KR102371998B1

KR102371998B1 - 초분자 자기 조립 히알루론산 하이드로겔 제조 및 응용

Info

Publication number: KR102371998B1
Application number: KR1020190133082A
Authority: KR
Inventors: 한세광; 김문구; 정상훈
Original assignee: (주)화이바이오메드
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2022-03-10
Also published as: KR20200047408A

Abstract

본 발명은 사이클로덱스트린과 아다만테인의 초분자 자기 조립에 의해 제조된 하이드로겔에 관한 것이다.
본 발명에 따른 하이드로겔은 약물 및 세포를 충전하여 다양한 질환에 적용 가능하며 히알루론산에 의해 경피 전달, 체내 약물 방출, 줄기세포를 이용한 난치성 질환 치료 등에 적용 가능하다.

Description

초분자 자기 조립 히알루론산 하이드로겔 제조 및 응용{Preparation and Application of Self-Assembled Supramolecular Hyaluronic Acid Hydrogels}

본 발명은 초분자 자기 조립 히알루론산 하이드로겔, 상기 하이드로겔의 제조 방법 및 상기 하이드로겔의 응용에 관한 것이다.

최근 다양한 생체재료가 약물 전달, 3차원적인 세포 배양 및 세포 전달을 위해 개발이 되고 있다. 그 중 이 목적에 부합하는 가장 효과적인 물질이 하이드로겔인 것으로 부각되었고 다양한 연구가 진행되고 있다. 하이드로겔은 그물망 구조를 가진 수용성 고분자로서, 물에는 녹지 않으면서 높은 수분 함유량을 가져 조직과 비슷한 성질을 가진다. 하이드로겔은 반응성이 좋은 화학물질을 이용하여 작용기 사이의 공유결합을 유도하여 젤 형태를 유도할 수 있다. 최근에는, 변성 없이 약물이나 세포를 충진시킬 수 있으며, 최소한의 상처를 발생시키면서 인체에 주입할 수 있는 주입형 하이드로겔에 대한 관심이 집중되고 있다. 주입형 하이드로겔을 개발하기 위해 효소나 화학물질, 빛에 의한 화학반응을 이용한 방법, 온도나 pH 변화와 같은 외부자극에 의한 방법, 용매의 변화와 팽윤에 의한 물리적 변화에 의한 방법을 사용하는 연구가 시도 되고 있다.

화학반응을 이용한 대표적인 방법 중에서는 반응성이 좋은 화학물질을 이용하는 방법으로서 티올기(thiol)와 이중결합(double bond)의 반응인 Michael addition을 이용하는 방법이 있다. 상용화된 Hystem-C와 중합 가능한 반응기를 가진 고분자를 빛을 이용한 initiator로 중합시켜 형성된 광중합방법을 이용한 PEGDA가 있다. Hystem은 히알루론산에 티올기를 도입하여 PEGDA와 간단하게 섞음으로써 하이드로겔을 형성할 수 있다는 장점이 있고, PEG 유도체만으로 구성된 제품으로 PEGDA에 photoinitiator를 첨가하여 자외선을 주사하면 5분내의 빠른 시간에 하이드로겔이 형성할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 광중합방법은 initiator를 사용하여야 반응을 일으킬 수 있지만 현재까지 상용화되어 있는 initiator는 대부분 세포독성을 가지고 있다는 문제가 있으며, 또한 광중합을 위한 자외선이 피부를 통과하기 어렵기 때문에 실질적으로 주입형 하이드로겔로 사용하기 어렵다는 단점이 있다. 또한 두 제품에서 공통적으로 사용되는 PEGDA의 경우, 반응성이 좋은 이중결합을 이용하기 때문에 젤 형성에 참여하지 않은 이중결합의 경우 체내에 도입되었을 경우 독성 유발 가능성이 잠재되어 있다는 단점이 있다.

또한, horseradish peroxidase와 같이 활성산소를 유도하여 화학반응을 일으키는, 효소를 이용하는 CorgelTM이 있고, 음이온을 띠는 고분자 물질이 2가 이상의 양이온과 정전기적 인력을 이용하여 킬레이트를 형성하는 이온반응을 이용하는 Gelite®라는 제품이 상용화되어 있다. 하지만 효소를 이용한 방법은 생체 내 고유의 효소를 이용한 방법보다는 horseradish peroxidase와 같이 대부분 주입 직전에 외부의 효소를 섞어서 주입을 하기 때문에 효소에 의한 면역거부 반응의 가능성이 있다. 그리고 이온 반응을 이용한 방법은 양이온의 농도에 의해 겔의 굳기가 좌우되므로 생체 내에서는 긴 시간 동안 젤 상태로 유지되기 어렵기 때문에 현재는 주로 약물 전달을 위한 제품 개발 연구에서 이용되고 있다.

