CN104262638B - 透明质酸‑胱胺‑聚乳酸‑羟基乙酸接枝聚合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种透明质酸‑胱胺‑聚乳酸‑羟基乙酸接枝聚合物及其制备方法，所述透明质酸‑胱胺‑聚乳酸‑羟基乙酸接枝聚合物的结构式如下式(1)所示，式(1)中n为16‑30的整数，Y与X的比例范围为1‑3:1，Y为153‑549的整数，X为73‑385的整数；透明质酸和聚乳酸‑羟基乙酸之间用小分子(2)胱氨链接。本发明的透明质酸‑胱胺‑聚乳酸‑羟基乙酸接枝聚合物生物相容性效果好，毒性低，作为药物载体材料具有肿瘤组织靶向作用，同时能够在肿瘤内氧化还原环境内分解，达到控制释放药物的作用。
Description
技术领域
本发明属于高分子聚合物领域，特别涉及一种透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物及其制备方法。
背景技术
透明质酸是一种天然高分子，大量存在于脊椎动物和细菌中，如人关节组织的细胞外基质，关节滑液，皮肤真皮及眼睛的玻璃体内(Fraser J,Laurent T,LaurentU.J.Intern.Med.1997；242:27-33.；Laurent TC,Fraser J.FASEB J.1992；6:2397-404.；Robert L,Robert A-M,Renard G.Pathol.Biol.2010；58:187-98.)。透明质酸也是一种线性多聚糖分子，单体是由糖苷键链接(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰-D-葡糖胺构成的二糖单元，分子量基本在1×105～-5×106道尔顿之间。在生理条件下，透明质酸以钠盐的形式存在，并带一定的负电荷，其结构中的羟基使其能与周围的水分子形成氢键，因此具有很强的亲水性。在细胞间隙和其他细胞外基质(胶原蛋白，弹性纤维)中透明质酸维持了一个敞开，湿润和稳定的环境，充当润滑剂和减震器的作用。Laurent,Lee等证实了透明质酸与细胞调节，迁移，粘附有关(Laurent TC,Laurent U,Fraser J.Ann.Rheum.Dis.1995；54:429.；Lee JY,Spicer AP.Curr.Opin Cell.Biol.2000；12:581-6.)。
由于具有以上的特性，同时具有生物相容性，安全，几乎不引起异物反应等的特点，透明质酸被广泛用于生物医药。如通过注射透明质酸来缓解关节疾病和手术治疗，除此之外，在临床上真皮填充，治疗关节恶化，眼科手术等也用到了透明质酸。目前，透明质酸也被用于药物载体。将药物包埋在透明质酸 颗粒中，通过透明质酸与细胞表面CD44受体(大部分癌细胞表达较正常细胞多)结合而进入细胞，然后透明质酸在透明质酸酶作用下降解而释放出药物。这个载体系统用于治疗过表达CD44受体的肿瘤细胞，具有增加药物溶解度，药物吸收量和吸收效率特点(Esposito E,Menegatti E,Cortesi R.Int.J.Pharm.2005；288:35-49.；Drobnik J.Adv.Drug Deliver.Rev.1991；7:295-308.；Hua Q,Knudson CB,Knudson W.J.Cell Sci.1993；106:365-75.)。
聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)又名乳酸-羟基乙醇酸共聚物、丙交酯乙交酯共聚物、聚乙丙交酯等。它是由羟基乙酸和乳酸聚合而成，是被FDA批准的药用辅料，目前认为是最为成熟的体内降解性聚合物之一。由于其易于合成、质量稳定、生物兼容性、生物可降解性、机械强度、降解速度可调节性和良好的可塑性，近10多年来被大量用作纳米控释系统的骨架材料(Jain RA.T Biomaterials.2000；21:2475-90.；Fonseca C,Simoes S,GasparR.J.Control Release.2002；83:273-86.；Saxena V,Sadoqi M,ShaoJ.Int.J.Pharm.2004；278:293-301.)。
PLGA通过水解作用降解，并且通过调节聚乳酸(PLA)与聚羟基乙酸(PGA)的比例以及聚合物的相对分子量，可得到不同的降解模式。另外，PLGA的降解产物为乳酸和羟基乙酸，这些产物在体内自然存在。PLGA纳米控释系统具有能够控制纳米球大小，延长药物释放时间、靶向释放、降低药物毒性和刺激性等特点。PLGA纳米控释系统适合用于半衰期短或是口服生物利用度低而又需要长期使用的药物，其优点是在几周或几个月时间内以一定速率释放药物，维持有效血液浓度，减少药物的给药次数。因此增加了患者的顺应性，提高了治疗效果，减少用药总量(Okada H,Doken Y,Ogawa Y,Toguchi H.Pharm.Res.1994；11:1143-7.；Davda J,Labhasetwar V.Int.J.Pharm. 2002；233:51-9.)。
两亲性聚合物同时具有亲水和疏水端，其分子在特定溶剂中具有较强的自组装能力，能够形成稳定的胶束，通过与小分子药物相互作用，胶束可具有药物储存及控制释放的功能(Kataoka K,Harada A,Nagasaki Y.Adv.Drug Delivery Rev.2001；47:113-131.)。作为药物载体，两亲性聚合物胶束由于其独特的结构而具有如下特点：(1)靶向性，正常组织细胞是紧密连接的，因此大分子量的聚合物胶束无法入内，而肿瘤特有的高通透性和高截留性(EPR effect)，可使两亲性聚合物胶束穿透肿瘤部位的毛细管壁进入肿瘤组织，又由于肿瘤组织的淋巴系统发育不完善，不能将胶束排除，从而达到胶束在肿瘤部位积蓄并释药的效果(Yoo HS,Park TG.J.Control Release.2001；70:63-70.)；(2)降低药物毒副作用，纳米胶束包载药物，具有缓释作用，使药物在体液中的浓度得到控制，因而使药物的毒性明显减少，同时对某些器官的刺激也明显降低(Yokoyama M,Fukushima S,Uehara R,Okamoto K,Sakurai Y,Okano T.J.Control Release.1998；50:79-92.)；(3)控制药物释放，减少重复给药次数，可通过改变聚合物性质，如亲疏水端比例，长度等调控药物释放速率；(4)药物通过物理包埋、化学结合和静电作用等方式进入胶束的内核，两亲性胶束的亲水性可以提高难容性药物的溶解度，疏水性可提高疏水性药物的包封率及细胞膜脂质双分子层对药物的通透性(Miwa A,Ishibe A,Nakano M,Yamahira T,Itai S,Jinno S,etal.Development of novel chitosan derivatives as micellar carriers oftaxol.Pharm.Res.1998；15:1844-50.)；(5)可生物降解，安全无毒，生物可降解两亲性共聚物作为药物释放载体材料在体内降解为无毒性的单体，有很好的生物相容性，可以保证机体的安全(Cheon Lee S,Kim C,Chan Kwon I,Chung H,Young Jeong S.J.ControlRelease.2003；89:437-46.)。
