
附图说明
图1示出了在25℃表面活性剂浓度对水性明胶溶液表面张力的影响。实验发现,TritonX-100的CMC为0.015-0.018,等于其在水中的所述CMC。
图2示出了水性明胶溶液的表面张力和吸附剂与从溶液中去除TritonX-100表面活性剂的比率之间的函数关系。
图3示出了使用的不同种类的Triton中的聚乙二醇部分的长度对纯化的影响。X轴表示式C8H17-C6H4-O-(C2H4O)nH中n的数目,Y轴表示纯化后的含LPS的明胶中以EU/g计的LPS的含量。
具体实施方式
实施例
表1列出了用于不同实施例的明胶的概况。
确定明胶性质的分析方法见GME10。
在各实施例中,对表面活性剂的去除进行了监测,因为表面活性剂如TritonX-100会掩盖LAL分析结果。详见实施例4。
除非另有说明,使用德国IKA Werke的水浴混合器,在R015功率模式下,用4-5cm长的标准磁力搅拌棒,以750rpm的速度进行混合操作。
除非另有说明,给出的明胶重量中包括10-13w/w%的含水量。
实施例1
从不同LPS含量的水性明胶溶液去除内毒素
表1.1:明胶初始材料
*使用20w/w%的溶液,而非6.67w/w%的溶液,在25℃根据GME10测量粘度。**G:比利时根特的Rousselot bvba,A:法国安格鲁姆的Rousselot AS,P:美国皮柏第的RousselotInc.,I:法国Isle sur la Sorgue的Rousselot SASlal。
接下来,添加最少5.0g活性炭(Cabot的Norit SX-Plus,荷兰)(0.7w/w%),接着在60℃下混合30分钟(500-1000rpm)。然后,溶液经0.45μm过滤器(Phenomenex的Phenex RC26mm,0.45μm,荷兰)过滤以去除活性炭,并且冷却到40℃以对纯化的溶液直接进行LPS分析,或者在-20℃下冷冻并使用Christ Alpha 2-4LD Plus冷冻干燥机(MartinChrist,德国)进行冷冻干燥。冷冻干燥的真空条件是:0.04mbar、-87℃、至少24-48小时,直至溶液干燥至含水量在4-6%左右。内毒素分析前不进行湿度校正。
初始(未纯化)明胶溶液经Phenex的0.45μm过滤器过滤,并不影响或降低明胶中的初始LPS水平。
从表1.2的数据可见,从初始材料高效去除了LPS。为了获得内毒素含量低至2EU/g以下的明胶,优选以内毒素含量为1500EU/g以下的明胶溶液开始。
表1.2:不同批号明胶中LPS的降低
明胶 | 初始LPS水平 | 纯化的LPS水平(EU/g) | 纯化因子 |
明胶1 | 1100 | 1 | 1100 |
明胶3 | 4960 | 190 | 26 |
明胶4 | 4200 | 142 | 30 |
明胶5 | 5120 | 28 | 182 |
明胶6 | 2480 | 109 | 23 |
明胶8 | 2912 | 39 | 75 |
明胶15 | 372 | 1 | 372 |
明胶15 | 465 | 2 | 232 |
明胶16 | 11467 | 7 | 1638 |
明胶17 | 10728 | 9 | 1192 |
实施例2
表面活性剂浓度的变化
如实施例1所述,使用平均分子量和粘度相似的批号为1、2和15的明胶制备三份6.66%w/w的明胶溶液(见表1.1)。将不同量的TritonX-100(CarlRoth,产品号3051.4)添加到溶液中(见表3),接着在最高60℃的温度下混合30分钟。接下来,对于试验2、3、4和5,添加5.0g(0.7w/w%)活性炭(Norit SX-Plus)。然后在最高60℃的温度下以500-1000rpm混合30分钟,再如实施例1所述,用0.45μm过滤器(Phenex RC26mm,0.45μm)去除活性炭。在试验6中,分别将活性炭量增至20g,以确保从纯化的明胶溶液中去除所有的TritonX-100。经表面张力分析确认,TritonX-100的浓度的确已降至低于CMC。
纯化后将明胶在-20℃下储存并如实施例1所述进行冷冻干燥。冷冻干燥的明胶用于LAL法的LPS分析。
表2表明,高于CMC的TritonX-100浓度对去除内毒素有利。
表2:不同水平TritonX-100对LPS去除的影响
实施例3
硅藻土作为LPS纯化剂
