WO2018066595A1 - コラーゲン組成物 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a composition containing fish skin-derived collagen having excellent water solubility and moisture retention, and a method for producing the same.
- Collagen is a major protein that forms the skin of animals such as cow skin, pig skin, and fish skin in addition to humans. Collagen has been used in large quantities as a raw material for cosmetics because it has high moisture retention and gives a smooth feel to the skin. They are also used in pharmaceuticals and medical devices because of their excellent biocompatibility. In recent years, it has also attracted attention as a food material. Collagens that have been used so far have been mainly derived from cattle skin and pork skin, but in recent years, the development of collagen derived from sources other than cattle and pigs has become active in search of new functions. Among them, fish skin-derived collagen is partly used. However, the collagen derived from fish skin has a problem that its solubility in water is low and a high-concentration solution cannot be obtained.
- An object of the present invention is to provide a collagen composition derived from fish skin having excellent solubility in water and having moisture retention, and a method for producing the same.
- the present inventors have extracted collagen from a fish skin treated with dilute acid and dilute alkali solution using dilute acid, and further reduced the molecular weight by ultrafiltration. By combining the steps of removing peptides and amino acids, it was found that a fish skin-derived collagen composition having excellent water solubility and moisture retention was obtained, and the present invention was completed.
- the gist of the present invention is as follows.
- the collagen composition according to (1), wherein the degree ( ⁇ ep) is 10.0 cm 2 ⁇ min ⁇ 1 ⁇ kV ⁇ 1 or less
- the collagen composition according to (1) or (2), wherein the moisture content of the skin 20 minutes after application to the skin is 1.1 times
- the collagen composition of the present invention is a collagen composition derived from fish skin that has excellent solubility in water and has moisture retention, so that it can be used not only for pharmaceuticals and medical devices but also in a wider range of fields than conventional products. It can be suitably used as a raw material for products such as pharmaceuticals, medical devices, cosmetics, and foods.
- M represents a molecular weight marker of the protein. It is an image which shows the state of the solubility test result with respect to the collagen composition obtained in Example 3, and the comparative product 1 with respect to water.
- 6 is a graph of the CD spectrum of collagen obtained in Example 4. It is a graph which shows the result of the moisture retention test which used the amount of stratum corneum moisture as a parameter
- the collagen composition of the present invention is a collagen composition mainly comprising collagen derived from fish skin, Collagen content with a molecular weight of 90000 or more is 70% or more with respect to the amount of protein in solid content, solubility in water (25 ° C.) is 10% or more, and ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ in electrophoresis under non-reducing non-heating conditions A band indicating a chain is observed.
- the collagen composition of the present invention comprises a collagen having a molecular weight suitable for exerting moisture retention because the collagen content with a molecular weight of 90000 or more is 70% or more with respect to the protein content as a solid content.
- the composition contains a large amount of collagen with high purity.
- the molecular weight of the collagen may be 90000 or more, and the upper limit is not particularly limited, but may be 500000 or less.
- the protein in the collagen composition of the present invention may be composed only of collagen having a molecular weight of 90000 or more, but other fish skin-derived protein components, for example, collagen having a molecular weight of less than 90000, muscle-derived myosin, It may contain blood-derived albumin and the like.
- a composition containing collagen is subjected to ultrafiltration or equilibrium dialysis.
- purifying by a method is mentioned.
- the ultrafiltration method and the equilibrium dialysis method may be any methods that can recover collagen having a molecular weight of 90000 or more, and there are no particular limitations on the types of ultrafiltration devices, dialysis devices, filtrates, and the like.
- the collagen content with a molecular weight of 90000 or more refers to the weight ratio in terms of solid content of the collagen with a molecular weight of 90000 or more in the total protein.
- the collagen composition of the present invention has a solubility in water (25 ° C.) of 10% or more, and thus has superior solubility compared to the raw fish skin-derived collagen.
- the solubility indicates the weight% of the collagen composition that can be dissolved in 100 g of water (25 ° C.) as a solvent or a buffer solution (25 ° C.) having a pH of 2 to 5, and for example, a solubility curve can be obtained by a known method. It can be calculated by measuring. Since the collagen composition of the present invention has a solubility in water of 10% or more, it can be used in a wide range of fields such as cosmetics.
- non-reducing conditions in electrophoresis refer to conditions in which a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol is not present.
- the non-heating condition means a condition in which a heating condition of 50 ° C. or higher is not applied in the sample pretreatment.
- Collagen has a triple helical structure in which three polypeptide chains (for example, ⁇ chains such as ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, etc.) are gathered.
- polypeptide chains for example, ⁇ chains such as ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, etc.
- types of collagen such as type I to type XVIII, and the type of polypeptide chain differs depending on the type.
- type I collagen is formed from two ⁇ 1 chains and one ⁇ 2 chain.
- type II collagen is formed from three ⁇ 1 chains
- type V collagen is formed from ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 3 chains. All of the sequence characteristics and structures of amino acid residues of ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain are known.
- each ⁇ chain has a structure in which (1) a helical region consisting of about 1,000 amino acids is in the center of the molecule, and (2) a non-helical region of about 10 to 30 residues is located at both ends thereof.
- the ⁇ chain refers to a dimer in which the ⁇ 1 chain is a double pair, and the ⁇ chain refers to a trimer of the ⁇ chain and the ⁇ 2 chain.
- the ⁇ 1 chain electrophoresis band is observed around 120 kDa
- the ⁇ 2 chain electrophoresis band is observed around 100 kDa
- the ⁇ chain electrophoresis band is observed around 230 kDa
- the ⁇ chain electrophoresis band is observed around 300 kDa.
- the bands showing the ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain may be observed visually using a commercially available protein stain such as Coma brilliant blue R250, Ponso S, or a commercially available gel analyzer. You may go. When observed, if the band appears darker than the background, it is determined that there is a band, and if the boundary between the band and the background is clear, it is determined that the band is clear. If a clear band cannot be obtained, the sample solution is diluted or concentrated, and electrophoresis is performed at a concentration at which a clear band is observed.
- the state of the above-described triple helix structure of collagen can be grasped to some extent by using capillary electrophoresis or circular dichroism (CD) spectrum.
- the electrophoretic mobility in capillary electrophoresis is determined by the charge / size ratio. That is, when the charges are the same, the electrophoretic mobility is small when the bulk of the molecule is large, and the electrophoretic mobility is large when the bulk is small. Therefore, when capillary electrophoresis was performed, if the electrophoretic mobility of the collagen composition of the present invention was 10.0 cm 2 ⁇ min ⁇ 1 ⁇ kV ⁇ 1 or less, the structure of the triple helix was partially loosened. It is estimated that the structure is a random coil.
- the conditions of the capillary electrophoresis are: an unmodified inner surface fused silica capillary (inner diameter 50 ⁇ m, length 62.5 cm, effective length 50 cm), applied voltage 25 kV, 50 mM borate buffer (pH 10.5). Electrophoretic mobility can be measured. Moreover, the object which measures electrophoretic mobility should just be a sample containing a neutral marker. As the neutral marker, benzyl alcohol, cinnamyl alcohol, mesityl oxide, or the like that has no positive or negative charge and has ultraviolet absorption is desirable.
- the CD spectrum of the collagen composition of the present invention shows a negative maximum at 207 to 210 nm and a large positive value at 200 nm
- part of the triple helix structure of the collagen is partially loosened, and the random coil It is estimated that the state has changed to a state having a shape.
- the collagen composition of the present invention in a relatively large molecular collagen having a molecular weight of 90000 or more, a part of the triple helical structure becomes a loose coiled structure, and the part becomes a gelatin-like structure, It is thought that the effect which the conventional fish skin origin collagen does not have is show
- CD spectrum In gelatin obtained by degrading collagen, all triple helix structures are scattered and low molecular in many cases. Therefore, when there is no specific higher order structure, CD spectrum is measured. It does not show a large positive value at 200 nm.
- the CD spectrum can be measured using a known measuring device. Specifically, the CD spectrum can be measured by the method described in Examples described later.
- the collagen composition of the present invention is excellent in skin moisture retention when applied to human skin.
- the moisturizing property for example, the moisture value of the skin 20 minutes after application to the skin is preferably 1.1 times or more, and 1.3 times or more compared to before application. More preferred.
- the stratum corneum moisture content is measured using a skin moisture meter. In addition, what is necessary is just to perform a specific measurement as it describes in the below-mentioned Example.
- Examples of the type of fish from which the fish skin, which is the collagen raw material, is derived include tuna, yellowtail, grouper, cod, flounder, skipjack, and cucumbers.
- tuna bluefin tuna, Atlantic sea bream, and the like because they are large in size and easily pick up fish skin containing a large amount of collagen with a molecular weight of 90000 or more, and because the skin is thick, the fish skin does not easily collapse during processing.
- Tuna such as bluefin tuna, yellowfin tuna, southern bluefin tuna, bigeye tuna, albacore tuna, cochinaga, etc. are preferred, and bluefin tuna is more preferred from the viewpoint of being able to obtain a stable and stable culture.
- the collagen composition of the present invention may contain other components in addition to the above-mentioned collagen having a molecular weight of 90000 or more as long as it does not affect water solubility and moisture retention.
- other components include partially fragmented collagen molecules, lipids, carbohydrates, other proteins, vitamins, pH adjusters, and preservatives such as ethanol, parabens, and phenoxyethanol. It is done.
