KR20220063514A - 고분자량의 아텔로콜라겐 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 여과조제를 이용하여 아텔로콜라겐을 제조함으로써, 콜라겐 체내 주사시 면역 거부반응이 발생하지 않을 뿐만 아니라 화장료로도 이용할 수 있는 아텔로콜라겐 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 여과조제를 이용하여 제조한 아텔로 콜라겐 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
우리의 몸은 다양한 기관으로 이루어져 있는데, 그중 피부와 혈관, 뼈, 치아 근육 등을 결합조직이라고 칭하고, 상기 결합조직의 주된 단백질 성분이 콜라겐이다.
노화가 시작되기 전에는 우리의 몸 내에 콜라겐의 양이 충분하고, 손실되더라도 빠르게 재상되어 언제나 탄력있는 피부를 유지할 수 있다. 그러나, 노화가 진행되기 시작하면 콜라겐의 손실량 대비 생성량이 감소하여 피부의 탄력을 잃게 된다.
이에 따라 콜라겐을 돼지, 소, 어류, 인간의 태반 등에서 추출하는 노력이 이어지고 있는데, 일예로 대한민국 공개특허 제1998-0012234 호에서는 인간의 태반으로부터 콜라겐을 추출하는 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나, 이렇게 추출한 콜라겐을 체내에 바로 주사할 경우 항원으로 인식되어 알레르기 반응을 유발하게 되는 문제점이 있어 이에 대한 연구가 시급한 실정이다.
본 발명은 여과조제를 이용하여 콜라겐 근육 주사제 및 화장료 등에 이용할 수 있고, 콜라겐 주사시 면역 거부 반응을 일으키는 텔로펩티드를 제거한 고분자량의 아텔로콜라겐 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 아텔로콜라겐의 제조방법은 콜라겐을 포함하는 콜라겐 조추출 부유액을 제조하는 1단계; 상기 콜라겐 조추출 부유액에 여과조제를 가하고, 흡인여과하여 조추출액을 제조하는 2단계; 상기 조추출액에 염화나트륨 용액 및 여과조제를 차례로 가하고 흡인여과시켜 염석(Salting out)콜라겐을 제조하는 3단계; 상기 염석콜라겐에 초산을 가하여 콜라겐 초산용액을 수득하는 4단계; 상기 콜라겐 초산용액으로부터 콜라겐 인산용액을 수득하는 5단계; 및 상기 콜라겐 인산용액으로부터 아텔로콜라겐(Atelo collagen)을 제조하는 6단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 콜라겐 조추출 부유액은 돈피(pig skin)에 초산 혼합액을 투입 및 혼합시킨 뒤 저온에서 18 ~ 32시간 동안 방치시키는 1-1단계; 상기 1-1단계를 수행한 돈피로부터 진피를 취하는 1-2단계; 상기 진피에 초산 혼합액을 가하고 교반하여 균질물을 만드는 1-3단계; 상기 균질물에 초산을 가하고 교반하는 1-4단계; 및 상기 1-4단계를 수행한 균질물에 펩신 효소액을 가하고 저속 교반하여 부유액을 제조하는 1-5단계;를 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 펩신 효소액은 상기 돈피 1L 당 0.5 ~ 1.5L의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 1-1단계 및 1-3단계의 초산 혼합액은 0.05 ~ 0.2% 과초산; 및 0.3 ~ 0.8M 초산; 및 잔량의 증류수를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 2단계의 여과조제는 상기 콜라겐 조추출 부유액 1L 당 5 ~ 15g의 비율로 투입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 3단계의 여과조제는 상기 조추출액 1L 당 7 ~ 13g의 비율로 투입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 3단계의 초산은 상기 염석 콜라겐 1kg 당 3 ~ 7L의 비율로 투입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 5단계는 상기 콜라겐 초산용액에 염화나트륨 용액을 가한 용액을 저속교반하는 5-1단계; 상기 용액을 원심분리하여 콜라겐 펠렛을 수득하는 5-2단계; 및 상기 콜라겐 펠렛에 인산완충액을 가하고 원심세척하는 공정을 1 ~ 5회 반복하는 5-3단계; 상기 5-3단계를 수행한 콜라겐 펠렛에 에탄올을 가하여 원심세척하고, 인산완충액을 가하여 콜라겐 인산용액을 수득하는 5-4단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 6단계는 상기 콜라겐 인산용액을 세파덱스 컬럼(Sephadex column)에 대하여 5 ~ 10부피%로 주입하는 6-1단계; 및상기 6-1단계를 수행한 세파덱스 컬럼을 인산완충액으로 전개시켜 아텔로콜라겐을 수득하는 6-2단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적으로, 상기한 제조방법으로부터 고분자량의 아텔로콜라겐을 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로써, 상기 아텔로콜라겐은 분자량(Molecular mass)이 28,000 ~ 40,000Da(달톤)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적으로, 상기 아텔로콜라겐으로부터 콜라겐 근육 주사제를 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적으로, 상기 아텔로콜라겐으로부터 화장료를 제조할 수 있다.