制备pH5.5的600ml的6.66w/w%的明胶1和明胶9的溶液,再如实施例1所述,用TritonX-100处理。在最高60℃的温度下温育30分钟后,添加用去离子水预洗涤的70克硅藻土(Claracel CBL)而非活性炭,接着在50℃下持续混合4小时。4小时后,通过过滤(Schleicher&Schuell的Glass微纤维,GF/C级,直径55mm,2μm,德国)去除硅藻土。过滤后的明胶溶液在-20℃下储存过夜,然后进行冷冻干燥(冷冻干燥条件见实施例1)。未纯化的6.67%的明胶1和明胶9样品也在-20℃下储存、冷冻干燥。对纯化的和未纯化的明胶样品进行LPS含量分析,见表3。
用硅藻土作为吸附剂可从明胶中去除显著含量的内毒素。然而,与使用活性炭相比,LPS纯化的效果略差,参见明胶1。但还是可以将硅藻土用于预纯化步骤。
表3:用硅藻土作为吸附剂时LPS的去除
实施例4
吸附剂量的变化
通过在添加表面活性剂至包含明胶的介质之前对样品的表面张力进行测量,再与用吸附剂处理和去除吸附剂后测量的表面张力比较,来分析吸附剂对表面活性剂的去除效果。在表面活性剂例如TritonX-100存在时,表面张力降低。图1显示出,1w/w%明胶溶液的初始表面张力65-67mN/m在TritonX-100的浓度以溶液重量计为0.001w/w%时开始显著降低。TritonX-100的临界胶束浓度在0.014w/w%与0.018w/w%之间。
用Digidrop(GBX,法国)接触角/表面张力分析设备进行表面张力分析。针直径为0.81mm,滴形成速度为0.384μl/s。最大滴体积为9.900μl。用ds/de方程计算表面张力。
在使用大量表面活性剂的情况下,可能需要使用相应更大量的吸附剂,以从溶液去除所述表面活性剂。为了去除在第一轮吸附中未去除的残留表面活性剂,也可以重复吸附步骤,直至获得等于纯明胶的表面张力值65-67mN/m。
如实施例1所述,在700ml水中制备50g、60g和100g的明胶7(见表1.1)的溶液,分别得到明胶浓度6.66w/w%、8.0w/w%和12.5w/w%。添加的TritonX-100(Carl-Roth)的量分别为,对于6.67w/w%明胶溶液为1.4g(0.18w/w%),对于8w/w%明胶溶液为1.7g(0.216w/w%),对于12.5w/w%明胶溶液为2.8g(0.36w/w%)。在60℃下以500-1000rpm的速度进行混合。
改变添加的活性炭((Norit SX-Plus)的量,且随着TritonX-100浓度增加而增加,见表4。添加活性炭之后,再将混合物在60℃下以500-1000rpm的速度混合30分钟。最后,参照实施例1,使用0.45μm过滤器(Phenex RC26mm,0.45μm)对溶液进行过滤。过滤后的溶液用于测量表面张力,见表4。从表4和图2看以观察到,在活性炭与TritonX-100的重量比为2.5以上时,表面张力接近不加表面活性剂的初始明胶溶液的表面张力。在重量比为3以上,尤其是3.5以上时,表面张力等于初始明胶溶液的表面张力,这表明表面活性剂已基本完全除去。更高(高于3.5)的活性炭与TritonX-100之比带来更高效的TritonX-100降低效果。仍参见图2。
表4:活性炭/TritoX100比及其对表面张力的效果
实施例5
温度变化及其对LPS去除和功能性的影响
对明胶1进行与实施例2所述相同的试验。将pH调至5.5。在添加TritonX-100之后,将溶液在60℃下混合15分钟,然后将温度调至表5所示温度,再在500-1000rpm下进行至多30分钟的混合。使用0.18w/w%和0.026w/w%两个不同的Triton-X100浓度。
接下来,如实施例1所述,用活性炭处理并过滤溶液。除LPS分析外,还分析溶液的粘度和明胶的平均分子量,用其表示处理后明胶的功能性。
根据GME10中描述的方法进行粘度分析。根据上述Olijve等的方法测量分子量分布。
如前所述,在LPS分析前将明胶冷冻干燥。
表5:pH5.5时温度变化对明胶1的影响
可清楚地观察到,在90℃的温度下明胶水解,丧失其功能性。粘度从初始值4.4mPas降至0.8mPas,平均分子量从130kDa降至46kDa,即分子量损失为65%。此外,在80℃的温度下,分子量和粘度降低也很显著。然而,在65℃以下的温度下(低于TritonX-100的浊点),避免了显著的水解,并且功能性得以保持,而且令人吃惊的是,观察到十分高效的LPS去除,或者在更低的TritonX-100浓度下,等于或甚至略高于更高温度下的去除程度。
实施例6
pH和温度变化及其对LPS去除和功能性的影响