- a first step of treating fish skin with a dilute strong acid treatment or dilute strong alkali treatment A second step of treating the fish skin treated with the dilute strong acid in the first step with a dilute strong alkali treatment, or treating the fish skin treated with the dilute strong alkali in the first step with a dilute strong acid treatment, A third step of extracting collagen from the fish skin obtained in the second step using a dilute weak acid solution; and a fourth step of purifying the collagen extracted in the third step by ultrafiltration or equilibrium dialysis. It is preferable to have.
- the fish skin used as a raw material in the first step may be, for example, fish skin with scales and meat parts attached, or fish skin with scales and meat parts cut off.
- a portion of the fish that is less colored, for example, tuna is preferably an abdominal fish skin with less coloring.
- the fish skin is preferably one in which impure proteins, blood, pigments, oils and the like are completely or partly removed by a physical method or a chemical method.
- the physical method includes collecting the fish skin from the fish body using a blade such as a spatula or knife, and removing other parts with blood, pigment and oil in addition to scales and meat, etc., hydraulic pressure And a method of removing scales, meat parts, and other parts with blood, pigments and oils attached to the surface of the fish skin.
- the fish skin from which the impure protein, blood, pigment, oil and the like are completely or partially removed is subjected to the first step.
- the first step either a dilute strong acid treatment or a dilute strong alkali treatment is performed.
- the dilute strong acid treatment is performed by bringing fish skin into contact with a dilute strong acid solution having a predetermined concentration by immersion or spraying.
- the solvent of the dilute strong acid solution may be water, but an organic solvent such as ethanol may be mixed.
- the type of strong acid in the dilute strong acid solution may be a commonly used strong acid, and examples thereof include hydrochloric acid, sulfuric acid, and nitric acid, but are not particularly limited.
- the strong acid concentration used is preferably 0.01 to 0.5N, more preferably 0.05 to 0.3N, and even more preferably 0.1 to 0.2N from the viewpoint of efficiently removing oil from fish skin. .
- the treatment temperature is preferably 15 to 25 ° C.
- the treatment time is preferably 1 to 72 hours. It is more preferably 3 to 48 hours, and further preferably 12 to 30 hours.
- the dilute strong alkali treatment is performed by immersing or spraying the fish skin in a dilute strong alkaline solution.
- the alkali component used in the dilute strong alkali solution may be any alkali component used in foods, and examples thereof include sodium hydroxide, potassium hydroxide, and calcium hydroxide, but are not particularly limited.
- the solvent of the dilute strong alkaline solution may be water, but an organic solvent such as ethanol may be mixed.
- the concentration of the dilute strong alkali in the dilute strong alkali solution is 0.05% from the viewpoint of efficiently removing impurities by removing protein components other than collagen and saponifying oil, and efficiently cleaving the telopeptide portion. To 0.5N is preferable, and 0.1 to 0.2N is more preferable.
- the treatment temperature is preferably 15 ° C. or less, and the treatment time is preferably 1 to 72 hours, more preferably 3 to 48 hours. 12-30 hours is more preferable.
- the dilute strong acid treatment or the dilute strong alkali treatment When the dilute strong acid treatment or the dilute strong alkali treatment is performed by immersion, it may be circulated using a stirrer. Further, after treatment with a dilute strong acid or dilute strong alkali, the fish skin may be filtered using a sieve, and then the fish skin residue remaining on the sieve may be immersed in a solvent such as water and washed.
- the fish skin treated with the dilute strong acid in the first step is treated with dilute strong alkali, or the fish skin treated with the dilute strong alkali in the first step is treated with dilute strong acid.
- the conditions for the dilute acid treatment and dilute strong alkali treatment performed in the second step may be the same as the conditions performed in the first step.
- the acid used in the dilute weak acid solution may be any acid used in foods, and examples thereof include inorganic acids such as carbonic acid and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid, citric acid, and lactic acid. There is no.
- the solvent of the dilute weak acid solution may be water, but an organic solvent such as ethanol may be mixed.
- the acid concentration in the dilute weak acid solution is preferably 0.001 to 2N, more preferably 0.01 to 2N from the viewpoint of efficiently performing the acid extraction of collagen, and is used in the form of a salt such as sodium and potassium. May be.
- the extraction of collagen with the dilute weak acid solution is performed at a temperature of 4 to 50 ° C., preferably 30 to 40 ° C., more preferably 35 to 37 ° C. for 1 to 48 hours, preferably 3 to 30 hours. It is desirable to do so.
- insoluble matter remains in the collagen extracted in the third step, it is preferable to remove the insoluble matter by subjecting the collagen-containing solution (collagen solution) to a filtration method, a centrifugal separation method, or the like.
- the collagen composition obtained in the third step is dissolved in a dilute weak acid solution, it can be used as it is, but is preferably further purified.
- ultrafiltration membranes and dialysis membranes are used to perform ultrafiltration and equilibrium dialysis, including dilute weak acid solutions for extraction and substitution with appropriate weak acid solutions or buffer solutions, and at the same time, low molecular peptides and amino acids. Water-soluble compounds such as these may be removed.
- the ultrafiltration membrane or dialysis membrane may be any membrane that can fractionate collagen having a molecular weight of 90000 or more.
- MWCO 30000 molecular weight cutoff of 30000
- the weak acid solution and buffer to be used may be any weak acid solution or buffer as long as it is a weak acid solution or buffer solution having a buffer capacity at pH 3 to 6, but from the viewpoint of economy, safety, etc. It is preferable to use a solution of citric acid, acetic acid or phosphoric acid, or a mixture of these with sodium salt or potassium salt.
- the collagen solution in order to remove the oil and other impurities dispersed in the collagen solution, it may be filtered with a narrow-diameter membrane filter.
- the diameter of the membrane filter is not particularly limited as long as it is 1.0 ⁇ m or less.
- the solution-like collagen composition can be made into a dried product by a drying method such as a freeze-drying method or a spray-drying method.
- a drying method such as a freeze-drying method or a spray-drying method.
- a known method may be used as long as it does not affect the water solubility and moisture retention of the collagen composition.
- the collagen composition of the present invention obtained as described above can be suitably used for pharmaceuticals, medical devices, quasi drugs, cosmetics, foods and the like.
- Example 1 Only the red part of the bluefin tuna skin was scraped off with a spatula, and then cut so that one side became a square of 2 to 3 cm. 1 kg of this piece was weighed and immersed in 10 L of 0.1N dilute hydrochloric acid solution at 20 ° C. for 24 hours (first step). The dilute hydrochloric acid solution was gently circulated using a stirrer. After the immersion, the mixture was filtered using a polypropylene sieve, and the fish skin residue was immersed in 5 L of water while gently stirring. The mixture was again filtered through a sieve, and the residue was immersed in a 0.1N sodium hydroxide solution at room temperature for 24 hours.
- the sodium hydroxide solution was gently circulated using a stirrer (second step). After the immersion, the mixture was filtered using a polypropylene sieve, and the fish skin residue was immersed in 5 L of water while gently stirring. It filtered again with the sieve, and was immersed in the acetic acid solution of 0.1N adjusted to 37 degreeC for 3 hours (3rd process). The acetic acid solution was gently circulated using a stirrer. After soaking, after filtering with a polypropylene sieve, the filtrate is filtered and filtered with ultrafiltration (MWCO 150,000, trade name “FB02-FC-FUS1582”, Daisen Membrane Systems).
- MWCO 150,000 trade name “FB02-FC-FUS1582”
- the solution was replaced with a 5-fold amount of citrate buffer (0.3% citric acid, 0.05% sodium citrate) (fourth step). After completion of solution replacement, the solution was sterilized by filtration with a membrane filter (0.2 ⁇ m ⁇ ) to obtain a collagen composition.
- Example 2 Only the red part of the bluefin tuna skin was scraped off with a spatula, and then cut so that one side became a square of 2 to 3 cm. 1 kg of this piece was weighed and immersed in 10 L of 0.1N dilute hydrochloric acid solution at 20 ° C. for 24 hours (first step). The dilute hydrochloric acid solution was gently circulated using a stirrer. After the immersion, the mixture was filtered using a polypropylene sieve, and the fish skin residue was immersed in 5 L of water while gently stirring. The mixture was again filtered through a sieve, and the residue was immersed in a 0.1N sodium hydroxide solution at room temperature for 24 hours.
- the sodium hydroxide solution was gently circulated using a stirrer (second step). After the immersion, the mixture was filtered using a polypropylene sieve, and the fish skin residue was immersed in 5 L of water while gently stirring. It filtered again with the sieve, and was immersed in the acetic acid solution of 0.1N adjusted to 37 degreeC for 3 hours (3rd process). The acetic acid solution was gently circulated using a stirrer. After completion of the immersion, the solution was filtered through a polypropylene sieve, the filtrate was filtered, and ultrafiltration (MWCO100,000, spectrum) was used to citrate buffer (0.3% citric acid) 50 times the filtrate volume. The solution was replaced with acid (0.05% sodium citrate) (fourth step). After completion of solution replacement, the solution was sterilized by filtration with a membrane filter (0.2 ⁇ m ⁇ ) to obtain a collagen composition.
- the collagen concentration in the obtained liquid collagen composition was measured by BCA method using fish gelatin as a standard and found to be 0.1%.
- Example 3 The collagen composition obtained in Example 1 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a 10% polyacrylamide gel, and then a protein band was detected with Comacy Brilliant Blue R250. These results are shown in FIG. In FIG. 1, lane 1 is a sample obtained by pretreating the collagen composition obtained in Example 1 in the presence of 2-mercaptoethanol under heating conditions (95 ° C., 10 minutes), and lane 2 is obtained in Example 1. The sample which pre-processed the collagen composition on non-heating conditions in the absence of 2-mercaptoethanol is shown.