본 발명을 통해 체내 주사시 면역 거부반응이 발생하지 않아, 근육 주사제 및 화장품 등에 이용될 수 있는 고분자량의 아텔로콜라겐 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법을 통해 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 콜라겐을 포함하는 콜라겐 조추출 부유액을 제조하는 1단계; 상기 콜라겐 조추출 부유액에 여과조제를 가하고, 흡인여과하여 콜라겐 조추출액을 제조하는 2단계; 상기 콜라켄 조추출액에 염화나트륨 용액 및 여과조제를 차례대로 가한 후, 흡인여과시켜 염석(Salting out)콜라겐을 제조하는 3단계; 상기 염석콜라겐에 초산을 가하여 콜라겐 초산용액을 수득하는 4단계; 상기 콜라겐 초산용액으로부터 콜라겐 인산용액을 수득하는 5단계; 및 상기 콜라겐 인산용액으로부터 아텔로콜라겐(Atelo collagen)을 제조하는 6단계;를 포함할 수 있다.
먼저, 1단계의 콜라겐 조추출 부유액은 돈피(pig skin)에 초산 혼합액을 투입 및 혼합시킨 뒤 저온에서 방치시키는 1-1단계; 상기 1-1단계를 수행한 돈피로부터 진피를 취하는 1-2단계; 상기 진피에 초산 혼합액을 가하고 교반하여 균질물을 만드는 1-3단계; 상기 균질물에 초산을 가하고 교반하는 1-4단계; 및 상기 1-4단계를 수행한 균질물에 펩신 효소액을 가하고 저속 교반하여 콜라겐 조추출 부유액을 제조하는 1-5단계;를 포함하여 제조할 수 있다.
상세하게는, 상기 1-1단계의 초산 혼합액은 과초산, 초산 및 증류수를 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.05 ~ 0.2% 과초산; 0.3 ~ 0.8M 초산; 및 잔량의 증류수를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.08 ~ 0.17% 과초산; 0.4 ~ 0.7M 초산; 및 잔량의 증류수를 포함할 수 있다.
한편, 상기 1-1단계의 저온 방치는 18 ~ 32시간 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 22 ~ 28시간 동안 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 1-3단계의 초산 혼합액은 상기 돈피 1kg 당 3 ~ 7L의 비율로 투입할 수 있고, 바람직하게는 1kg 당 4 ~ 6L의 비율로 투입할 수 있다.
이때, 상기 초산 혼합액은 과초산, 초산 및 증류수를 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.05 ~ 0.2% 과초산; 0.3 ~ 0.8M 초산; 및 잔량의 증류수를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.08 ~ 0.17% 과초산; 0.4 ~ 0.7M 초산; 및 잔량의 증류수를 포함할 수 있다.