该实施例采用实施例5所述的方法。明胶1、2、3、7、8和10用于纯化。除温度外,还调节和改变纯化溶液的pH。添加Triton-X100(0.026w/w%和0.18w/w%)后,如表6.1所示,将温度从57.5℃调节到90℃,接着在500-1000rpm下混合30分钟。然后,添加5.0克活性炭(Norit SX-Plus),溶液在500-1000rpm下再混合15-30分钟。再如前述实施例所述,使用0.45μm过滤器过滤溶液。如前所述,在LPS分析前将明胶冷冻干燥。在表6.1中,对明胶7实施温度变化,且pH调到4.5。在较低的pH值时,温度对于明胶水解变更关键。除了内毒素(LPS)分析外,还在纯化后进行分子量和粘度值测量,以观察可能的明胶水解和明胶性质损失。使用实施例5所述的方法进行粘度和分子量分布分析的测定。
表6.1:pH4.5时温度变化对明胶7的影响
可以观察到,在高于65℃的温度,尤其在80℃和90℃下,且4.5这样低的pH值下,会导致在所用试验条件下分子量和粘度的损失,见表6.1。因此,在该方法的步骤中明胶优选在65℃以下保存至15分钟以下。更优选的是,在该方法的步骤中,如果pH为4.5以下,例如4.0时,温度不超过60℃。
为了确认表6.1的结果,在更宽的pH范围,使用明胶2、3和7在57.5℃的温度即低于明胶水解的温度(60℃)和高于明胶水解的温度下进行试验。
使用的pH范围见表6.2。在添加Triton-X100之前用0.1M的盐酸(Sigma Aldrich,258148-500ML)或0.1MNaOH(Sigma-Aldrich,221465-500G,美国)调节明胶溶液的pH。可使用其他酸如硫酸(Sigma-Aldrich)而非盐酸来降低pH。可观察到,pH调节后氯的浓度在50mM以下,这不会影响所用表面活性剂的浊点。
明胶溶液制备、Triton-X100(0.18w/w%)的添加、活性炭(5克,0.7w/w%)的添加、明胶样品的混合和过滤与前述实施例描述的方法相同。如前所述,在LPS分析前,将明胶冷冻干燥。LPS在57.5℃的纯化结果以及纯化后测量的分子量和粘度见于表6.2。
在57.5℃时pH的变化未导致胶束水相发生相分离。
表6.2:在57.5℃、TritonX-100的浓度为0.18w/w%时的pH变化
在57.5℃时pH的变化仅造成pH值高于4.5时分子量和粘度的有限损失,见表6.2。pH值在4.5与5.6之间时,发生显著的LPS纯化,而未造成分子量/粘度损失。对于明胶7尤其是这样。
在57.5℃的温度和pH为4.5和5.5的条件下,对各种明胶(1、2、3、7、8和10)进行试验,以比较在不损失分子量和粘度情况下的纯化效率,见表6.3。如前所述制备明胶溶液。如需要,用0.1M的盐酸(Sigma-Aldrich,258148-500ML)或0.1MNaOH(Sigma-Aldrich,221465-500G,美国)调节pH为4.5和5.5。可使用其他酸如硫酸(Sigma-Aldrich)而非盐酸。
所用的TritonX-100浓度为0.18w/w%,且混合最少5g活性炭。如前述实施例所述,在LPS分析前过滤明胶溶液。如前所述,在LPS分析前将明胶冷冻干燥。
与pH为5.5相比,pH为4.5时可见到改进的LPS纯化。初始LPS值越高,较低pH对改进LPS纯化的影响越大。在需要低水平LPS(<20EU/g)的情况下,优选较低的pH。对于试验的明胶,在57.5℃,pH为4.5和5.5时未观察到显著的分子量分布变化,数值未列出。
表6.3:在57.5℃,pH为4.5和5.5时不同明胶的LPS去除
实施例7
高于和低于表面活性剂的浊点下的LPS去除
本实施例的目的是,测量在低于所用表面活性剂浊点的条件下从明胶溶液去除LPS的情况,与在高于所用表面活性剂浊点的条件下相比较。为了使条件相似,使用57.5℃的温度条件,同时将TritonX-100(浊点为68℃)和TritonX-114(Sigma-Aldrich,浊点为23℃)均用作表面活性剂。
如前述实施例所述,用明胶7制备明胶溶液。所用pH为4.7,浓度为0.18w/w%的TritonX-100、TritonX-114或其混合物用作表面活性剂。在将表面活性剂添加到水性明胶介质之后,将温度调节到57.5℃,接着混合15-30分钟。添加活性炭至少5克(0.7w/w%),再另外混合15-30分钟。过滤后,如前述实验所述,在LPS分析前如前所述将明胶冷冻干燥。