- Example 3 The solubility of the collagen composition obtained in Example 1 was examined.
- the collagen composition obtained in Example 1 was freeze-dried to obtain 29.6 g of a dried collagen product.
- 1 mL of room temperature water was added to 400 mg of dried collagen (containing 211 mg as collagen) to obtain a collagen solution having a solid content of 20%.
- 1 mL of water was added to 450 mg (containing 212 mg of collagen) of a commercial collagen derived from yellowfin tuna (Ciege collagen, hereinafter referred to as Comparative product 1), and allowed to stand at room temperature for 5 minutes with gentle stirring.
- Comparative product 1 a commercial collagen derived from yellowfin tuna
- the lyophilized product of the collagen composition obtained in Example 1 was completely dissolved in water (25 ° C.) in 5 minutes, and a 20% (w / v) solution was easily prepared.
- the solubility in water (25 ° C.) is 21.1% or more, which is very high.
- the solubility in water (25 ° C.) was significantly inferior to that of the collagen composition obtained in Example 1.
- Example 4 The circular dichroism (CD) spectrum of the collagen composition obtained in Example 1 was measured.
- the collagen composition obtained in Example 1 was diluted with a 0.3% citric acid-0.05% disodium citrate solution to 0.003 mg / mL, and using a cell with an optical path length of 1 mm, JASCO Corporation A circular dichroism spectrum at 10 ° C. was analyzed using a circular dichroism dispersometer “J-820”.
- freeze-dried commercial collagen derived from yellowfin tuna (Comparative Product 1) and Fish Gelatin (“FGL-250TS” manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd., hereinafter referred to as Comparative Product 2) were used with 0.3% citric acid-0.
- the collagen composition obtained in Example 1 has a circular dichroism (CD) spectrum having a negative maximum at 207 to 210 nm and a positive value at 200 nm ( (Top view of FIG. 3).
- the comparative product 1 shows a negative maximum at a CD spectrum of less than 207 nm (middle of FIG. 3), and the fish gelatin of the comparative product 2 shows a negative value at a CD spectrum of 200 nm. Therefore (lower diagram in FIG. 3), it can be seen that the structure of the collagen molecule is different from the collagen in the collagen composition obtained in Example 1.
- Example 5 In order to verify the moisturizing effect of the collagen composition obtained in Example 1 (hereinafter referred to as the present invention product) and Comparative Product 1, a moisturizing test was performed using the stratum corneum moisture content as an index. The forearm was dried with cold air from a dryer for 1 minute, and the stratum corneum moisture content was measured with a portable skin moisture meter Mobile Moisture HP10-N (baseline). A 55% filter paper was impregnated with a 1% collagen sample (the product of the present invention, comparative product 1 or control (distilled water)) and affixed to the dried portion of the forearm for 5 minutes.
- the present invention product comparative product 1 or control (distilled water)
- the filter paper was removed and air-dried for 1 minute to measure the stratum corneum moisture content (immediately after application). Thereafter, the stratum corneum moisture content was measured using the portable skin moisture meter after 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes, and 20 minutes, respectively, while drying with cold air.
- the product of the present invention has a skin moisture value 20 minutes after application to the skin, which is 1.3 times or more compared with that before the application, and compared with Comparative Product 1. Since the reduction of the stratum corneum moisture content is suppressed every time after application, it is understood that the moisture retention is excellent. On the other hand, Comparative Product 1 shows that the moisture value of the skin 20 minutes after application to the skin is about the same as that before application, and thus the moisturizing effect is not about 20 minutes.
- Example 6 The collagen composition obtained in Examples 1 and 2 (hereinafter referred to as the product of the present invention) and Comparative product 1 were analyzed by capillary electrophoresis, and the electrophoretic mobility ( ⁇ ep) was calculated according to the following equation. The results are shown in Table 1.
- t-0 represents the migration time of the neutral substance
- t-Protein represents the migration time of the target protein.
- capillary electrophoresis device “CAPI-3100” manufactured by Otsuka Electronics Capillary: Unmodified inner surface fused silica capillary (manufactured by GL Sciences, inner diameter 50 ⁇ m, length 62.5 cm, effective length 50 cm) Sample injection: drop method (2.5 cm x 30 seconds) Applied voltage: 25 kV Detection wavelength: 200 nm Electrophoresis: 50 mM borate buffer (pH 10.5)
