CN108103065A - 一种klf4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法 - Google Patents

一种klf4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法，该方法通过建立小鼠腹腔细粒棘球蚴早期感染模型以及原头蚴与巨噬细胞共培养体系，了解巨噬细胞M1/M2极化相关因子表达情况和转录因子KLF4水平，期望阐明细粒棘球蚴通过上调KLF4转录、抑制IκB水平进而诱导M2型巨噬细胞的极化。并在此基础上，沉默KLF4试图恢复M1巨噬细胞的活性，有效杀伤虫体。为棘球蚴病的防治和新技术开发提供实验依据和理论基础。

Description

一种KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法。
背景技术
棘球绦虫(Echinococcus)后绦虫幼虫即棘球蚴寄生于牛、马、羊等草食动物，亦可寄生于人体引起棘球蚴病(Echinococcosis)或称包虫病(hydatid disease，hydatidosis)，为一种严重的人畜共患慢性寄生虫病。众所周知，巨噬细胞能够应对微生物和细胞因子环境信号，驱动其极化功能的表达。外界因素刺激将导致巨噬细胞表现出高度的可塑性、异质性。巨噬细胞存在一个连续的极化状态和2种不同的巨噬细胞表型，M1和M2是这种连续状态的极端。M1型巨噬细胞可有IFN-γ，TNF-α或脂多糖(LPS)诱导活化，产生多种促炎因子如IL-1β，IL-12，TNF-α高表达，IL-10低表达；M1型巨噬细胞也产生高浓度的活性氧和氮中间体，如一氧化氮(NO)，产生强大的抗菌、抗肿瘤作用，促进Th1型免疫应答。相反，M2巨噬细胞产生抗炎细胞因子IL-10，增加Arg-1的表达，与iNOS竞争同一个限制性的底物精氨酸。M2型巨噬细胞促进Th2型免疫应答，有文献报道，IL-4和IL-13诱导产生的M2巨噬细胞因子在变态反应性疾病，寄生虫疾病和组织修复中发挥重要角色。M2型标记性基因Arg-1，MR，Fizz-1及Ym1最近已被发现存在于寄生虫感染的小鼠体内。
M1和M2巨噬细胞的特性为研究早期E.granulosus感染产生免疫逃逸机制提供了重要的依据。M2巨噬细胞已被证实参与某些寄生虫感染如线虫、吸虫和绦虫。因此，更重要的是探究E.granulosus感染早期，M1/M2巨噬细胞调节的分子机制。转录因子调节巨噬细胞分化是目前研究较为热点方向。研究发现，Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)参与巨噬细胞调节。KLF4是一个真核生物锌指蛋白转录因子，属于KLF超家族一员。已有研究表明，KLF4诱导M2型巨噬细胞活化，而抑制M1型巨噬细胞的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法。通过建立小鼠腹腔细粒棘球蚴早期感染模型以及原头蚴与巨噬细胞共培养体系，了解巨噬细胞M1/M2极化相关因子表达情况和转录因子KLF4水平，期望阐明细粒棘球蚴通过上调KLF4 转录、抑制IκB水平进而诱导M2型巨噬细胞的极化。并在此基础上，沉默KLF4试图恢复 M1巨噬细胞的活性，有效杀伤虫体。为棘球蚴病的防治和新技术开发提供实验依据和理论基础。
其具体技术方案为：一种KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法，包括以下步骤：
步骤1、通过体外实验探讨原头蚴对巨噬细胞极化的影响；
建立细粒棘球绦虫原头蚴与RAW264.7细胞共培养体系，分别在12,36,48,84h收集细胞和培养上清液，qRT-PCR检测KLF4，M1(TNF-α、IL-6、MCP-1)，M2(Arg-1、Fizz-1、 MR)巨噬细胞因子的表达；ELISA检测相关因子分泌的含量；
步骤2、通过体内实验探讨细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的影响；
采用腹腔接种法建立小鼠细粒棘球蚴感染模型，BALB/c小鼠随机分组，实验组：0.2mL/ 只(原头蚴浓度：10000个/mL)；对照组：PBS 0.2mL/只；分别于第1、5、10、15天处死小鼠，收集腹腔巨噬细胞及外周血；qRT-PCR检测KLF4，M1(TNF-α、IL-6、MCP-1、iNOS)， M2(IL-10、TGF-β、Arg-1、Fizz-1、MR)巨噬细胞因子的mRNA表达；Western Blot检测 KLF4、iNOS、Arg-1及IκB的蛋白表达；ELISA检测血清M1(IL-6、MCP-1)，M2(Arg-1、MR)巨噬细胞因子的表达；
步骤3、通过干扰KLF4的转录探讨其在巨噬细胞极化中的作用；
建立原头蚴与腹腔巨噬细胞共培养体系，12、24、36、48h收集细胞，qRT-PCR检测KLF4，M1(IL-1β、IL-6、MCP-1)，M2(IL-10、TGF-β、Arg-1、Fizz-1、MR)巨噬细胞因子的mRNA表达；Western Blot检测KLF4、iNOS、Arg-1及IκB的蛋白表达；通过小干扰 RNA沉默KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，48h收集细胞，重复上述实验。