结果见表7。可以看到,当在高于TritonX-100的浊点即75℃下使用时,获得的明胶溶液仍含27EU/g的LPS,而当该方法在57.5℃即在低于其浊点下进行时,LPS含量仅为15EU/g。这说明,在低于表面活性剂的浊点下进行该方法时,能更有效地去除LPS。此外,在75℃时,明胶发生显著水解,导致不期望的粘度和功能性损失,见例如实施例6。在75℃时,粘度从5.8mPas降至约4.9mPas,而在57.5℃时,粘度保持在5.8mPas。在57.5℃使用TritonX-114导致明胶溶液仍含有114至150EU/gLPS,这说明与在75℃即在高于两表面活性剂的浊点下使用TritonX-100时比较,TritonX-100带来更好的LPS去除效果。在相同的温度(57.5℃,即低于TritonX-100的浊点且高于TritonX-114的浊点)下,LPS去除效果的差异更显著。
从混合实验清楚可见,与TritonX-114相比,TritioX100的量越大,去除的LPS越多。
表7:TritonX-114和TritonX-100作为表面活性剂
*为得到0.18w/w%的表面活性剂溶液时Triton-X100与Triton-X114的混合比。
**75℃是高于TritonX-100的浊点的温度,<60℃(即57.5℃)是低于TritonX-100浊点的温度。
实施例8
明胶浓度对LPS去除的作用
用明胶7进行如实施例1所述的试验,在试验中明胶浓度从6.66w/w%变为10w/w%和15w/w%,见表8。TritonX-100的浓度随明胶浓度等比率地增加。对于6.66w/w%的明胶浓度,使用1.4g(0.18w/w%)TritonX-100。对于10w/w%的明胶浓度,使用2.1g(0.27w/w%)TritonX-100,对于15w/w%的明胶浓度,使用3.2g(0.40w/w%)TritonX-100。与TritonX-100一致,活性炭的量也从6.66w/w%明胶浓度的5g(0.7w/w%)分别增加到10w/w%明胶浓度的7.5g(1.05w/w%)和15w/w%明胶浓度的11.3g(1.6w/w%)。各个纯化步骤期间的混合在500-1000rpm下进行15-30分钟。用布氏漏斗经2μm过滤器(Schleicher&Schuell的Glass微纤维,GF/C级,直径55mm,2μm)过滤。如上所述,在LPS分析前将明胶冷冻干燥。
明胶浓度较高时,去除活性炭的过滤步骤更费力。为了确认可能影响LPS/LAL分析的残留TritonX-100,如实施例4所述测量表面张力。表面张力结果与不含TritonX-100的原始明胶的相同或接近。
表8:使用明胶7在pH4.7、57.5℃下明胶浓度对LPS去除的效果
LPS纯化效果几乎不受明胶浓度的影响。此外,在15w/w%的高明胶浓度时,可检测到有效的纯化。
实施例9
不同Triton的比较
如实施例1所述,用明胶批号5制备6.66w/w%的明胶溶液。将不同种类的0.18w/w%的Triton添加到明胶溶液中,接着在55℃混合30分钟。接下来,添加5.0g(0.7w/w%)活性炭(Norit SX-Plus),在500-1000rpm、55℃下混合30分钟,再如实施例1所述,用0.45μm过滤器(Phenex RC26mm,0.45μm)去除活性炭。如实施例1所述,纯化后将明胶在-20℃下储存且冷冻干燥。在LPS分析前将纯化和未纯化的明胶样品在-20℃下储存且冷冻干燥。
可观察到,使用分子式为C8H17-C6H4-O-(C2H4O)nH其中n为8-13的Triton时,可获得20EU以下的低LPS含量。纯化后的明胶的分子量和粘度均与纯化前的初始明胶的相当。
表9:在55℃下用不同的Triton降低LPS
Triton | LPS水平(EU/g) | n的数目 |
TritonX-165 | 350 | 16 |
TritonX-102 | 15 | 12 |
TritonX-100 | 10 | 9.5 |
TritonX-114 | 150 | 7.5 |
未处理的明胶5 | 5200 |
图3示出了在纯化明胶时使用了TritonX-100、TritonX-102、TritonX-114和TritonX-165的图。该图表明,当n在8与13之间时,特别是在8.5与12.5之间时,可获得约20EU/g以下的更好的纯化效果。还可发现,使用TritonX-114(n为7.5)和TritonX-165(n为16)时,也可降低包含LPS的明胶中LPS的含量,但是含量不能降至使用n值在8与13之间的Triton如TritonX-100和TritonX-102时的水平。
实施例10
B型骨明胶的纯化
试验条件与前述实施例相同。
