ES2881951T3

ES2881951T3 - Purificación de gelatina

Info

Publication number: ES2881951T3
Application number: ES15830899T
Authority: ES
Inventors: Joseph Hubertus Olijve; Bjorn Vergauwen; Paul Stevens
Original assignee: Rousselot Bv
Current assignee: Rousselot Bv
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: KR102626805B1; US20170342130A1; HUE056139T2; JP2018502066A; PT3223869T; NL2013880B1; US10155805B2; EP3223869B1; PL3223869T3; AR102853A1; WO2016085345A1; JP7009586B2; DK3223869T3; CA2968672C; BR112017010929A2; JP6860766B2; CN107580608B; EP3223869A1; AU2015354868B2; CA2968672A1

Abstract

Método para la remoción de lipopolisacárido desde un medio acuoso que comprende gelatina y lipopolisacáridos, comprendiendo dicho método los pasos de: 1) suministro de un medio acuoso que comprende por lo menos 2 % p/p de gelatina y lipopolisacáridos, 2) adición al medio acuoso de 0.01 - 1.5 % p/p de un tensioactivo que forma micela, 3) poner en contacto el medio del paso 2) con un adsorbente sólido, 4) separación del adsorbente sólido del paso 3) del medio, 5) recuperación del medio acuoso que comprende la gelatina, en donde cada uno de los pasos 1) - 5) es ejecutado a una temperatura de 68 °C o menos, estando dicha temperatura por debajo del punto de enturbiamiento del tensioactivo que forma micela, siendo ejecutados por lo menos los pasos 2) y 3) a una temperatura de por lo menos 30 °C.

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de gelatina

La invención se refiere a un método para la remoción de lipopolisacárido de un medio acuoso que comprende gelatina y lipopolisacáridos, y a gelatina que tiene un bajo contenido de lipopolisacárido.

La gelatina es una mezcla de proteínas solubles en agua, derivada del colágeno. La gelatina es obtenida por ejemplo mediante hidrólisis parcial de colágeno, obtenido de la extracción acuosa de piel, tendones, ligamentos, huesos, etc. en condiciones ácidas o alcalinas, o mediante hidrólisis enzimática. La gelatina obtenida mediante tratamiento ácido es llamada gelatina tipo A, mientras la gelatina tipo B se deriva del proceso en base alcalina.

La gelatina no constituye una molécula uniforme de proteína, sino que comprende una cantidad variable de moléculas de proteína de longitud variable, que tiene un promedio de peso molecular de hasta 200-250 kDa. Por ello, la distribución de peso molecular de la gelatina es un parámetro importante responsable por o que determina frecuentemente propiedades críticas e importantes de la gelatina, tales como viscosidad y valor de fuerza de gelificación, o fuerza del gel.

La gelatina forma un gel termorreversible a temperatura ambiente y se disuelve en agua caliente. La gelatina es usada comúnmente en diversas industrias, por ejemplo en aplicaciones en alimentos, productos farmacéuticos y cosméticos, entre otros, como agente gelificante y que da textura en, por ejemplo, gomas de fruta y postres de gelatina, pero también encuentra aplicación en el campo médico, por ejemplo para sustitución de plasma e implantes a base de gelatina.

El peso molecular varía, entre otros, debido a diferentes temperaturas y condiciones de extracción. Como un resultado, la fuerza de gelificación y la viscosidad variarán también. La temperatura es un parámetro importante en la preparación de la gelatina, por ejemplo condiciones de purificación antes de que pueda aplicarse la gelatina en aplicaciones de alimentos, farmacéuticas, técnicas y médicas, y frecuentemente requiere control cuidadoso. Cuando se llega al uso de gelatina, en aplicaciones donde son importantes las características de gelificación y viscosidad, se considera una temperatura de 60 °C como la temperatura máxima de manejo, aunque pueden ser aceptables temperaturas de hasta por ejemplo 62 °C o 65 °C por un periodo limitado de tiempo de por ejemplo 5 o 10 a 30 o 45 min., bajo circunstancias donde se tolera alguna pérdida de capacidad de gelificación y/o viscosidad. A temperaturas por encima de 65 °C, en particular por encima de 70 °C, ocurre una hidrólisis indeseada de la gelatina, es decir, ruptura de las moléculas de proteína hasta péptidos más pequeños, dando como resultado una menor fuerza del gel o incluso pérdida de la capacidad de gelificación. De acuerdo con ello, la denominada “gelatina hidrolizada” es una preparación de péptido que se origina en la hidrólisis de gelatina hasta moléculas de péptido que tienen promedio de peso molecular de 70 kDa o menos, usualmente 20 kDa o menos, usualmente entre 100 y 15000 Da. Debido a las moléculas relativamente pequeñas, la gelatina hidrolizada no tiene propiedades de formación de jalea. La gelatina hidrolizada es usada por ejemplo usada como acondicionador de textura y humectante en cremas tópicas, y es usado también en productos nutricionales, debido al elevado contenido de glicina, prolina e hidroxiprolina y está asociada con efectos en la salud, pero puede ser usada también para aplicaciones biomédicas. También se le llama “colágeno hidrolizado”, dado que el colágeno es hidrolizado primero hasta gelatina y luego adicionalmente hasta el hidrolizado que no produce gelificación.

La distribución de peso molecular de la gelatina es medida usualmente mediante técnicas HPLC (cromatografía líquida de alto desempeño) de exclusión por tamaño, y las fracciones de elución son detectadas por absorción UV y los datos medidos son evaluados mediante software adecuados, todas metodologías conocidas en la técnica, véase por ejemplo Olijve et.al., Journal of Colloid and Interface Science (2001) 243, 476-482. Para las gelatinas hidrolizadas, con un promedio de peso molecular menor a 70 kDa, tales como menor a 20 kDa, puede usarse el mismo método, pero se prefiere usar una columna de separación, tal como TSKgel2000SWXL (Tosoh Bioscience, Japón), para obtener alta resolución (Zhang et.al., Food Hydrocolloids 23 (2009) 2001 -2007).

La viscosidad de la gelatina (la viscosidad dinámica) es medida usualmente midiendo el tiempo de flujo de una solución 6.67 % p/p de gelatina, a través de una pipeta de flujo estándar a 60 °C, véase GME Monograph Standardized Metods forthe testing de Edible Gelatin, versión 10, 2014 (GME, Bruselas, Bélgica), denominada en esta memoria también como 'GM E10', capítulo 2.4.2, p. 81 - 86.

La fuerza del gel de un gel de gelatina a 6.67 % p/p puede ser determinada mediante aparatos estandarizados (véase GME10), tal como un equipo de análisis de textura QTS 25 (viscosímetros Brookfield) o un equipo de análisis de textura TA-XT2 (Stable Micro Systems Ltd., Londres, Reino Unido), y es indicado por un número de fuerza de gelificación (también denominado en esta memoria como “valor de fuerza de gelificación”, véase GME10).

En los procesos de preparación de gelatina frecuentemente las materias primas son contaminadas por bacterias, y como un resultado las preparaciones comunes de gelatina pueden comprender lipopolisacáridos (LPS).

Los lipopolisacáridos son hallados en la membrana exterior de las baterías Gram negativas y son toxinas potenciales. Los LPS son conocidos también como "endotoxinas" dado que los lipopolisacáridos no son secretados por bacterias sino que son parte de la estructura de la membrana. Por ello, los lipopolisacáridos son liberados principalmente después de la muerte y lisis de la célula bacteriana.

Los LPS consisten en una cadena variable de polisacárido y un fragmento de lípido, el lípido A. Las moléculas de LPS tienen un tamaño aproximado de 10 kDa, pero pueden formar agregados grandes en medio acuoso, también llamados "micelas" que tienen un peso molecular de hasta 1000 kDa.

Los LPS son tóxicos para la mayoría de los mamíferos y frecuentemente el huésped animal sufrirá de un amplio espectro de reacciones patofisiológicas no específicas, tales como fiebre, taquicardia, disfunción orgánica e incluso la muerte.

Aunque un cierto contenido de LPS puede ser tolerado para muchas aplicaciones de gelatina, en aplicaciones específicas, tales como para propósitos médicos (por ejemplo como sustitución de plasma a base de gelatina, dispositivos e implantes) el nivel de endotoxina debería ser preferiblemente menor que 20, preferiblemente 10 EU/g o incluso menos. Por ejemplo las regulaciones gubernamentales de EE.UU. de Food and Drug Administration (FDA) permiten un máximo de 0.5 EU/ml o 20 EU/dispositivo para productos que están en contacto con el sistema cardiovascular y/o linfático. Para dispositivos en contacto con el fluido cerebroespinal, el límite es incluso 0.06 EU/ml o 2.15 EU/dispositivo (~ 2 EU/g de gelatina). Para dispositivos que están en contacto directo o indirecto con el ambiente intraocular, puede aplicar un límite incluso menor de endotoxina.

El ensayo de Limulus (LAL) es un bioensayo bien conocido en la técnica, para medir cantidades de hasta por debajo del picogramo de LPS. El lisado de Limulus de amebocito (LAL) es un extracto acuoso de células de la sangre (amebocitos) del cangrejo herradura, Limulus polifemus. El LAL reacciona con endotoxina o lipopolisacárido (LPS) bacteriano, que es un componente de la membrana de bacterias Gram negativas. Esta reacción es la base de la prueba de lAl , que es luego usada para la detección y cuantificación de endotoxinas bacterianas. Un método de LAL recomendado aceptado por US-FDA, USP 2011, capítulo <85> para cuantificar los niveles de LPS es el método cromogénico Endosafe, por ejemplo de Charles River EE.UU. Otros métodos aceptados y recomendados son el método de factor C recombinante EndoZyme de Hyglos GmbH (Alemania). Ambos métodos dan como resultado valores de medición similares o idénticos y por ello pueden ser usados de modo intercambiable.

En la técnica, los métodos para la reducción del contenido de LPS de soluciones de proteína, usando detergentes tales como Triton, son descritos por ejemplo por Hirayama y Sakata, Journal of Chromatography B, 781 (2002) pp.

419-432. Se describe que los detergentes liberan los monómeros de endotoxina desde las micelas, monómeros que serán adsorbidos por los adsorbentes. Sin embargo, Hirayama y Sakata advierten sobre el uso de adsorbentes no selectivos tales como carbón activado e intercambiadores aniónicos, cuando se retira la endotoxina de una solución que contiene proteína, dado que no sólo la endotoxina, sino también las proteínas, tienden a unirse a dichos adsorbentes no selectivos.

El documento WO 2009/154440 describe un método para la reducción en el contenido de LPS en un material de biopolímero que contiene LPS, tal como un alginato acuoso o solución de gelatina. El método en el documento WO 2009/154440 confía en el uso en dicha solución, de un tensioactivo, un adsorbente sólido, y en un incremento en la temperatura de dicha solución hasta por encima del punto de enturbiamiento del tensioactivo usado, dando como resultado la pérdida de la solubilidad y la agregación del tensioactivo y con ello en un proceso de extracción de 3 fases, en donde tanto el tensioactivo agregado como también el LPS, unido al adsorbente son retirados mediante centrifugación de la fase acuosa que comprende el biopolímero purificado. Con ese propósito, es crítico que la solución sea llevada a condiciones tales que la temperatura de la solución que comprende el biopolímero, tensioactivo, absorbente y el LPS esté por encima de la temperatura de punto de enturbiamiento del tensioactivo a aquellas condiciones, con objeto de permitir que el tensioactivo se agregue, de modo que mediante centrifugación puedan retirarse los agregados, junto con el LPS adsorbido al adsorbente.