进一步，步骤1中，原头蚴与RAW264.7细胞共培养，实验组(84h)的KLF4mRNA水平较对照组明显升高。随着感染时间延长，M2巨噬细胞Arg-1、Fizz-1、MR的mRNA和蛋白水平呈上升趋势，M1巨噬细胞的TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平呈先升后降趋势。
进一步，步骤2中，细粒棘球蚴感染小鼠早期，腹腔巨噬细胞中KLF4的mRNA及蛋白表达水平上调；M1巨噬细胞相关因子的mRNA及蛋白表达水平先升高后下降；M2巨噬细胞相关因子的mRNA及蛋白表达水平呈上升趋势；IκB的蛋白表达也随感染时间延长而升高。
进一步，步骤3中，
a)原头蚴与腹腔巨噬细胞共培养12、24、36、48h后，KLF4的mRNA及蛋白表达上调，48h达高峰；IL-1β、MCP-1、IL-6、iNOS的表达水平下降，IL-10、TGF-β、Arg-1、Fizz-1、 MR的表达在感染后期升高，48h有显著差异；IκB蛋白在36h开始升高，48h达峰值。
b)沉默KLF4后，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，KLF4表达降低，M1巨噬细胞表达水平上调，M2巨噬细胞表达下降，IκB蛋白表达也下降。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的研究结果表明：
1.原头蚴刺激RAW264.7细胞，诱导巨噬细胞KLF4高表达，巨噬细胞上调M2相关因子，下调M1相关因子。
2.小鼠细粒棘球蚴感染早期，腹腔巨噬细胞KLF4及IκB表达上调，巨噬细胞从M1型转向M2型，对棘球蚴的杀伤力降低，有利于包虫逃避宿主免疫杀伤。
3.干扰KLF4，M1巨噬细胞相关因子表达升高，M2相关因子表达下降，且下调IκB。推测细粒棘球蚴感染早期，由于KLF4表达上调，从而抑制了促炎因子活化，使炎症水平降低，降低对病原体的清除，从而使细粒棘球蚴逃避宿主的免疫杀伤。
本发明假设KLF4可能参与包虫病巨噬细胞极化的过程，产生虫体对宿主的免疫逃逸，进而能够长期生存。本研究拟通过测定细粒棘球蚴原头蚴诱导RAW264.7细胞，小鼠腹腔巨噬细胞中KLF4及巨噬细胞M1/M2细胞因子的表达，探讨KLF4在细粒棘球蚴感染中的作用，并通过RNA干扰技术敲低腹腔巨噬细胞KLF4基因，进一步探讨KLF4调节巨噬细胞极化的作用机制，为包虫病的早期发生机制提供新的思路和理论依据。
附图说明
图1A为原头蚴刺激RAW264.7，在不同时间点qRT-PCR定量检测KLF4mRNA的表达(**P<0.001)；
图1B为随着感染时间的延长，KLF4在mRNA水平的表达量呈增高趋势；
图2A为原头蚴刺激RAW264.7，在不同时间点qRT-PCR定量检测TNF-αmRNA的表达(*P<0.05，**P<0.001)；
图2B为原头蚴刺激RAW264.7，在不同时间点qRT-PCR定量检测IL-6mRNA的表达(*P<0.05)；
图2C为原头蚴刺激RAW264.7，在不同时间点qRT-PCR定量检测MCP-1mRNA的表达(*P<0.05，**P<0.001)；
图2D为随着感染时间的延长，M1型细胞因子TNF-α，IL-6，MCP-1在mRNA水平的表达量早期升高显著；
图3A为原头蚴刺激RAW264.7，ELISA实验检测IL-6的表达(*P<0.05,**P<0.001)；
图3B为原头蚴刺激RAW264.7，ELISA实验检测MCP-1的表达(*P<0.05,**P<0.001)；
图3C为随着感染时间的延长，IL-6，MCP-1在培养上清中的浓度含量早期升高显著；
图4A为原头蚴刺激RAW264.7，在不同时间点qRT-PCR定量检测Arg-1mRNA的表达(*P<0.05，**P<0.001)；
图4B为原头蚴刺激RAW264.7，在不同时间点qRT-PCR定量检测Fizz-1mRNA的表达(*P<0.05，**P<0.001)；
图4C为原头蚴刺激RAW264.7，在不同时间点qRT-PCR定量检测MR mRNA的表达(*P<0.05， **P<0.001)；
图4D为随着感染时间的延长，M2型细胞因子Arg-1，Fizz-1，MR在mRNA水平的表达量逐渐升高
图5A为原头蚴刺激RAW264.7，ELISA实验检测Arg-1的表达(*P<0.05,**P<0.001)；
图5B为原头蚴刺激RAW264.7，ELISA实验检测MR的表达(*P<0.05,**P<0.001)；
图5C为随着感染时间的延长，Arg-1，MR在培养上清中的浓度含量逐渐升高；
图6A为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞KLF4mRNA的表达 (*P<0.05)；
图6B为随着感染时间的延长，KLF4在mRNA水平的表达量呈增高趋势；
图6C为小鼠细粒棘球蚴感染早期，Western blot检测腹腔巨噬细胞KLF4的表达；
图6D为半定量分析在感染不同时间点KLF4/β-actin IOD平均值(*P<0.05)；