因此，研究同时具有亲水和疏水端的两亲性聚合物具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新型的具有两亲性的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物。本发明提供的接枝聚合物克服透明质酸单独不能形成胶束，而脂肪族聚酯疏水性强等缺点。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物，其具有下式(1)所示的结构式，
式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；透明质酸和聚乳酸-羟基乙酸之间用小分子(2)胱氨链接，
根据本发明的聚合物，所述透明质酸的重均分子量为6600-12000Da，例如为7000Da、8500Da、10000Da、11500Da等。
根据本发明的聚合物，所述聚乳酸-羟基乙酸的重均分子量为20000-50000 Da，例如为22000Da、35000Da、43000Da等。
根据本发明的聚合物，所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400-370000Da。
根据本发明的聚合物，所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物可以形成粒径为190-280nm的纳米粒子。
本发明的目的之一还在于提供本发明所述的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(a)在第一有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和聚乳酸-羟基乙酸接触，得到式(3)所示的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物；
式(3)中Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；由于聚乳酸-羟基乙酸的端羧基在碳二亚胺缩合剂如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或N,N-二环己基碳二亚胺活化下生成不稳定的活性中间体，若不用酰化活化剂转化为相应的活性酯或活性酰胺，其自身易成脲；所以在反应体系中加入一定比例的酰化活化剂如N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑，可生成稳定的活性酯或活性酰胺；
(b)在有机胺的存在下，在第二有机溶剂中，使步骤(a)所得的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物和胱氨接触，得到由式(4)所示的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸；
式(3)中Y与X的比例范围为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；
(c)在第三有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和透明质酸接触，得到活化的透明质酸溶液；
(d)在有机胺的存在下，将步骤(b)所得产物与步骤(c)所得活化的透明质酸溶液接触，得到式(1)所示的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物；
式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；透明质酸和聚乳酸-羟基乙酸之间用小分子(2)胱氨链接。
根据本发明的制备方法，步骤(a)所述聚乳酸-羟基乙酸一端为羧基，另 一端酯封。
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸的分子量为20000-50000Da。
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比1-3:1。
优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N-二环己基碳二亚胺。
优选地，所述的酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑。
优选地，所述第一有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿。
优选地，所述碳二亚胺缩合剂和酰化活化剂摩尔比为1-5:1。
优选地，所述碳二亚胺缩合剂和聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为2-6:1。
优选地，相对于1g聚乳酸-羟基乙酸，所述第一有机溶剂的用量为2-10ml。
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为2-4小时。
优选地，步骤(a)还包括将所得反应粗产物酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物中的第一有机溶剂去除，然后将所述产物酯化聚乳酸-羟基乙酸沉淀出来，得到粘稠状产物，再将所得产物洗涤后真空干燥。
优选地，所述沉淀使用乙醚进行，优选使用冷却的乙醚。
优选地，所述洗涤使用乙醚/甲醇混合溶液进行，乙醚和甲醇的体积比没有特别的限定，但是优选使用体积比为1-9:1的乙醚/甲醇混合溶液。
优选地，所述真空干燥的温度为20～30℃；真空干燥的时间为24-48小时。
根据本发明的制备方法，步骤(b)中所述有机胺为N,N-二异丙基乙胺和/或三乙胺。
优选地，所述第二有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，所述胱氨和所述酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物的摩尔比2-10:1。
