CN102139113B

CN102139113B - 新的药物增溶载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102139113B
Application number: CN 201110081748
Authority: CN
Inventors: 何仲贵; 廉鹤; 孙进; 王永军; 孙英华
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-04-01
Also published as: CN102139113A

Abstract

本发明涉及维生素E或其衍生物接枝壳聚糖的制备方法及在药物增溶方面的应用。该载体为生物可降解两亲性壳聚糖衍生物，通过在壳聚糖骨架上引入疏水性维生素E或其衍生物使其具有两亲性，在水溶液中能自组装形成聚合物胶束，通过疏水性药物与疏水基团的分子间作用力使药物增溶在胶束中并稳定存在。该胶束安全性好，载药量高，包封率高，较低的临界胶束浓度，制备过程简单，可作为难溶性药物，蛋白质和基因药物的载体，可用于肌肉注射、静脉注射和口服给药，有很好的应用前景。

Description

新的药物增溶载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种新的药物增溶载体及其制备方法和应用，具体涉及以壳聚糖（CS）和维生素E或其衍生物为原料合成的药物增溶载体，本发明还涉及该载体的制备方法及其作为药物载体的应用。

背景技术

聚合物胶束作为一类胶体给药系统，在过去的十几年里，已经越来越得到药剂学工作者的关注。天然多糖作为聚合物的一种，来源广泛，并且已经广泛的应用于纳米给药系统的研究。以多糖作为基本载体具有较好的优势，多糖作为天然的生物材料，具有较好的稳定性、安全性、无毒性，具有生物降解性，给药后，可缓慢降解，不会在机体产生蓄积作用；多糖结构上具有大量的氨基或羟基等活性基团，具有较好的亲水性，并且能与生物组织如粘膜或上皮细胞有较好的相容性；同时多糖分子上的活性基团还可进行共价修饰，如PEG 化，连接靶向配体等。因此，基于多糖修饰的聚合物给药系统的研究具有重要意义。

以这种方法制备的自组装胶束具有一些独特优势，如：

1）具有核—壳结构，内核引入疏水链，可作为药物储库，包裹难溶性药物，如紫杉烷类，喜树碱类药物。外层由亲水性聚合物组成，维持胶束的空间稳定性，并保护药物不被降解。

2）具有纳米级别尺寸和窄的粒径分布，可通过渗透与保留作用被动靶向肿瘤组织。

3）可对胶束进行表面修饰，由于多糖分子带有氨基或羟基等活性基团，可对其进行功能化修饰。如表面连接配体（如叶酸，曲妥珠单抗，半乳糖等），实现对肿瘤组织的主动靶向。还可在胶束表面进行长循环修饰,(如不同分子量的PEG，PEG2000，PEG5000等) 避免网状内皮系统（reticuloendothelial system，RES）对纳米粒子的吞噬，延长体内循环时间，增加药物生物利用度。

4）临界胶束浓度（CMC）较低，可保证在体内条件下仍保留胶束的完整性，维持其空间稳定性，保证有足够的药物浓度到达病灶部位。

5）同时由于载体本身是由两亲性聚合物构成，内核疏水链的疏水性与疏水性药物之间强大的内聚力使二者结合紧密，药物以被动扩散的方式释放出来，有较好的缓释效果。

CS，作为天然多糖之一，是自然界中存在的唯一碱性多糖，存在于虾蟹及昆虫外壳中，来源广发。有良好的水溶性，生物可降解性，生物相容性，是一种优良的生物材料。同时作为碱性多糖，其表面带正电荷，可与组织和细胞经电荷作用而粘着，具有较好的生物粘附性。以壳聚糖作为原料制备聚合物胶束，更具有较好的生物学性质。

发明内容

本发明的目的是提供一种药物增溶载体及其制备方法和应用，是以生物可降解的天然多糖CS和维生素E或其衍生物作为原料，通过化学修饰得到的稳定性好，安全性好，载药量高的药物增溶载体。

其结构通式为：

本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述载体在药物制剂领域的应用。

本发明在现有的技术基础上，选择合适的合成工艺及条件，在温和条件下引入疏水链接枝于壳聚糖，以合适的工艺制备了稳定性好，载药量高的CS聚合物胶束。

本发明目的可通过以下技术方法实现：

一种药物增溶载体，该载体是在壳聚糖骨架上接枝疏水链维生素E或其衍生物，使其具有在水中自组装形成聚合物胶束的性质，能将药物被动靶向传递至肿瘤组织的两亲性壳聚糖衍生物。