图7A为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA的表达(*P<0.05
图7B为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞MCP-1mRNA的表达 (*P<0.05)；
图7C为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞IL-6mRNA的表达 (*P<0.05)；
图7D为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞iNOS mRNA的表达 (*P<0.05)；
图7E为小鼠细粒棘球蚴感染早期，Western blot检测腹腔巨噬细胞iNOS的表达(*P<0.05)；
图7F为小鼠细粒棘球蚴感染早期，Western blot检测腹腔巨噬细胞IκB的表达 (*P<0.05)；
图7G为小鼠细粒棘球蚴感染早期，ELISA检测腹腔巨噬细胞MCP-1的表达(*P<0.05)；
图7H为小鼠细粒棘球蚴感染早期，ELISA检测腹腔巨噬细胞IL-6的表达(*P<0.05)；
图8A为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞IL-10mRNA的表达 (*P<0.05)；
图8B为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞TGF-βmRNA的表达(*P<0.05)；
图8C为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞Fizz-1mRNA的表达(*P<0.05)；
图8D为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞MR mRNA的表达(*P<0.05)；
图8E为小鼠细粒棘球蚴感染早期，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞Arg-1mRNA的表达 (*P<0.05)；
图8F为小鼠细粒棘球蚴感染早期，Western blot检测腹腔巨噬细胞Arg-1的表达(*P<0.05)；
图8G为小鼠细粒棘球蚴感染早期，ELISA检测腹腔巨噬细胞MR的表达(*P<0.05)；
图8H为小鼠细粒棘球蚴感染早期，ELISA检测腹腔巨噬细胞Arg-1的表达(*P<0.05)；
图9A为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测腹腔巨噬细胞KLF4mRNA 的表达(*P<0.05)；
图9B为随着感染时间的延长，KLF4在mRNA水平的表达量呈增高趋势；
图9C为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，Western blot检测腹腔巨噬细胞KLF4的表达；
图9D为半定量分析在感染不同时间点KLF4/β-actin IOD平均值(*P<0.05)；
图10A为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测IL-1βmRNA的表达(*P<0.05)；
图10B为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测MCP-1mRNA的表达(*P<0.05)；
图10C为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测IL-6mRNA的表达(*P<0.05)；
图10D为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，Western blot检测iNOS的表达(*P<0.05)；
图10E为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，Western blot检测IκB的表达(*P<0.05)；
图11A为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测IL-10mRNA的表达(*P<0.05)；
图11B为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测TGF-βmRNA的表达(*P<0.05)；
图11C为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测Fizz-1mRNA的表达(*P<0.05)；
图11D为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测MR mRNA的表达 (*P<0.05)；
图11E为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR定量检测Arg-1mRNA的表达(*P<0.05)；
图11F为原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，Western blot检测Arg-1的表达 (*P<0.05)；