制备6.66(w/w%)的明胶12、13和14溶液,并将温度保持在57.5℃。不调节明胶溶液的pH。添加TritonX-100至浓度为0.18w/w%,再混合30分钟。接下来,添加5.0g(0.7w/w%)活性炭,接着另外混合15分钟。最后,如前所述过滤明胶溶液。温度保持在57.5℃。直接测量或先在-20℃下冷冻然后如前述实施例所述冷冻干燥后测量过滤后的明胶溶液的LPS水平。
TritonX-100纯化法对于将B型明胶纯化至低于LPS含量为20EU/g也同样非常有效。初始明胶中LPS水平越低,纯化后的明胶中LPS水平也越低。
表10:B型明胶的纯化
实施例11
在不同pH值下纯化B型骨明胶
所用条件与实施例10中的相同。制备明胶12的溶液,并用均来自Sigma-Aldrich的0.1M的盐酸或0.1M的氢氧化钠将溶液的pH调节至在4与6之间。如前所述,在LPS分析前将明胶冷冻干燥。
表11:在57.5℃、不同pH值下纯化B型明胶12
明胶12 | LPS含量(EU/g) |
未纯化的初始LPS值 | 3200 |
在pH4.0纯化 | 44 |
在pH4.5纯化 | 44 |
在pH5.0纯化 | 44 |
在pH6.0纯化 | 71 |
在pH7.0纯化 | 78 |
可观察到pH的效果。尤其在pH低于6.0时,可观察到改进的LPS纯化。
实施例12
A型鱼明胶的纯化
试验条件与实施例10和11中描述的相同。
在57.5℃下制备6.66(w/w%)的明胶11溶液,再添加TritonX-100至浓度为0.18w/w%。接下来,添加5.0g活性炭,接着另外混合15分钟。最后,如前所述过滤溶液。将温度保持在57.5℃。不调节明胶溶液的pH,并保持在5.7。如前所述,在LPS分析前将明胶冷冻干燥。
表12:A型鱼明胶的纯化
明胶(11) | LPS含量(EU/g) |
未纯化 | 33760 |
纯化的LPS含量 | 80 |
TritonX-100对于纯化高LPS含量的鱼明胶十分高效。可观察到,可通过将A型鱼明胶溶液的pH降至4.5与5.5之间可进一步改进其纯化水平。作为初始的高LPS水平的结果,可通过重复步骤2)至5)来进行额外纯化,从而达到<20/<10/<5EU的水平。
实施例13
不同的活性炭去除法
如前述实施例所述,制备明胶7的溶液。
使用浓度为0.18w/w%的TritonX-100。在57.5℃下以750rpm混合溶液30分钟。接下来,添加5g(0.7w/w%)活性炭,接着在57.5℃下另外混合15-30分钟。在温育后,用三种方法去除活性炭:
1、如前述实施例所述,用0.45μm过滤器过滤。
3、用布氏漏斗经未活化的硅藻土(Ceca Chemicals的Clarcel CBL,法国或Sigma-Aldrich的Sigma-Aldrich D3877,美国)过滤。对于含0.18w/w%的TritonX-100和0.7w/w%的活性炭的每125克6.67w/w%的明胶溶液,使用7.5-10克硅藻土。硅藻土是用于例如明胶生产过程的众所周知的过滤助剂。
如前所示,在LPS分析前将明胶冷冻干燥。
表13中提及的过滤后的明胶溶液的表面张力为66-67mN/m,等于未经处理的明胶对照溶液的表面张力(数据未显示)。
所有3种过滤法均可用于有效去除活性炭及吸附的TritonX-100和LPS。结果表明,经硅藻土过滤比用0.45μm和2μm过滤器过滤更有效,说明可经硅藻土进行额外的LPS纯化。
表13:不同的活性炭去除法
明胶7 | LPS含量(EU/g) |
未处理的明胶 | 2850 |
纯化的,根据方法1的活性炭过滤 | 34 |
纯化的,根据方法2的活性炭过滤 | 17 |
纯化的,用硅藻土的活性炭过滤 | 1.5 |
在另一具体实施方式中,不将活性炭引入明胶溶液,而使包含明胶和表面活性剂的水性介质通过R55S型3M ZetaCarbon滤芯(3M,美国),得到与上述方法2相比改进的LPS去除水平。此外,通过过滤器的溶液的表面张力为66-67mN/m,与未经处理的明胶对照溶液相等,这表明表面活性剂基本完全留在过滤器上,可参见实施例4。当表面张力与对照溶液不相似时,可串联使用两个滤芯或根据需要使用更多个滤芯。当使用R30L3S型(3M,美国)滤芯而非R55S型过滤器时,得到了相似的结果。
实施例14
TritonX-100、氧化及组合的TritonX-100与氧化