优选地，相对于1g步骤(a)所得的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为0.05-1.5ml，所述第二有机溶剂的用量为5-10ml。
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为12-24小时。
优选地，步骤(b)中还包括将所得胱氨-聚乳酸-羟基乙酸从第二有机溶剂中沉淀出来，再将所得固体产物洗涤后真空干燥。
优选地，所述沉淀剂洗涤使用水进行，优选使用蒸馏水。
优选地，所述真空干燥的温度为20～30℃；真空干燥的时间为24-48小时。
根据本发明的制备方法，步骤(c)中所述透明质酸的重均分子量为6600-12000Da。
优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N-二环己基碳二亚胺。
优选地，所述的酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑。
优选地，所述第三有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，所述碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和透明质酸摩尔比为5:5:1-40:40:1。
优选地，相对于1g所述透明质酸，所述第三有机溶剂的用量为5-30ml。
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触时间为2-4小时。
根据本发明的制备方法，步骤(d)中所述胱氨-聚乳酸-羟基乙酸和所述酯 化透明质酸的质量比4-8:1。
优选地，相对于1g胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为0.02-1.5ml。
优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。
优选地，所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为12-24小时。
优选地，步骤(d)中还包括将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物产物溶液放入透析袋中透析。
优选地，所述透析在20-25℃的蒸馏水中透析24-72小时。透析后的产物可在烘箱如真空箱中进行干燥，如在20-40℃的真空箱中干燥10小时以上，如12-48小时。
制得的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子可以冻干保存。
以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为碳二亚胺缩合剂，N-羟基琥珀酰亚胺为酰化活化剂合成透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物为例，步骤(a)到步骤(d)的反应路线如下所示：
本发明制得的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物同时具有亲水和 疏水两部分组成，亲水部分为透明质酸部分，疏水部分为聚乳酸-羟基乙酸部分。这种两亲性衍生物在水溶液中可以自组装成透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的纳米胶束，亲水片段形成外壳，疏水片段形成内核，构成独特的核-壳结构。
透明质酸大量存在人体内，作为药物载体材料，它的安全性高，几乎不引起异物反应特点；同时，透明质酸与细胞表面CD44受体(大部分癌细胞表达较正常细胞多)结合而进入细胞，然后透明质酸在透明质酸酶作用下降解而释放出药物。聚乳酸-羟基乙酸是获美国FDA批准认可能进入人体的脂肪族聚酯，进入体内首先分解成乳酸和羟基乙酸，然后经过体内代谢分解成水和二氧化碳，作为药物载体材料，它能延缓释放药物分子，从而延长药效降低毒性。半胱氨酸分子结构中含有双硫键，能够在还原条件下断裂，作为高分子间的链接分子，它使得高分子具有氧化还原响应特征。
本发明的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物生物相容性效果好，毒性低，作为药物载体材料具有肿瘤组织靶向作用，同时能够在肿瘤内氧化还原环境内分解，达到控制释放药物的作用。因此，本发明中的这种透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的制备方法具有广泛的应用性。
附图说明
图1为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图；
图2为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子光散射示意图的粒径分布图；
图3(a)为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米 粒子光散射示意图的Zeta电位分布图；
图4(a)为实施例1中的聚乳酸-羟基乙酸的红外谱图；
图4(b)为实施例1中的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸的红外谱图；
图4(c)为实施例1中的透明质酸的红外谱图；
图4(d)为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的红外谱图；
图5(a)为实施例1中的透明质酸的核磁共振氢谱图；
图5(b)为实施例1中的聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱图；
图5(c)为实施例1中的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱图；
图5(d)为实施例1中的透明质酸-聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中的重均分子量是通过美国沃特斯515+2410的凝胶渗透色谱(GPC)测得的，溶剂为四氢呋喃。
对以下实施例中的透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸、胱氨-聚乳酸-羟基乙酸、透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物进行红外光谱检测，检测条件包括：样品与KBr质量比为1:50，混匀后，研磨成透明薄片，通过红外光谱仪(美国珀金-埃尔默公司，型号为Spectrum one)进行检测。