图12A为转染KLF4siRNA，qRT-PCR筛选出高效率KLF4-mus-1331；
图12B为转染KLF4-mus-1331，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，Western blot检测KLF4的表达(*,#P<0.05；*versus control group(ctrl),#versus negative control(NC))；
图13A为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测IL-1βmRNA表达；
图13B为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测MCP-1mRNA表达；
图13C为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测IL-6mRNA表达；
图13D为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，Western blot检测iNOS的表达；
图13E为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，Western blot检测IκB的表达(*,#P<0.05；*versus control group(ctrl),#versus negative control(NC))；
图14A为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测MR mRNA表达；
图14B为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测TGF-βmRNA表达；
图14C为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测IL-10mRNA表达；
图14D为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测Fizz-1mRNA表达；
图14E为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测Arg-1mRNA表达；
图14F为低表达KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，Western blot检测Arg-1的表达(*, #P<0.05；*versus control group(ctrl),#versus negative control(NC))。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1：体外原头蚴与RAW264.7细胞共培养KLF4的变化及巨噬细胞极性相关因子表达目的：探讨细粒棘球蚴原头蚴刺激RAW264.7细胞，可能通过分泌某些抗原、蛋白，诱导巨噬细胞KLF4高表达而促使其向M2分化，抑制巨噬细胞的功能，从而逃逸宿主的免疫杀伤。
1材料
1.1主要仪器和试剂
1.2主要病原体采集及细胞来源
原头蚴：感染细粒棘球蚴的绵羊病肝来自新疆昌吉市屠宰场。
细胞：小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)为实验室保种存放。
2方法
2.1原头蚴的制备
2.1.1细粒棘球蚴原头蚴的采集和培养
从屠宰场采集新鲜自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，自来水反复冲洗干净肝脏表面，用 75％酒精消毒，然后以无菌方式抽取无钙化、无感染、完整的含有原头节的囊液置无菌离心管中。待原头节自然沉淀后弃去上清囊液，用含有100ΙU/mL青霉素和100ΙU/mL链霉素的PBS(PH 7.3)漂洗3～5次。按一定浓度将制备好的原头蚴置于培养瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液(青霉素100ΙU/mL，链霉素100ΙU/mL)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2～3d换一次培养液，待用。
2.1.2细粒棘球蚴原头蚴的活性鉴定
采用伊红排斥实验鉴定虫体的活性。原头蚴经无菌PBS漂洗后，加入一定量的PBS，吹打混匀，取10μL置于载玻片上，加一滴0.5％的伊红染液，静置5min，盖上盖玻片，在倒置显微镜下观察颜色变化。活的原头节不着色，活力差或死亡的原头节染成红色，活力>90％可用于实验。
2.2体外原头蚴与RAW264.7细胞共培养
将培养对数期的RAW264.7细胞以1×106种板，0.5mL每孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，进行下列处理。实验组：每孔0.5mL细胞加入1000个/mL的原头节悬液0.5mL；对照组：等量的细胞加入0.5mL 1640，每个时间点3个复孔，37℃、5％CO2培养箱中培养。分别在12、36、48、84h收集细胞用于qRT-PCR检测，上清液冻存在-80℃，用于ELISA检测。