De acuerdo con ello, el documento WO 2009/154440 describe la preparación de una solución acuosa de alginato que comprende Triton X-114 (que tiene un punto de enturbiamiento de 23 °C) y un adsorbente sólido a una temperatura justo por debajo del punto de enturbiamiento, seguido por calentamiento a 70 °C, es decir, bien por encima de dicho punto de enturbiamiento, para formar agregados del tensioactivo. Tanto los agregados como el adsorbente fueron precipitados mediante centrifugación, dando como resultado una fase acuosa de alginato con disminución en el contenido de LPS. También, se describe la preparación de una solución de gelatina que comprende Triton X-100 (que tiene un punto de enturbiamiento de 68 - 69 °C) y carbón activado como adsorbente, nuevamente justo por debajo de la temperatura de punto de enturbiamiento, seguido por calentamiento a 90 °C para inducir la separación de fases, es decir, la formación de agregados del tensioactivo. Mediante centrifugación, precipitaron el tensioactivo agregado y el carbón activado, al cual estaba unido el LPS. Sin embargo, el calentamiento por encima del punto de enturbiamiento de Triton X-100, es decir, a 70 °C o más, in casu 90 °C, da como resultado significativa hidrólisis de la gelatina, y una pérdida intrínseca de funcionalidad, tal como viscosidad y fuerza del gel. A tales temperaturas altas, también puede ocurrir la coloración indeseada de la gelatina, debido a reacciones de Maillard en la gelatina. En la enseñanza de WO2009/154440, la gelatina es destruida por el paso de calentamiento y se produce un hidrolizado de gelatina, es decir, incapaz de formar gel. Además, el paso de centrifugación hace difícil la aplicación industrial de dicho método.

El documento JP 2005/289841 describe un método para la producción de gelatina tipo B con contenido reducido de endotoxina. El método comprende el tratamiento de un tejido animal con una solución de hidróxido de calcio y una sal de amonio cuaternario, a un pH de 12 durante por lo menos 5 días. A tales condiciones básicas, tiene lugar la desaminación de la gelatina, dando como resultado una disminución en el punto isoeléctrico a 5 - 6, es decir, sólo puede obtenerse gelatina de tipo B. A continuación, se neutraliza con ácido la solución de gelatina hasta un pH de aproximadamente 4.5-5, y se obtiene gelatina mediante extracción a una temperatura de por lo menos 65 °C. La gelatina así obtenida puede ser esterilizada adicionalmente mediante filtración a través de una membrana de 0.2 micrómetros, que contiene menos de 5 EU/g de endotoxinas. Sin embargo, este método no es adecuado para moléculas grandes de gelatina que tienen un peso molecular por encima de 200 KDa, debido al tamaño de poro de la membrana usada en el paso de filtración.

El documento JP 2004/300077 describe un método para la remoción de endotoxina desde proteína de colágeno, que comprende el sometimiento de dicha proteína a un tratamiento de alcohol y/o acetona básicos, a un pH de 10 - 12, descomponiendo con ello la endotoxina contenida en la proteína de colágeno. La proteína resultante que tiene menos de 1000 EU/g de LPS es recuperada mediante precipitación. Atales valores altos de pH, el punto isoeléctrico de la proteína caerá a aproximadamente 5 - 6 como un resultado de la desaminación.

El documento EP 1829946 describe un método para la reducción del contenido de endotoxina en gelatina, sometiendo soluciones de gelatina, que tienen un promedio de peso molecular de hasta 100,000 Da, a ultrafiltración. Aunque este documento describe el posible uso de membranas que tienen un corte de 300,000, las gelatinas de tal tamaño no pueden ser procesadas eficientemente de esta manera, debido a la viscosidad de la solución. Sólo pueden someterse a ultrafiltración soluciones muy diluidas de tales gelatinas, haciendo el método muy ineficiente y costoso. Mediante ultrafiltración, solamente las gelatinas que tienen un promedio de peso molecular de 100,000 Da o menos, han mostrado ser adecuadas y descritas para ultrafiltración.

El documento WO 2012/031916 describe un método para la reducción del contenido de endotoxina de colágeno insoluble hasta menos de 10 EU/g, comprendiendo el tratamiento del colágeno con álcali, ácido y un agente oxidante acuosos, sin disolver el colágeno.

Los presentes inventores han encontrado ahora sorprendentemente que el LPS puede ser retirado de manera muy efectiva de las preparaciones acuosas de gelatina, sin la necesidad de un paso de ultrafiltración o centrifugación, usando un tensioactivo que forma micela, tal como Triton X-100, bajo condiciones que no generan hidrólisis para la gelatina, sin la necesidad de formar agregados insolubles del tensioactivo para habilitar la remoción eficiente de los mismos. Se ha hallado ahora que la remoción de LPS desde las soluciones de gelatina puede ser realizada usando un tensioactivo que forma micela, bajo condiciones que están por debajo del punto de enturbiamiento del dicho tensioactivo, dando como resultado una reducción incluso mejorada de LPS, comparada con la técnica de extracción por encima del punto de enturbiamiento. Sin desear estar atados a ninguna explicación, se cree que la adsorción efectiva del tensioactivo y LPS por un adsorbente sólido, tal como carbón activado, sorprendentemente no depende de la formación de agregados insolubles del tensioactivo, haciendo con ello superflua la elevación de la temperatura después del paso en el que se permite que el tensioactivo interactúe con el LPS en el medio por encima del punto de enturbiamiento del tensioactivo, habilitando con ello la remoción de LPS bajo condiciones más suaves. De acuerdo con ello, se suministra un método que es adecuado para la remoción de LPS desde la gelatina bajo condiciones que no generan hidrólisis, manteniendo sustancialmente intactas las propiedades de la gelatina, tales como viscosidad, comparadas con las de la gelatina antes de la remoción de LPS.

Con este fin, la invención suministra un método para la remoción de lipopolisacárido desde un medio acuoso que comprende gelatina y lipopolisacáridos, comprendiendo dicho método los pasos de:

1) suministro de un medio acuoso que comprende por lo menos 2 % p/p de gelatina y lipopolisacáridos,

2) adición al medio acuoso de 0.01 -1.5 % p/p de un tensioactivo que forma micela,

3) contacto del medio del paso 2) con un adsorbente sólido,

4) separación del adsorbente sólido del paso 3) desde el medio,

5) recuperación del medio acuoso que comprende la gelatina, en donde cada uno de los pasos 1) - 5) es ejecutado a una temperatura de 68 °C o menos, estando dicha temperatura por debajo del punto de enturbiamiento del tensioactivo que forma micela, siendo ejecutados por lo menos los pasos 2) y 3) a una temperatura de por lo menos 30 °C.

Se pretende que el término "medio acuoso" abarque agua, mezclas de solventes miscible en agua y agua, en donde el agua está presente predominantemente, y cualquier solución en donde el agua o tal mezcla es el solvente. Sin embargo, preferiblemente el medio no tiene solventes miscibles en agua. El medio acuoso puede comprender cualquier tipo de gelatina, por ejemplo gelatina tipo A o tipo B, de por ejemplo origen bovino, porcino, de corral o pescado. No existen restricciones respecto a los valores de fuerza de gelificación, peso molecular y viscosidad de la gelatina desde la cual va a retirarse el LPS. En particular, la gelatina es disuelta en el medio acuoso, por ejemplo mediante mezcla de la gelificación con el solvente, por ejemplo agua, a temperatura ambiente o temperatura elevada, pero preferiblemente no por encima de 68 °C, preferiblemente no por encima de 65 °C, más preferiblemente no por encima de 60 °C, con objeto de evitar la hidrólisis de la gelatina, durante aproximadamente 30 a 60 minutos para permitir que la gelatina se hinche, dando como resultado que el medio es una solución de gelatina. A o por debajo de 60-68 °C se evitan la hidrólisis térmica de la gelatina y posibles reacciones químicas indeseadas, de modo que las propiedades y funcionalidad de la gelatina, tal como el valor fuerza de gelificación, promedio de masa molecular y viscosidad, permanecen intactos comparados con los de la gelatina suministrada en el paso 1). En esta memoria, se define que la funcionalidad permanece intacta cuando el peso molecular de la gelatina disminuye, como un resultado del método de la invención, en máximo 15%, preferiblemente en máximo 10%, con máxima preferencia en máximo 5%.

Es muy bien posible ejecutar los diferentes pasos a diferentes temperaturas, pero cada uno de los pasos es ejecutado a un máximo de 68 °C.

Debe notarse que con objeto de llevar la gelatina a solución, el medio puede ser calentado por encima de 68 °C, pero tal paso precede el método reivindicado. Pero preferiblemente, la gelatina es suministrada como una solución acuosa, donde el solvente acuoso, en particular agua, no ha sido calentado por encima de 68 °C, y no es calentado por encima de las temperaturas, según se describió en esta memoria, con objeto de no perder funcionalidad.

Al dicho medio se añade un tensioactivo que forma micela, como un resultado de lo cual el LPS es transformado en monómeros y se cree que dichos monómeros interactúan con el tensioactivo, formando complejos de micela de tensioactivo y LPS.

Los tensioactivos que forman micela son conocidos en la técnica, y son descritos por ejemplo en el documento WO2009/15440. Un tensioactivo que forma micela es capaz de formar micelas (agregados solubles) en solución. Con este fin, se define la denominada concentración crítica de micelas (CMC), como la concentración de tensioactivos por encima de la cual se forman micelas y todos los tensioactivos adicionales añadidos al sistema van a micelas. A la CMC existe equilibrio con el tensioactivo presente en las interfaces y el tensioactivo en el estado micelar. La dicha CMC es dependiente de la temperatura; para tensioactivos no iónicos, los valores CMC incrementan al disminuir la temperatura (M .J. Schick J. Phys. Chem., 1963, 67 (9) 1796-1799). Además, la elevación de la temperatura da como resultado la pérdida de solubilidad del tensioactivo, estando el tensioactivo presente casi exclusivamente como agregados insolubles, dando como resultado que la solución se torne opaca o turbia. La temperatura a la cual esto tiene lugar es el denominado punto de enturbiamiento. El incremento en las concentraciones de sal da como resultado la disminución del punto de enturbiamiento. Por ejemplo el punto de enturbiamiento de una solución al 1 % p/p de Triton X-100 disminuye desde 68 °C hasta temperatura ambiente por adición de 9-23% de (N H ^S O ⁴o 16%-25% (es decir, 2.74 - 4.27 M) de NaCl, (Arnold y Linke, BioTechniques, 43 (2007), 427-440). También pueden usarse alcoholes para disminuir el punto de enturbiamiento (Gu y Galera-Gomez; Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 147 (1999) 365-370).