对以下实施例中的透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸、胱氨-聚乳酸-羟基乙酸、透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物进行核磁共振氢谱(瑞士，布鲁克公司，型号为AV400)检测，透明质酸的核磁共振氢谱的检测条件包括：水为内标，所用溶剂为重水；聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱的检测条件包括： 二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜，胱氨-聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱的检测条件包括：二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的核磁共振氢谱的检测条件包括：二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜。
对以下实施例中所得到的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子进行动态光散射(Zetasizer NanoZS)、透射电镜(美国FEI,Tecnai G220S-TWIN，200kV)。
实施例1
(a)将5g的聚乳酸-羟基乙酸(乳酸与羟基乙酸的摩尔比75/25，分子量：2万，济南岱罡)、0.144g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(Alfar Aesar公司，98％)和0.086g的N-羟基琥珀酰亚胺(Alfar Aesar公司，98％)置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入15mL的二氯甲烷溶解，温度为20℃，氮气保护下反应2小时，得到N-羟基琥珀酰亚胺活化的聚乳酸-羟基乙酸粗产品。将粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去二氯甲烷，然后用200mL乙醚进行沉淀，甲醇/乙醚(3：7)混合溶液清洗(100mL×3次)，在25℃真空烘箱箱中干燥36小时，得到固体产物N-羟基琥珀酰亚胺化聚乳酸-羟基乙酸4.245g。
(b)将N-羟基琥珀酰亚胺活化的聚乳酸-羟基乙酸4.245g加入到20mL二甲基亚砜中，制备N-羟基琥珀酰亚胺化聚乳酸-羟基乙酸二甲基亚砜溶液；将0.096g的胱氨二盐酸盐(Fluka公司，98％)和0.5mL的三乙胺(西陇化工股份有限公司，分析纯)用5mL二甲基亚砜溶解，制备胱氨和三乙胺混合二甲基亚砜溶液；将5mL的胱氨和三乙胺混合二甲基亚砜溶液滴加到N-羟基琥珀酰亚胺化聚乳酸-羟基乙酸二甲基亚砜溶液中，在氮气的保护下反应24h，得到透 明的半胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液加入到200mL的蒸馏水中沉淀，然后用9500rmp转数离心20分钟得到半胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物粗产物，再用100mL蒸馏水清洗产物，继续用9500rmp转数离心20分钟，重复2-3次。得到纯化半胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物产物在25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物4.042g。
(c)将1.0g透明质酸(华熙福瑞达生物医药有限公司，分子量：6600Da)、0.290g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(Alfar Aesar公司，98％)和0.174g的N-羟基琥珀酰亚胺(Alfar Aesar公司，98％)置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入20mL的二甲基亚砜溶解，常温下，氮气保护下反应4小时，得到N-羟基琥珀酰亚胺化透明质酸溶液。
(d)将4g纯化后的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物加入到上述步骤(3)中的N-羟基琥珀酰亚胺化透明质酸溶液中，抽真空，加入1.5mL三乙胺(西陇化工股份有限公司，分析纯)溶液，在氮气氛围下反应24h，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶液。将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶液加入到透析袋(12000-14000Da)中，在蒸馏水中透析72h，去除杂质，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浊液，用9500rmp转数离心20分钟，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物粗产物，再用100mL蒸馏水清洗产物，继续用9500rmp转数离心20分钟，重复2-3次。得到纯化透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物4.142g。
10mg透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于1mL的二氯甲烷中，加入200uL蒸馏水，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(1％，Wt％)和嵌段式聚醚 F-68(1％,Wt％)混合溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400Da。
其它各项检测图谱见图1至图5(d)。其中，图1为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图。从该图1可以看出，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球形结构，粒径在200nm左右；同时可以看出典型的核壳结构，内核是疏水的聚乳酸-羟基乙酸，外壳为亲水的透明质酸。