2.3 qRT-PCR法检测KLF4及RAW264.7细胞中相关因子mRNA表达水平
2.3.1RAW264.7细胞总RNA提取
1.直接在培养板中加入裂解液RZ裂解细胞，每孔1mL RZ裂解液。用取样器抽打若干次至溶液透明。将处理过的细胞裂解液置于无RNA酶的EP管保存，做好标记，封口膜密封，立即提取RNA或-80℃保存备用。
2.将匀浆细胞裂解液在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加入200μL氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。
3. 4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的 50％(～500μL)。把水相转移到新无RNA酶的EP管中，进行下一步操作。
4.缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃掉收集管中的废液。
5.向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液(使用前加入乙醇)，4℃12,000rpm (～13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
6.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液(使用前加入乙醇)，室温静置2min，4℃ 12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。12,000rpm(～13,400×g)离心30 sec，弃废液。
7.重复步骤6。
8.将吸附柱放入收集管中，4℃12,000rpm(～13,400×g)离心2min，离心后室温将吸附柱放置数分钟，去除残余的液体。注意：离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的qRT-PCR等实验操作。
9.将吸附柱转入新EP管中，加入30-100μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min， 4℃12,000rpm(～13,400×g)离心2min，溶解RNA。
10.使用核酸定量仪(A260/A280,Nanodrop 2000，Thermo Fisher)检测提取 RNA纯度(吸光度值为波长260-280nm)，结果以1.8-2.0的样本用于下一步逆转录。
2.3.2 RNA逆转录合成cDNA
1.将得到的样品RNA调成同一浓度逆转成cDNA，步骤严格遵循TIANScript cDNA第一链合成试剂盒说明书。
2.在冰浴的无酶EP管中加入如下反应混合物：
3. 70℃加热5min，冰上冷却2min，掌上离心机离心后加入以下各组分：
4. 42℃温浴50min，95℃加热5min，终止反应。用Rnase-Free ddH2O将反应体系稀释到 50μL，冷冻保存。
2.3.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测
1.目的及内参引物设计
按照GenBank的小鼠KLF4、Arg-1、Fizz-1、MR、TNF-α、IL-6、MCP-1基因序列，以β-Actin作为内参基因，全部引物均由上海生物公司合成(基因序列见表1-1)。
表1 qRT-PCR引物
2.将cDNA取出冰上溶解，严格按照试剂盒说明操作添加相应试剂，反应体系如下：
Total reaction volume
3.qRT-PCR反应条件如下：
4.将96孔板瞬时离心后，打开BioRad PCR仪，设置反应条件，放入96空反应板，开始运行程序，待完毕后保存结果并进行处理分析，同一样本设3个复孔，实验重复3次，用2-△△Ct法对扩增结果进行分析，△△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。
2.4 ELISA检测共培养上清液中细胞因子的表达含量
2.4.1试剂的配制
1.提前20分钟将Washing buffer(50×)和即用溶液从试剂盒中取出，以平衡至室温。
2.标准品溶解后混匀，准确倍比稀释，严格操作非常重要。标准品的倍比稀释最好在进口的或者硅化的EP管中完成，减少非特异性吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。母液若没有用完请按照一次用量分装，-20℃保存。标准品浓度梯度为：1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、 125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL。
3.Biotinylated antibody：1∶100用Dilution buffer R(1×)稀释，混匀制成1×antibody工作液。