- the electrophoretic mobility of the product of the present invention is 10.0 cm 2 ⁇ min ⁇ 1 ⁇ kV ⁇ 1 or less, and the electrophoretic mobility of the comparative product 1 (15.58 cm 2 ⁇ min ⁇ 1 ⁇ kV ⁇ 1 ), which is significantly smaller. Therefore, it can be seen that the collagen in the collagen composition of the present invention has a bulky structure as compared with commercially available collagen.
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Abstract
分子量９００００以上のコラーゲン含量が固形分でタンパク質量に対して７０％以上であり、水（２５℃）対する溶解度が１０％以上であり、非還元非加熱条件での電気泳動においてα鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドが観察されるコラーゲン組成物。前記コラーゲン組成物は、魚皮を希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理し、次いで希薄強酸処理した魚皮を希薄強アルカリ処理したり、希薄強アルカリ処理した魚皮を希薄強酸処理したりして得られた魚皮から希薄弱酸溶液を用いてコラーゲンを抽出し、さらに抽出したコラーゲンを限外ろ過法または平衡透析法により精製することで製造することができる。
Description
本発明は、水に対する溶解性に優れ、かつ保湿性を備えた魚皮由来コラーゲンを含む組成物およびその製造方法に関する。
コラーゲンは、ヒトの他、牛皮、豚皮、魚皮など動物の皮膚を形成する主要タンパク質である。コラーゲンは、高い保湿性を有し、皮膚に滑らかな感触を付与することから化粧品の原料として多量に利用されてきた。また、医薬品、医療用具にもそれらは優れた生体適合性を有することから利用されている。さらに、近年食品素材としても注目を浴びている。これまで使用されてきたコラーゲンは主に牛皮や豚皮由来であったが、近年新しい機能を求めてウシやブタ以外の由来のコラーゲンの開発が盛んになってきた。そのなかで魚皮由来のコラーゲンも一部使用されている。しかしながら、魚皮由来のコラーゲンは、水に対する溶解度が低く高濃度溶液にすることが出来ないという問題があった。
また、魚皮から得られる従来のコラーゲンでは、製品純度が低く、しかも透明度が低いため、化粧品の分野では到底使用できないので、それを解決するために機械的な予備加工工程、混合工程及び水洗工程を経る方法が開示されているが（特許文献１）、これらの方法によって得られるコラーゲンも水に対する溶解度が低く、化粧品等で使用する際には十分な効果を発揮する濃度を添加することが困難である。従って、魚皮由来のコラーゲンを有効利用するために水に対する溶解性が優れ、かつ保湿性を備えたコラーゲン及びその製造法の開発が渇望されている。
本発明の目的は、水に対して溶解性に優れ、かつ保湿性を備えた魚皮由来のコラーゲン組成物およびその製造方法を提供することにある。
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、希酸、希アルカリ溶液で処理した魚皮から希薄酸を用いてコラーゲンを抽出し、さらに限外ろ過法にて低分子のペプチド及びアミノ酸を除去する工程を組み合わせることにより、水に対する溶解性に優れ、しかも保湿性を備えた魚皮由来のコラーゲン組成物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の要旨は、
（１）魚皮由来のコラーゲンを主成分とするコラーゲン組成物であって、
分子量９００００以上のコラーゲン含量が固形分でタンパク質量に対して７０％以上であり、水（２５℃）対する溶解度が１０％以上であり、非還元非加熱条件での電気泳動においてα鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドが観察されるコラーゲン組成物、
（２）内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ）、印加電圧２５ｋＶ、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）でのキャピラリー電気泳動において、電気泳動移動度(μｅｐ)として１０．０ｃｍ２・ｍｉｎ－１・ｋＶ－１以下を示す前記（１）に記載のコラーゲン組成物、
（３）肌への塗付後２０分後の肌の水分値が塗付前と比較して１．１倍以上である保湿性を有する前記（１）または（２）に記載のコラーゲン組成物、
（４）円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルが２０７～２１０ｎｍで負の極大を示し、２００ｎｍで正の値を示す前記（１）～（３）のいずれかに記載のコラーゲン組成物、
（５）魚皮の由来がマグロ類である前記（１）～（４）のいずれかに記載のコラーゲン組成物、
（６）魚皮を希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理する第一工程、
前記第一工程で希薄強酸処理した魚皮を希薄強アルカリ処理する、または前記第一工程で希薄強アルカリ処理した魚皮を希薄強酸処理する第二工程、
前記第二工程で得られた魚皮から希薄弱酸溶液を用いてコラーゲンを抽出する第三工程、および
前記第三工程で抽出したコラーゲンを限外ろ過法または平衡透析法により精製する第四工程
を含む前記（１）～（５）のいずれかに記載のコラーゲン組成物の製造方法
に関する。
（１）魚皮由来のコラーゲンを主成分とするコラーゲン組成物であって、
分子量９００００以上のコラーゲン含量が固形分でタンパク質量に対して７０％以上であり、水（２５℃）対する溶解度が１０％以上であり、非還元非加熱条件での電気泳動においてα鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドが観察されるコラーゲン組成物、
（２）内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ）、印加電圧２５ｋＶ、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）でのキャピラリー電気泳動において、電気泳動移動度(μｅｐ)として１０．０ｃｍ２・ｍｉｎ－１・ｋＶ－１以下を示す前記（１）に記載のコラーゲン組成物、
（３）肌への塗付後２０分後の肌の水分値が塗付前と比較して１．１倍以上である保湿性を有する前記（１）または（２）に記載のコラーゲン組成物、
（４）円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルが２０７～２１０ｎｍで負の極大を示し、２００ｎｍで正の値を示す前記（１）～（３）のいずれかに記載のコラーゲン組成物、
（５）魚皮の由来がマグロ類である前記（１）～（４）のいずれかに記載のコラーゲン組成物、
（６）魚皮を希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理する第一工程、
前記第一工程で希薄強酸処理した魚皮を希薄強アルカリ処理する、または前記第一工程で希薄強アルカリ処理した魚皮を希薄強酸処理する第二工程、
前記第二工程で得られた魚皮から希薄弱酸溶液を用いてコラーゲンを抽出する第三工程、および
前記第三工程で抽出したコラーゲンを限外ろ過法または平衡透析法により精製する第四工程
を含む前記（１）～（５）のいずれかに記載のコラーゲン組成物の製造方法
に関する。
本発明のコラーゲン組成物は、水に対する溶解性に優れ、かつ、保湿性を備えた魚皮由来のコラーゲン組成物であるため、医薬品、医療用具だけでなく、従来品に比べてより幅広い分野の製品、例えば、医薬品、医療用具、化粧料、食品などの原料として好適に使用することができる。
本発明のコラーゲン組成物は、魚皮由来のコラーゲンを主成分とするコラーゲン組成物であって、
分子量９００００以上のコラーゲン含量が固形分でタンパク質量に対して７０％以上であり、水（２５℃）対する溶解度が１０％以上かつ非還元非加熱条件での電気泳動においてα鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドが観察されることを特徴とする。
分子量９００００以上のコラーゲン含量が固形分でタンパク質量に対して７０％以上であり、水（２５℃）対する溶解度が１０％以上かつ非還元非加熱条件での電気泳動においてα鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドが観察されることを特徴とする。
本発明のコラーゲン組成物は、前記のように、分子量９００００以上のコラーゲン含量が固形分でタンパク質量に対して７０％以上であることで、保湿性を発揮するのに適した分子量を有するコラーゲンを多量に含有した、コラーゲンの純度の高い組成物となる。
また、前記コラーゲンの分子量については、９００００以上であればよく、その上限値については特に限定はないが５０００００以下であればよい。
本発明のコラーゲン組成物中におけるタンパク質としては、前記分子量９００００以上のコラーゲンのみで構成されていてもよいが、他の魚皮由来のタンパク質成分、例えば、分子量９００００未満のコラーゲン、筋肉由来のミオシン、血液由来のアルブミンなどを含有していてもよい。
本発明のコラーゲン組成物において、分子量９００００以上のコラーゲン含量を、固形分でタンパク質量に対して７０％以上となるように調整する手法としては、コラーゲンを含む組成物を限外ろ過法や平衡透析法により精製する手法が挙げられる。
前記限外ろ過法および平衡透析法は、分子量９００００以上のコラーゲンを回収できる方法であればよく、限外ろ過装置、透析装置、ろ液などの種類について特に限定はない。
なお、前記分子量９００００以上のコラーゲン含量は、全タンパク質中における前記分子量９００００以上のコラーゲンの固形分換算の重量割合をいう。
また、前記コラーゲンの分子量については、９００００以上であればよく、その上限値については特に限定はないが５０００００以下であればよい。
本発明のコラーゲン組成物中におけるタンパク質としては、前記分子量９００００以上のコラーゲンのみで構成されていてもよいが、他の魚皮由来のタンパク質成分、例えば、分子量９００００未満のコラーゲン、筋肉由来のミオシン、血液由来のアルブミンなどを含有していてもよい。
本発明のコラーゲン組成物において、分子量９００００以上のコラーゲン含量を、固形分でタンパク質量に対して７０％以上となるように調整する手法としては、コラーゲンを含む組成物を限外ろ過法や平衡透析法により精製する手法が挙げられる。
前記限外ろ過法および平衡透析法は、分子量９００００以上のコラーゲンを回収できる方法であればよく、限外ろ過装置、透析装置、ろ液などの種類について特に限定はない。
なお、前記分子量９００００以上のコラーゲン含量は、全タンパク質中における前記分子量９００００以上のコラーゲンの固形分換算の重量割合をいう。