图2为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子动态光散射示意图中的粒径分布图，其中平均粒径220nm，分散系数0.080。与图1相比，粒径较电镜图中的粒径大，这是由于投射电子显微镜样品制备过程中胶束壳层的塌陷收缩，在真空环境下使得胶束缩小，而动态光散射测定的是具有核壳结构的胶束在溶液中完全舒展时的水合力学直径，在水中存在亲水性外壳溶胀。
图3为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子动态光散射示意图中的电位分布图，从图3可以看出，透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子表面带一定的负电荷，平均Zeta电位为-27.0mV。纳米粒子表面带一定的电荷有利于粒子的稳定性，防止粒子之间相互团聚。
图4(a)为实施例1中的聚乳酸-羟基乙酸的红外光谱图。图4(b)为实施例1中的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物的红外光谱图。图4(c)为实施例1中的透明质酸的红外光谱图。图4(d)为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸- 羟基乙酸接枝聚合物的红外光谱图。
与图4(a)相比，图4(b)在1625和1576cm-1附近出现两个新的吸收峰，这是聚乳酸-羟基乙酸端羧基与胱氨端氨基反应生成的酰胺键特征峰，1625cm-1对应酰胺Ⅰ峰，1576cm-1对应酰胺Ⅱ峰，这说明胱氨和聚乳酸-羟基乙酸端羧基发生了反应；与图4(a)和4(c)相比较，图4(d)的3458cm-1为透明质酸羟基(-OH)的伸缩振动峰，1631和1570cm-1为胱氨酸端氨基与聚乳酸-羟基乙酸端羧基反应生成的酰胺键、胱氨端氨基与透明质酸羧基反应生成酰胺键的特征峰，其中1631cm-1对应酰胺Ⅰ峰，1570cm-1对应酰胺Ⅱ峰，这些都说明胱氨将聚乳酸-羟基乙酸和透明质酸链接上生成透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物。由此可见，采用本发明的方法制备可以得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物。
图5(a)为实施例1中的透明质酸的核磁共振氢谱；图5(b)为实施例1中的聚乳酸-羟基乙酸的核磁共振氢谱；图5(c)为实施例1中的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物的核磁共振氢谱；图5(d)为实施例1中的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的核磁共振氢谱。
同图5(b)相比较，图5(c)中在～1.43ppm、～4.87ppm和～5.20ppm处的信号分别对应于胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物中聚乳酸-羟基乙酸链段中乳酸单体中–CH3上的质子吸收峰、–CH–上的质子吸收峰和羟基乙酸单体中–CH2–上的质子吸收峰，在～2.73ppm和～2.88ppm处的信号分别对应于半胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物中胱氨链段中–CH2–S–和–CH2–N–上的质子吸收峰，这些说明了胱氨酸与聚乳酸-羟基乙酸反应生成了胱氨酸-聚乳酸-羟基乙酸。
同图5(a)、5(b)和5(c)相比较，图5(d)中在～1.43ppm、～4.87ppm和～5.20ppm处的信号分别对应于透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物 中聚乳酸-羟基乙酸链段乳酸单体中–CH3上的质子吸收峰、–CH–上的质子吸收峰和羟基乙酸单体–CH2–上的质子吸收峰，在～2.64ppm和～2.77ppm处的信号分别对应于透明质酸-聚乳酸-羟基乙酸聚合物中半胱氨链段中–CH2–S–和–CH2–N–上的质子吸收峰，在～1.93ppm和～3.26-4.53ppm分别对应于透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物中透明质酸链段的–COCH3和–CH2O–，葡萄糖骨架上的质子吸收峰，这些说明了活化透明质酸与胱氨-聚乳酸-羟基乙酸反应生成了明质酸-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物。由此可见，采用本发明的方法制备得到了目标化合物羟丙基β-环糊精-聚乳酸-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
实施例2
(a)将5g的聚乳酸-羟基乙酸(乳酸与羟基乙酸的摩尔比75/25，分子量：5万，济南岱罡)、0.115g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(Alfar Aesar公司，98％)和0.081g的1-羟基苯并三唑(阿拉丁试剂上海有限公司，99％)置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入10mL的氯仿溶解，温度为40℃，氮气保护下反应4小时，得到1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸粗产品。将粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去氯仿，然后用200mL乙醚进行沉淀，甲醇/乙醚(5：5)混合溶液清洗(100mL×3次)，在25℃真空烘箱箱中干燥36小时，得到固体产物1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸4.461g。
(b)将1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸4.461g加入到30mLN,N-二甲基甲酰胺中，制备1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸N,N-二甲基甲酰胺溶液；将0.101g的胱氨二盐酸盐(Fluka公司，98％)和0.5mL的N,N-二异丙基乙胺(国药集团化学试剂有限公司，99％)用5mL N,N-二甲基甲酰溶解，制备胱氨和N,N-二异丙基乙胺混合N,N-二甲基甲酰溶液；将5mL的胱氨和有 机胺混合N,N-二甲基甲酰溶液滴加到1-羟基苯并三唑活化的聚乳酸-羟基乙酸N,N-二甲基甲酰胺溶液中，温度为40℃，在氮气的保护下反应12h，得到透明的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液加入到200mL的蒸馏水中沉淀，然后用9500rmp转数离心20分钟得到胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物粗产物，再用100mL蒸馏水清洗产物，继续用9500rmp转数离心20分钟，重复2-3次。得到纯化胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物产物在25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物半胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物4.213g。