4.Streptavidin-HRP：1∶100用Dilution buffer R(1×)稀释，混匀制成1×HRP工作液。
5.Washing buffer(50×)：1∶50用蒸馏水稀释。
2.4.2操作过程
1.使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。
2.根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样品(含标准品) 和空白都应做复孔。
3.加样：100μL/well加入稀释后的Cytokine standard至标准品孔，100 μL/well加入样品至样品孔，设置空白孔，用Dilution buffer R(1×)代替样本和标准品。
4.加检测抗体：50μL/well加入稀释后的Biotinylated antibody。混匀后，盖上封板膜，37℃温育90分钟。
5.洗板：扣去孔内液体，300μL/well加入1×washing buffer；停留1分钟后弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干。
6.加酶：100μL/well加入稀释后的Streptavidin-HRP。盖上封板膜，37℃温育30分钟。
7.洗板：重复步骤5。
8.显色：100μL/well加入TMB，37℃避光温育5-30分钟之间，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10-20分钟可以达到很好的效果。
9.终止反应：100μL/well迅速加入Stop solution终止反应。
10.读板：终止后10分钟内，用检测波长(measurement wavelength)450nm读值。
11.根据标准品的OD值和稀释浓度绘制标准曲线并建立标准曲线方程式，再通过方程式计算出待测样品的浓度。
2.5统计学处理
应用SPSS17.0软件进行统计学分析，均数间比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1原头蚴与RAW264.7细胞共培养，KLF4mRNA表达升高
qRT-PCR检测KLF4mRNA的表达情况(图1)。结果显示：除刺激后12h P<0.05外，其他各个时间点KLF4在mRNA水平的表达量均高于对照组，84h与对照组比较，有显著统计学意义(P<0.001)(图1A)。且随着感染时间的延长，KLF4在mRNA水平的表达量呈增高趋势(图1B)，采用单因素方差分析发现，84h与12h、36h、48h比较均有显著统计学意义 (P<0.001)。
3.2原头蚴与RAW264.7细胞共培养，M1型细胞因子先升后降
3.2.1原头蚴与RAW264.7细胞共培养，M1型细胞因子在mRNA水平先升后降
qRT-PCR检测M1型细胞因子mRNA的表达结果显示：原头蚴刺激RAW264.7细胞后，TNF-α、IL-6、MCP-1的表达开始上升，经统计学分析，TNF-α、IL-6在刺激后36、48、 84h，实验组与对照组相比均有统计学意义；MCP-1仅在36、48h与对照组比较有统计学意义，48h时，TNF-α、IL-6、MCP-1的表达分别都达到最高。随着感染时间延长，TNF-α、 IL-6、MCP-1的表达又逐渐降低，在84h，TNF-α、IL-6、MCP-1的表达明显低于48h的表达，呈现出先升后降的趋势(*P<0.05，**P<0.001)(图2)。
3.2.2原头蚴与RAW264.7细胞共培养，M1型细胞因子在培养上清中含量先升后降
ELISA检测培养上清中M1型细胞因子浓度结果显示：IL-6、MCP-1的浓度在原头蚴刺激 RAW264.7细胞后开始上升，48h均达到最高；但随着刺激时间延长，IL-6、MCP-1的浓度呈下降趋势，在84h，IL-6、MCP-1的浓度与刺激起始时相当。上清中IL-6、MCP-1的浓度变化与其mRNA的水平变化相一致(图3)。
3.3原头蚴与RAW264.7细胞共培养，M2型细胞因子表达升高
3.2.1原头蚴刺激RAW264.7细胞后，使M2型细胞因子mRNA水平表达上升
qRT-PCR检测各个时间点M2型细胞因子mRNA的表达，结果显示：随着体外刺激时间的推进，Arg-1，Fizz-1，MR的mRNA表达逐步增加。Arg-1在原头蚴刺激12、36、48、84h 后，由control组的1.33倍提高到40.03倍(图4A)；Fizz-1的表达由control组的6.18 倍增加到54.05倍(图4B)；MR的mRNA表达由control组的0.12倍上升到8.64倍(图4C)。各感染组间有统计学意义(*P<0.05，**P<0.001)。图4D图统计学分析显示，M2型细胞因子均呈现上升趋势，且Arg-1上升尤为显著。
3.2.2原头蚴刺激RAW264.7细胞后，使上清中M2型细胞因子分泌增多
ELISA检测上清液中M2型细胞因子浓度结果显示：原头蚴刺激RAW264.7细胞后，上清液中Arg-1，MR的浓度变化与其mRNA表达有相似结果，呈现上升趋势，在84h浓度达到最高，实验组之间比较有统计学意义(*P<0.05，**P<0.001)(图5)。
实施例2：小鼠细粒棘球蚴感染早期KLF4变化及巨噬细胞极性相关因子表达