本発明のコラーゲン組成物は、水（２５℃）対する溶解度が１０％以上であることで、原料の魚皮由来のコラーゲンに比べて、優れた溶解性を有する。
前記溶解度は、溶媒である水（２５℃）またはｐＨ２～５の緩衝液（２５℃）１００ｇ中に対して溶解できるコラーゲン組成物の重量％を示しており、例えば、公知の方法で溶解度曲線を測定することで算出することができる。
本発明のコラーゲン組成物は、水への溶解度が１０％以上であるため、化粧品など幅広い分野で使用することができる。
前記溶解度は、溶媒である水（２５℃）またはｐＨ２～５の緩衝液（２５℃）１００ｇ中に対して溶解できるコラーゲン組成物の重量％を示しており、例えば、公知の方法で溶解度曲線を測定することで算出することができる。
本発明のコラーゲン組成物は、水への溶解度が１０％以上であるため、化粧品など幅広い分野で使用することができる。
本発明のコラーゲン組成物は、非還元非加熱条件での電気泳動においてα鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドが観察されるものである。
本発明において、電気泳動における非還元条件とは、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトールなどの還元剤が存在していない条件をいう。また、非加熱条件とは、試料の前処理において５０℃以上の加熱条件を加えない条件をいう。
本発明のコラーゲン組成物は、非還元非加熱条件で電気泳動を行うことで、α鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドを目視でも容易に観察することができる。
また、前記電気泳動は、タンパク質を分離するための電気泳動であればよいが、α鎖、β鎖、γ鎖を明瞭に観察し易い観点から、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動が好ましい。
本発明のコラーゲン組成物は、非還元非加熱条件で電気泳動を行うことで、α鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドを目視でも容易に観察することができる。
また、前記電気泳動は、タンパク質を分離するための電気泳動であればよいが、α鎖、β鎖、γ鎖を明瞭に観察し易い観点から、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動が好ましい。
コラーゲンは、ポリペプチド鎖（例えば、α１鎖、α２鎖、α３鎖などのα鎖）が３本集まった三重らせん構造を有している。そして、コラーゲンには、Ｉ型～ＸＶＩＩＩ型など様々なタイプがあり、そのタイプ毎にポリペプチド鎖の種類は異なっており、例えば、Ｉ型コラーゲンはα１鎖２本とα２鎖１本から形成されており、ＩＩ型コラーゲンは３本のα１鎖から形成されており、Ｖ型コラーゲンはα１鎖、α２鎖、α３鎖から形成されていることが知られている。
α鎖、β鎖、γ鎖のアミノ酸残基の配列的特徴および構造についてはいずれも知られている。
例えば、各α鎖は、（1）分子中央には約１，０００残基のアミノ酸からなるらせん領域があり、（2）その両端に１０～３０残基程度の非らせん領域がある構造を有する。
β鎖とは、前記α１鎖が２本組になった２量体をいい、γ鎖とは、前記β鎖と前記α２鎖の３量体をいう。
前記α１鎖の電気泳動のバンドは１２０ｋＤａ付近、α２鎖の電気泳動のバンドは１００ｋＤａ付近、β鎖の電気泳動のバンドは２３０ｋＤａ付近、γ鎖の電気泳動のバンドは３００ｋＤａ付近に観察される。
α鎖、β鎖、γ鎖のアミノ酸残基の配列的特徴および構造についてはいずれも知られている。
例えば、各α鎖は、（1）分子中央には約１，０００残基のアミノ酸からなるらせん領域があり、（2）その両端に１０～３０残基程度の非らせん領域がある構造を有する。
β鎖とは、前記α１鎖が２本組になった２量体をいい、γ鎖とは、前記β鎖と前記α２鎖の３量体をいう。
前記α１鎖の電気泳動のバンドは１２０ｋＤａ付近、α２鎖の電気泳動のバンドは１００ｋＤａ付近、β鎖の電気泳動のバンドは２３０ｋＤａ付近、γ鎖の電気泳動のバンドは３００ｋＤａ付近に観察される。
本発明において前記α鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドの観察は、コマシーブリリアントブルーＲ２５０、ポンソＳなど市販のタンパク質染色剤を使い、目視で行ってもよいし、市販のゲル解析装置で行ってもよい。観察した際に、バンドが背景よりも濃い色で現れていれば、バンドがあると判断し、バンドと背景の境界が明確であれば、バンドが明瞭であると判断する。
なお、明瞭なバンドが得られない場合には、試料溶液を希釈または濃縮して明瞭なバンドが観察される濃度で電気泳動を行う。
なお、明瞭なバンドが得られない場合には、試料溶液を希釈または濃縮して明瞭なバンドが観察される濃度で電気泳動を行う。
また、上記のコラーゲンの三重らせん構造の状態については、キャピラリー電気泳動や円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを用いることである程度把握できる。
例えば、キャピラリー電気泳動での電気泳動移動度は電荷／サイズ比により決まる。すなわち、電荷が同じ場合、分子の嵩高さが大きい場合に前記電気泳動移動度は小さく、嵩高さが小さい場合には前記電気泳動移動度は大きくなる。したがって、キャピラリー電気泳動を行った場合に、本発明のコラーゲン組成物の電気泳動移動度が１０．０ｃｍ２・ｍｉｎ－１・ｋＶ－１以下であれば、三重らせんの構造が部分的にほぐれたランダムコイル状の構造になっていると推測される。
前記キャピラリー電気泳動の条件としては、内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ）、印加電圧２５ｋＶ、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）とすることで、電気泳動移動度を測定することができる。
また、電気泳動移動度を測る対象は、中性マーカーを含有する試料であればよい。中性マーカーとしては、ベンジルアルコール、シンナミルアルコール、メシチルオキシドなど、正または負の電荷を持たず、紫外部吸収性を有するものが望ましい。
例えば、キャピラリー電気泳動での電気泳動移動度は電荷／サイズ比により決まる。すなわち、電荷が同じ場合、分子の嵩高さが大きい場合に前記電気泳動移動度は小さく、嵩高さが小さい場合には前記電気泳動移動度は大きくなる。したがって、キャピラリー電気泳動を行った場合に、本発明のコラーゲン組成物の電気泳動移動度が１０．０ｃｍ２・ｍｉｎ－１・ｋＶ－１以下であれば、三重らせんの構造が部分的にほぐれたランダムコイル状の構造になっていると推測される。
前記キャピラリー電気泳動の条件としては、内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ）、印加電圧２５ｋＶ、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）とすることで、電気泳動移動度を測定することができる。
また、電気泳動移動度を測る対象は、中性マーカーを含有する試料であればよい。中性マーカーとしては、ベンジルアルコール、シンナミルアルコール、メシチルオキシドなど、正または負の電荷を持たず、紫外部吸収性を有するものが望ましい。
また、本発明のコラーゲン組成物のＣＤスペクトルが２０７～２１０ｎｍで負の極大を示し、２００ｎｍで大きく正の値を示す場合、前記コラーゲンの三重らせん構造の一部が部分的にほぐれて、ランダムコイル状の構造を有する状態に変化していると推測される。
本発明のコラーゲン組成物では、分子量９００００以上と比較的大きな分子状のコラーゲンにおいて、その三重らせん構造の一部がほぐれたランダムコイル状の構造になることによって、その部分がゼラチン様の構造となり、保湿性とともに、優れた溶解性を両立させている点で、従来の魚皮由来のコラーゲンにはない効果が奏されると考えられる。
なお、コラーゲンを分解して得られるゼラチンでは、三重らせん構造の全てがバラバラになっていると共に低分子化されている場合が多いため、特定の高次構造を持たないことからＣＤスペクトルを測定すると前記２００ｎｍで大きな正の値を示さない。
前記ＣＤスペクトルは、公知の測定装置を用いて測定できる。具体的には、後述の実施例に記載の方法で、ＣＤスペクトルを測定することができる。
本発明のコラーゲン組成物では、分子量９００００以上と比較的大きな分子状のコラーゲンにおいて、その三重らせん構造の一部がほぐれたランダムコイル状の構造になることによって、その部分がゼラチン様の構造となり、保湿性とともに、優れた溶解性を両立させている点で、従来の魚皮由来のコラーゲンにはない効果が奏されると考えられる。
なお、コラーゲンを分解して得られるゼラチンでは、三重らせん構造の全てがバラバラになっていると共に低分子化されている場合が多いため、特定の高次構造を持たないことからＣＤスペクトルを測定すると前記２００ｎｍで大きな正の値を示さない。
前記ＣＤスペクトルは、公知の測定装置を用いて測定できる。具体的には、後述の実施例に記載の方法で、ＣＤスペクトルを測定することができる。
また、本発明のコラーゲン組成物は、ヒトの肌に塗布した場合、皮膚の保湿性に優れたものである。
前記保湿性としては、例えば、肌への塗付後２０分後の肌の水分値が塗付前と比較して１．１倍以上となることが好ましく、１．３倍以上となることがより好ましい。
前記水分値の測定方法としては、皮膚水分計を用いて角層水分量を測定する。なお、具体的な測定は、後述の実施例に記載のようにすればよい。
前記保湿性としては、例えば、肌への塗付後２０分後の肌の水分値が塗付前と比較して１．１倍以上となることが好ましく、１．３倍以上となることがより好ましい。
前記水分値の測定方法としては、皮膚水分計を用いて角層水分量を測定する。なお、具体的な測定は、後述の実施例に記載のようにすればよい。
前記コラーゲンの原料である魚皮の由来となる魚の種類としては、マグロ類、ブリ類、ハタ類、タラ類、カレイ類、カツオ類、クエ類等が挙げられる。中でも、魚体が大型で、分子量９００００以上のコラーゲンを多量に含む魚皮を採り易い点、皮が厚いため処理中に魚皮が崩れにくく抽出・精製が容易などの点などから、クロマグロ、タイセイヨウクロマグロ、キハダマグロ、ミナミマグロ、メバチマグロ、ビンナガマグロ、コシナガなどのマグロ類が好ましく、更には完全養殖に成功して安定して入手し易い点から、クロマグロがより好ましい。
本発明のコラーゲン組成物には、水に対する溶解性および保湿性に影響を与えない範囲で、前記分子量９００００以上のコラーゲン以外にも他の成分が含まれていてもよい。このような他の成分としては、例えば、一部断片化されたコラーゲン分子や、脂質、糖質、他のタンパク質、ビタミン類、ｐＨ調整剤及びエタノール、パラベン類やフェノキシエタノールなどの保存料などが挙げられる。
本発明のコラーゲン組成物は、魚皮から所望の分子量のコラーゲンを効率よく抽出でき、かつ、他の成分の含有量も効率よく抑えることができる観点から、
魚皮を希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理する第一工程、
前記第一工程で希薄強酸処理した魚皮を希薄強アルカリ処理する、または前記第一工程で希薄強アルカリ処理した魚皮を希薄強酸処理する第二工程、