한편, 상기 1-3단계의 교반은 20 ~ 40분 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 25 ~ 35분 동안 수행할 수 있다.
또한, 상기 교반은 미트그라인더(Meat grinder) 및 워링블랜더(Waring blender)를 통해 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 1-4단계의 초산은 상기 균질물 1L 당 7 ~ 11L의 비율로 투입할 수 있고, 바람직하게는 8 ~ 10L의 비율로 투입할 수 있다.
한편, 상기 1-4단계의 교반은 전동 교반기를 통해 20 ~ 40분 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 25 ~ 35분 동안 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 1-5단계의 펩신 효소액은 상기 돈피 1L당 0.5 ~ 1.5L의 비율로 가할 수 있고, 바람직하게는 0.7 ~ 1.3L의 비율로 가할 수 있다.
또한, 상기 펩신 효소액은 0.8 ~ 1.2중량%의 농도로 희석된 것일 수 있고, 바람직하게는 0.9 ~ 1.1중량%의 농도로 희석된 것일 수 있다.
한편, 상기 1-5단계의 저속 교반은 8 ~ 16시간 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 10 ~ 14시간 동안 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 2단계의 여과조제는 상기 부유액 1L 당 5 ~ 15g의 비율로 투입할 수 있고, 바람직하게는 7 ~ 13g의 비율로 투입할 수 있다.
한편, 상기 2단계의 흡인여과를 통해 불용성의 물질을 흡착 제거함으로써 투명한 형상의 조추출액을 제조할 수 있다.
다음으로, 상기 3단계의 염화나트륨 용액은 상기 조추출액 100 부피비에 대하여 130 ~ 220 부피비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 150 ~ 200 부피비로 포함할 수 있다.
또한, 상기 염화나트륨 용액의 농도는 3 ~ 7M일 수 있고, 바람직하게는 4 ~ 6M일 수 있다.
다음으로, 상기 3단계의 여과조제는 상기 조추출액 1L 당 7 ~ 13g의 비율로 투입할 수 있고, 바람직하게는 9 ~ 12g의 비율로 투입할 수 있다.
또한, 상기 여과조제를 투입한 뒤, 5 ~ 15분 동안 저속교반 수행할 수 있고, 바람직하게는 7 ~ 13분 동안 저속교반 수행할 수 있다.
한편, 4단계를 수행하기 전에 상기 염석콜라겐에 차가운 에탄올을 가하여 잔존 지방을 제거할 수 있다.
다음으로, 상기 4단계의 초산은 상기 염석콜라겐 1kg 당 3 ~ 7L의 비율로 투입할 수 있고, 바람직하게는 4 ~ 6L의 비율로 투입할 수 있다.
이때, 상기 초산의 농도는 0.3 ~ 0.7M일 수 있고, 바람직하게는 0.4 ~ 0.6M일 수 있다.
다음으로, 상기 5단계는 상기 콜라겐 초산용액에 염화나트륨 용액을 혼합 및 저속 교반한 후, 원심분리하여 콜라겐 펠렛을 수득하는 5-1단계; 및 상기 콜라겐 펠렛에 인산완충액을 가한 후, 원심세척하는 공정을 1 ~ 5회 반복 수행하는 5-2단계; 및 상기 5-2단계를 수행한 콜라겐 펠렛에 에탄올을 혼합한 다음 정치시켜서 부유액을 수득한 다음 부유액을 원심분리하여 펠렛을 회수하는 5-3단계; 및회수한 펠렛과 인산완충액을 혼합 및 교반하여 콜라겐 인산용액을 수득하는 5-4단계;를 포함할 수 있다.
상세하게는, 상기 5-1단계의 염화나트륨 용액은 상기 콜라겐 초산용액 100 부피비에 대하여 130 ~ 220 부피비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 150 ~ 200 부피비로 포함할 수 있다.
또한, 상기 염화나트륨 용액의 농도는 3 ~ 7M일 수 있고, 바람직하게는 4 ~ 6M일 수 있다.