所述的接枝疏水链是指疏水性的支链取代壳聚糖氨基葡萄糖单元中的氨基，总取代度5%~30%。

所述的本发明的药物增溶载体的制备方法，包括下列步骤：

壳聚糖溶于稀醋酸中，水浴加热至40~80℃。疏水性支链溶于有机溶剂中，加热搅拌至40~80℃，加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺，继续搅拌；然后将壳聚糖溶液缓慢滴加到疏水物质混合液中，搅拌下反应3~10h，之后室温继续搅拌12~48h。反应液于过量的乙醇/水混合液1/4~1/1（v/v）中透析12~72h，之后蒸馏水透析12~72h，透析袋截留分子量：12000~14000，然后冷冻干燥，得白色固体。

所述的稀醋酸浓度为0.5%~15%。

所述的有机溶剂选自能溶解该疏水支链并与水相混溶的乙醇、N-N二甲基甲酰胺、丙酮，甲醇，丙醇，DMSO，二氧六环中的一种或几种。

所述的疏水性支链碳原子数不低于10；所选用的壳聚糖分子量为1×10⁴~500×10⁴。

所述的提供疏水基团的疏水物质是维生素E或其衍生的酯、醇、酸、酮、醚、醛、酚等。

所述的药物增溶载体，其特征在于，所述的药物为难溶或微溶于水的小分子药物是喜树碱类、蒽醌类、紫杉烷类抗肿瘤药或二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或衍生物。

可采用透析法和超声法两种途径制备聚合物胶束。透析法是将两亲性壳聚糖衍生物和难溶或微溶于水的药物溶于有机溶剂，于蒸馏水中透析除去有机溶剂，同时两亲性壳聚糖衍生物自组装形成纳米胶束，之后离心，冻干即得粒径为10~1000nm的聚合物胶束。超声法是将所述的两亲性CS衍生物按1~5mg/ml 的浓度溶于水，将难溶或微溶于水的药物溶于有机溶剂后，缓慢滴入两亲性壳聚糖衍生物溶液中，经过超声处理，得到澄清透明纳米胶束溶液，之后离心，冻干即得粒径为10~1000nm的聚合物胶束。

该胶束安全性好，载药量高，包封率高，较低的临界胶束浓度，制备过程简单，可作为难溶性药物，蛋白质和基因药物的载体，可用于肌肉注射、静脉注射和口服给药，有很好的应用前景。

新型药物传递系统经疏水性修饰的CS聚合物胶束，载体制备方法简单，易操作，容易实现。载药胶束具有较小的粒径分布，可被动靶向于病灶部位。可将疏水性药物紧密的包裹于胶束，同时该聚合物还可作为蛋白质、基因给药的载体。具有较低的临界胶团浓度，在生理条件下稳定，可保证药物不渗漏而缓慢释放，以期达到长效治疗效果。

附图说明：

图1：CS-VES荧光发射光谱I₁/I₃与聚合物浓度对数关系图。

图2：CS-VES载药胶束的体外释放曲线图。

图3：壳聚糖（CS）1H-NMR图谱（以D2O/ DCl ,5:1 v/v为溶剂）。

图4：接枝产物CS-VES 1H-NMR图谱（以D2O/ DCl ,5:1 v/v为溶剂）。

具体实施方式：

实施例1 疏水链修饰CS衍生物的制备：

壳聚糖100mg溶于稀醋酸1%中，水浴加热至70℃。疏水性支链维生素E琥珀酸酯溶于乙醇中，水浴加热磁力搅拌至70℃，加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺120mg，继续搅拌；然后将壳聚糖溶液缓慢滴加到疏水物质混合液中，搅拌下反应5h，之后室温继续搅拌24h。反应液于过量的乙醇/水混合液1/10~1/1（v/v）中透析48h，之后蒸馏水透析48h，透析袋截留分子量：14000，然后冷冻干燥，得白色固体，即疏水链修饰CS衍生物。