외부 자극에 의해 하이드로겔이 형성되는 방법 중 한가지로 온도 민감성 시스템을 활용하는 방법이 있으며 PLGA-PEG-PLGA의 3중 블록 공중합체를 이용한 ReGel®, PEO-PPO-PEO의 3중 블록공중합체를 이용한 Pluronic® (Poloxamer), Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 쥐의 sarcoma 세포에서 유래된 콜라겐을 이용한 MatrigelTM등이 상용화되어 있다. 온도 민감성 시스템에서는 임계 용액 온도 (Lower critical solution temperature, LCST) 현상을 보이는데 자세히 설명하면 온도가 낮을 때에는 액체로 존재하고 있다가 37℃로 체온의 온도가 되면 고체형태가 되는 현상이다. 액체상태로 낮은 온도에서 보관하고 있다가 필요할 때 생체 내에 주입하여 젤을 만들어 약물전달 및 세포전달을 간편하게 시도할 수 있다는 장점이 있다. 특히 MatrigelTM의 경우 각종 세포성장 인자가 있어서 세포의 생존기간을 연장시킬 수 있는 장점이 있다. 하지만 이렇게 온도 민감성 주입형 하이드로겔은 마이셀을 형성하는 물리적 결합으로 그물망 구조를 형성하고 있기 때문에, 초반 방출량도 많고 생체 내 분해속도가 빨라서 생체 내에서 오랜시간동안 안정적으로 유지하지 못한다는 단점이 있다. 또한 Regel®의 경우 합성고분자를 이용하였기 때문에 분해산물이 부분적으로 세포 독성을 나타내고, MatrigelTM의 경우 쥐의 암세포 유래의 물질이기 때문에 실제 사람에게 사용하기에는 한계가 있다.

pH 민감성 시스템으로는 Polyacrylic Acid를 이용한 Carbopol® 제품이 상용화 되어있는데 이 제품의 경우 pH가 4일 때 점성이 낮아서 용액상태로 존재하다가 pH가 높아지게 되면 이온화 되어있던 acrylic acid 그룹이 서서히 중성화되면서 소수성을 띠게 되어 hydrophobic 반응에 의한 물리적 결합이 일어나게 되어 점성이 높아지다가 생리활성 pH인 7.4 이 되면 고체화가 된다. 따라서 액체상태로 주입을 하면 생리 활성 pH인 7.4에 쉽게 도달하기 때문에 젤을 간단하게 만들 수 있다는 장점이 있다. 하지만 젤을 주입하기 위해서는 산성의 환경인 pH 4인 상태로 사용하여야 하므로, 투여 시 세포에 손상을 줄 수 있다는 단점이 있다.

위에서 기술한 바와 같이 화학반응을 이용한 주입형 하이드로겔 제작 방법은 반응성이 좋은 화학 물질 때문에 담지된 세포에 심각한 손상을 유발할 수 있다는 단점이 있어 고분자에 작용기를 도입하지 않고 물리적인 상호작용만으로 하이드로겔을 형성하고자 하는 시도가 많이 진행되고 있고, ReGel®, MatrigelTM, Pluronic® 등과 같은 제품들이 상용화되었다. 하지만 이 제품들을 세포치료제로서 생체 내에 적용하기에는 위에서 기술한 바와 같은 약점을 가지고 있어 생체 내에서 적절한 시간 동안 안정하게 유지되고, 생체적합성, 생분해성이 뛰어나고 면역거부반응이 적으면서 독성이 없는 안전한 주입형 하이드로겔의 개발이 요구된다.

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Journal of Material Chemistry B, 3(40), 20151028, pp8010-8019

본 발명은 사이클로덱스트린과 아다만테인의 초분자 자기 조립에 의해 제조된 하이드로겔을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체; 및 히알루론산-아다만테인 유도체로부터 제조된 하이드로겔을 제공한다.

또한, 본 발명은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체 및 히알루론산-아다만테인 유도체를 혼합하는 단계를 포함하는 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체; 및 히알루론산-아다만테인 유도체를 포함하는 약물전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 하이드로겔에 사이클로덱스트린을 첨가하는 단계를 포함하는 하이드로겔의 분해 방법을 제공한다.

본 발명은 사이클로덱스트린과 아다만테인의 초분자 자기 조립에 의해 제조된 하이드로겔을 제공한다.

본 발명에 따른 하이드로겔은 약물 및 세포를 충전하여 다양한 질환에 적용 가능하며 히알루론산에 의해 경피 전달, 체내 약물 방출, 줄기세포를 이용한 난치성 질환 치료 등에 적용 가능하다.