다음으로, 상기 5-2단계의 원심분리는 0 ~ 20℃ 하에서 6,000 ~ 10,000rpm의 회전속도로 20 ~ 40분 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 5 ~ 15℃ 하에서 7,000 ~ 9,000rpm의 회전속도로 25 ~ 35분 동안 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 5-3단계의 인산완충액은 pH가 3.5 ~ 5.5일 수 있고, 바람직하게는 3.8 ~ 5.2일 수 있다.
또한, 상기 인산완충액의 농도는 0.05 ~ 0.15M일 수 있고, 바람직하게는 0.8 ~ 1.2M일 수 있다.
한편, 상기 5-3단계는 1 ~ 5회 반복 수행할 수 있고, 바람직하게는 2 ~ 4회 반복 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 5-4단계의 인산완충액은 pH가 1.0 ~ 3.0일 수 있고, 바람직하게는 1.5 ~ 2.5일 수 있다.
또한, 상기 인산완충액의 농도는 0.05 ~ 0.15M일 수 있고, 바람직하게는 0.8 ~ 1.2M일 수 있다.
다음으로, 상기 6단계는 상기 콜라겐 인산용액을 세파덱스 컬럼(Sephadex column)에 주입하는 6-1단계; 및 상기 6-1단계를 수행한 세파덱스 컬럼을 인산완충액으로 전개시켜 아텔로콜라겐을 수득하는 6-2단계;를 포함할 수 있다.
상세하게는, 상기 6-1단계의 콜라겐 인산용액은 상기 세파덱스 컬럼에 대하여 5 ~ 10부피%로 주입할 수 있고, 바람직하게는 6 ~ 9부피%로 주입할 수 있다.
또한, 상기 세파덱스 컬럼은 5 ~ 15mM 농도의 인산완충액을 평형화시킨 것일 수 있고, 바람직하게는 7 ~ 13mM 농도의 인산완충액을 평형화시킨 것일 수 있다.
다음으로, 상기 6-2단계의 인산완충액의 농도는 5 ~ 15mM일 수 있고, 바람직하게는 7 ~ 13mM일 수 있다.
상기한 방법으로 제조한 고분자량의 아텔로콜라겐은 분자량(Molecular mass)이 28,000 ~ 40,000Da(달톤)일 수 있고, 바람직하게는 28,500 ~ 38,000Da일 수 있다.
한편, 상기 고분자량의 아텔로콜라겐은 의약품, 화장품 등에 사용될 수 있으며, 바람직한 일예로 콜라겐 근육 주사제, 마스크팩 원액 및 에센스 원액 등에 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한을 두는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적으로, 상기 아텔로콜라겐을 포함하는 콜라겐 근육 주사제를 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적으로, 상기 아텔로콜라겐을 포함하는 화장료를 제조할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조
(1)콜라겐 조추출 부유액의 제조
돈피(Pig skin) 10kg에 초산 혼합액을 가하고, 저온에서 24시간 동안 반응시키고, 진피를 수득하였다.
이때, 상기 초산 혼합액은 상기 돈피 1kg 당 5L로 투입하였으며, 과초산(0.1%) 및 초산(0.5M)을 포함하여 제조하였다.
그리고, 상기 진피에 초산 혼합액을 가하고, 교반하여 균질물을 제조하였다.
이때, 상기 초산 혼합액은 상기 돈피 1kg 당 5L로 투입하였으며, 과초산(0.1%) 및 초산(0.5M)을 포함하여 제조하였다.
이때, 상기 교반은 미트그라인더(Meat grinder) 및 워링블랜더(Waring blender)를 통해 수행하였다.
그리고, 상기 균질물에 1L 당 초산을 9L의 비율로 가하고, 전동 교반기로 30분 동안 교반하였다.
그리고, 상기 단계를 수행한 균질물에 0.1% 펩신 효소액을 상기 돈피 1L 당 1.0L의 비율로 가하고, 12시간 동안 저속교반하여 콜라겐 조추출 부유액을 제조하였다.