所述稀醋酸浓度为：0.5%~15% ，疏水性支链可为维生素E或其衍生的酯、醇、酸、酮、醚、醛、酚。

实施例2 两亲性CS聚合物的鉴定

采用核磁共振仪测定两亲性CS聚合物的形成。分别取适量壳聚糖CS和接枝共聚物CS-VES，溶解于重水和氘代盐酸的混合溶剂中，在室温条件下，利用1H-NMR核磁共振仪测定壳聚糖CS和接枝共聚物CS-VES的核磁共振谱图。

CS信号峰归属如下（如图3）：1.96（乙酰氨甲基），2.95（氨基葡萄糖环C2次甲基），3.5~3.9（氨基葡萄糖环C3、4、5、6位次甲基）。接枝产物CS-VES的核磁共振图谱出现了高场质子信号，信号峰归属如下（如图4）：0.4~1.0ppm（维生素E琥珀酸酯高场质子信号），2.5ppm（琥珀酰基中亚甲基质子信号），以上信息均说明维生素E琥珀酸酯成功的连接到了壳聚糖上面。

实施例 3 两亲性CS聚合物空白胶束制备方法

按1～5 mg/mL的浓度将两亲性CS衍生物溶于水中，经超声处理，制备成粒径为10～1000 nm的聚合物胶束。

实施例 4 两亲性CS聚合物载药胶束制备方法

透析法：

将两亲性壳聚糖衍生物和难溶或微溶于水的药物溶于适当溶剂，于蒸馏水中透析除去有机溶剂，同时两亲性壳聚糖衍生物自组装形成纳米胶束，之后离心，冻干即得粒径为10~1000nm的聚合物胶束。所谓适当溶剂是指药学上使用的能溶解该药物和CS衍生物的溶剂如乙醇、N-N二甲基甲酰胺、丙酮，甲醇，丙醇，DMSO，二氧六环。

超声法：

将所述的两亲性CS衍生物按1~5mg/ml 的浓度溶于水，将难溶或微溶于水的药物溶于适当溶剂后，缓慢滴入两亲性壳聚糖衍生物溶液中，经过超声处理，得到澄清透明纳米胶束溶液，之后离心，冻干即得粒径为10~1000nm的聚合物胶束。所谓适当溶剂是指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。

采用两亲性CS衍生物作为载体制备载药胶束，可用于增溶难溶性药物。

可使用该两亲性CS衍生物作为载体的难溶性药物有：阿霉素、羟基喜树碱、喜树碱、紫杉醇、多西他赛、长春新碱、丝裂霉素等。尤其是对紫杉醇、多西他赛、羟基喜树碱、喜树碱、阿霉素有增溶效果，但并不局限于这些所列药物。

实施例5 载紫杉醇两亲性CS聚合物胶束的制备

（1）透析法

两亲性CS衍生物40 mg和理论载药量分别约为5%，10%，20%的紫杉醇溶解于3 mL DMSO/H₂O（8/2，v/v）中，室温下磁力搅拌使其混匀，然后将其转移进提前处理好的一定体积的透析袋中，用蒸馏水进行透析24 h，不断更换蒸馏水，除去有机溶剂和游离紫杉醇。将透析袋内液体于3500 rpm离心30 min，上清液过0.8 μm滤膜，得到澄清透明溶液，制得三种不同载药量的纳米胶束。

（2）超声法

CS衍生物40 mg以2.5 mg/mL浓度溶解于水，将理论载药量分别约为5%，10%，20%的紫杉醇溶解于0.5 mL无水乙醇（甲醇，乙腈）中，缓慢滴加至上述水溶液中，磁力搅拌8 h后，冰浴超声20 min（超声功率200W，工作2 s，间歇3 s），溶液于3500 rpm离心30 min，上清液过0.8μm滤膜，得到澄清透明溶液，制得三种不同载药量的纳米胶束。

载药聚合物胶束中紫杉醇含量的测定

采用HPLC法（LC-10AT泵，SPD-10A检测器，Anastar色谱工作站）测定胶束溶液中紫杉醇含量。色谱条件：色谱柱Diamond C₁₈(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相乙腈-水（60：40）；流速为1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：227 nm。