(c)将0.5g透明质酸(华熙福瑞达生物医药有限公司，分子量：12000Da)、0.319g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(Alfar Aesar公司，98％)和0.225g的1-羟基苯并三唑(阿拉丁试剂上海有限公司，99％)置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入15mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，常温下，氮气保护下反应4小时，得到1-羟基苯并三唑活化的透明质酸溶液。
(d)将4g纯化后的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物加入到上述步骤(3)中的1-羟基苯并三唑化透明质酸溶液中，抽真空，加入0.5mLN,N-二异丙基乙胺，在氮气氛围下反应12h，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶液。将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶液加入到透析袋(12000-14000Da)中,在蒸馏水中透析72h，去除杂质，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浊液，用9500rmp转数离心20分钟，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物粗产物，再用100mL蒸馏水清洗产物，继续用9500rmp转数离心20分钟，重复2-3次。得到纯化透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物4.021g。
10mg透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于1mL的二氯甲烷 中，加入200uL蒸馏水，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(1％，Wt％)和嵌段式聚醚F-68(1％,Wt％)混合溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为370000Da。其它各项检测图谱与实施例1的相应图谱类似。透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；粒子大小在183±8nm，分散系数为0.073±0.023，平均Zeta电位为-28.9±3.1mV。
实施例3
(a)将5g的聚乳酸-羟基乙酸(乳酸与羟基乙酸的摩尔比50/50，分子量：2万，济南岱罡)、0.309g的N,N-二环己基碳二亚胺(国药集团化学试剂有限公司，99％)和0.173g的N-羟基琥珀酰亚胺(Alfar Aesar公司，98％)置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入50mL的二氯甲烷溶解，温度为25℃，氮气保护下反应4小时，得到N-羟基琥珀酰亚胺活化的聚乳酸-羟基乙酸粗产品。然后用200mL乙醚进行沉淀，甲醇/乙醚(3：7)混合溶液清洗(100mL×3次)，在25℃真空烘箱箱中干燥36小时，得到固体产物N-羟基琥珀酰亚胺化聚乳酸-羟基乙酸4.845g。
(b)将N-羟基琥珀酰亚胺化聚乳酸-羟基乙酸4.845g加入到30mL二甲基亚砜中，制备N-羟基琥珀酰亚胺化聚乳酸-羟基乙酸二甲基亚砜溶液；将0.273g的胱氨二盐酸盐(Fluka公司，98％)和1.5mL的三乙胺(Alfar Aesar公司，99％)用10mL二甲基亚砜溶解，制备胱氨和三乙胺混合二甲基亚砜溶液；将10mL 的胱氨酸和三乙胺混合二甲基亚砜溶液滴加到N-羟基琥珀酰亚胺化聚乳酸-羟基乙酸二甲基亚砜溶液中，在氮气的保护下反应24h，得到透明的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液加入到200mL的蒸馏水中沉淀，然后用9500rmp转数离心20分钟得到胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物粗产物，再用100mL蒸馏水清洗产物，继续用9500rmp转数离心20分钟，重复2-3次。得到纯化胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物产物在25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物4.363g。
(c)将1.0g透明质酸(分子量：6600Da)、0.312g的N,N-二环己基碳二亚胺(国药集团化学试剂有限公司，99％)和0.174g的N-羟基琥珀酰亚胺(Alfar Aesar公司，98％)置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入20mL的二甲基亚砜溶解，常温下，氮气保护下反应4小时，得到N-羟基琥珀酰亚胺活化的透明质酸溶液。
(d)将4g纯化后的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物加入到上述步骤(3)中的N-羟基琥珀酰亚胺活化的透明质酸溶液中，抽真空，加入1.5mL三乙胺溶液，在氮气氛围下反应24h，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶液。将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶液加入到透析袋(12000-14000Da)中,在蒸馏水中透析72h，去除杂质，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物浊液，用9500rmp转数离心20分钟，得到透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物粗产物，再用100mL蒸馏水清洗产物，继续用9500rmp转数离心20分钟，重复2-3次。得到纯化透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物4.142g。