前記第二工程で得られた魚皮から希薄弱酸溶液を用いてコラーゲンを抽出する第三工程、および
前記第三工程で抽出したコラーゲンを限外ろ過法または平衡透析法により精製する第四工程
を有することが好ましい。
魚皮を希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理する第一工程、
前記第一工程で希薄強酸処理した魚皮を希薄強アルカリ処理する、または前記第一工程で希薄強アルカリ処理した魚皮を希薄強酸処理する第二工程、
前記第二工程で得られた魚皮から希薄弱酸溶液を用いてコラーゲンを抽出する第三工程、および
前記第三工程で抽出したコラーゲンを限外ろ過法または平衡透析法により精製する第四工程
を有することが好ましい。
前記第一工程で原料として使用する魚皮は、例えば、鱗、肉部などが付着した魚皮でもよいし、鱗、肉部などを切り離した魚皮でもよい。また、コラーゲン組成物が着色するのを防ぐ観点から、魚体の中でも着色の少ない部分、例えば、マグロ類であれば、着色の少ない腹部の魚皮が好ましい。
また、前記魚皮としては、不純タンパク質、血液、色素、油分等を物理的方法または化学的方法によって完全にまたは一部除去されものが好ましい。
前記物理的方法としては、ヘラ、ナイフ等の刃物を用いて魚体から魚皮を回収し、鱗、肉部などに加えて、血液、色素、油分が付いた他の部分を除去する方法、水圧を利用して魚皮表面についた鱗、肉部、さらに血液、色素、油分が付いた他の部分を除去する方法などが挙げられる。
前記物理的方法としては、ヘラ、ナイフ等の刃物を用いて魚体から魚皮を回収し、鱗、肉部などに加えて、血液、色素、油分が付いた他の部分を除去する方法、水圧を利用して魚皮表面についた鱗、肉部、さらに血液、色素、油分が付いた他の部分を除去する方法などが挙げられる。
前記のようにして、不純タンパク質、血液、色素、油分などを完全にまたは一部除去した魚皮を第一工程に供する。
前記第一工程では、希薄強酸処理、希薄強アルカリ処理のいずれかを行う。
前記第一工程では、希薄強酸処理、希薄強アルカリ処理のいずれかを行う。
前記希薄強酸処理は、魚皮を所定濃度の希薄強酸溶液に浸漬、噴霧などして接触させることで行う。
前記希薄強酸溶液の溶媒は、水であればよいが、エタノールなどの有機溶媒を混合していてもよい。
前記希薄強酸溶液中の強酸の種類としては、通常用いられる強酸であればよく、塩酸、硫酸、硝酸などが挙げられるが特に限定は無い。使用する強酸濃度としては、魚皮から油分を効率よく除去できる観点から、０．０１～０．５Ｎが好ましく、０．０５～０．３Ｎがより好ましく、０．１～０．２Ｎがさらに好ましい。
前記希薄強酸処理では、コラーゲンの変性を防ぎ、かつ効率的に脂質を除去する観点から、処理温度としては１５～２５℃で行うことが好ましく、また、処理時間としては１～７２時間が好ましく、３～４８時間がより好ましく、１２～３０時間がさらに好ましい。
前記希薄強酸溶液の溶媒は、水であればよいが、エタノールなどの有機溶媒を混合していてもよい。
前記希薄強酸溶液中の強酸の種類としては、通常用いられる強酸であればよく、塩酸、硫酸、硝酸などが挙げられるが特に限定は無い。使用する強酸濃度としては、魚皮から油分を効率よく除去できる観点から、０．０１～０．５Ｎが好ましく、０．０５～０．３Ｎがより好ましく、０．１～０．２Ｎがさらに好ましい。
前記希薄強酸処理では、コラーゲンの変性を防ぎ、かつ効率的に脂質を除去する観点から、処理温度としては１５～２５℃で行うことが好ましく、また、処理時間としては１～７２時間が好ましく、３～４８時間がより好ましく、１２～３０時間がさらに好ましい。
前記希薄強アルカリ処理としては、魚皮を希薄強アルカリ溶液に浸漬、噴霧などして接触させることで行う。
前記希薄強アルカリ溶液に用いるアルカリ成分としては、食品に用いられるアルカリ成分であればよく、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどが挙げられるが、特に限定はない。
前記希薄強アルカリ溶液の溶媒は、水であればよいが、エタノールなどの有機溶媒を混合していてもよい。
前記希薄強アルカリ溶液中の希薄強アルカリ濃度としては、コラーゲン以外のタンパク質成分の除去及び油分のけん化によって不純物の除去を効率よく行うとともに、テロペプチド部分の切断を効率よく行う観点から、０．０５～０．５Ｎが好ましく、０．１～０．２Ｎがより好ましい。
前記希薄強アルカリ処理では、コラーゲンの変性を防ぐために、処理温度としては、１５℃以下で行うことが好ましく、また、処理時間としては、１～７２時間が好ましく、３～４８時間がより好ましく、１２～３０時間がさらに好ましい。
前記希薄強アルカリ溶液に用いるアルカリ成分としては、食品に用いられるアルカリ成分であればよく、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどが挙げられるが、特に限定はない。
前記希薄強アルカリ溶液の溶媒は、水であればよいが、エタノールなどの有機溶媒を混合していてもよい。
前記希薄強アルカリ溶液中の希薄強アルカリ濃度としては、コラーゲン以外のタンパク質成分の除去及び油分のけん化によって不純物の除去を効率よく行うとともに、テロペプチド部分の切断を効率よく行う観点から、０．０５～０．５Ｎが好ましく、０．１～０．２Ｎがより好ましい。
前記希薄強アルカリ処理では、コラーゲンの変性を防ぐために、処理温度としては、１５℃以下で行うことが好ましく、また、処理時間としては、１～７２時間が好ましく、３～４８時間がより好ましく、１２～３０時間がさらに好ましい。
前記希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理を浸漬で行う際には、攪拌機を用いて循環させてもよい。
また、希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理後、篩を用いて魚皮をろ過した後、篩上に残った魚皮残渣を水などの溶媒に浸漬して洗浄してもよい。
また、希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理後、篩を用いて魚皮をろ過した後、篩上に残った魚皮残渣を水などの溶媒に浸漬して洗浄してもよい。
前記第二工程では、第一工程において希薄強酸処理した魚皮を希薄強アルカリ処理する、または第一工程で希薄強アルカリ処理した魚皮を希薄強酸処理する。
第二工程で行う希薄酸処理および希薄強アルカリ処理の条件については、前記第一工程で行う条件と同じであればよい。
前記第三工程では、前記第二工程で得られた魚皮から希薄弱酸溶液を用いてコラーゲンを抽出する。
前記希薄弱酸溶液に用いる酸としては、食品に用いられる酸であればよく、例えば、炭酸、リン酸などの無機酸や、酢酸、クエン酸、乳酸などの有機酸などが挙げられるが、特に限定はない。
前記希薄弱酸溶液の溶媒は、水であればよいが、エタノールなどの有機溶媒を混合していてもよい。
前記希薄弱酸溶液中の酸濃度としては、コラーゲンの酸抽出を効率よく行う観点から、０．００１～２Ｎが好ましく、０．０１～２Ｎがより好ましく、ナトリウム及びカリウム等の塩の状態で使用しても良い。
また、前記希薄弱酸溶液によるコラーゲンの抽出は、４～５０℃、好ましくは３０～４０℃、より好ましくは３５～３７℃の温度条件下で、１～４８時間、好ましくは３～３０時間、撹拌することにより行うことが望ましい。
前記希薄弱酸溶液に用いる酸としては、食品に用いられる酸であればよく、例えば、炭酸、リン酸などの無機酸や、酢酸、クエン酸、乳酸などの有機酸などが挙げられるが、特に限定はない。
前記希薄弱酸溶液の溶媒は、水であればよいが、エタノールなどの有機溶媒を混合していてもよい。
前記希薄弱酸溶液中の酸濃度としては、コラーゲンの酸抽出を効率よく行う観点から、０．００１～２Ｎが好ましく、０．０１～２Ｎがより好ましく、ナトリウム及びカリウム等の塩の状態で使用しても良い。
また、前記希薄弱酸溶液によるコラーゲンの抽出は、４～５０℃、好ましくは３０～４０℃、より好ましくは３５～３７℃の温度条件下で、１～４８時間、好ましくは３～３０時間、撹拌することにより行うことが望ましい。
また、第三工程で抽出されたコラーゲンに不溶分が残存している場合には、コラーゲンを含む溶液（コラーゲン溶液）を濾過法、遠心分離法などに供して不溶分を除去することが好ましい。
前記第三工程で得られたコラーゲン組成物は、希薄弱酸溶液に溶解しているので、そのままでも使用可能であるが、さらに精製するのが好ましい。
すなわち、限外ろ過膜や透析膜を使用して限外ろ過や平衡透析を行うことで抽出用の希薄弱酸溶液を含め、適当な弱酸溶液または緩衝液に置換すると同時に、低分子のペプチド、アミノ酸等の水溶性化合物を除去してもよい。
前記限外ろ過膜または透析膜としては、分子量９００００以上のコラーゲンを分画できるものであればよく、例えば、分画分子量３００００（ＭＷＣＯ３００００）以上の膜、好ましくはＭＷＣＯ１０００００、より好ましくはＭＷＣＯ１５００００の膜が挙げられるが、特に限定はない。
すなわち、限外ろ過膜や透析膜を使用して限外ろ過や平衡透析を行うことで抽出用の希薄弱酸溶液を含め、適当な弱酸溶液または緩衝液に置換すると同時に、低分子のペプチド、アミノ酸等の水溶性化合物を除去してもよい。
前記限外ろ過膜または透析膜としては、分子量９００００以上のコラーゲンを分画できるものであればよく、例えば、分画分子量３００００（ＭＷＣＯ３００００）以上の膜、好ましくはＭＷＣＯ１０００００、より好ましくはＭＷＣＯ１５００００の膜が挙げられるが、特に限定はない。
使用する前記弱酸溶液および緩衝液はｐＨ３～６で緩衝能を有する弱酸溶液または緩衝液であればどの弱酸溶液および緩衝液であっても使用可能であるが、経済性、安全性等から考えて、クエン酸、酢酸、リン酸の溶液、これらのナトリウム塩、カリウム塩との混合液を使用することが好ましい。
また、コラーゲン溶液中に分散している油分その他の不純物を除去するため、細口径のメンブレンフィルターにてろ過してもよい。
前記メンブレンフィルターの口径としては、１．０マイクロメートル以下のものであればよく、特に限定はない。
前記メンブレンフィルターの口径としては、１．０マイクロメートル以下のものであればよく、特に限定はない。
前記の溶液状のコラーゲン組成物は、凍結乾燥法、スプレードライ法などの乾燥法により乾燥物にすることも可能である。
凍結乾燥法およびスプレードライ法については、コラーゲン組成物の水に対する溶解性および保湿性に影響を与えない範囲で、公知の手法を用いればよい。
凍結乾燥法およびスプレードライ法については、コラーゲン組成物の水に対する溶解性および保湿性に影響を与えない範囲で、公知の手法を用いればよい。
以上のようにして得られる本発明のコラーゲン組成物は、医薬品、医療用具、医薬部外品、化粧品、食品などに好適に使用することが可能である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら制限されるものではない。
（実施例１）
クロマグロ皮の赤身部分のみをヘラでそぎ落としたのち、１辺が２～３ｃｍの正方形になるように切断した。この断片を１ｋｇ量り採り、１０Ｌの０．１Ｎの希塩酸溶液に２０℃で２４時間浸漬した（第一工程）。希塩酸溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩を用いてろ過した後、魚皮残渣を５Ｌの水に緩やかに攪拌しながら浸漬した。