(2)염석콜라겐의 제조
상기 콜라겐 조추출 부유액에 여과조제를 가하고, 흡인여과하여 조추출액을 제조하였다.
이때, 상기 여과조제는 상기 부유액 1L 당 10g의 비율로 투입하였다.
그리고, 상기 조추출액에 염화나트륨 용액 및 여과조제를 차례로 가한 뒤, 흡인여과하여 염석콜라겐을 제조하였다.
이때, 상기 염화나트륨 용액은 상기 조추출액 100 부피비에 대하여 178 부피비로 포함하였다.
또한, 상기 여과조제를 상기 조추출액 1L 당 10g의 비율로 투입하고 10분 동안 저속 교반하였다.
그리고, 상기 염석콜라겐에 차가운 에탄올을 가하여 잔존 지방(불순물)을 제거하였다.
(3)콜라겐 초산용액의 제조
상기 염석콜라겐 1kg 당 0.5M의 초산 5L를 투입하여 콜라겐 초산용액을 제조하였다.
(4)콜라겐 인산용액의 제조
상기 콜라겐 초산용액에 5M 농도의 염화나트륨 용액을 가한 뒤, 12시간 동안 저속 교반하였다.
이때, 상기 염화나트륨 용액은 상기 콜라겐 초산용액 100 부피비에 대하여 178 부피비로 포함하였다.
그리고, 상기 단계를 수행한 콜라겐 초산용액을 10℃ 하에서 8,000rpm의회전속도로 30분 동안 원심분리하여 콜라겐 펠렛을 수득하였다.
그리고, 상기 콜라겐 펠렛에 0.1M의 인산완충액을 가하고 원심세척하는 단계를 3회 반복하였다.
이때, 상기 인산완충액은 pH가 4.5이었다.
그리고, 상기 단계를 수행한 콜라겐 펠렛에 에탄올을 혼합한 다음 정치시켜서 부유액을 수득한 다음 상기 부유액을 원심분리하여 콜라겐 펠렛을 회수하였다.
이때, 상기 인산완충액은 0.1M의 농도였으며, pH가 2.0이었다.
(5)아텔로콜라겐의 제조
상기 콜라겐 인산용액을 세파덱스 컬럼(Sephadex column, Sephadex G-100)에 대하여 7.5부피%로 충전하였다.
상기 단계를 수행한 세파덱스 컬럼을 10mM 농도의 인산완충액으로 전개시켜 아텔로콜라겐을 수득하였다.
실시예 2 ~ 실시예 5 및 비교예 1 ~ 비교예 4: 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 아텔로콜라겐을 제조하되, (2)단계에서 콜라겐 조추출 부유액 1L 당 여과조제의 양과 조추출액 1L 당 여과조제의 양을 하기 표 1 ~ 표 2와 같이 하여 실시예 2 ~ 실시예 5 및 비교예 1 ~ 비교예 4 를 실시하였다.
실험예 1: 고분자량의 아텔로콜라겐의 물성 측정
실시예 1 ~ 실시예 5 및 비교예 1 ~ 비교예 4에서 제조한 아텔로콜라겐 각각을 18g씩 시료를 채취하였고, 하기와 같은 방법으로 아텔로콜라겐의 물성을 측정하여 하기 표 1 ~ 표 2에 그 결과값을 나타내었다. 이때, 각 실험의 검체량은 1mL이었다.
(1)성상 평가
육안으로 성상을 평가하여 기록하였다.
(2)pH 측정
pH 미터(meter)기를 통해 측정하였다
(3)분자량 및 순도 측정
SDS-PAGE 장치를 통해 측정하였다.
(4)중금속 및 비소량 측정
대한약전 일반시험법에 나타나 있는 방법으로 측정하였다.
(5)콜라겐 함량 측정
Sircol Collagn Assay 장치를 통해 측정하였다.