目的：本研究将通过建立细粒棘球蚴感染小鼠动物模型，探讨细粒棘球蚴感染小鼠早期，腹腔巨噬细胞KLF4的表达水平，及巨噬细胞相关炎性细胞因子的表达情况，从而阐明包虫病感染早期KLF4的非特异性免疫调节作用。
1材料
1.1主要仪器和试剂
主要仪器设备名称 生产公司
蛋白电泳系统 美国Bio-Rad生物工程公司
蛋白转膜系统 美国Bio-Rad生物工程公司
恒温磁力加热搅拌器 江苏市金坛市医疗器械厂
凝胶成像分析仪 美国Bio-Rad生物工程公司
PH计 中国上海公司
注：其它同实施例1
注：其它同实施例1
1.2主要病原体采集及实验动物
原头蚴：感染细粒棘球蚴的绵羊病肝来自新疆昌吉市屠宰场。
小鼠：雌性BALB/c小鼠，体重20±2g，6-8周。购自新疆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(新)2013-0001。
2方法
2.1原头蚴的制备(同实施例1)
2.2建立细粒棘球蚴感染小鼠动物模型
将40只健康雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组，每组20只。感染组：腹腔接种浓度为10000个/mL原头蚴，0.2mL/只；对照组：腹腔接种PBS，0.2mL/只，分别在 1、5、10、15d无菌采集外周血，椎脱臼法处死小鼠，提腹腔巨噬细胞。
2.3小鼠外周血的采集及保存
采用无菌法摘取小鼠的眼球采集外周血，待血液自然凝固静置数分钟后，离心3500 rpm/min，10min后收集血清，放置在-80℃备用。
2.4小鼠腹腔巨噬细胞的分离
细粒棘球蚴感染小鼠1、5、10、15d后收集腹腔巨噬细胞。先无菌采集小鼠外周血，后将小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡3min，取出小鼠，腹面向上，用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜。然后用5mL注射器注入5mL无血清1640 培养基，针尖朝上，轻轻按揉腹膜5-8min，避开肠道和脂肪组织，回抽，将收集的腹腔液放于15mL离心管，离心(2000r/min，5min)，用含有10％FBS的DMEM重悬。若有红细胞，则用ACK buffer裂解红细胞。细胞悬液置入6孔培养板，37℃培养12h后，吸弃上清，留下贴壁细胞，即为分离的小鼠腹腔巨噬细胞。
2.5 qRT-PCR法检测KLF4及腹腔巨噬细胞极性相关因子mRNA表达水平
2.5.1腹腔巨噬细胞总RNA提取(同实施例1)
2.5.2 RNA逆转录合成cDNA(同实施例1)
2.5.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测
1.目的基因KLF4、Arg-1、Fizz-1、MR、IL-10、TGF-β、TNF-α、IL-6、MCP-1、 iNOS及β-Actin内参基因引物均由上海生物公司合成(基因序列见表2-1)。
表2 qRT-PCR引物
注：其它基因序列见表1。
2.qRT-PCR反应体系，反应条件及结果处理同实施例1。
2.6 Western Blot法检测KLF4、IκB、Arg-1、iNOS及β-Actin的蛋白表达水平
2.6.1 Western Blot相关试剂配制
2.6.2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方
2.6.3凝胶的配制
1.自来水加入洗涤剂清洗灌胶玻璃板，使用纱布擦拭灌胶面，保证无残余凝胶粘附，自来水冲洗干净后，蒸馏水润洗3遍，放入烘干箱中烘干。
2.用清洗干净的小烧杯配制分离胶，即下层胶：两块胶10mL(胶的浓度根据自己所做蛋白大小确定，配比见2.6.2)，每加一种成分即摇匀，加入TEMED混匀后即可灌胶，灌胶后加ddH2O封闭液面，去除气泡并隔绝空气，室温静置45min。
3.待分离胶完全聚合(平视观察胶面与水面自然分离产生缝隙)，缓慢弃去上层水，用滤纸吸干残留液体。
4.用清洗干净的小烧杯配制5％浓缩胶，即上层胶：两块较6mL，每加一种成分即摇匀，加入TEMED混匀后即可灌胶，灌至顶部(避免产生气泡)，垂直插入10孔齿梳，室温静置30min。
5.待凝胶完全聚合，取下胶板，浸泡于ddH2O中4℃保存备用。
2.6.4腹腔巨噬细胞总蛋白的提取
1.准备好2.4中提取分离的腹腔巨噬细胞，吸净并弃除旧的培养基，用预冷的PBS浸洗细胞2次，吸净PBS残液丢弃后，将6孔板放在冰上。100mm培养皿加入600μL预冷的含有6μL PMSF的细胞裂解液，60mm培养皿加入200μL预冷的含有2μL PMSF的细胞裂解液(PMSF︰细胞裂解液＝1︰100)，冰上放置15min。
2.迅速并轻轻地用细胞刮至培养皿的一侧，将细胞碎片和裂解液收集入1.5mL的Ep管中， 4℃，50rpm，旋转混匀45min。
3.放入离心机离心10min(4℃，12000rpm)，将全部上清液收集至新的1.5mL Ep管中，测量上清液的蛋白含量，用上述细胞裂解液平衡所有样本，使其具有相同的浓度。
4.每400μL蛋白加入100μL的5×protein loading buffer上样缓冲液(蛋白︰protein loading buffer＝4︰1)，混匀，在加热模块上煮沸8min(100℃)，-20℃冰箱保存备用。用于Western Blot检测。