再度篩にてろ過し、残渣を０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に室温で２４時間浸漬した。水酸化ナトリウム溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた（第二工程）。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩を用いてろ過した後、魚皮残渣を５Ｌの水に緩やかに攪拌しながら浸漬した。
再度篩にてろ過し、３７℃に調整した０．１Ｎの酢酸溶液に３時間浸漬した（第三工程）。酢酸溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩にてろ過した後、ろ液をフィルターろ過し、限外ろ過（ＭＷＣＯ１５００００、商品名「FB02-FC-FUS1582」、ダイセン・メンブレン・システムズ）にて、ろ液容量の５倍量のクエン酸緩衝液（０．３％クエン酸、０．０５％クエン酸ナトリウム）にて溶液置換した（第四工程）。
溶液置換終了後、メンブレンフィルター（０．２μｍφ）にてろ過滅菌し、コラーゲン組成物を得た。
クロマグロ皮の赤身部分のみをヘラでそぎ落としたのち、１辺が２～３ｃｍの正方形になるように切断した。この断片を１ｋｇ量り採り、１０Ｌの０．１Ｎの希塩酸溶液に２０℃で２４時間浸漬した（第一工程）。希塩酸溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩を用いてろ過した後、魚皮残渣を５Ｌの水に緩やかに攪拌しながら浸漬した。
再度篩にてろ過し、残渣を０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に室温で２４時間浸漬した。水酸化ナトリウム溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた（第二工程）。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩を用いてろ過した後、魚皮残渣を５Ｌの水に緩やかに攪拌しながら浸漬した。
再度篩にてろ過し、３７℃に調整した０．１Ｎの酢酸溶液に３時間浸漬した（第三工程）。酢酸溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩にてろ過した後、ろ液をフィルターろ過し、限外ろ過（ＭＷＣＯ１５００００、商品名「FB02-FC-FUS1582」、ダイセン・メンブレン・システムズ）にて、ろ液容量の５倍量のクエン酸緩衝液（０．３％クエン酸、０．０５％クエン酸ナトリウム）にて溶液置換した（第四工程）。
溶液置換終了後、メンブレンフィルター（０．２μｍφ）にてろ過滅菌し、コラーゲン組成物を得た。
得られた液体状のコラーゲン組成物中におけるコラーゲンの濃度をＢＣＡ法でフィッシュゼラチンをスタンダードとして測定したところ０．４％となった。
（実施例２）
クロマグロ皮の赤身部分のみをヘラでそぎ落としたのち、１辺が２～３ｃｍの正方形になるように切断した。この断片を１ｋｇ量り採り、１０Ｌの０．１Ｎの希塩酸溶液に２０℃で２４時間浸漬した（第一工程）。希塩酸溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩を用いてろ過した後、魚皮残渣を５Ｌの水に緩やかに攪拌しながら浸漬した。
再度篩にてろ過し、残渣を０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に室温で２４時間浸漬した。水酸化ナトリウム溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた（第二工程）。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩を用いてろ過した後、魚皮残渣を５Ｌの水に緩やかに攪拌しながら浸漬した。
再度篩にてろ過し、３７℃に調整した０．１Ｎの酢酸溶液に３時間浸漬した（第三工程）。酢酸溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩にてろ過した後、ろ液をフィルターろ過し、限外ろ過（ＭＷＣＯ１０００００、スペクトラム）にて、ろ液容量の５０倍量のクエン酸緩衝液（０．３％クエン酸、０．０５％クエン酸ナトリウム）にて溶液置換した（第四工程）。
溶液置換終了後、メンブレンフィルター（０．２μｍφ）にてろ過滅菌し、コラーゲン組成物を得た。
クロマグロ皮の赤身部分のみをヘラでそぎ落としたのち、１辺が２～３ｃｍの正方形になるように切断した。この断片を１ｋｇ量り採り、１０Ｌの０．１Ｎの希塩酸溶液に２０℃で２４時間浸漬した（第一工程）。希塩酸溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩を用いてろ過した後、魚皮残渣を５Ｌの水に緩やかに攪拌しながら浸漬した。
再度篩にてろ過し、残渣を０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に室温で２４時間浸漬した。水酸化ナトリウム溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた（第二工程）。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩を用いてろ過した後、魚皮残渣を５Ｌの水に緩やかに攪拌しながら浸漬した。
再度篩にてろ過し、３７℃に調整した０．１Ｎの酢酸溶液に３時間浸漬した（第三工程）。酢酸溶液は攪拌機を用いて緩やかに循環させた。
浸漬終了後、ポリプロピレン製の篩にてろ過した後、ろ液をフィルターろ過し、限外ろ過（ＭＷＣＯ１０００００、スペクトラム）にて、ろ液容量の５０倍量のクエン酸緩衝液（０．３％クエン酸、０．０５％クエン酸ナトリウム）にて溶液置換した（第四工程）。
溶液置換終了後、メンブレンフィルター（０．２μｍφ）にてろ過滅菌し、コラーゲン組成物を得た。
得られた液体状のコラーゲン組成物中におけるコラーゲンの濃度をＢＣＡ法でフィッシュゼラチンをスタンダードとして測定したところ０．１％となった。
（実施例３）
実施例１で得られたコラーゲン組成物を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったのち、コマシーブリリアントブルーＲ２５０でタンパク質バンドを検出した。これらの結果を図１に示す。
なお、図１ではレーン１が実施例１で得られたコラーゲン組成物を２－メルカプトエタノール存在下加熱条件（９５℃、１０分間）で前処理した試料、レーン２は実施例１で得られたコラーゲン組成物を２－メルカプトエタノール非存在下非加熱条件で前処理した試料を示す。
実施例１で得られたコラーゲン組成物を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったのち、コマシーブリリアントブルーＲ２５０でタンパク質バンドを検出した。これらの結果を図１に示す。
なお、図１ではレーン１が実施例１で得られたコラーゲン組成物を２－メルカプトエタノール存在下加熱条件（９５℃、１０分間）で前処理した試料、レーン２は実施例１で得られたコラーゲン組成物を２－メルカプトエタノール非存在下非加熱条件で前処理した試料を示す。
図１に示す結果より、コラーゲンのα１鎖、α２鎖、β鎖、γ鎖を示すバンドが確認され、コラーゲン溶液が得られていることが確認できる（レーン１）。さらに、レーン２の２－メルカプトエタノール非存在下非加熱で前処理した試料では、レーン１に比べて更に明瞭なα１鎖、α２鎖、β鎖、γ鎖を示すバンドが観察されており、高純度なコラーゲン溶液が得られていることが確認できる。なお、β鎖とはα１鎖が２本組になった２量体であり、γ鎖とはβ鎖とα２鎖の３量体である。
また、バンドの状態をＷｅａｌｔｅｃ社製ＫＥＴＡ Ｍ 解析装置を用いて測定したところ、コラーゲン組成物中において、分子量９００００以上のコラーゲン含量は、固形分として、タンパク質量に対して８５％と算出された。
また、バンドの状態をＷｅａｌｔｅｃ社製ＫＥＴＡ Ｍ 解析装置を用いて測定したところ、コラーゲン組成物中において、分子量９００００以上のコラーゲン含量は、固形分として、タンパク質量に対して８５％と算出された。
（実施例３）
実施例１で得られたコラーゲン組成物の溶解性を検討した。
実施例１で得られたコラーゲン組成物を凍結乾燥することにより、２９．６ｇのコラーゲン乾燥物が得られた。コラーゲン乾燥物４００ｍｇ（コラーゲンとして２１１ｍｇを含有する）に１ｍＬの常温の水を加え、固形分濃度が２０％のコラーゲン溶液を得た。
一方、キハダマグロ由来の市販コラーゲンの凍結乾燥物（シージェムコラーゲン、以下、比較品１）４５０ｍｇ（コラーゲンとして２１２ｍｇ含有）にそれぞれ１ｍＬの水を加え、軽く攪拌しながら室温で５分間放置した。これらの結果を図２に示す。
なお、前記比較品１中におけるコラーゲンの含量は、固形分として、タンパク質中約９０％であった。
実施例１で得られたコラーゲン組成物の溶解性を検討した。
実施例１で得られたコラーゲン組成物を凍結乾燥することにより、２９．６ｇのコラーゲン乾燥物が得られた。コラーゲン乾燥物４００ｍｇ（コラーゲンとして２１１ｍｇを含有する）に１ｍＬの常温の水を加え、固形分濃度が２０％のコラーゲン溶液を得た。
一方、キハダマグロ由来の市販コラーゲンの凍結乾燥物（シージェムコラーゲン、以下、比較品１）４５０ｍｇ（コラーゲンとして２１２ｍｇ含有）にそれぞれ１ｍＬの水を加え、軽く攪拌しながら室温で５分間放置した。これらの結果を図２に示す。
なお、前記比較品１中におけるコラーゲンの含量は、固形分として、タンパク質中約９０％であった。
図２に示すように、実施例１で得られたコラーゲン組成物の凍結乾燥物は、５分間で水（２５℃）に完全に溶解し、２０％（ｗ/ｖ）の溶液が容易に調製されたことから、水（２５℃）に対する溶解度は２１．１％以上あり、非常に高いことが分かる。
一方、比較品１は、完全には溶解しないで残渣があったことから、水（２５℃）に対する溶解度は、実施例１で得られたコラーゲン組成物に比べると顕著に劣ることがわかる。
一方、比較品１は、完全には溶解しないで残渣があったことから、水（２５℃）に対する溶解度は、実施例１で得られたコラーゲン組成物に比べると顕著に劣ることがわかる。
（実施例４）
実施例１で得られたコラーゲン組成物の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを測定した。
実施例１で得られたコラーゲン組成物を０．３％クエン酸－０．０５％クエン酸二ナトリウム溶液で０．００３ｍｇ／ｍＬに希釈し、光路長１ｍｍのセルを用いて、日本分光株式会社製 円二色性分散計「J-８２０」を用いて１０℃における円偏光二色性スペクトルを分析した。
一方、キハダマグロ由来の市販コラーゲンの凍結乾燥物（比較品１）およびフィッシュゼラチン（「FGL-250TS」 新田ゼラチン社製、以下、比較品２）を用いて、０．３％クエン酸－０．０５％クエン酸二ナトリウム溶液で固形分濃度が０．００３ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、同様に円偏光二色性スペクトルを分析した。これらの結果を図３に示す。