De acuerdo con ello, en esta memoria el término "punto de enturbiamiento" pretende indicar la temperatura a la cual el tensioactivo forma agregados insolubles en el medio. Dicha temperatura depende de las condiciones del medio, tales como concentración de sal. Cuando no se dan condiciones específicas, el punto de enturbiamiento es definido en esta memoria como la temperatura donde una solución acuosa al 1 % p/p forma agregados insolubles. De este modo, si se describe que la temperatura está por debajo del punto de enturbiamiento de un tensioactivo, dicha temperatura es 68-69 °C (es decir, para una solución al 1 % p/p de Triton X-100), pero en el caso de una solución al 16-25 % p/p de NaCl, dicho punto de enturbiamiento es la temperatura ambiente. De acuerdo con la invención, es importante para el método, que la temperatura de los pasos del método permanezca por debajo del punto de enturbiamiento es decir, la temperatura debería ser tal que el tensioactivo no da como resultado turbidez u opacidad de la solución.

El punto de enturbiamiento puede ser determinado convenientemente bajo las circunstancias dadas, determinando la absorbancia de la luz de la solución a 620 nm sin adición del tensioactivo, y revisando si la absorbancia aumenta cuando se añade la cantidad prevista de tensioactivo. Por encima del punto de enturbiamiento, aumenta la absorbancia. La determinación de la absorbancia puede ser ejecutada de acuerdo con el protocolo del capítulo 2.4.5 del GM E2014 (p. 96-99).

Sorprendentemente se encontró que no es necesaria la elevación de la temperatura por encima del punto de enturbiamiento. Incluso más sorprendentemente, los pasos 1) - 5) son más eficientes cuando son ejecutados a temperaturas por debajo del punto de enturbiamiento del tensioactivo que forma micela.

Para la invención, es suficiente para el tensioactivo formar micelas, es decir, agregados solubles, sin la necesidad de formar agregados insolubles a temperaturas elevadas, como se explicó anteriormente.

Para la eficiente remoción de LPS, el tensioactivo que forma micela está presente preferiblemente en una concentración igual o mayor a la CMC, de modo que se forman agregados solubles que pueden unirse al adsorbente. Para Triton X-100, la CMC es 0.015 % p/p.

Mientras los agregados mixtos de LPS y tensioactivo estén en solución, es decir, sin la necesidad de formar agregados insolubles, el medio entra en contacto con un adsorbente sólido, capaz de enlazar los agregados solubles de tensioactivo y LPS y monómeros del mismo. Esto puede ser hecho mediante adición de adsorbente en partículas al medio, o por ejemplo pasando el medio a través de un elemento de filtro que comprende el dicho adsorbente, o incubar el medio con un vehículo que tiene el adsorbente presente en la superficie exterior del mismo. La persona experta es consciente de las vías adecuadas para poner en contacto un medio acuoso con un adsorbente sólido y para separar el adsorbente del medio. La dicha separación puede comprender por ejemplo centrifugación o filtración en el caso que el adsorbente sea añadido en partículas al medio, donde se prefiere la filtración desde el punto de vista de la aplicabilidad industrial. En una realización preferida, el adsorbente puede estar presente en un filtro, y el medio es pasado a través de dicho filtro o a través de una serie de tales filtros, mientras opcionalmente los filtros pueden ser lavados con objeto de optimizar el rendimiento del filtrado. De esta manera, los pasos 3), 4) y 5) como se describió anteriormente, pueden ser combinados en un paso individual de filtración. Alternativamente, pueden empaparse en dicho medio cuerpos más grandes, tales como barras o perlas recubiertos con el adsorbente, permitiendo la unión de los complejos LPS-tensioactivo al adsorbente, y pueden ser retirados del medio después de ello. El adsorbente puede ser también apilado en una columna, y la solución de gelatina puede pasar sobre la columna para retirar tensioactivo y LPS.

Por lo menos los pasos 2) y 3), es decir, el paso de adición del tensioactivo y el paso de contacto con el adsorbente, pero preferiblemente todos los pasos 1) - 5) son ejecutados a una temperatura de por lo menos 30 °C, es decir, por encima de la temperatura de fusión de la gelatina. Es ventajoso que el medio acuoso sea una solución que fluye libremente, es decir, que tiene un valor de viscosidad dinámica medible (es decir, que tiene un valor G" dominante). Aunque la viscosidad y temperatura de gelificación varían para diferentes gelatinas, las soluciones de gelatina fluyen libremente y son bien procesables a una temperatura de por lo menos 30 °C. Una solución que fluye libremente es ventajosa cuando es puesta en contacto con el adsorbente, para permitir el contacto óptimo entre el medio y el adsorbente, y para asegurar la separación adecuada del adsorbente y el medio.

El medio acuoso es recuperado y, si se desea, puede determinarse el recuento de LPS usando, por ejemplo el ensayo LAL descrito anteriormente.

El promedio de peso molecular de la gelatina está preferiblemente dentro del intervalo de 1500 Da a 250 kDa, o incluso más alto tal como 300 kDa o 275 kDa, y cualquier valor dentro de este intervalo puede sertomado como límite superior o inferior para definir un intervalo más pequeño, tal como por ejemplo un límite más bajo de 2000 Da, 4000 Da, 5000 Da, 15 kDa o 20 kDa, y un límite superior de por ejemplo 200 kDa, 180 kDa o 170 kDa. En el caso de gelatina de, por ejemplo, valor medio o alto de fuerza de gelificación, se prevé que el promedio de peso molecular esté por encima de 120 kDa. En el caso de hidrolizado de gelatina, se prevé que el promedio de peso molecular pueda ser menor de 70 u 80 kDa.

Aunque el tensioactivo que forma micela puede ser un tensioactivo iónico, tal como un tensioactivo catiónico o aniónico, el tensioactivo es preferiblemente un tensioactivo no iónico, dado que tal tensioactivo tiende a formar micelas a concentraciones más bajas, comparado con tensioactivos iónicos. Además, los tensioactivos iónicos pueden interactuar con la gelatina mediante enlaces iónicos, y son de remoción más difícil. Preferiblemente, el tensioactivo no iónico que forma micela es un tensioactivo etoxilado, preferiblemente un alquilfenol etoxilato, siendo representado el alquilfenol etoxilato preferiblemente por la fórmula CxH²x+¹-C⁶H⁴-O-(C²H⁴O)nH, en donde x es 4 -12 y n es 7.5 - 14, siendo X preferiblemente 8 y siendo n preferiblemente 8-13, más preferiblemente 8.5-12.5, con máxima preferencia 9 12, en particular Triton X-100, Triton X-102, o mezclas de los mismos. Se ha encontrado que se obtienen resultados atractivos con Triton X-100 y Triton X-102. Aunque un valor más alto para n daría como resultado un tensioactivo con mayor solubilidad y mayor punto de enturbiamiento, tales tensioactivos más largos parecen ser menos efectivos para la remoción de LPS. Sin embargo, otros tensioactivo no iónicos que son adecuados comprenden nonilfenoxipolietoxietanoles C-i⁵H²⁴O(C²H⁴O)n, siendo n 3 - 40, tal como nonoxinol-4, nonoxinol-15 y nonoxinol-30, o monoésteres de polietilen glicol sorbitano de ácidos grasos C¹²-C¹⁸, tales como TWEEN. CHAPSO (3-([3-colamidopropil]dimetil amonio)-2-hidroxil-1-propanosulfonato) es otro tensioactivo no iónico adecuado.

El adsorbente sólido puede ser cualquier adsorbente adecuado, capaz de enlazar al tensioactivo, y preferiblemente también LPS, conocido por la persona experta, tal como un adsorbente hidrófobo. El adsorbente es preferiblemente insoluble, y los adsorbentes adecuados comprenden arcillas, tales como tierra de diatomeas (activada) o arcillas, filosilicatos, tales como filosilicato de aluminio, minerales de esmectita y adsorbentes hidrófobos, tales como carbón activado, por ejemplo Norit SX Plus o Norit ROX 0.8 (Cabot, Países Bajos), o cartuchos de filtro 3M ZetaCarbon, por ejemplo tales como los de los tipos R55S o R30L3S (3M, EE.UU.). También pueden aplicarse mezclas de uno o más adsorbentes. El adsorbente sólido puede ser añadido por ejemplo a medio acuoso que contiene gelatina y, después de permitir que el tensioactivo y preferiblemente también el LPS se enlacen al adsorbente, puede retirarse el adsorbente por ejemplo mediante filtración, sedimentación o centrifugación y similares. El paso de contacto es ejecutado por un tiempo suficiente para permitir la apropiada adsorción del tensioactivo, dando como resultado la remoción del tensioactivo y el LPS enlazado al tensioactivo y opcionalmente también al adsorbente. Preferiblemente, el adsorbente está en contacto con el medio acuoso durante 5 minutos a 1 hora, más preferiblemente durante 10 - 30 minutos. Es posible un tiempo mayor, pero es menos deseado desde el punto de vista de la eficiencia del proceso y un mayor riesgo de hidrólisis de la gelatina, en particular en el caso de que se usen temperaturas por encima de 60 °C o 65 °C. Son posibles periodos de tiempo más cortos que 5 minutos, pero puede necesitarse usar más del adsorbente, comparado con la incubación por un período de tiempo más largo, con objeto de llegar a la remoción deseada de tensioactivo. En una realización atractiva, el paso de adsorción puede ser repetido por lo menos una vez, mediante contacto del medio recuperado del paso 5, nuevamente con adsorbente sólido, de manera similar a lo ejecutado en el paso 2).

Preferiblemente, cada uno de los pasos 1) - 5) es ejecutado a una temperatura de 65 °C o menos, más preferiblemente 62 °C o menos, incluso más preferiblemente de 60 °C o menos. Como se indicó anteriormente, no es necesaria la elevación de la temperatura por encima de 68 °C, para obtener una adsorción eficiente de tensioactivo y remoción de LPS desde el medio acuoso. También se ha encontrado sorprendentemente que la remoción eficiente de tensioactivo es obtenida a temperaturas incluso más bajas de 65 °C, 62 °C, 60 °C, 58 °C o 55 °C. Los diferentes pasos pueden ser ejecutados también a diferentes temperaturas, pero dentro del intervalo de 30 °C - 68 °C y por encima del punto de enturbiamiento del tensioactivo usado. En vista del mantenimiento de la funcionalidad de la gelatina, la temperatura preferida está entre 55 y 65 °C, tal como 57 °C - 60 °C, o 58 °C.

Por lo menos los pasos 2) y 3), pero preferiblemente todos los pasos 1) - 5) son ejecutados preferiblemente a una temperatura de por lo menos 35 °C, más preferiblemente de por lo menos 40 °C, incluso más preferiblemente de por lo menos 45 °C, de por lo menos 50 °C, con máxima preferencia de por lo menos 55 °C. La solución de gelatina es más líquida, es decir, menos viscosa a temperaturas más altas, lo cual incrementa la manipulación de la solución y el contacto con el adsorbente.