10mg透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物溶于1mL的二氯甲烷 中，加入200uL蒸馏水，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(1％，Wt％)和嵌段式聚醚F-68(1％,Wt％)混合溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为87000Da。其它各项检测图谱与实施例1的相应图谱类似。透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；粒子大小在223±4nm，分散系数为0.155±0.073，平均Zeta电位为-29.3±4.2mV。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (51)
1.一种透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物，其特征在于，其具有下式(1)所示的结构式，
式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，所述透明质酸的重均分子量为6600-12000Da。
3.根据权利要求2所述的聚合物，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸的重均分子量为20000-50000Da。
4.根据权利要求1-3任一项所述的聚合物，其特征在于，所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400-370000Da。
5.根据权利要求1-3任一项所述的聚合物，其特征在于，所述透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的粒径为190-280nm。
6.一种权利要求1-5任一项所述的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(a)在第一有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和聚乳酸-羟基乙酸接触，得到式(3)所示的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物；
式(3)中Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；
(b)在有机胺的存在下，在第二有机溶剂中，使步骤(a)所得的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物和胱氨接触，得到式(4)所示的胱氨-聚乳酸-羟基乙酸；
式(3)中Y与X的比例范围为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数；
(c)在第三有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和透明质酸接触，得到活化的透明质酸溶液；
(d)在有机胺的存在下，将步骤(b)所得产物与步骤(c)所得活化的透明质酸溶液接触，得到式(1)所示的透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物；
式(1)中n为16-30的整数，Y与X的比例为1-3:1，Y为153-549的整数，X为73-385的整数。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述聚乳酸-羟基乙酸一端为羧基，另一端酯封。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述聚乳酸-羟基乙酸的分子量为20000-50000Da。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比1-3:1。
10.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述的碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N-二环己基碳二亚胺。
11.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述的酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑。
12.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述第一有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿。
13.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述碳二亚胺缩合剂和酰化活化剂摩尔比为1-5:1。
14.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述碳二亚胺缩合剂和聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为2-6:1。
15.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)相对于1g聚乳酸-羟基乙酸，所述第一有机溶剂的用量为2-10ml。
16.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述接触在惰性气氛下进行。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述接触在氮气气氛中进行。
18.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为2-4小时。