なお、図中、「本発明品」は、実施例１で得られたコラーゲン組成物を示す。
実施例１で得られたコラーゲン組成物の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを測定した。
実施例１で得られたコラーゲン組成物を０．３％クエン酸－０．０５％クエン酸二ナトリウム溶液で０．００３ｍｇ／ｍＬに希釈し、光路長１ｍｍのセルを用いて、日本分光株式会社製 円二色性分散計「J-８２０」を用いて１０℃における円偏光二色性スペクトルを分析した。
一方、キハダマグロ由来の市販コラーゲンの凍結乾燥物（比較品１）およびフィッシュゼラチン（「FGL-250TS」 新田ゼラチン社製、以下、比較品２）を用いて、０．３％クエン酸－０．０５％クエン酸二ナトリウム溶液で固形分濃度が０．００３ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、同様に円偏光二色性スペクトルを分析した。これらの結果を図３に示す。
なお、図中、「本発明品」は、実施例１で得られたコラーゲン組成物を示す。
図３に示す結果より、実施例１で得られたコラーゲン組成物は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルが２０７～２１０ｎｍで負の極大を示し、２００ｎｍで正の値を示すことがわかる（図３の上図）。
一方、比較品１は、ＣＤスペクトルが２０７ｎｍ未満で負の極大を示しており（図３の中図）、また比較品２のフィッシュゼラチンは、ＣＤスペクトルが、２００ｎｍで負の値を示しているため（図３の下図）、コラーゲン分子の構造が実施例１で得られたコラーゲン組成物中のコラーゲンと相違していることが分かる。
一方、比較品１は、ＣＤスペクトルが２０７ｎｍ未満で負の極大を示しており（図３の中図）、また比較品２のフィッシュゼラチンは、ＣＤスペクトルが、２００ｎｍで負の値を示しているため（図３の下図）、コラーゲン分子の構造が実施例１で得られたコラーゲン組成物中のコラーゲンと相違していることが分かる。
（実施例５）
実施例１で得られたコラーゲン組成物（以下、本発明品）および比較品１の保湿効果を検証のために、角層水分量を指標とした保湿試験を行った。
前腕部をドライヤーの冷風にて１分間乾燥させ、携帯型皮膚水分計モバイルモイスチャーＨＰ１０－Ｎにて角層水分量を測定した（ベースライン）。
５５ｍｍろ紙に１％コラーゲンサンプル（本発明品、比較品１またはコントロール（蒸留水）を染み込ませ、前腕部の乾燥処理した部分に５分間貼り付けた。
ろ紙を除去して１分間風乾し、角層水分量を測定した（塗布直後）。
その後、冷風にて乾燥させながら２分後、５分後、１０分後、２０分後にそれぞれ前記携帯型皮膚水分計を用いて角層水分量を測定した。これらの結果を図４に示す。
実施例１で得られたコラーゲン組成物（以下、本発明品）および比較品１の保湿効果を検証のために、角層水分量を指標とした保湿試験を行った。
前腕部をドライヤーの冷風にて１分間乾燥させ、携帯型皮膚水分計モバイルモイスチャーＨＰ１０－Ｎにて角層水分量を測定した（ベースライン）。
５５ｍｍろ紙に１％コラーゲンサンプル（本発明品、比較品１またはコントロール（蒸留水）を染み込ませ、前腕部の乾燥処理した部分に５分間貼り付けた。
ろ紙を除去して１分間風乾し、角層水分量を測定した（塗布直後）。
その後、冷風にて乾燥させながら２分後、５分後、１０分後、２０分後にそれぞれ前記携帯型皮膚水分計を用いて角層水分量を測定した。これらの結果を図４に示す。
図４に示す結果より、本発明品は、肌への塗付後２０分後の肌の水分値が塗付前と比較して１．３倍以上であり、また、比較品１に比べて塗布後時間が経過するごとに角層水分量の低減が抑えられていることから、保湿性に優れていることがわかる。
一方、比較品１は、肌への塗布後２０分後の肌の水分値が塗布前と同程度になったことから、保湿効果は２０分程度でなくなることがわかる。
一方、比較品１は、肌への塗布後２０分後の肌の水分値が塗布前と同程度になったことから、保湿効果は２０分程度でなくなることがわかる。
（実施例６）
実施例１および２で得られたコラーゲン組成物（以下、本発明品）ならびに比較品１をキャピラリー電気泳動によって分析し、以下の式により電気泳動移動度（μｅｐ）を算出した。その結果を表１に示す。なお、表中、「t-0」は中性物質の移動時間を示し、「t-Protein」は、標的タンパク質の移動時間を示す。
電気泳動移動度（μｅｐ）（ｃｍ２ｍｉｎ－１ｋＶ－１）
＝キャピラリー全長（ｃｍ) x キャピラリー有効長 (ｃｍ) x （(中性物質の移動時間(ｍｉｎ)）－１－（試料の移動時間(ｍｉｎ)）－１)／印加電圧(ｋＶ)
実施例１および２で得られたコラーゲン組成物（以下、本発明品）ならびに比較品１をキャピラリー電気泳動によって分析し、以下の式により電気泳動移動度（μｅｐ）を算出した。その結果を表１に示す。なお、表中、「t-0」は中性物質の移動時間を示し、「t-Protein」は、標的タンパク質の移動時間を示す。
電気泳動移動度（μｅｐ）（ｃｍ２ｍｉｎ－１ｋＶ－１）
＝キャピラリー全長（ｃｍ) x キャピラリー有効長 (ｃｍ) x （(中性物質の移動時間(ｍｉｎ)）－１－（試料の移動時間(ｍｉｎ)）－１)／印加電圧(ｋＶ)
また、キャピラリー電気泳動の条件は、以下のとおり。
キャピラリー電気泳動装置：大塚電子製「CAPI-3100」
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（ジーエルサイエンス社製、内径５０μｍ、長さ６２．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
試料注入：落差法（２．５ｃｍｘ３０秒）
印加電圧：２５ｋＶ
検出波長：２００ｎｍ
泳動液：５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
キャピラリー電気泳動装置：大塚電子製「CAPI-3100」
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（ジーエルサイエンス社製、内径５０μｍ、長さ６２．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
試料注入：落差法（２．５ｃｍｘ３０秒）
印加電圧：２５ｋＶ
検出波長：２００ｎｍ
泳動液：５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
表１に示す結果より本発明品の電気泳動移動度はいずれも、１０．０ｃｍ２・ｍｉｎ－１・ｋＶ－１以下であり、比較品１の電気泳動移動度（１５．５８ｃｍ２・ｍｉｎ－１・ｋＶ－１）と比較して有意に小さいことがわかる。
したがって、本発明のコラーゲン組成物中のコラーゲンは、市販コラーゲンと比べると、嵩高い構造を有していることが分かる。
したがって、本発明のコラーゲン組成物中のコラーゲンは、市販コラーゲンと比べると、嵩高い構造を有していることが分かる。
Claims (6)
- 魚皮由来のコラーゲンを主成分とするコラーゲン組成物であって、
分子量９００００以上のコラーゲン含量が固形分でタンパク質量に対して７０％以上であり、水（２５℃）対する溶解度が１０％以上であり、非還元非加熱条件での電気泳動においてα鎖、β鎖およびγ鎖を示すバンドが観察されるコラーゲン組成物。 - 内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２．５ｃｍ、有効長５０ｃｍ）、印加電圧２５ｋＶ、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）でのキャピラリー電気泳動において、電気泳動移動度(μｅｐ)として１０．０ｃｍ２・ｍｉｎ－１・ｋＶ－１以下を示す請求項１に記載のコラーゲン組成物。
- 肌への塗付後２０分後の肌の水分値が塗付前と比較して１．１倍以上である保湿性を有する請求項１または２に記載のコラーゲン組成物。
- 円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルが２０７～２１０ｎｍで負の極大を示し、２００ｎｍで正の値を示す請求項１～３のいずれかに記載のコラーゲン組成物。
- 魚皮の由来がマグロ類である請求項１～４のいずれかに記載のコラーゲン組成物。
- 魚皮を希薄強酸処理または希薄強アルカリ処理する第一工程、
前記第一工程で希薄強酸処理した魚皮を希薄強アルカリ処理する、または前記第一工程で希薄強アルカリ処理した魚皮を希薄強酸処理する第二工程、
前記第二工程で得られた魚皮から希薄弱酸溶液を用いてコラーゲンを抽出する第三工程、および
前記第三工程で抽出したコラーゲンを限外ろ過法または平衡透析法により精製する第四工程
を含む請求項１～５のいずれかに記載のコラーゲン組成物の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2018066595A1 true WO2018066595A1 (ja) | 2018-04-12 |
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ID=61831820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5685416A (en) * | 1979-11-19 | 1981-07-11 | Seton Co | Production of soluble collagen fiber |
| JPH03209395A (ja) * | 1988-08-04 | 1991-09-12 | Univ Bar Ilan | 魚皮からのゼラチンの製造方法 |
| WO2002094959A1 (en) * | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Croda International Plc | Improved alkaline process for preparing type b fish gelatin |
| JP2005053847A (ja) * | 2003-08-05 | 2005-03-03 | Ihara Suisan Kk | 魚類真皮コラーゲン含有組成物の製造方法、魚類真皮コラーゲン含有組成物及びその組成物を用いた成形体 |
| CN101628938A (zh) * | 2009-08-12 | 2010-01-20 | 江苏省海洋资源开发研究院 | 大分子胶原蛋白提取工艺 |
| JP2012136496A (ja) * | 2010-12-10 | 2012-07-19 | Nitto Denko Corp | シート状製剤及びシート状製剤の製造方法 |
-
2016
- 2016-10-05 JP JP2016197245A patent/JP6999890B2/ja active Active
-
2017
- 2017-10-04 WO PCT/JP2017/036110 patent/WO2018066595A1/ja active Application Filing
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