本发明的优势：

一、该两亲性CS聚合物胶束对以上难溶或微溶于水的药物具有良好的增溶作用，尤其是对紫杉醇。以CS接枝维生素E琥珀酸酯（CS-VES）为载体材料，制得的空白胶束和载药胶束的粒径、多分散系数及紫杉醇的包封率及载药量结果见表1。

表1 CS-VES空白及载药胶束表征

制剂	粒径（nm）	粒度分布	包封率（%）	载药量（%）
					CS-VES	211.5	0.244	-	-
PTX-CS-VES(5%)	310.9	0.180	81.27	5.14
					PTX-CS-VES(10%)	318.9	0.198	80.43	9.69
PTX-CS-VES(20%)	380.0	0.104	80.92	21.24

二、两亲性聚合物胶束与低分子表面活性剂相比有更低的临界胶束浓度，保证在体液稀释的条件下仍然维持空间结构，使药物稳定的存在于胶团内部，使之有足够的药物浓度到达治疗部位。因此考察了两亲性CS衍生物的临界胶束浓度。

实施例 6 两亲性CS衍生物临界胶束浓度（CMC）的测定

芘是一种脂溶性的荧光探针，由于芘在水中溶解度较低和它的自淬灭作用，在极性环境有较弱荧光，而在非极性环境中的荧光较强。当极性溶剂中（如水）有胶团或疏水区域时，芘由极性环境会自发向非极性环境转移，引起荧光加强。

通常芘的这一特性由第一发射峰与第三发射峰强度比值来反映，当这一比值显著增大时，为芘由极性环境向非极性环境迁移，即为胶束或疏水区域产生。

精密称定芘6.07mg于100ml容量瓶，用无水乙醇溶解并定容，得3×10^-4mol/l 储备液。移取1ml于10ml容量瓶，无水乙醇定容，得3×10^-5mol/l 芘溶液。精密称定10mg CS-VES，用10ml蒸馏水溶解，得1mg/ml聚合物溶液。探头超声20 min（超声功率200 W，工作2 s，间歇3 s）后，过0.8μm滤膜得胶束溶液。取该胶束溶液适量，用水稀释成系列浓度（1×10^-3，5×10^-3，1×10^-2，2×10^-2，4×10^-2，5×10^-2，8×10^-2，1×10^-1，2×10^-1，5×10^-1 mg/mL）的溶液个5ml，分别加入一定量的芘（终浓度为6×10^-7），将此溶液避光放置12h平衡，之后水浴超声30min。用荧光分光光度计测定荧光强度。激发波长337 nm，发射波长I₁=373 nm，I₃=385 nm。

芘在373 nm与384 nm处的荧光强度比值(I₃₇₃/I₃₈₄) 为纵坐标，聚合物浓度对数log C (mg/mL)为横坐标作图（图1），曲线的拐点即为该聚合物CMC值。计算得CS-VES的CMC分别为12.6 μg/mL。

三、两亲性聚合物在水溶液中可自组装形成胶束，作为难溶性药物、蛋白质和基因类药物的载体。本发明辅料可通过血管内注射、肌肉注射和口服给药。作为静脉给药系统，材料的溶血性是其安全性评价的重要组成部分，其溶血性应符合静脉注射药用辅料标准。因此以CS-VES为例考察了两亲性CS衍生物的溶血性。

实施例7 以CS接枝维生素E琥珀酸酯（CS-VES）为例考察溶血性

取大鼠全血10ml，用竹签轻轻搅动血液，去除纤维蛋白，使成为脱纤血液。移取0.5ml至离心管中，加入10倍量生理盐水，搅匀，之后离心（2500rpm,10min），弃去上清液，再加入生理盐水，再搅匀后离心，如此反复洗涤3次至上清液不显红色。移取2ml血细胞混悬液到100ml容量瓶中，生理盐水定容，即得2%血细胞混悬液。配制10mg/ml的CS-VES溶液，备用。取洁净具塞试管7只，编号，1-5号为供试品溶液，6号为阴性对照溶液，7号为阳性对照溶液，按表2顺序依次加入2%红细胞混悬液、生理盐水、蒸馏水和CS-VES溶液得到浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2mg/ml的样品溶液，混匀后放入37 ℃恒温水浴中进行温育。每隔1小时取出0.5ml观察有无溶血现象，连续观察至3h。若溶液呈红色，即表示溶血，用（+）来表示，若红细胞下沉，上层液体无色即表示无溶血，用中（--）来表示。