(6)바이러스 검출 유무
PCR(Polymerase chain reaction) 방법를 통해 바이러스 검출 유무를 측정하였다.
실시예1 | 실시예2 | 실시예3 | 실시예4 | 실시예5 | |
부유액 1L 당 여과조제량(g) | 10 | 5 | 15 | 10 | 10 |
조추출액 1L 당 여과조제량(g) | 10 | 10 | 10 | 7 | 13 |
성상 | 무색투명 액상 | 무색투명 액상 | 무색투명 액상 | 무색투명 액상 | 무색투명 액상 |
pH | 3.4 | 3.1 | 3.2 | 3.5 | 3.4 |
분자량(Da) | 30,000 | 28,900 | 30,200 | 29,100 | 30,100 |
순도(%) | 95 | 91 | 97 | 90 | 96 |
중금속(ppm) | 10 | 12 | 8 | 13 | 9 |
비소(ppm) | 2 | 3 | 1 | 4 | 2 |
콜라겐 함유량(mg/mL) | 10 | 8 | 12 | 9 | 11 |
바이러스 검출 | X | X | X | X | X |
비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 | |
부유액 1L 당 여과조제량(g) | 4 | 16 | 10 | 10 |
조추출액 1L 당 여과조제량(g) | 10 | 10 | 4 | 16 |
성상 | 무색투명 액상 | 무색투명 액상 | 무색투명 액상 | 무색투명 액상 |
pH | 3.3 | 3.4 | 3.2 | 3.1 |
분자량(Da) | 26,000 | 30,100 | 27,000 | 29,900 |
순도(%) | 75 | 78 | 77 | 80 |
중금속(ppm) | 16 | 8 | 14 | 7 |
비소(ppm) | 6 | 2 | 5 | 2 |
콜라겐 함유량(mg/mL) | 3 | 4 | 4 | 5 |
바이러스 검출 | X | X | X | X |
상기 표 1 ~ 표 2를 살펴보면, 실시예 1 ~ 실시에 5는 콜라겐의 순도 및 함유량이 높은 것으로 나타났다.
반면에, 여과조제의 양이 범위 미만인 비교예 1 및 비교예 3은 콜라겐의 순도 및 함유량이 낮고, 중금속 및 비소의 검출량도 높은 것으로 나타났는데, 이는 불순물이 과량 함유되어 있기 때문인 것으로 판단된다.
또한, 여과조제의 양이 범위를 초과하는 비교예 2 및 비교예 4는 콜라겐의 순도 및 함유량이 낮은 것으로 나타났는데, 이는 여과조제의 양이 과도함에 따라 불순물로 분류되었기 때문으로 판단된다.
제조예 1: 콜라겐 근육 주사제의 제조
실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐과, 염화나트륨, 일인산수소나트륨, 이인산수소나트륨 각각을 가해, 삼투질의 농도를 340밀리오스몰로 조절하였다.
그리고, 상기 삼투질의 pH를 중성으로 조절하고, 제균 여과하여 멸균 주사용기에 분병 밀전하여 제1형의 콜라겐 근육 주사제를 제조하였다.
제조예 2: 화장품용 원액의 제조
실시예 1의 제조과정 중 콜라겐 펠렛 100g을 준비하였고, 상기 펠렛 1g 당 초산 10L의 비율로 가해 용해한 용액을 제조하였다.
그리고, 상기 용액에 호박산 30g을 용해시키고, 10M 농도의 수산화나트륨 용액을 적가하여 pH를 10으로 조절하였다.
그리고, 상기 단계를 수행한 용액에 10M의 염산을 가하여 pH의 농도가 4.0이 되도록 하였다.
그리고, 상기 단계를 수행한 용액을 원심분리하여 침사를 회수하고, 상기 침사를 10mM인 인산완충액 pH 4.5를 가하여 부유하고 원심세척하는 단게를 3회 반복하였다.