19.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)还包括将所得反应粗产物酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物中的第一有机溶剂去除，然后将所述产物酯化聚乳酸-羟基乙酸沉淀出来，得到粘稠状产物，再将所得产物洗涤后真空干燥。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀使用乙醚进行。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀使用冷却的乙醚进行。
22.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述洗涤使用乙醚/甲醇混合溶液进行。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述洗涤使用体积比为1-9:1的乙醚/甲醇混合溶液进行。
24.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述真空干燥的温度为20～30℃；真空干燥的时间为24-48小时。
25.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述有机胺为N,N-二异丙基乙胺和/或三乙胺。
26.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述第二有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺。
27.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述胱氨和所述酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物的摩尔比2-10:1。
28.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中相对于1g步骤(a)所得的酯化聚乳酸-羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为0.05-1.5ml，所述第二有机溶剂的用量为5-10ml。
29.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述接触在惰性气氛下进行。
30.根据权利要求29所述的制备方法，其特征在于，所述接触在氮气气氛中进行。
31.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为12-24小时。
32.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中还包括将所得胱氨-聚乳酸-羟基乙酸从第二有机溶剂中沉淀出来，再将所得固体产物洗涤后真空干燥。
33.根据权利要求32所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂洗涤使用水进行。
34.根据权利要求33所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂洗涤使用蒸馏水。
35.根据权利要求32所述的制备方法，其特征在于，所述真空干燥的温度为20～30℃；真空干燥的时间为24-48小时。
36.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述透明质酸的重均分子量为6600-12000Da。
37.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述的碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N-二环己基碳二亚胺。
38.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述的酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑。
39.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述第三有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺。
40.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和透明质酸摩尔比为5:5:1-40:40:1。
41.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中相对于1g所述透明质酸，所述第三有机溶剂的用量为5-30ml。
42.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述接触在惰性气氛下进行。
43.根据权利要求42所述的制备方法，其特征在于，所述接触在氮气气氛中进行。
44.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述接触的温度为20-40℃，接触时间为2-4小时。
45.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中所述胱氨-聚乳酸-羟基乙酸和所述酯化透明质酸的质量比4-8:1。
46.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中相对于1g胱氨-聚乳酸-羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为0.02-1.5ml。
47.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中所述接触在惰性气氛下进行。
48.根据权利要求47所述的制备方法，其特征在于，所述接触在氮气气氛中进行。
49.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中所述接触的温度为20-40℃，接触的时间为12-24小时。
50.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中还包括将所得透明质酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸接枝聚合物产物溶液放入透析袋中透析。
51.根据权利要求50所述的制备方法，其特征在于，所述透析在20-25℃的蒸馏水中透析24-72小时。
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