El pH del medio está preferiblemente entre 3.5 y 9.0, más preferiblemente entre 3.5 y 8.0, 4.0 y 8.0, 4.0 y 6.0, incluso más preferiblemente entre 4.5 y 5.5. Por debajo de un pH de 3.5 - 4, la gelatina se torna susceptible a la hidrólisis, en particular a temperaturas por encima del punto de fusión de la gelatina. Por ello, el pH del medio está preferiblemente por encima de estos valores de pH.

La persona experta sabe que la gelatina puede ser incubada o mantenida a un bajo pH sin pérdida significativa de su funcionalidad, pero que esto depende de la temperatura y tiempo de incubación. Cuanto más bajo sea el pH, menor debería ser la temperatura, y/o menor debería ser el tiempo de incubación, con objeto de no perder funcionalidad. Sin embargo, la persona experta será capaz de determinar las condiciones apropiadas respecto a pH, tiempo y temperatura, para evitar la hidrólisis de la gelatina. Muy sorprendentemente se ha encontrado que cuando el método es ejecutado a un bajo pH, el LPS es retirado incluso más eficientemente. Desde luego, debe tenerse cuidado de evitar la hidrólisis de la gelatina cuando se ejecute el método a bajo pH, es decir, cuando se ejecute el método a una temperatura moderada que no excede por ejemplo 58 °C, 60 °C o 65 °C. Con este fin, el pH del medio acuoso que comprende la gelatina está preferiblemente entre 4.0 y 6.0 a través de los pasos del método, más preferiblemente entre 4.5 y 5.5. A tal pH, la temperatura preferiblemente es de aproximadamente 57 - 58 °C. El tiempo total en donde el medio está a tal pH bajo durante el método es preferiblemente 2 horas o menos, más preferiblemente 1 hora o menos, e incluso más preferiblemente media hora o menos.

El medio acuoso en el paso 1) puede comprender cualquier concentración de gelatina. En una realización preferida, el medio acuoso en el paso 1) comprende por lo menos 2 % p/p, preferiblemente por lo menos 8 % p/p y más preferiblemente por lo menos 12 % p/p de gelatina disuelta e incluso más preferiblemente por lo menos 20 % p/p de gelatina. El medio acuoso puede comprender hasta 30 % p/p de gelatina disuelta o incluso más, tal como 37 % p/p, dependiendo del tamaño de las moléculas de gelatina. Un medio acuoso con una baja concentración de gelatina tendrá una temperatura de gelificación más baja que el medio que tiene una elevada concentración de gelatina, permitiendo ejecutar el método a una temperatura más baja, lo cual puede ser ventajoso en caso que la incubación sea ejecutada a un bajo pH. Por encima de 30 - 37%, el medio acuoso puede tornarse demasiado viscoso para un apropiado procesamiento, en particular para el contacto y remoción del adsorbente. Sólo en el caso que se use gelatina con tamaño relativamente pequeño, tal como hidrolizado de gelatina puede incrementarse la concentración hasta aproximadamente 40 % p/p. La elevación de la temperatura para reducir la viscosidad de tales soluciones altamente concentradas de gelatina puede dar como resultado indeseadas hidrólisis de gelatina, pérdida de peso molecular, viscosidad y valor de fuerza de gelificación.

En el paso 2), la relación en peso de gelatina a tensioactivo no iónico añadido es preferiblemente 2000:1 o menos, más preferiblemente 500:1 o menos, incluso más preferiblemente 250:1 o menos, con máxima preferencia 50:1 o menos. La relación en peso de gelatina a tensioactivo no iónico añadido es preferiblemente 50 - 5:1. A mayores relaciones en peso, es decir, donde hay relativamente más gelatina, no todo el LPS será enlazado por el tensioactivo. En el otro extremo, a relaciones más bajas, puede perjudicarse el rendimiento de gelatina, o la absorción es subóptima a elevados niveles de tensioactivo. En tal caso, pueden requerirse más rondas de adsorción para la óptima remoción de tensioactivo. Sin embargo, dado que el LPS tiende a unirse de modo más fuerte al adsorbente, en particular en el caso de carbón activado, usualmente se elige usar un exceso de adsorbente comparado con el tensioactivo, con objeto de retirar en un solo paso tanto tensioactivo como sea posible.

En el paso 2) del método, el tensioactivo es añadido preferiblemente a una concentración de 0.015 -1.0 % p/p, más preferiblemente de 0.020 - 0.50 % p/p, permitiendo la remoción apropiada del mismo, después de haberse unido al LPS en el medio, permitiendo todavía un elevado contenido de gelatina para la eficiente habilidad de procesamiento. La concentración apropiada de tensioactivo puede ser ajustada también al contenido de LPS en la gelatina. Si el material de gelatina de partida tiene ya un contenido relativamente bajo de LPS, puede necesitarse una concentración relativamente baja (que no excedan demasiado el valor CMC) de tensioactivo, lo cual facilita la remoción del tensioactivo.

El paso 2) del método comprende preferiblemente la incubación del medio durante por lo menos 1 minuto después de la adición del tensioactivo, más preferiblemente 2 minutos a 1 hora, incluso más preferiblemente durante 5-30 minutos, con máxima preferencia durante 15-30 minutos, con objeto de permitir una unión apropiada del LPS al tensioactivo. La incubación demasiado larga, particularmente por encima de 60 °C, incrementará el riesgo de hidrólisis de la gelatina y pérdida de funcionalidad (fuerza de gelificación, viscosidad).

Con objeto de suministrar la remoción óptima del tensioactivo, y el LPS desde el medio, los pasos 3) y 4) comprenden preferiblemente el paso del medio obtenido después del paso 2) a través de uno o más elementos de filtro que comprenden el adsorbente sólido. Los sistemas de filtro que contienen carbón activado, por ejemplo filtro de cartucho 3M ZetaCarbon del tipo R55S o R30L3S (3M, EE.UU.) han probado ser muy adecuados. La gelatina puede ser recuperada adicionalmente desde el filtrado si se desea, por ejemplo mediante aislamiento. Tal paso de filtración puede ya cuidar de la recuperación de la gelatina con contenido reducido de endotoxina en la forma prevista, es decir, sin la necesidad de pasos adicionales de recuperación. En tal caso, los pasos 3), 4) y 5) comprenden el paso del medio obtenido después del paso 2) a través de uno o más elementos de filtro que comprenden el adsorbente sólido.

En otra realización, en el paso 3) del método, el adsorbente sólido es añadido preferiblemente al medio en una relación en peso frente al tensioactivo de por lo menos 2.5:1, más preferiblemente de por lo menos 3.0:1, con máxima preferencia de por lo menos 3.5:1. El adsorbente sólido es añadido preferiblemente al medio en una concentración de 0. 1 - 3 % p/p, preferiblemente de 0.5 - 1 % p/p. En el caso en que se usen elementos o sistemas de filtro, puede preferirse usar cantidades similares de adsorbente en el sistema de filtro.

El paso 5) de recuperación comprende preferiblemente filtración, separación del adsorbente sólido del medio. Esta realización es ventajosa cuando el material adsorbente está mezclado, por ejemplo como material particulado, en el medio acuoso que comprende la gelatina y el tensioactivo. Como se indicó anteriormente, el adsorbente puede, aunque menos preferido, ser también sometido a centrifugación, o ser enlazado a un vehículo o similar. Como se indicó anteriormente, el paso de filtración puede ser combinado también con el paso 3) y 4), mediante el uso de elementos de filtro que comprenden el material adsorbente.

De acuerdo con la presente invención, es posible trabajar en bajas condiciones de sal, dado que la presencia de sal no es necesaria para llevar a cabo la invención. Aunque es posible incluir sal, por ejemplo para disminuir el punto de enturbiamiento de un tensioactivo previsto para uso en el método de la invención, esto no es necesario. En contraste, las condiciones de los pasos del método deben ser ejecutadas por debajo del punto de enturbiamiento del tensioactivo usado, de modo que no hay necesidad de disminuir el punto de enturbiamiento. Además, en la gelatina purificada final no se prefieren elevadas concentraciones de sal, necesarias para tener un efecto sobre el punto de enturbiamiento del tensioactivo, y pueden afectar la funcionalidad de la misma.

Por ello, en una realización atractiva de la invención, el medio acuoso tiene un contenido de sal de 100 mM o menos, preferiblemente de 80, 70, 60 o 50 mM o menos, con máxima preferencia de 40, 30 o 20 mM o menos durante los pasos 1) - 5). De acuerdo con ello, es posible suministrar una solución de gelatina que tiene bajo contenido de endotoxina, con bajo contenido de sal, sin necesidad de incluir ningún paso de eliminación de sal. Con este fin, el medio recuperado del paso 5) tiene preferiblemente un contenido de sal de 100 mM o menos, más preferiblemente 80, 70, 60 o 50 mM o menos, con máxima preferencia de 40, 30 o 20 mM o menos.

Dado que el método de la invención da como resultado una gelatina que tiene bajo contenido de endotoxina, sin la necesidad de un paso de centrifugación, preferiblemente el método de la invención está libre de un paso de centrifugación. Tal paso de centrifugación dificulta y hace costosa la recuperación de gelatina con bajo contenido de endotoxina a gran escala. Dado que el método de la invención puede suministrar gelatina baja en endotoxina, por ejemplo mediante filtración, preferiblemente se evita un paso de centrifugación.

Dado que el método de la invención da como resultado gelatina que tiene bajo contenido de endotoxina, sin la necesidad de un paso laborioso de ultrafiltración, el método de la invención es preferiblemente libre de un paso de ultrafiltración. Esto no sólo es ventajoso desde el punto de vista de la efectividad de costos, sino que también es posible obtener gelatina con tamaño grande, por ejemplo con elevada fuerza de gelificación, que tiene un promedio de peso molecular de 100 kDa o mayor, tal como 150 kDa o 200 kDa o 250 kDa o mayor, gelatinas que no pasarían la membrana de ultrafiltración.

Además, el rendimiento es significativamente menor cuando se usa ultrafiltración. en otra realización, la solución acuosa está sustancialmente libre de acetona, preferiblemente de cualquier cetona durante los pasos 1) - 5). En contraste con los métodos conocidos en la técnica, el método de la presente invención no requiere la adición de ninguna cetona, que es en efecto un contaminante indeseado. en otra realización, la solución acuosa es sustancialmente libre de alcohol, en particular etanol.

En una realización particular, el método comprende además la incubación del medio acuoso, con un agente oxidante. Se ha encontrado sorprendentemente que el contenido de LPS puede ser reducido adicionalmente cuando durante el método reivindicado se añade un agente oxidante al medio, en particular durante cualquiera de los pasos 1), 2) o 3), preferiblemente durante el paso 2).

El agente oxidante es elegido preferiblemente de entre peróxido de hidrógeno y ácido peracético y mezclas de ellos. El peróxido de hidrógeno es el más preferido.

El agente oxidante es añadido preferiblemente en una concentración de 0.5 - 2.5 % p/p.