도 1은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체의 합성 모식도를 나타낸다.
도 2는 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체의 NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체의 FT-IR 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 히알루론산-아다만테인 유도체의 합성 모식도를 나타낸다.
도 5는 히알루론산-아다만테인 유도체의 NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 히알루론산-아다만테인 유도체의 FT-IR 분석 결과를 나타낸다.
도 7 및 8은 본 발명에 따른 하이드로겔의 Rheology 테스트 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 하이드로겔의 동물실험 결과를 나타낸다.
도 10 및 도 11은 본 발명에 따른 하이드로겔의 분해를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 12는 단백질 방출 실험 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체; 및 히알루론산-아다만테인 유도체로부터 제조된 하이드로겔에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 하이드로겔을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 히알루론산은 생체 적합성 및 생분해성 특성을 가질 뿐만 아니라 경피 전달 특성을 가지고 있어, 인체에 안전하게 적용할 수 있으며 항원 단백질을 비롯한 다양한 단백질 의약품 및 화학 의약품의 경피 약물 전달 시스템에 적용 가능하다는 장점을 가진다.

본 발명에서 명시적인 기재가 없는 한, '히알루론산(Hyaluronic acid, HA)'은 하기 일반식 1로 표현되는 반복단위를 갖는 고분자를 지칭하며, 히알루론산의 염 또는 유도체 형태를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

[일반식 1]

상기 일반식 1에서, n은 50 내지 10,000 의 정수일 수 있다.

본 발명에서 히알루론산의 염으로 히알루론산의 테트라부틸암모늄염(HA-TBA)을 사용할 수 있다.

본 발명에서 ‘히알루론산 유도체’는 상기 일반식 1의 히알루론산 기본 구조를 기반으로 하여 아민기, 알데하이드기, 바이닐 그룹, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 등의 작용기가 도입되어있는 히알루론산의 모든 변형체를 지칭한다. 예를 들어, 상기 히알루론산 유도체로 HA-디아미노부탄(HA-diaminobutane), HA-헥사메틸렌디아민(HA-hexamethylenediamine), HA-알데하이드(HA-aldehyde), HA-아디픽산 디하이드라지드(HA-Adipic Acid Dihydrazide, HA-ADH), HA-2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드(HA-2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride), HA-스페르민(HA-Spermine), HA-스페르미딘(HA-spermidine), HA-SPDP, HA-NHS 등을 사용할 수 있다.

상기 히알루론산은 대부분의 동물에 존재하며 생분해성, 생적합성, 면역반응이 없는 선형적인 다당류의 고분자로서 인체에 안전하게 적용할 수 있다. 히알루론산은 체내에서 분자량에 따라 여러 가지 다른 역할을 수행하기 때문에 여러 가지 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 히알루론산, 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게는 분자량이 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)일 수 있다.

또한, 본 발명에서 명시적인 기재가 없는 한, "하이드로겔(hydrogel)"은 물을 분산매로 하는 겔을 의미한다. 상기 하이드로겔은 하이드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성될 수 있다. 전해질 고분자의 하이드로겔은 고흡수성을 나타내는 것이 많으며 흡수성 고분자로서 다방면에 실용화되어 있다. 히드로겔 중에는 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화하는 것도 있다.

본 발명에 따른 하이드로겔은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체 및 히알루론산-아다만테인 유도체로부터 제조될 수 있다.

본 발명에서 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체(HA-CD 유도체)는 히알루론산과 사이클로덱스트린이 아마이드 결합을 통해 결합된 유도체를 의미한다. 구체적으로, 히알루론산의 카르복실기와 사이클로덱스트린의 아민기가 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 이때, 사이클로덱스트린 중의 하나 이상의 하이드록실기는 아민기로 치환되어, 상기 아민기가 결합을 형성할 수 있다.

상기 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R은 사이클로텍스트린일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체는 히알루론산과 사이클로덱스트린을 반응시켜 제조할 수 있다.

구체적으로, 히알루론산, 히알루론산의 염 또는 히알루론산의 유도체와 사이클로덱스트린을 용매에 용해시킨 후, 커플링 시약의 존재하에서 반응시켜 제조할 수 있다.

상기 용매로 물, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 PBS(Phosphate-buffered saline)를 사용할 수 있으며, 커플링 시약으로 DMTMM(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride), EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, NHS(N-Hydroxysuccinimide), Pyridine, HBTU(N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate) 또는 BOP((Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate)를 사용할 수 있다. 또한 반응 시, 버퍼로 PBS 또는 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 사용할 수 있으며, 반응은 10 내지 40℃, 20 내지 30℃ 또는 상온에서 수행할 수 있다.

본 발명에서 히알루론산-아다만테인(CD-Ad) 유도체는 히알루론산과 아다만테인이 에스터 결합을 통해 결합된 유도체를 의미한다. 구체적으로, 히알루론산의 하이드록실기와 아다만테인의 카르복실기가 에스터 결합을 형성할 수 있다. 이때, 아다만테인으로 카르복실기가 치환된 Adamantaneacetic acid(Ada-acetic acid)을 사용할 수 있다.