그리고, 상기 단계를 통해 수득된 펠렛에 0.1M의 인산완충액을 가하고 하루동안 교반시켜 콜라겐 인산용액을 수득하였다.
그리고, 상기 콜라겐 인산용액에 히알루론산, 아데노신, 진주가루, 천연방부제를 각각 미량씩 가하여 화장품용 원액을 제조하였다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의사상은 본 명세서에 제시되는 실시예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
Claims (11)
- 콜라겐 조추출 부유액을 제조하는 1단계;
상기 콜라겐 조추출 부유액에 여과조제를 가하고, 흡인여과하여 콜라겐 조추출액을 제조하는 2단계;
상기 콜라켄 조추출액에 염화나트륨 용액 및 여과조제를 차례대로 가한 후, 흡인여과시켜 염석(Salting out)콜라겐을 제조하는 3단계;
상기 염석콜라겐에 초산을 가하여 콜라겐 초산용액을 수득하는 4단계;
상기 콜라겐 초산용액으로부터 콜라겐 인산용액을 수득하는 5단계; 및
상기 콜라겐 인산용액으로부터 아텔로콜라겐(Atelo collagen)을 제조하는 6단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 콜라겐 조추출 부유액은 돈피(pig skin)에 초산 혼합액을 투입 및 혼합시킨 뒤 저온에서 18 ~ 32시간 동안 방치시키는 1-1단계;
상기 1-1단계를 수행한 돈피로부터 진피를 취하는 1-2단계;
상기 진피에 초산 혼합액을 가하고 교반하여 균질물을 만드는 1-3단계;
상기 균질물에 초산을 가하고 교반하는 1-4단계; 및
상기 1-4단계를 수행한 균질물에 펩신 효소액을 가하고 저속 교반하여 콜라겐 조추출 부유액을 제조하는 1-5단계;를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법.
- 제2항에 있어서,
상기 펩신 효소액은 상기 돈피 1L 당 0.5 ~ 1.5L의 비율로 가하는 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법.
- 제2항에 있어서,
상기 1-1단계 및 1-3단계의 초산 혼합액은 과초산, 초산 및 증류수를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 2단계의 여과조제는 상기 콜라겐 조추출 부유액 1L 당 5 ~ 15g의 비율로 투입하고,
상기 3단계의 여과조제는 상기 조추출액 1L 당 7 ~ 13g의 비율로 투입하는 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 3단계의 초산은 상기 염석 콜라겐 1kg 당 3 ~ 7L의 비율로 투입하는 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 5단계는 상기 콜라겐 초산용액에 염화나트륨 용액을 혼합 및 저속 교반한 후, 원심분리하여 콜라겐 펠렛을 수득하는 5-1단계; 및
상기 콜라겐 펠렛에 인산완충액을 가한 후, 원심세척하는 공정을 1 ~ 5회 반복 수행하는 5-2단계; 및
상기 5-2단계를 수행한 콜라겐 펠렛에 에탄올을 혼합한 다음 정치시켜서 부유액을 수득한 다음 부유액을 원심분리하여 펠렛을 회수하는 5-3단계; 및
회수한 펠렛과 인산완충액을 혼합 및 교반하여 콜라겐 인산용액을 수득하는 5-4단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 6단계는 상기 콜라겐 인산용액을 세파덱스 컬럼(Sephadex column)에 대하여 5 ~ 10부피%로 주입하는 6-1단계; 및
상기 6-1단계를 수행한 세파덱스 컬럼을 인산완충액으로 전개시켜 아텔로콜라겐을 수득하는 6-2단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐의 제조방법.
- 제1항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항에 따른 제조방법으로부터 제조되고, 분자량(Molecular mass)이 28,000 ~ 40,000Da(달톤)인 것을 특징으로 하는 고분자량의 아텔로콜라겐.
- 제9항에 따른 아텔로콜라겐을 포함하는 콜라겐 근육 주사제.
- 제9항에 따른 아텔로콜라겐을 포함하는 화장료.
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