En el método reivindicado, el medio acuoso en el paso 1) tiene preferiblemente un contenido de lipopolisacárido de 1000 EU/g de peso seco de gelatina o menos. En caso que el contenido de LPS sea mayor, el medio puede ser pretratado por ejemplo mediante un paso de cromatografía de intercambio iónico, tal como se describe por ejemplo en el documento en EP0739630, para la remoción de endotoxina de sangre entera, o más en general por Hirayama y Sakata, arriba. También es posible iniciar con una preparación de gelatina que tiene un contenido mayor de LPS, y ejecutar el método de la invención repitiendo los pasos 2) - 5) con materiales frescos en pasos 2) y 3) repetidos. El medio acuoso del paso 5) puede ser usado luego para suministrar el dicho medio en un nuevo paso, si se requiere.

Si el material de partida en el paso 1) tiene un contenido de LPS por debajo de 1500 - 1000 EU/g, puede obtenerse una gelatina purificada, en una ronda individual de los 5 pasos como se describió, que comprende menos de 100, menos de 50, menos de 20, menos de 10, menos de 5 o incluso menos de 2 o incluso menos de 1 EU de lipopolisacárido por gramo de gelatina (EU/g). El método de acuerdo con la invención suministra una gelatina purificada en una ronda individual de los 5 pasos como se describió, que comprende por lo menos 50 veces menos de LPS, preferiblemente por lo menos 100 veces, más preferiblemente por lo menos 150 veces, incluso más preferiblemente por lo menos 200 veces y con máxima preferencia por lo menos 250 veces menos de LPS, comparado con el contenido de LPS del material de partida del paso 1). El término EU es conocido en la técnica y refleja “unidades de endotoxina”. Una EU es aproximadamente equivalente a 100 pg de lipopolisacárido de E. coli, la cantidad presente en aproximadamente 104-105 bacterias. En esta memoria, el término EU/g refleja el recuento de EU por peso seco de gelatina.

La divulgación se refiere también a gelatina, obtenible mediante el método de la invención, que está sustancialmente libre de sales de amonio cuaternario, que comprende moléculas derivadas de gelatina que tienen un peso molecular por encima de 100,000 Da, con máxima preferencia por encima de 120,000 Da, que tiene un contenido de lipopolisacárido de menos de 100 EU/g, más preferiblemente menos de 50 EU/g, incluso más preferiblemente menos de 20 EU/g, incluso más preferiblemente menos de 10 EU/g, incluso más preferiblemente menos de 5 EU/g, incluso más preferiblemente menos de 2 EU/g, con máxima preferencia menos de 1 EU/g. No hasta que se hizo la invención, había sido posible preparar una gelatina tal, baja en endotoxina gelatina. Los métodos conocidos de ultrafiltración suministran gelatinas, en donde las moléculas de gelatina no son más grandes que 100,000 Da, de modo que tales gelatinas no comprenden moléculas derivadas de gelatina que tienen un peso molecular por encima de 100 kDa. Tales gelatinas son, en el mejor de los casos, gelatinas o hidrolizados con baja fuerza de gelificación. Sólo mediante tratamiento con sales de amonio cuaternario a elevada concentración, se ha mostrado posible obtener gelatina de tipo B baja en endotoxina. Sin embargo, la presencia de sal puede tener un impacto en la funcionalidad de la gelatina. No obstante, la presente invención también suministra gelatina baja en endotoxina con elevado peso molecular, sin la necesidad de usar sales de amonio cuaternario. El término "moléculas derivadas de gelatina" pretende abarcar moléculas de péptido y proteína que fueron parte de la matriz de colágeno en la materia prima, que fue procesada para la fabricación de gelatina, como es conocido por ejemplo en la técnica.

En una realización, la invención suministra gelatina obtenible a través del método de la invención, que tiene un contenido de lipopolisacárido de menos de 2 EU/g, preferiblemente menos de 1 EU/g. Mediante el presente método pueden fabricarse gelatinas, por ejemplo de los tipos A y B, que tienen tal contenido bajo de LPS, mientras los métodos de la técnica suministran gelatinas con un contenido más alto de LPS.

En una realización particular, la invención se refiere a gelatina del tipo A, es decir, que tiene un punto isoeléctrico por encima de 7, preferiblemente por encima de 8, obtenible mediante el método de la invención, que comprende moléculas derivadas de gelatina que tienen un peso molecular por encima de 100,000 Da, con máxima preferencia por encima de 120,000 Da, que tiene un contenido de lipopolisacárido de menos de 100 EU/g, más preferiblemente menos de 50 EU/g, incluso más preferiblemente menos de 20 EU/g, incluso más preferiblemente menos de 10 EU/g, incluso más preferiblemente menos de 5 EU/g, incluso más preferiblemente menos de 2 EU/g, con máxima preferencia menos de 1 EU/g. En la técnica, la única gelatina tipo A con tal contenido bajo de endotoxina es fabricada mediante ultrafiltración, dando como resultado moléculas de gelatina más pequeñas que 100 kDa. Sin embargo, la presente invención suministra por primera vez gelatina tipo A que comprende moléculas más grandes de gelatina, mientras todavía tiene contenido muy bajo en endotoxina.

La gelatina de la invención tiene preferiblemente un promedio de peso molecular de entre 1500 Da y 250,000 Da, más preferiblemente entre 2000 y 200,000 Da, incluso más preferiblemente entre 5000 y 180,000 Da, con máxima preferencia entre 20,000 Da y 170,000 Da. La gelatina tiene preferiblemente un promedio de peso molecular por encima de 80,000 Da, preferiblemente por encima de 100,000 Da, con máxima preferencia por encima de 120,000 Da.

En una realización atractiva, la gelatina es libre de acetona, preferiblemente de cualquier cetona. Además, la gelatina es libre de alcohol, en particular alcoholes básicos, y también está libre de sales de amonio cuaternario.

En todavía otra realización, la invención se refiere a un medio acuoso que comprende por lo menos 2 % p/p de gelatina de la invención, teniendo dicho medio un contenido de sal de 100 mM o menos, preferiblemente 50 mM o menos, con máxima preferencia 20 mM o menos. El medio acuoso es preferiblemente libre de acetona y/o sales de amonio cuaternario y /o alcoholes, en particular alcoholes básicos. El medio acuoso comprende preferiblemente por lo menos 6 % p/p, preferiblemente por lo menos 10 % p/p, más preferiblemente por lo menos 15 % p/p y con máxima preferencia por lo menos 20 % p/p de gelatina.

La invención será mejor descrita ahora por la vía de ejemplos y figuras no limitantes.

La Figura 1 es una gráfica que muestra el efecto de la concentración de tensioactivo sobre la tensión superficial de una solución acuosa de gelificación a 25 °C. Se halla que la CMC de Triton X-100 es 0.015 - 0.018, igual a la dicha CMC en agua.

La Figura 2 es una gráfica que muestra la tensión superficial de soluciones acuosas de gelatina como función de la relación de adsorbente para retirar tensioactivo de Triton X-100 de la solución.

La Figura 3 es una gráfica que muestra el efecto de la longitud del fragmento de polioxietileno en diferentes especies de Triton usadas en la purificación. El eje X representa el número n en la CsH¹⁵-C⁶H⁴-O-(C²H⁴O)nH, y el eje Y muestra el contenido de LPS en EU/g en una gelatina que contiene LPS, después de la purificación.

Ejemplos

En la tabla 1 se lista una vista general completa de las gelatinas usadas en los diferentes ejemplos.

El método de análisis para determinar las propiedades de la gelatina es descrito en GME10.

En los ejemplos, la remoción de tensioactivo fue vigilada, como tensioactivo, dado que Triton X100 puede enmascarar los resultados de análisis LAL. Véase el ejemplo 4 para detalles adicionales.

A menos que se indique de otro modo, la mezcla fue ejecutada con una velocidad de 750 rpm usando un mezclador de baño de agua de IKAWerke Alemania, modelo R015 powery una barra de agitación magnética estándar de longitud de 4-5 cm.

A menos que se indique de otro modo, el peso de gelatina indicado incluye un contenido de humedad de 10 - 13 % p/p.

Ejemplo 1

Purificación de endotoxina desde soluciones acuosas de gelatina de diferente contenido de LPS

Se prepararon soluciones de gelatina al 6.66 % p/p, mediante peso de 50 g de los lotes 1, 3, 4, 5, 6 y 8, 15, 16 y 17 de gelatina con diferentes contenidos iniciales de LPS, variando desde -1000 hasta aproximadamente 34,000 EU/g de gelatina, (véase la tabla 1.1) con 700 ml de agua. Las gelatinas mostradas en la Tabla 1 tienen un contenido de humedad entre 10.3 y 12.6 p/p %. Así, el contenido real de gelatina sobre base seca es 87.5 - 89.7%.

Se mantuvo la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos, para permitir que la gelatina hinchara/ hidratara. A continuación, se llevó a solución la gelatina mediante elevación de la temperatura hasta un máximo de 60 °C bajo mezcla constante durante 30 - 45 minutos con una velocidad de 750 rpm. El pH medido de la solución de gelatina estaba entre 5.2 y 5.6, no se hizo ajuste adicional de pH. Se tomó una muestra y se midió el contenido inicial de LPS. Se usaron el método Endosafe LAL de Charles River EE.UU. y el método de factor C recombinante EndoZyme de Hyglos GmbH (Alemania) para analizar los niveles de LPS en las gelatinas antes y después de la purificación.

Ambos métodos fueron usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para determinar el contenido de LPS. Para el análisis de LPS se disolvieron 1000 mg de gelatina en 40.0 ml agua desionizada libre de pirógenos. Se disolvió completamente la gelatina mediante calentamiento de la solución a 55 °C durante 30 - 45 minutos, se ajustó a 40 °C y se diluyó apropiadamente antes de ejecutar el análisis de LPS.

A continuación, se añadieron 1.4 g (0.18 % p/p) de Triton X100 (Carl-Roth, Alemania, número de producto 3051.4) a la solución de gelatina y, bajo mezcla constante con una velocidad de 750 rpm, se colocó la solución de gelatina -Triton X100 a 75°C durante 30 minutos.

A continuación, se añadió (0.7 % p/p) un mínimo de 5.0 g de carbón activado (Norit SX-Plus, Cabot, Países Bajos), seguido por una mezcla adicional durante 30 minutos (500-1000 rpm) a 60 °C. A continuación, se filtró la solución sobre un filtro de 0.45 pm (Phenex RC 26 mm, 0.45 pm (Phenomenex, Países Bajos) para retirar el carbón activado y se enfrió a 40 °C para análisis directo de LPS sobre la solución purificada, o se congeló a -20 °C y se liofilizó usando un liofilizador Christ Alpha 2-4LD Plus (MartinChrist, Alemania). Condiciones de liofilización al vacío: 0.04 mbar y -87 °C durante por lo menos 24 - 48 horas hasta que las soluciones secaron a un contenido de humedad de alrededor de 4 - 6%. No se realizó corrección de humedad antes del análisis de endotoxina.

La filtración de una solución inicial (no purificada) de gelatina sobre un filtro Phenex de 0.45pm no influyó en o redujo el nivel inicial de LPS en la gelatina.