상기 히알루론산-아다만테인 유도체는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

[화학식 2]

일 구체예에서, 상기 히알루론산-아다만테인 유도체는 히알루론산과 아다만테인(Ada-acetic acid)을 반응시켜 제조할 수 있다.

구체적으로, 히알루론산, 히알루론산의 염 또는 히알루론산의 유도체와 아다만테인을 용매에 용해시킨 후, 반응 시약의 존재하에서 반응시켜 제조할 수 있다.

상기 용매로 물, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 PBS(Phosphate-buffered saline)를 사용할 수 있다. 반응 시약은 에스터 반응을 일으키는 시약으로서, 4-DMAP(4-Dimethylaminopyridine), DVA(Divinyl acetate), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide;DCC), Adamantane anhydride 또는 Di-tert-butyl dicarbonate를 사용할 수 있다. 또한 반응 시, 버퍼로 PBS 혹은 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 사용할 수 있다. 상기 반응은 진공 상태에서 수행될 수 있다.

본 발명에서 하이드로겔은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체; 및 히알루론산-아다만테인 유도체로부터 제조되며, 구체적으로 하이드로겔은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 히알루론산-아다만테인 유도체의 아다만테인의 초분자 반응에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 초분자(supramolecule)란 수소결합, 정전기적 상호작용 또는 반데르발스 인력과 같은 비공유 결합을 통해 분자나 이온이 모여 형성된 분자복합체를 의미한다. 초분자의 구조를 형성하는 대표적인 비공유결합들은 공유결합에 비해 매우 약하기 때문에 초분자 물질은 주변의 환경에 따라 구조가 쉽게 변할 수 있으며, 이러한 특징을 이용하면 물질의 모양을 임의적으로 조절할 수 있다. 초분자 구조를 형성하는 대표적인 원리로 자기조립(self-assembly)이 있다. 자기조립은 자발적인 상호작용으로 분자들이 조립되는 현상을 의미한다.

본 발명에서는 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 사용하여 초분자체, 즉, 하이드로겔을 제조할 수 있다. 사이클로덱스트린은 6~8개의 포도당 분자의 α-1,4 결합을 통해 형성된 소수성 공동을 갖는 고리형 올리고사카라이드(oligosaccharide)로 포도당 분자의 개수가 6개인 α-사이클로덱스트린, 7개인 α-사이클로덱스트린, 및 8개의 포도당 분자로 이루어진 α-사이클로덱스트린으로 구분된다. 이때 사이클로덱스트린을 형성하고 있는 포도당 분자의 개수에 따라 사이클로덱스트린의 분자량, 소수성 공동의 크기, 용해도 등이 달라질 수 있다.

사이클로덱스트린의 구조는 X-ray분석에 의하면 C2와 C3에 결합해있는 hydroxyl기가 바깥쪽으로 펼쳐져 있고, C6 에 결합해있는 hydroxyl기 역시 반대방향으로 펼쳐져 있기 때문에 링의 외곽은 전체적으로 친수성을 띄고 있다. 반면 C3 와 C5의 수소이온과 에테르의 산소가 사이클로덱스트린 구조 안쪽에 위치하고 있어 내부 공동은 소수성을 띈다. 따라서 전체 구조의 친수성 외각은 물과 같은 극성용매에 잘 녹을 수 있게 하면서 구조체 내부에는 외곽과 반대되는 성격의 소수성 기공을 형성한다. 이는 사이클로덱스트린의 가장 큰 특성인 호스트-게스트 상호작용을 통해 복합체 형성을 가능하게 한다.

게스트 물질은 일정한 사이즈를 갖는 사이클로덱스트린의 기공 안에 들어가면서 구조적 fitting에 의해 복합체를 형성하는데, 사이클로덱스트린의 종류에 따라 기공의 높이는 같지만 직경과 부피가 서로 달라지게 된다. 본 발명에서는 게스트 물질로 아다만테인을 사용한다. 상기 아다만테인은 사이클로헥세인 환 4개가 바구니 모양으로 축합된 구조를 갖고 대칭성이 높으며 안정한 화합물로, 사이클로덱스트린과 호스트-게스트 상호작용을 통해 결합을 형성할 수 있다.

즉, 본 발명은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 히알루론산-아다만테인 유도체의 아다만테인의 호스트-게스트 상호작용을 통해 하이드로겔이 제조될수 있다.

일 구체예에서, 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체 및 히알루론산-아다만테인 유도체의 함량비는 1:0.1 내지 1:10, 1:0.5 내지 1:2 또는 1:1일 수 있다.

또한, 일 구체예에서, 하이드로겔은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체 및 히알루론산-아다만테인 유도체의 물리적 혼합에 의해 제조할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 하이드로겔은 약물, 형광물질, 방사성 동위원소, 표적 지향성 물질, 이미징 물질 및 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유용 물질을 추가로 포함할 수 있다. 유용 물질을 포함하는 하이드로겔은, 상기 유용 물질의 전달을 위한 약물전달체로서 기능할 수 있다.