根据实施例1所述方法制备三份不同的6.66%的明胶1和明胶10溶液。向一份溶液中添加TritonX-100至浓度达到0.18w/w%。向第二份溶液中添加H2O2至浓度达到1.5w/w%。向第三份溶液中添加TritonX-100和H2O2至浓度分别达到0.18w/w%和1.5w/w%。不调节溶液的pH,明胶1和明胶10的溶液的pH分别为5.5和5.3。在57.5℃下混合和温育30分钟。将最少5g(0.7w/w%)活性炭添加到明胶溶液中,接着另外混合15-30分钟。接下来,如实施例1所述,将明胶溶液用0.45μm过滤器(Phenex,RC26mm,0.45μm)过滤。如前所述,在LPS分析前将明胶冷冻干燥。用GME10中描述的方法分析残留的H2O2,发现<20ppm,这证明其未干扰LAL分析法。
表14:明胶1和明胶10的氧化剂-TritonX-100的效果
处理 | LPS含量(EU/g) |
<u>明胶1</u> | |
初始值 | 1075 |
TritonX-100 | 2 |
1.5%的H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> | 122 |
TritonX-100+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> | <1 |
<u>明胶10</u> | |
初始值 | 17640 |
TritonX-100 | 288 |
1.5%的H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> | 3116 |
TritonX-100+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> | 18 |
由上文提到的Hirayama和Sakata的US8133269和WO2012031916已知,H2O2会降低或钝化明胶中的LPS。然而,我们却观察到TritonX-100与H2O2的令人惊异的协同作用。
实施例15
明胶和TritonX-100的变化及其对LPS纯化的作用
在55至57.5℃的温度下以750rpm的速度将具有不同浓度的溶解的明胶的明胶溶液与不同浓度的TritonX-100混合30分钟。将混合物经R55S型3M ZetaCarbon滤芯过滤。收集滤液,直接进行LPS分析法,或在-20℃下冷冻并用Christ Alpha 2-4LD Plus冷冻干燥仪(MartinChrist,德国)进行冷冻干燥。冷冻干燥的真空条件为0.04mbar、-87℃,至少24-48小时,直至溶液干燥到含水量为约4-6%。内毒素分析前不进行湿度校正。
表15:明胶和TritonX-100的变化及其对LPS纯化的效果
Claims (38)
1.一种从包含明胶和脂多糖的水性介质中去除脂多糖的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提供包含至少2w/w%明胶和脂多糖的水性介质,
2)向所述水性介质添加0.01-1.5w/w%的胶束形成表面活性剂,所述胶束形成表面活性剂包含非离子型表面活性剂,所述非离子型表面活性剂为烷基酚乙氧基化物,所述烷基酚乙氧基化物用式CxH2x+1-C6H4-O-(C2H4O)nH表示,其中x为4-12,n为8-13,
3)使步骤2)的介质与固体吸附剂接触,
4)将步骤3)的固体吸附剂与所述介质分离,
5)回收包含所述明胶的水性介质,
其中步骤1)至5)的各步骤均在68℃以下的温度下进行,所述温度低于所述胶束形成表面活性剂的浊点,至少步骤2)和3)在至少30℃的温度下进行。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述明胶的平均分子量在1500Da与250,000Da之间。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述表面活性剂为TritonX-100、或TritonX-102,或它们的混合物。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述固体吸附剂为疏水性吸附剂。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述疏水性吸附剂包括活性炭。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤1)至5)的各步骤均在65℃以下的温度下进行。