A partir de los datos de la tabla 1.2 puede observarse que puede obtenerse una remoción muy eficiente de LPS, desde los materiales de partida. Con objeto de obtener gelatinas con un contenido de endotoxina tan bajo como 2 EU/g o menos, se prefiere iniciar con una solución de gelatina que tiene 1500 EU/g de endotoxina o menos.

Tabla 1.2: Reducción de LPS en diferentes lotes de gelatina

Ejemplo 2:

Variación de la concentración de tensioactivo

Se prepararon tres soluciones de gelatina al 6.66% p/p, como se describe para el ejemplo 1, usando los lotes 1, 2 y 15 de gelatina, que tienen un promedio de peso molecular y viscosidad casi similares, véase la tabla 1. Se añadieron a la solución diferentes cantidades de Triton X100 (Carl-Roth, número de producto 3051.4) (véase la tabla 3) seguido por mezcla a máximo 60 °C durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 5.0 g (0.7 % p/p) de carbón activado (Norit SX-Plus) a las pruebas 2-3-4-5. A continuación se mezcló a máximo 60 °C durante 30 minutos a 500 - 1000 rpm y se le retiró como se describe en el ejemplo 1, usando un filtro de 0.45 pm (Phenex RC 26mm, 0.45 pm). Se incrementó la cantidad de carbón activado para la prueba 6 a respectivamente 20 g, para asegurar que todo el Triton X100 será retirado de la solución purificada de gelatina. El análisis de tensión superficial confirmó que en verdad la concentración de Triton X100 se redujo a un valor por debajo de la CMC.

Después de la purificación, se almacenaron las gelatinas a -20 °C y se liofilizaron como se describió en el ejemplo 1. Las gelatinas liofilizadas fueron usadas para el análisis LAL de LPS.

La tabla 2 indica que una concentración de Triton superior a la CMC del mismo muestra ser ventajosa para la remoción de endotoxina.

Tabla 2: Reducción de LPS con diferentes niveles de Triton X100

Ejemplo 3

Tierra de diatomeas como agente de purificación de LPS

Se prepararon 600 ml de solución al 6.66 % p/p de gelatinas 1 y 9 a pH de 5.5, y se trataron con Triton X100 como se describió en el ejemplo 1. Después del paso de incubación de 30 minutos a una temperatura máxima de 60 °C, en lugar de carbón activado, se añadieron 70 gramos de tierra de diatomeas (Claracel CBL), prelavada con agua desionizada, seguido por 4 horas de mezcla continua a 50 °C. Después de 4 horas, se retiró la tierra de diatomeas mediante filtración (microfibra Whatman Glass calidad GF/C, diámetro de 55 mm, 2 mm. Schleicher & Schuell, Alemania). Se almacenó a - 20 °C durante la noche la solución filtrada de gelatina, seguido por liofilización (véase el ejemplo 1 para las condiciones de liofilización). También se almacenó a -20% una muestra al 6.67% no purificada de gelatina 1 y 9 y se liofilizó. Se analizó el contenido de LPS sobre las muestras purificadas y no purificadas, liofilizadas de gelatina, véase la tabla 3.

Puede retirarse de la gelatina una cantidad significativa de la endotoxina, usando tierra de diatomeas como adsorbente. Sin embargo, la purificación de LPS es algo menos eficiente, comparada con la del uso de carbón activado, véase gelatina 1. Sin embargo, también es posible aplicar tierra de diatomeas en un paso de prepurificación.

Tabla 3: Disminución de LPS con tierra de diatomeas como adsorbente

Ejemplo 4:

Variación de la cantidad de adsorbente

Se analiza la eficiencia de remoción de tensioactivo por el adsorbente, midiendo la tensión superficial de las muestras, antes de la adición del tensioactivo al medio que comprende la gelatina, y se compara con la tensión superficial medida después del tratamiento con adsorbente y remoción del mismo. La tensión superficial cae en presencia de tensioactivo, por ejemplo Triton X100. La Figura 1 muestra que la tensión superficial inicial de una solución al 1 % p/p de gelatina, de 65-67 mN/m cae significativamente comenzando a una concentración de Triton de 0.001 % p/p, sobre la base del peso de la solución. La concentración crítica de micela de Triton X100 está entre 0.014 y 0.018% p/p.

La tensión superficial fue analizada usando el equipo Digidrop (GBX, Francia) para análisis de ángulo de contacto / tensión superficial. El diámetro de la aguja fue de 0.81 mm y la velocidad de formación de caída fue de 0.384 pl/s. El volumen de caída máxima es 9.900 pl. La tensión superficial fue calculada usando la ecuación ds / de.

En el caso en que se usen elevadas cantidades de tensioactivo, puede necesitarse una cantidad correspondientemente más elevada de adsorbente, para retirar el dicho tensioactivo de la solución. También es posible repetir el paso de adsorción con objeto de retirar cualquier tensioactivo residual, no retirado en una primera ronda de adsorción, hasta que se obtiene un valor de tensión superficial de 65 - 67mN/m, igual a la gelatina pura.

Se prepararon soluciones de 50, 60 y 100 g de gelatina 7 (véase la tabla 1) en 700 ml de agua, como se describe en el ejemplo 1, dando como resultado concentraciones de gelatina de 6.66, 8.0 y 12.5 % p/p, respectivamente. Las cantidades añadidas de Triton X100 (Carl-Roth) fueron 1.4 g (0.18 % p/p) para una solución al 6.67% de gelatina, 1.7g (0.216 % p/p para una solución al 8% de gelatina y 2.8 g (0.36 % p/p) para una solución al 12.5% de gelatina. La mezcla fue realizada a una velocidad de 500 - 1000 rpm a 60 °C.

Se variaron las cantidades añadidas de carbón activado (Norit SX-Plus) y también se incrementaron en línea con el incremento de la concentración de Triton X100, véase la tabla 4. Después de la adición de carbón activado, se mezcló la mezcla por otros 30 minutos a 60 °C a una velocidad de 500-1000 rpm. Finalmente, se filtraron las soluciones del mismo modo que en el ejemplo 1 usando filtro de 0.45 |jm (Phenex RC 26mm, 0.45 |jm). Se usaron las soluciones filtradas para medir la tensión superficial, véase la tabla 4. De la tabla 4 y la figura 2 puede observarse que a una relación en peso de carbón activado:Triton X100 de 2.5 o mayor, se tiene como resultado una tensión superficial cercana a la de la solución de gelatina sin tensioactivo añadido. A una relación en peso de 3 o mayor, en particular de 3.5 o mayor, la tensión superficial es igual a aquella de la solución inicial de gelatina, indicando que el tensioactivo ha sido retirado de modo sustancialmente completo. Una relación mayor (por encima de 3.5) de carbón activado:Triton da como resultado una reducción incluso más eficiente de Triton X100. Véase también la figura 2.

Tabla 4: Relación de carbón activado / Triton y efecto sobre la tensión superficial

Ejemplo 5

Variación de la temperatura, influencia en la remoción de LPS funcionalidad.

Sobre la gelatina 1 se ejecutó una prueba igual a la descrita en el ejemplo 2. Se realizó ajuste de pH hasta un valor de 5.5. Después de la adición de Triton X100, se mezcló la solución a 60 °C durante 15 minutos, y a continuación se ajustó la temperatura a las temperaturas listadas en la tabla 5 seguido por una mezcla adicional de máximo 30 minutos a 500 - 1000 rpm. Se usaron dos concentraciones diferentes de Triton X100, 0.18 y 0.026 p/p %.

A continuación, se realizó tratamiento con carbón activado y filtración de la solución, de acuerdo con el ejemplo 1. Adicionalmente al análisis de LPS, también realizó análisis de la viscosidad de las soluciones así como del promedio de peso molecular de la gelatina, como un indicativo de la funcionalidad de la gelatina después del tratamiento. Se analizó la viscosidad de acuerdo con el método descrito en el GME10. Se midió la distribución de peso molecular, de acuerdo con Olijve et.al., arriba.

Las gelatinas fueron liofilizadas antes del análisis de LPS, como se describió anteriormente.

Tabla 5: Variación de la temperatura a pH 5.5 - gelatina 1

Puede observarse claramente que a una temperatura de 90 °C, la gelatina es hidrolizada y pierde su funcionalidad. La viscosidad disminuye desde un valor inicial de 4.4 hasta 0.8 mPas y el promedio de peso molecular disminuye desde 130 hasta 46 kDa, es decir, una pérdida de peso molecular de 65%. También a una temperatura de 80 °C, la reducción en el peso molecular y viscosidad son igualmente significativas. Sin embargo, a temperaturas de 65 °C o menos (por debajo del punto de enturbiamiento de Triton X100), donde se previene de manera significativa la hidrólisis, se mantiene la funcionalidad y, sorprendentemente, se observa una remoción muy eficiente de LPS, que es igual a, o a concentración más baja de Triton X100, incluso ligeramente mejor que a temperaturas mayores.

Ejemplo 6

Variación de pH y temperatura, influencia sobre la remoción de LPS y funcionalidad

Este ejemplo fue ejecutado como se describió en el ejemplo 5. Se usaron las gelatinas 1,2, 3, 7, 8 y 10 para la purificación. Adicionalmente a la temperatura, también se ajustó y varió el pH de la solución de purificación. Después de la adición de Triton X100 (0.026 y 0.18 % p/p), se ajustó a temperatura desde 57.5 a 90 °C como se indica en la tabla 6.1 y seguido por mezcla durante 30 minutos a 500 - 1000 rpm. A continuación, se añadieron 5.0 gramos de carbón activado (Norit SX-Plus) y se mezcló con la solución por otros 15 - 30 minutos a 500 - 1000 rpm. Luego se filtró la solución usando un filtro de 0.45 pm, como se describió en los ejemplos previos. Se liofilizaron las gelatinas antes del análisis de LPS, como se describió anteriormente. La variación de temperatura de la tabla 6.1 fue ejecutada con gelatina 7 con un ajuste de pH hasta pH 4.5. La temperatura se tornará mucho más crítica en relación con la hidrólisis de gelatina a valores más bajos de pH. Aparte del análisis de endotoxina (LPS), también se midieron los valores de peso molecular y viscosidad después de la purificación, para observar la posible hidrólisis de gelatina y pérdida en las propiedades de la gelatina. Se realizó el análisis de viscosidad y distribución de peso molecular, usando los métodos mencionados en el ejemplo 5.

Tabla 6.1: Variación de temperatura a un pH de 4.5 - gelatina 7

Se observa que una temperatura por encima de 65 °C, en particular a 80 y 90 °C, y un bajo pH de 4.5 conduce a pérdida de peso molecular y viscosidad bajo las condiciones de prueba usadas, véase la tabla 6.1. Por ello, la gelatina es mantenida preferiblemente a 65 °C o menos durante los pasos del método, durante 15 minutos o menos. Con máxima preferencia, a temperatura durante los pasos del método no excede 60 °C si el pH es 4.5 o menos, tal como 4.0.