상기 약물은 인간을 포함한 동물에서 질병 또는 증상을 저해, 억제, 경감, 완화, 지연, 예방 또는 치료할 수 있는 물질로서, 그 예로는 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오레우라실(5-fluoreuracil), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 베르베린(berberine), 에피루비신(epirubicin), 독시사이클린(doxycycline), 겜시타빈(gemcitabine), 라파마이신(rapamycin), 타목시펜(tamoxifen), 헤르셉틴(herceptin), 아바스틴(avastin), 티사브리(tysabri), 에르비툭스(erbitux,) 캠패트(campath), 제발린(zevalin), 휴미라(humira), 밀로타르그(mylotarg), 졸레어(Xolair), 벡사르(bexxar), 랩티바(raptiva), 레미카데(remicade), siRNA, 앱타머(aptamer), 인터페론(interferon), 인슐린, 레오프로(reopro), 리툭산(rituxan), 제나팍(zenapax), 시물렉트(simulect), 오르토클론(orthoclone), 시나기스(synagis), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 표피 성장 인자(EGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 티오레독신(thioredoxin), Fel d1, Api m1, 마이엘린 염기성 단백질(myelin basic protein), Hsp60 및 dnaJ 등을 사용할 수 있다.

상기 형광물질은 본 발명이 속하는 당업계에서 일반적으로 사용되는 형광 물질일 수 있으며, 그 예로는 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rodamine), 단실(Dansyl), Cy 및 안트라센(antracene) 등을 사용할 수 있다.

상기 방사성 동위원소는　³H,　¹⁴C,　²²Na,　³⁵S,　³³P,　³²P 및　¹²⁵I일 수 있다.

상기 표적 지향성 물질은 특정 표적 물질을 선택적으로 인지, 결합 또는 전달할 수 있는 임의의 물질을 의미하며, 그 예로는 RGD(알지닌-루신-아스파틱산), TAT(트레오닌-알라닌-트레오닌) 및 MVm(메티오닌-발린-D메티오닌) 등의 펩티드, 특정 세포를 인지하는 펩티드, 항원, 항체. 엽산, 핵산, 앱타머, 또는 탄수화물(예, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스 등)을 사용할 수 있다.

또한, 이미징 물질은 이미징 물질은 NMR(Nuclear Resonance Spectrometer), MRI(자기공명이미지), PET(Positron Emission Tomography), CT(Nuclear Resonance Spectrometer)와 같은 스펙트로스코피나, 형광 현미경, 공촛점 레이져 주사 현미경 등의 현미경을 통해 감지할 수 있는 임의의 물질로서, 그 예로는 Ga-콤플렉스, 나노 입자 및 탄소 나노 재료 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 Ga-콤플렉스로는 Ga-DTPA, Ga-DTPA-BMA, Ga-DOT 및 Ga-cyclam등이 있으며, 상기 나노 입자로는 금, 은, 망간, 카드뮴, 셀레늄, 텔루륨 및 아연 등이 있으며, 바람직하게는 1~200 nm 크기의 나노 입자이며, 상기 탄소 나노 재료로는 단일벽 나노 튜브, 다중벽 나노 튜브, 플러린 및 그라핀 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체; 및 히알루론산-아다만테인 유도체를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 하이드로겔은 전술한 유도체들의 자가 조립을 통해 제조되므로 상기 하이드로겔 내부에 유용 물질, 구체적으로 약물을 담지할 수 있다. 이러한 약물로는 전술한 종류, 즉, 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오레우라실(5-fluoreuracil), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 베르베린(berberine), 에피루비신(epirubicin), 독시사이클린(doxycycline), 겜시타빈(gemcitabine), 라파마이신(rapamycin), 타목시펜(tamoxifen), 헤르셉틴(herceptin), 아바스틴(avastin), 티사브리(tysabri), 에르비툭스(erbitux,) 캠패트(campath), 제발린(zevalin), 휴미라(humira), 밀로타르그(mylotarg), 졸레어(Xolair), 벡사르(bexxar), 랩티바(raptiva), 레미카데(remicade), siRNA, 앱타머(aptamer), 인터페론(interferon), 인슐린, 레오프로(reopro), 리툭산(rituxan), 제나팍(zenapax), 시물렉트(simulect), 오르토클론(orthoclone), 시나기스(synagis), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 표피 성장 인자(EGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 티오레독신(thioredoxin), Fel d1, Api m1, 마이엘린 염기성 단백질(myelin basic protein), Hsp60 및 dnaJ 등을 사용할 수 있다.

일 구체예에서 유용 물질의 담지는 하이드로겔의 제조과정에서 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체 및 히알루론산-아다만테인 유도체와 상기 유용 물질을 함께 혼합함으로써, 하이드로겔 내에 유용 물질을 용이하게 담지할 수 있다.