7.根据权利要求1所述的方法,其中至少所述步骤2)和3)在至少35℃的温度下进行。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤1)至5)的各步骤均在至少30℃的温度下进行。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述介质的pH在3.5和9.0之间。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤1)中的水性介质包含至少8w/w%的溶解的明胶。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述水性介质包含37w/w%以下溶解的明胶。
12.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤2)中,所述明胶与所添加的表面活性剂的重量比为2000∶1以下。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述明胶与所添加的胶束形成表面活性剂的重量比为50-5:1。
14.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤2)中,添加所述表面活性剂达到0.015-1.0w/w%的浓度。
15.根据权利要求1所述的方法,其中添加所述表面活性剂达到高于其临界胶束浓度。
16.根据权利要求1所述的方法,其中步骤2)包括在添加所述表面活性剂之后温育所述介质至少1分钟。
17.根据权利要求16所述的方法,其中温育所述介质2分钟至1小时。
18.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤3)中,将所述固体吸附剂以与所述表面活性剂的重量比为至少2.5∶1添加到所述介质中。
19.根据权利要求1所述的方法,其中步骤3)和4)包括使步骤2)后获得的介质通过一个或多个包含所述固体吸附剂的过滤元件。
20.根据权利要求19所述的方法,其中步骤3)、4)和5)包括使所述步骤2)后获得的介质通过一个或多个包含所述固体吸附剂的过滤元件。
21.根据权利要求1所述的方法,其中步骤5)包括过滤,使所述固体吸附剂与所述介质分离。
22.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法无离心步骤。
23.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法无超滤步骤。
24.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤1)至5)期间,所述水性介质的盐含量为100mM以下。
25.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤1)至5)中,所述水性介质不含丙酮和/或醇。
26.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括将所述水性介质与氧化剂一同温育。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述氧化剂在步骤1)、2)和3)的任一步期间添加。
28.根据权利要求26所述的方法,其中所述氧化剂选自过氧化氢、过乙酸及它们的混合物。
29.根据权利要求26所述的方法,其中所述氧化剂以0.5-2.5w/w%的浓度添加。
30.根据权利要求1所述的方法,其中步骤1)中的水性介质的脂多糖含量基于每克明胶干重为1500EU以下。
31.一种明胶,其通过前述权利要求任一项所述的方法获得,所述明胶基本不含季铵盐,包含分子量高于100,000Da的明胶衍生分子,所述明胶的脂多糖含量低于50EU/g。
32.一种A型明胶,其通过权利要求1-30任一项所述的方法获得,所述明胶包含高于分子量100,000Da的明胶衍生分子,所述明胶的脂多糖含量低于50EU/g。
33.根据权利要求31所述的明胶,其中所述明胶的平均分子量在1500Da与250,000Da之间。
34.根据权利要求31所述的明胶,其中所述明胶的平均分子量高于80,000Da。
35.根据权利要求31所述的明胶,其不含丙酮和/或季铵盐和/或醇。
36.一种包含至少2w/w%的权利要求31-35任一项所述的明胶的水性介质,所述介质的盐含量为100mM以下。
37.根据权利要求36所述的水性介质,其基本不含丙酮和/或季铵盐。
38.根据权利要求36所述的水性介质,其包含至少6w/w%的明胶。
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