Para confirmar los resultados de la tabla 6.1 se probó un intervalo más amplio de pH, usando gelatinas 2, 3 y 7 a temperaturas de 57.5 °C, es decir, por debajo y por encima de la temperatura donde se presenta hidrólisis de la gelatina (60 °C).

En la tabla 6.2 se listan los intervalos aplicados de pH. El ajuste de pH de la solución de gelatina fue hecho antes de la adición de Triton X100, con ácido clorhídrico con 0.1M (Sigma Aldrich, 258148-500ML) o NaOH 0.1M (Sigma-Aldrich, EE.UU., 221465-500G). En lugar de ácido clorhídrico, para bajar el pH también pueden usarse otros ácidos, tales como ácido sulfúrico (Sigma-Aldrich). Debe observarse que la concentración de cloruro después del ajuste de pH estuvo por debajo de 50mM, concentración que no afecta el punto de enturbiamiento del tensioactivo usado.

La preparación de la solución de gelatina, el Triton X100 (0.18 % p/p), adición de carbón activado (5 gramos, 0.7 % p/p), mezcla y filtración de las muestras de gelatina fueron iguales a los métodos descritos en los ejemplos previos. Las gelatinas fueron liofilizadas antes del análisis de LPS, como se describió anteriormente. Los resultados de purificación de LPS a 57.5 °C y el peso molecular y viscosidad medidos después de la purificación, son suministrados en la tabla 6.2.

La variación en el pH a 57.5 °C no dio como resultado separación de fases de la fase acuosa micelar.

Tabla 6.2: Variación de pH a 57.5 °C, Tritón X1000.18% (p/p)

La variación de pH a 57.5 °C da como resultado pérdida limitada en el peso molecular y viscosidad a valores de pH por encima de 4.5, véase la tabla 6.2. La purificación significativa de LPS sin pérdida en el peso molecular /viscosidad es obtenida entre valores de pH de 4.5 y 5.6. En particular para gelatina 7.

Se probaron diferentes gelatinas (1, 2, 3, 7, 8, 10) a una temperatura de 57.5 °C a pH de 4.5 y 5.5, para comparar la eficiencia de purificación sin pérdida en peso molecular y viscosidad, tabla 6.3. La preparación de la solución de gelatina fue ejecutada como se describió anteriormente. Si se requiriese, el pH fue ajustado a 4.5 y 5.5 con ácido clorhídrico 0.1M (Sigma Aldrich, 258148-500ML) o NaOH 0.1M (Sigma-Aldrich, 221465-500G). En lugar de ácido clorhídrico pueden usarse también otros ácidos tales como ácido sulfúrico (Sigma-Aldrich).

La concentración usada de Triton X100 fue de 0.18 % p/p y se mezcló un mínimo de 5 g de carbón activado. La solución de gelatina fue filtrada antes del análisis de LPS, como se describió para los ejemplos previos. Como se describió arriba, antes del análisis de LPS, se liofilizaron las gelatinas.

Avalores de pH de 4.5 es visible una purificación mejorada de LPS, comparada con 5.5. La influencia de la purificación mejorada de LPS a pH más bajo parece ser mayor a valores iniciales más altos de LPS. El pH más bajo es preferido en caso que se requieran valores bajos de LPS (< 20 EU/g). No se observó cambio significativo en la distribución de peso molecular, entre pH 4.5 y 5.5 para las gelatinas probadas, a 57.5 °C, valores no listados.

Tabla 6.3: Remoción de LPS a pH 4.5 y 5.5 a 57.5 °C para diferentes gelatinas

Ejemplo 7

Remoción de LPS por encima y por debajo del punto de enturbiamiento del tensioactivo

El propósito era medir la remoción de LPS desde soluciones de gelatina a condiciones por debajo del punto de enturbiamiento del tensioactivo usado, comparada con las condiciones por encima del punto de enturbiamiento. Con objeto de mantener las condiciones similares, se usaron condiciones de temperatura de 57.5 °C mientras se usaba Triton X-100 (punto de enturbiamiento de 68 °C) así como Triton X-114 (Sigma-Aldrich, punto de enturbiamiento de 23 °C) como tensioactivo.

Se usó la gelatina 7 para preparar una solución de gelatina, como se describió en los ejemplos previos. El pH aplicado fue de 4.7. Se usaron Triton X-100, Triton X-114 o mezclas de ellos como tensioactivo, en una concentración de 0.18 % p/p. Después de la adición de tensioactivo al medio acuoso de gelatina, se ajustó a temperatura a 57.5 °C, seguido por mezcla durante 15-30 minutos. Se añadió carbón activado en una cantidad de por lo menos 5 gramos (0.7 % p/p) y se realizó una mezcla adicional durante 15-30 minutos. Después de la filtración, como se describe en los experimentos previos, se liofilizaron las gelatinas antes del análisis de LPS, como se describió anteriormente.

En la tabla 7 se dan los resultados. Puede verse que cuando se usa Triton X-100 a una temperatura por encima del punto de enturbiamiento del mismo, es decir, a una temperatura de 75 °C, se obtiene una solución de gelatina que todavía contiene 27 EU/g de LPS, comparado con solamente 15 EU/g cuando el método fue ejecutado a 57.5 °C, es decir, por debajo de dicho punto de enturbiamiento. Esto indica que la remoción de LPS es más eficiente cuando el método es ejecutado por debajo del punto de enturbiamiento del tensioactivo. Adicionalmente, a 75 °C, ocurre una significativa hidrólisis de gelatina, dando como resultado una pérdida indeseada de viscosidad y funcionalidad, véase por ejemplo el ejemplo 6. A 75 °C, la viscosidad disminuyó de 5.8 mPas a aproximadamente 4.9 mPas, mientras a 57.5 °C, la viscosidad permaneció en 5.8 mPas. El uso de Triton X-114 at 57.5 °C dio como resultado una solución de gelatina que todavía tenía 114 a 150 EU/g de LPS, indicando que, en comparación con Triton X-100 a 75 °C, es decir, ambos en condiciones por encima del punto de enturbiamiento del respectivo tensioactivo, Triton X-100 da como resultado una mejor remoción de LPS. A la misma temperatura (a 57.5 °C, es decir, por debajo del punto de enturbiamiento de Triton X-100 pero por encima del de Triton X-114) la diferencia en la remoción de LPS es incluso más pronunciada.

A partir de un experimento de mezcla, es claro que cuanto mayor sea la cantidad relativa de Triton X-100, comparada con la de Triton X-114, mejor es la remoción de LPS.

Tabla 7: Triton X114 y Triton X100 como tensioactivos

Ejemplo 8

Efecto de la concentración de gelatina sobre la remoción de LPS.

Se ha ejecutado una prueba como se describió en el ejemplo 1, con gelatina 7 en donde la concentración de gelatina varió desde 6.66 % p/p a 10 % p/p y 15 % p/p, véase la tabla 8. La concentración de Triton X100 fue incrementada en igual relación a la concentración de gelatina. Para una concentración de gelatina de 6.67%, se aplicó 1.4 g (0.18 % p/p) de Triton X100. Para una solución de gelatina al 10 % p/p se usaron 2.1 g (0.27 % p/p) y para una solución de gelatina al 15 % p/p se usaron 3.2 g (0.40 % p/p) de Triton X100. En línea con el Triton X100, también se incrementaron las cantidades añadidas de carbón activado, de 5 gramos (0.7 % p/p) para la solución de gelatina al 6.66%, a 7.5 gramos (1.05 % p/p) y 11.3 gramos (1.6 % p/p) para las soluciones de gelatina al 10 y 15% (p/p), respectivamente. Se realizó la mezcla durante los diferentes pasos de purificación, a 500 - 1000 rpm durante 15-30 minutos. Se filtraron las gelatinas utilizando filtración sobre un filtro de 2pm (filtros de microfibra Whatman® Glass calidad GF/C, diámetro de 55 mm, 2 pm (Schleicher & Schuell), usando un embudo Buchner. Se liofilizaron en las gelatinas antes del análisis de LPS, como se describió anteriormente.

A mayores concentraciones de gelatina, el paso de filtración para retirar el carbón activado requiere más esfuerzos.

Para confirmar las posibles trazas remanentes de Triton X100, que puedan influir en el análisis de LPS / LAL, se ejecutaron mediciones de la tensión superficial como se describió en el ejemplo 4 arriba. Los resultados de tensión superficial son iguales/cercanos a la gelatina original que no contenía Triton X100.

Tabla 8: Efecto de las concentraciones de gelatina sobre la remoción de LPS, gelatina 7, pH 4.7 y 57.5 °C

La purificación de LPS es difícilmente afectada por la concentración de gelatina. También se midió una purificación efectiva en soluciones altas, 15 % p/p de gelatina.

Ejemplo 9:

Comparación de diferentes Tritones.

Se prepararon soluciones al 6.66 % p/p de gelatina como se describió en el ejemplo 1, usando el lote 5 de gelatina. Se añadió 0.18 % p/p de diferentes especies de Triton a las soluciones de gelatina, seguido por mezcla a 55 °C durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 5.0 g (0.7 % p/p) de carbón activado (Norit SX-Plus), se mezcló a 55 °C durante 30 minutos a 500 - 1000 rpm y se le retiró como se describió en ejemplo 1, usando un filtro de 0.45 pm (Phenex RC 26mm, 0.45 pm). Después de la purificación, se almacenaron las gelatinas a -20 °C y se liofilizaron como se describió en el ejemplo 1. Las muestras de gelatina purificadas y no purificadas fueron almacenadas a -20 °C y se liofilizaron antes del análisis de LPS.

Se observó que con las especies de Triton que tienen la fórmula CsH¹⁵-C⁶H⁴-O-(C²H⁴O)nH, en donde n está entre 8 y 13, pudo lograrse un bajo contenido de LPS de 20 EU o menos. La gelatina purificada tuvo un peso molecular y una viscosidad comparable con la de la gelatina antes de la purificación.

Tabla 9: Reducción de LPS con diferentes Tritones a 55 °C

La Figura 3 muestra una gráfica en donde se usan Triton X100, Triton X102, Triton X114 y Triton X165 en la purificación de gelatina. La gráfica muestra que cuando el valor n está entre 8 y 13, específicamente entre 8.5 y 12.5 se obtiene una mejor purificación de aproximadamente 20 EU/g o menos. Se nota que el uso de Triton X-114 (n de 7.5) y Triton-X165 (n de 16) también da como resultado la reducción del nivel del contenido de LPS, en un LPS que contiene gelatina, pero no en los niveles obtenidos con los Tritones que tienen un valor "n" entre 8 y 13, tales como Triton X-100 y Triton X-102.

Ejemplo 10:

Purificación de gelatina de hueso tipo B.

Las condiciones de prueba son iguales a los ejemplos descritos previamente.

Se preparó una solución al 6.66% (p/p) de las gelatinas 12, 13 y 14 y se mantuvo la temperatura en 57.5 °C. No se ajustó el pH de la solución de gelatina. Se añadió Triton X100 a una concentración de 0.18 % p/p y se mezcló durante 30 minutos. A continuación, se añadió una cantidad de 5.0 g (0.7 % p/p) de carbón activado, seguido por una mezcla adicional de 15 minutos. Finalmente, se filtraron las soluciones de gelatina, como se describió anteriormente. Se mantuvo la temperatura en 57.5 °C. Se midió el nivel del LPS de la solución filtrada de gelatina directamente, o primero se congeló a -20 °C seguido por liofilización como se describió en los ejemplos previos.