일 구체예에서, 약물전달체의 제조시, 즉, 하이드로겔 내에 유용 물질의 담지시, 상기 유용 물질은 히알루론산에 유용 물질이 결합된 HA-유용 물질 접합체의 형태로 사용하거나, 또는 히알루론산-아다만테인 유도체에 유용 물질이 결합된 HA-Ad-유용 물질 접합체의 형태로 사용할 수 있다. 또는 유용 물질 자체로도 사용할 수 있다. 상기 HA-유용 물질 접합체는 히알루론산에 알데하이드기를 도입하고, amine-aldehyde 반응을 통해 히알루론산에 유용 물질(상기 유용 물질은 아민기를 포함하거나, 아민기로 개질될 수 있다.)을 결합시켜 제조할 수 있다. 또한, HA-Ad-유용 물질 접합체는 히알루론산-아다만테인(HA-Ad) 유도체에 알데하이드기를 도입하고, amine-aldehyde 반응을 통해 HA-Ad 유도체에 유용 물질(상기 유용 물질은 아민기를 포함하거나, 아민기로 개질될 수 있다.)을 결합시켜 제조할 수 있다.

상기 약물전달체는 인간을 포함한 동물에게 생체내 또는 시험관내로 유용 물질을 전달하기 위한 용도로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약물전달체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 경구, 비경구 투여, 예컨대 주사, 주입, 이식될 수 있다. 비경구 경로의 예로는 혈관내, 종양내, 암 주변부, 경점막, 경피, 근육내, 비내, 정맥내, 피내, 피하, 복강내, 뇌실내(intraventricularly), 두개강내(intracranially), 질내, 흡입, 직장 등이 있다.

상기 약제학적 조성물은 제조된 하이드로겔을 그대로 사용하거나, 또는 투여 경로에 적합한 형태, 즉, 고체 제제, 액체 제제, 또는 수화젤로 제형화하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 하이드로겔에 사이클로덱스트린을 첨가하는 단계를 포함하는 하이드로겔의 분해 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하이드로겔에 사이클로덱스트린을 첨가하면, 하이드로겔의 분해가 일어난다.

이때, 사이클로덱스트린의 함량은 하이드로겔 전체 중량(100 중량부) 대비 2.5 내지 5 중량부일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예.

실시예 1. 하이드로겔 제조

(1) 히알루론산-사이클로덱스트린(HA-CD) 유도체의 제조

히알루론산-사이클로덱스티린 유도체의 합성 과정을 도 1에 모식도로 나타내었다.

구체적으로, 히알루론산 100 mg과 DMTMM(4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트라이아진-2-일)-4-메틸모폴리니움 클로라이드) 282.5 mg을 MES(2-(N-모포리노)에테인서포닉산) 완충용액 10 ml에 용해하고 사이클로덱스트린 158.76 mg과 혼합하여 상온에서 반응시켰다.

그 후, 투석(dialysis) 과정을 통해 반응하지 않은 DMTMM 및 사이클로덱스트린을 제거하였다. 투석 시, 1 일에는 염화나트륨(Sodium chloride) 0.1M을 넣고 진행하였으며, 2 일부터 3 일까지는 물을 넣고 진행하였다. 투석 후, 동결건조하였다.

(2) 히알루론산-아다만테인(HA-Ad) 유도체의 제조

히알루론산-아다만테인 유도체의 합성 과정을 도 4에 모식도로 나타내었다.

먼저, 히알루론산의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide)염을 제조하였다. DOWEX 50WX 8,400 12.5 g을 물 250 ml에 15 분 동안 분산시켜 분산액을 제조하였다. 상기 분산액을 침전시킨 후, 상층액을 버리는 과정을 반복하였다. 이후 분산액에 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide)염 24.5 ml을 첨가 후, 교반시켰다. 교반 후, 혼합물을 필터로 여과하여 파우더만 추출하였다.

히알루론산 1 g을 물 100 ml에 용해시킨 후, 상기 제조된 파우더를 첨가하여 3 시간 동안 교반하였다. 교반한 혼합물을 여과 후, 동결건조하여, 히알루론산의 TBA염을 제조하였다.

상기 히알루론산의 TBA염, 아다만테인아세트산(1-Adamantaneacetic acid) 123 mg 및 디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine) 18.9 mg을 섞고 진공상태에서 DMSO 7.5 ml를 첨가한 후 용해시켰다. 용해 후 디-터트-부틸-디카보네이트(Di-tert-butyl dicarbonate) 22.92 mg을 첨가하였다.

그 후, 투석(dialysis) 과정을 통해 반응하지 않은 아다만테인아세트산 및 디메틸아미노피리딘을 제거하였다. 투석 시 1 일에는 물 5L에 20% 부피비의 DMSO를 첨가하여 진행하였고, 2 일에는 염화나트륨(Sodium chloride) 0.1 M을 넣고 진행하였으며, 3 일에는 물로 진행하였다. 투석 완료 후, 동결건조하였다.