表2 溶血实验设计与结果

实验结果

CS-VES溶液体外溶血实验样品在3h内未见溶血和血球凝集现象，与生理盐水组（阴性对照）相比无明显差异，蒸馏水组则完全溶血，说明CS-VES溶液不具有溶血性，安全性良好。本发明中其他CS衍生物溶血性与CS-VES相似，表明两亲性CS衍生物是可以满足静脉注射的安全性要求。

四、本发明中CS衍生物对难溶或微溶于水的药物具有良好的增溶作用，通过疏水内核与药物之间的相互作用，使药物稳定存在于疏水内核并且具有明显的体外缓释效果。药物的缓释对于增强抗肿瘤治疗具有重要意义，一般要求抗肿瘤药物载体以足够的浓度到达肿瘤部位后，在一段时间内持续释放药物使肿瘤部位维持有效治疗浓度，增强抗肿瘤药物的疗效。因此以CS衍生物CS-VES为载体材料，以紫杉醇为模型药物，考察市售制剂Taxol和理论载药量分别为5%，10%，20% 的胶束的体外释放行为。

实施例8 CS-VES载药胶束的体外释放行为

分别移取载药量为5%，10%，20%的紫杉醇CS-VES胶束溶液和Taxol溶液1ml置于透析袋中，两端夹紧后，以80ml PBS溶液（PH=7.4，含2% cremophorEL(w/v)）作为释放介质，于37℃空气浴下振荡，转速100rpm。分别于给定时间内取样2ml，同时补充相同体积的新鲜介质，用0.22μm滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液HPLC分析溶液中紫杉醇含量。计算累积释放百分数，并绘制释放曲线。

色谱条件同载紫杉醇胶束中药物含量测定下条件

以时间横坐标，累积释放百分数为纵坐标，绘制释放曲线（图2）。由图中可知，市售紫杉醇注射液释放较快，在12小时内释放约为79.33%。与溶液剂相比，载紫杉醇胶束的释放比较缓慢，载药量分别为5%，10%，20%的胶束溶液在24小时分别释放16.34%，20.65%，14.77%，在96小时分别释放33.34%，36.72%和33.76%。而在168小时内，分别释放44.35%，51.06%和50.88%，并且释放曲线没有显示出明显的突释作用。以上数据说明CS-VES载药胶束在体外具有良好的缓释作用，这可能是因为疏水链与药物之间的相互作用导致释放缓慢，这表明CS衍生物可以作为抗肿瘤药物的有效载体。

Claims

1.药物增溶载体，其特征在于，该载体是在壳聚糖骨架上接枝疏水链维生素E或其酯，使其具有在水中自组装形成聚合物胶束的性质，能将药物选择性传递至肿瘤组织的两亲性壳聚糖衍生物，所述的接枝疏水链是指疏水性的支链取代壳聚糖氨基葡萄糖单元中的氨基，总取代度5%~30%。

2.如权利要求1所述的药物增溶载体的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

壳聚糖溶于稀醋酸中，水浴加热至40~80℃，疏水性支链溶于有机溶剂中，水浴加热搅拌至40~80℃，加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺，继续搅拌；然后将壳聚糖溶液缓慢滴加到疏水物质混合液中，搅拌下反应3~10h ，之后室温继续搅拌12~48h，反应液于过量的乙醇/水混合液1/10~1/1（v/v）中透析12~72h，之后蒸馏水透析12~72h，透析袋截留分子量12000~14000，然后冷冻干燥，得白色固体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的稀醋酸浓度为0.5%~15%。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自乙醇、N、N-二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇、丙醇、DMSO、二氧六环中的一种或几种。

5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的疏水性支链碳原子数不低于10。

6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所选用的壳聚糖分子量为1×10⁴~500×10⁴。

7. 根据权利要求1所述的药物增溶载体，其特征在于，所述的药物增溶载体通过透析法或超声法制备聚合物胶束，包载难溶或微溶于水的小分子药物，蛋白质，基因类药物。

8.根据权利要求7所述的药物增溶载体，其特征在于，所述的难溶或微溶于水的小分子药物是喜树碱类、蒽醌类、紫杉烷类抗肿瘤药或二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质。