El método de purificación del Triton X100 es también muy efectivo para purificar gelatinas tipo B hasta niveles por debajo de 20 Eu/g. Los niveles más bajos de LPS purificados son obtenidos en el caso en que el nivel de LPS en la gelatina de partida es más bajo.

Tabla 10: Purificación de gelatina tipo B

Ejemplo 11:

Purificación de gelatina tipo B de hueso a diferentes valores de pH

Las condiciones fueron iguales a las condiciones usadas en el ejemplo 10. Se preparó la solución de gelatina 12 y se ajustó el pH a valores entre 4 y 6 usando ácido clorhídrico 0.1M o hidróxido de sodio 0.1M, ambos de Sigma-Aldrich.

Se liofilizaron las gelatinas antes del análisis de LPS, como se describió anteriormente.

Tabla 11: Gelatina 15, tipo B, purificación a diferentes valores de pH a 57.5 °C

Se observa un efecto del pH. En particular a valores por debajo de 6.0, se observó mejora en la purificación de LPS.

Ejemplo 12:

Purificación de gelatina tipo A de pescado.

Las condiciones de prueba fueron como se describió para los ejemplos 10 y 11.

Se preparó una solución al 6.66% (p/p) de gelatina 11 a 57.5 °C y se añadió Triton X100 a una concentración de 0.18 % p/p. a continuación, se añadió una cantidad de 5.0 g de carbón activado, seguido por una mezcla adicional durante 15 minutos. Finalmente, se filtró la solución como se describió anteriormente. Se mantuvo la temperatura en 57.5 °C.

No se ajustó el pH de la solución de gelatina y se mantuvo en 5.7. Las gelatinas fueron liofilizadas antes del análisis de LPS, como se describió anteriormente.

Tabla 12: Purificación de gelatina tipo A de pescado:

La purificación con Triton X100 es muy eficiente para purificar gelatina de pescado con elevado contenido de LPS. Se observó que el nivel de purificación para la gelatina tipo A de pescado puede ser mejorado adicionalmente, disminuyendo el pH de la solución de gelatina de pescado hasta valores entre 4.5 y 5.5. Puede ejecutarse una purificación adicional mediante repetición de los pasos 2) - 5), para obtener niveles <20 / <10 / <5 EU/g, como resultado del elevado nivel inicial de LPS.

Ejemplo 13:

Diferentes métodos de remoción de carbón activado

Se preparó una solución de gelatina 7 como se mencionó en los ejemplos previos.

Se aplicó una concentración de Triton X100 de 0.18 % p/p. Se mezcló la solución durante 30 minutos a 750 rpm a 57.5 °C. A continuación, se añadieron 5 gramos (0.7 % p/p) de carbón activado seguido por una mezcla adicional durante 15-30 minutos a 57.5 °C. Después de la incubación, se retiró el carbón activado por tres diferentes vías: 1. Filtración sobre un filtro de 0.45 |jm, como se describió en los ejemplos previos

2. Filtración sobre un filtro de 2 jm (filtros de microfibra de Whatman®, calidad GF/C, diámetro de 55mm, 2 jm (Schleicher & Schuell), usando un embudo Buchner. Los poros de filtro más grandes son benéficos para el procesamiento.

3. Filtración sobre tierra de diatomeas no activada (Clarcel CBL, Ceca Chemicals, Francia, o Sigma-Aldrich D3877, Sigma-Aldrich, EE.UU.), usando un embudo Buchner. Se usaron 7.5 - 10 gramos de tierra de diatomeas por 125 gramos de solución al 6.67% de gelatina que contenía 0.18 % p/p de Triton X100 y 0.7 % p/p de carbón activado. La tierra de diatomeas es una ayuda de filtración bien conocida, usada por ejemplo en el proceso de producción de gelatina.

La tensión superficial de las soluciones filtradas de gelatina mencionadas en la tabla 13 fue de 66-67 mN/m, igual a la de la solución de control de gelatina no tratada (datos no mostrados).

Todos los 3 métodos de filtración pueden ser usados para retirar efectivamente el carbón activado y el Triton X100 y el LPS adsorbidos. Los resultados sugieren que la filtración sobre tierra de diatomeas es más efectiva, comparada con un filtro de 0.45 jm y uno de 2 jm y sugiere una purificación adicional de LPS mediante tierra de diatomeas.

Tabla 13: Diferentes métodos de remoción de carbón activado

En otro experimento, no se introdujo el carbón activado dentro de la solución de gelatina sino que se pasó el medio acuoso que comprendía gelatina y el tensioactivo, a través de un cartucho de filtro 3M ZetaCarbon del tipo R55S (3M, EE.UU.), dando como resultado una mejora en la remoción de LPS, comparada con el método 2 anterior. También, la tensión superficial de la solución después del paso por el filtro fue de 66-67 mN/m, igual a la de la solución de control de gelatina no tratada, indicando que el tensioactivo permaneció de modo sustancialmente completo en el filtro, véase también el ejemplo 4. En casos donde la tensión superficial no es similar a la de la solución de control, pueden usarse en serie dos o más, si se desea, cartuchos de filtro. Se encontraron resultados similares cuando en lugar del filtro R55S se usó un filtro del tipo R30L3S (3M, EE.UU.).

Ejemplo 14

Efectos de Triton X100, oxidación y combinación de Triton X100-oxidación

Se prepararon tres soluciones diferentes al 6.66% de gelatina 1 y gelatina 10 de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 1. A una solución se añadió Triton X100 hasta una concentración de 0.18 % p/p. A la segunda solución, se añadió H²O²hasta una concentración de 1.5 % p/p. A la tercera solución se añadieron Triton X100 y H²O²hasta la concentración de 0.18 % p/p y 1.5% % p/p respectivamente. No se ajustó el pH de las soluciones y fueron 5.5 y 5.3 para gelatina 1 y gelatina 10, respectivamente. Se realizó la mezcla e incubación a 57.5 °C durante 30 minutos. Se añadió un mínimo de 5 gramos (0.7 % p/p) de carbón activado a las soluciones de gelatina, seguido por una mezcla adicional durante 15-30 minutos. A continuación se filtraron las soluciones de gelatina, usando un filtro de 0.45 jm (Phenex RC 26mm, 0.45jm) como se describió en el ejemplo 1. Las gelatinas fueron liofilizadas antes del análisis de LPS, como se describió anteriormente. Se analizó el H²O²remanente usando el método descrito en el GME10 y fue de < 20 ppm, confirmando que no ocurrió interferencia con el método de análisis LAL.

Tabla 14: Efecto de agentes oxidantes - Triton X100 con gelatina 1 y gelatina 10

A partir de Hirayama y Sakata, arriba, los documentos US8133269 y WO2012031916 se sabe que e1H²O²reduce o inactiva el LPS en gelatina. Sin embargo, ahora se observa un sorprendente efecto sinérgico entre Triton X100 y H²O². Ejemplo 15:

Variación de gelatina y Triton X100 y efecto sobre la purificación de LPS

Se mezclaron soluciones de gelatina con diferentes concentraciones de gelatina disuelta, a diferentes concentraciones de Triton X-100 bajo mezcla constante con una velocidad de 750 rpm y a una temperatura de 55 a 57.5 °C durante 30 minutos. Luego se filtró la mezcla sobre dos cartuchos de filtro 3M ZetaCarbon de tipo R55s. Se recolectó el filtrado para análisis directo de LPS o se congeló a -20 °C y se liofilizó usando un liofilizador Christ Alpha 2-4LD Plus (MartinChrist, Alemania). Condiciones de liofilización al vacío: 0.04 mbar y -87 °C durante por lo menos 24 - 48 horas hasta que las soluciones estuvieron secas a un contenido de humedad de alrededor 4 - 6%. No se hizo corrección de humedad antes del análisis de endotoxina.

Tabla 15: Variación de gelatina y Triton X100 y efecto sobre la purificación de LPS

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para la remoción de lipopolisacárido desde un medio acuoso que comprende gelatina y lipopolisacáridos, comprendiendo dicho método los pasos de:

3) poner en contacto el medio del paso 2) con un adsorbente sólido,

4) separación del adsorbente sólido del paso 3) del medio,

5) recuperación del medio acuoso que comprende la gelatina, en donde cada uno de los pasos 1) - 5) es ejecutado a una temperatura de 68 °C o menos, estando dicha temperatura por debajo del punto de enturbiamiento del tensioactivo que forma micela, siendo ejecutados por lo menos los pasos 2) y 3) a una temperatura de por lo menos 30 °C. 2. Método de la reivindicación 1, en donde el promedio de peso molecular de la gelatina está entre 1500 Da y 250,000 Da, preferiblemente entre 2000 y 200,000 Da, más preferiblemente entre 5000 y 180,000 Da, con máxima preferencia entre 20,000 Da y 170,000 Da.

3. Método de la reivindicación 1 o 2, en donde el tensioactivo que forma micela comprende un tensioactivo no iónico, en donde el tensioactivo no iónico es un tensioactivo etoxilado que es un alquilfenol etoxilato, en donde el alquilfenol etoxilato es representado por la fórmula CxH²x+¹-C⁶H⁴-O-(C²H⁴O)nH,

en donde x es 4 -12 y n es 7.5 -14.

4. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tensioactivo es Triton X-100 o Triton X-102 o mezclas de los mismos.

5. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el adsorbente sólido es un adsorbente hidrófobo, preferiblemente en donde el adsorbente hidrófobo comprende carbón activado.

6. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada uno de los pasos 1) - 5) es ejecutado a una temperatura de 65 °C o menos, preferiblemente de 62 °C o menos con máxima preferencia de 60 °C o menos.

7. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el pH del medio está entre 3.5 y 9.0, preferiblemente entre 4.0 y 8.0, más preferiblemente entre 4.0 y 6.0, con máxima preferencia entre 4.5 y 5.5.

8. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medio acuoso en el paso 1) comprende por lo menos 8 % p/p de gelatina disuelta.

9. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tensioactivo es añadido por encima de la concentración crítica de micela del mismo.

10. Gelatina, obtenible mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, que tiene un contenido de lipopolisacárido de menos de 2 EU/g, preferiblemente menos de 1 EU/g.

11. Gelatina de la reivindicación 10 en donde el promedio de peso molecular de la gelatina está entre 1500 Da y 250,000 Da.

12. Gelatina de acuerdo con la reivindicación 10, que está libre de acetona, sales de amonio cuaternario y alcoholes.

13. Medio acuoso que comprende por lo menos 2 % p/p de gelatina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones -10 -12, teniendo dicho medio un contenido de sal de 100 mM o menos y estando libre de acetona y sales de amonio cuaternario.

14. Medio acuoso de la reivindicación 13, que comprende por lo menos 6 % p/p de gelatina.