(3) 하이드로겔 제조

(1)에서 제조된 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체 및 (2)에서 제조된 히알루론산-아다만테인 유도체를 1:1 의 비율로 혼합하고, 상온에서 물리적으로 고루 혼합시켜 하이드로겔을 제조하였다.

실험예 1. 유도체의 NMR 분석

(1) 방법

(1)에서 제조된 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체 및 (2)에서 제조된 히알루론산-아다만테인 유도체를 NMR(DPX300, Bruker, Germany)으로 분석하였다.

(2) 결과

히알루론산-사이클로덱스트린 유도체의 NMR 분석 결과를 도 2에, 히알루론산-아다만테인 유도체의 NMR 분석 결과를 도 5에 나타내었다.

먼저, 도 2에 나타난 바와 같이, 사이클로덱스트린 픽이 검출된 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 히알루론산에 사이클로덱스트린이 접합된 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 아다만테인 픽이 검출된 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 히알루론산에 아다만테인이 접합된 것을 확인할 수 있다.

실험예 2. 유도체의 푸리에변환적외선분광(FT-IR) 분석

(1) 방법

(1)에서 제조된 히알루론산-사이클로덱스트린 유도체 및 (2)에서 제조된 히알루론산-아다만테인 유도체를 FT-IR(NICOLET 5700)로 분석하였다.

(2) 결과

히알루론산-사이클로덱스트린 유도체의 FT-IR 분석 결과를 도 3에, 히알루론산-아다만테인 유도체의 FT-IR 분석 결과를 도 6에 나타내었다.

먼저, 도 3에 나타난 바와 같이, 푸리에변환적외선분광학(FT-IR)을 통하여 분자구조를 분석한 결과 아마이드 결합을 형성하여 히알루론산에 사이클로덱스트린이 접합된 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 에스터 결합을 형성하여 히알루론산에 아다만테인이 접합된 것을 확인할 수 있다.

실험예 3. 하이드로겔 물성 측정

(1) 방법

실시예 1의 (3)에서 제조된 하이드로겔의 물성을 측정하였다.

구체적으로, 레오미터(Rheometer, MCR101, Anton Paar)를 이용하여 하이드로겔의 모듈러스(moduli) 및 전단응력(shear stress)을 측정하였다.

Strain을 2%로 고정한 상태에서 angular frequency가 0.01부터 100까지 변할 때, storage modulus 및 loss modulus를 측정하였으며, Shear rate(1/s)가 0.1에서 10000까지 변할 때, 점도(viscosity)와 전단 응력를 측정하였다.

(2) 결과

측정 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.

도 7 및 8에 나타난 바와 같이, 전단 응력에 따라 물성이 변하는 것을 확인할 수 있으며. strain 2% 고정상태에서 angular frequency 변화에 따라 물성이 변하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 전단 유동화(shear thinning) 한 것을 확인할 수 있다.

실험예 4. 동물실험

(1) 방법

실시예 (1) 및 (2)에서 각각 제조한 HA-CD 및 HA-Ad를 PBS에 5 wt%로 용해하였다. 주사기에 상기 5 wt% HA-CD 50 ul 및 5wt% HA-Ad 50 ul를 넣고, 고루 섞어주고 쥐의 피하에 주사하였다. 날짜별로 sacrifice하여 해부 후, 하이드로겔이 남아있는지 확인하였다.

(2) 결과

결과를 도 9에 나타내었다.

상기 도 9에 나타난 바와 같이, 하이드로겔이 28 일째까지 남아있는 것을 확인할 수 있다.

실험예 5. 사이클로덱스트린에 의한 하이드로겔 분해 실험

(1) 방법

5 wt% HA-CD 및 5 wt% HA-Ad를 각각 150 ul씩 섞어주어 하이드로겔을 형성한 후, 50 mg/ml의 CD 수용액 300 ul을 상기 하이드로겔 위에 첨가하였다. 15 분 후, 하이드로겔이 담긴 바이알을 뒤집어 젤이 형태를 유지하는지를 통해 하이드로겔의 분해 여부를 확인하였다.

(2) 결과

결과를 도 10에 나타내었다.

상기 도 10에 나타난 바와 같이, 하이드로겔에 사이클로덱스트린을 첨가하면, 15분 후, 하이드로겔이 분해되어 액상으로 존재하는 것을 확인할 수 있다(오른쪽 사진).

실험예 6. 효소에 의한 하이드로겔 분해 실험

(1) 방법

5 wt% HA-CD 및 5 wt% HA-Ad를 각각 150 ul씩 섞어주어 하이드로겔을 형성한 후, E-tube에 상기 하이드로겔을 넣고 원심분리(centrifugation)하여 겔 내부의 기포를 제거하였다.

실험군에는 PBS에 400 U/ml 히알루로니다제(hyaluronidase)를 용해한 용액 1 ml를 첨가하고, 대조군에는 PBS 1 ml를 첨가하였다. 이후 날짜별로 상층액의 분해된 하이드로겔 농도를 확인하였다.

(2) 결과

결과를 도 11에 나타내었다.

상기 도 11에 나타난 바와 같이, 실험군(w Hyaluronidase)에서 히알루로니다제에 의해 분해된 하이드로겔 정도가 대조군(w/o Hyaluronidase) 보다 높은 것을 확인할 수 있다.

실험예 7. 단백질 방출 실험

(1) 방법

히알루론산-아다만테인(HA-Ad) 유도체 및 히알루론산(HA)에 sodium peroxidase를 사용하여 알데하이드 작용기를 도입하였다.

상기 알데하이드 작용기가 도입된 히알루론산-아다만테인(HA-Ad) 유도체 및 히알루론산(HA)에 EGF 단백질(EGF protein)을 sodium cyanoborohydride를 사용해 반응시켜 알데하이드-아민 반응을 통해 접합체를 제조하였다. 상기 반응에 의해 HA-Ad-EGF 접합체 및 HA-EGF 접합체가 제조되었다.

5 wt% 히알루론산-아다만테인(HA-Ad) 유도체 용액에 EGF 및 상기 제조된 HA-Ad-EGF 접합체 및 HA-EGF 접합체를 각각 20 ug/ml의 농도로 첨가하였다. 상기 용액 각각 50 ul에 5 wt% 히알루론산-사이클로덱스트린(HA-CD) 유도체 용액 50 ul를 첨가한 후, 혼합하여 하이드로겔을 제조하였다.

E-tube에 상기 하이드로겔을 넣고 원심분리(centrifugation)하여 내부 기포를 제거하였다. PBS 500 ul를 각각의 하이드로겔에 첨가하였다.

날짜별로 상층액에 포함된 EGF의 농도를 HPLC로 분석하였다.

(2) 결과

상기 분석 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에서 EGF는 하이드로겔 제조시 EGF를 사용한 경우를, HA-EGF는 HA-EGF 접합체를 사용한 경우를, 및 HA-Ad-EGF는 HA-Ad-EGF 접합체를 사용한 경우를 나타낸다.

도 12에 나타난 바와 같이, 시간에 따라 방출되는 EGF의 양은 HA-Ad-EGF < HA-EGF < EGF 순으로 증가한다. 각각의 하이드로겔 내에 첨가한 단백질의 농도는 동일하므로, HA-Ad-EGF가 가장 천천히 일정한 농도의 단백질을 오래 방출시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

일반적인 약물전달체는 초기 방출량이 많고 이후 방출이 미미하나, 본 발명에 따른 약물전달체는 약물을 일정한 농도로 꾸준히 방출시킬 수 있다.

Claims

히알루론산-사이클로덱스트린 및 히알루론산-아다만테인을 혼합하는 단계를 포함하고,
상기 히알루론산-사이클로덱스트린은 히알루론산과 아민 그룹이 치환된 사이클로덱스트린을 물 또는 PBS(Phosphate-buffered saline)에 용해시킨 후, 커플링 시약의 존재하에서 반응시켜 제조한 것인 하이드로겔의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
히알루론산-사이클로덱스트린은 히알루론산과 사이클로덱스트린이 아마이드 결합을 통해 결합되어 있는 것인 하이드로겔의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
커플링 시약은 DMTMM(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride), EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, NHS(N-Hydroxysuccinimide), Pyridine, HBTU(N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate) 또는 BOP((Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate)인 하이드로겔의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
히알루론산-아다만테인은 히알루론산과 아다만테인이 에스터 결합을 통해 결합되어 있는 것인 하이드로겔의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
히알루론산-사이클로덱스트린 및 히알루론산-아다만테인의 함량비는 1:0.1 내지 1:10 인 하이드로겔의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
하이드로겔은 히알루론산-사이클로덱스트린의 사이클로덱스트린 및 히알루론산-아다만테인의 아다만테인의 초분자 반응에 의해 형성되는 것인 하이드로겔의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
약물, 형광물질, 방사성 동위원소, 표적 지향성 물질, 이미징 물질 및 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유용 물질을 추가로 포함하는 것인 하이드로겔의 제조 방법.
히알루론산-사이클로덱스트린; 및 히알루론산-아다만테인으로부터 제조된 하이드로겔에 사이클로덱스트린을 첨가하는 단계를 포함하는 하이드로겔의 분해 방법.
제 8 항에 있어서,
사이클로덱스트린의 함량은 하이드로겔 전체 중량 대비 2.5 내지 5 중량부인 것인 하이드로겔의 분해 방법.
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