2.6.5 Western Blot检测
1.电泳：将制备好的凝胶组装到垂直电泳架上，放入电泳槽中。将1×电泳缓冲液倒入电泳内槽，将免疫共沉淀的两种蛋白液加入加样孔中，浓缩胶：80V，30min，分离胶：110V，100min。
2.电泳完成后将胶板取出，对凝胶进行合适的裁剪，放入1×电转液中浸泡15min。
3.提前准备与凝胶一样大小的滤纸及PVDF膜(使用前需要甲醇浸泡3min)(也常用NC膜，使用前ddH2O浸泡3min)，一并放入1×电转液中浸泡25min。
4.电转：按照滤纸→膜→胶→滤纸从下往上的顺序(胶靠近负极，膜靠近正极)，放入半干式电转膜仪中，并赶出各层间的气泡。恒压21V，43min(转膜时间根据蛋白分子量不同，需要摸索)。
5.封闭：将转膜后的PVDF膜(左上角剪角标记)放入10mL 5％脱脂奶粉溶液中封闭，室温放置，40rpm，封闭2h(也可以4℃孵育过夜)。
6.孵育一抗：一抗按KLF4：3μg/mL，IκB：1︰1000，Arg-1：1︰5000，iNOS： 1︰1000，β-Actin：1︰5000的比例稀释于5％脱脂奶粉封闭液中，50-60rpm，4℃孵育过夜。
7.洗涤：将膜从一抗转移至另外一个皿中，正面向上，加入1×TBST液，快速振荡洗涤5次(80-100rpm)，第一次5min，后面4次各15min。
8.孵育二抗：将辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG的二抗按说明书推荐比例，以1:50000的比例加入新配置的含有5％脱脂奶粉的封闭液中，置于摇床上室温低速(40-50rpm)孵育2h。
9.洗涤：将膜从二抗转移至另外一个皿中，正面向上，加入1×TBST液，快速振荡洗涤4次(80-100rpm)，第一次5min，后面3次各10min。
10.显色：ECL发光试剂盒检测蛋白印记条带，等体积混合发光试剂A和B液，加到保鲜膜上。将膜上液体沥干，正面与发光试剂充分接触，室温孵育3min。去尽残液，移至发光板上，用保鲜膜包好，避免出现气泡。
11.曝光：将裁剪好的胶片放到包有膜的玻璃板上，压片30s，将胶片在显影液中快速抽取10次，在红外线下看胶片是否显影，根据条带的深浅，调整压片和曝光的时间，以达最佳效果。显影后将胶片放入定影液中3-5min，之后用清水冲洗，晾干。
12.将胶片标记后置于凝胶成像系统中进行拍照处理。
2.7 ELISA检测小鼠外周血中IL-6、MCP-1、MR、Arg-1的表达含量(同实施例1)
2.8统计学处理(同实施例1)
3结果
3.1小鼠细粒棘球蚴感染早期，腹腔巨噬细胞KLF4表达水平增加
3.1.1KLF4的mRNA表达水平上调
图6A，B为各个时间点各组小鼠腹腔巨噬细胞KLF4的mRNA相对表达量，相比于Control 组，Infection组的KLF4mRNA表达水平于第10天上调，第15天达到峰值(图6A)(*P<0.05)，且在第10天到第15天上调迅速，两组之间有统计学意义(图6B)(*P<0.05)。
3.1.2 KLF4的蛋白表达水平上升
Western Blot的方法检测小鼠腹腔巨噬细胞KLF4蛋白表达水平的变化。结果显示：小鼠腹腔巨噬细胞KLF4蛋白表达与mRNA的表达趋势基本一致，与Control组相比，Infection 组KLF4蛋白的表达水平在第10天明显升高，第15天至最高(图6C-D)(*P<0.05)。
3.2小鼠细粒棘球蚴感染早期，腹腔巨噬细胞M1型巨噬细胞因子表达先升后降
3.2.1小鼠细粒棘球蚴感染早期，腹腔巨噬细胞TNF-α、MCP-1、IL-6、iNOS的mRNA表达水平先升高后下降
细粒棘球蚴感染早期，M1型巨噬细胞因子TNF-α、MCP-1、IL-6、iNOS的mRNA相对表达量结果显示：Infection组的TNF-α、MCP-1、IL-6、iNOS mRNA表达水平第1天开始升高，TNF-α、MCP-1、IL-6mRNA相对表达量在第10天明显高于Control组，达峰值，随后，MCP-1、IL-6mRNA相对表达量迅速下降，在第15天基本与Control组相平，TNF-α显示下降较为缓和(图7A-C)(*P<0.05)，然而，iNOS mRNA相对表达量在第5天显著高于 Control组，达峰值，之后第10天、第15天表达量基本保持稳定，但也有所下降(图7D) (*P<0.05)。
3.2.2小鼠细粒棘球蚴感染早期，腹腔巨噬细胞iNOS，IκB蛋白表达水平
图7E为细粒棘球蚴原头蚴感染后各个时间点各组小鼠腹腔巨噬细胞中iNOS的相对表达。Western Blot结果显示Infection组小鼠腹腔巨噬细胞中iNOS蛋白的表达与mRNA的表达趋势基本一致。第1天开始升高，在第5天显著高于Control组，达峰值，而后降低，第15天达最低(*P<0.05)。
Western Bolt检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中IκB蛋白水平的表达(图7F)，从图7F中可见IκB在实验组小鼠腹腔巨噬细胞中第1天至第5天表达较低，第10天开始升高，第 15天达峰值，且第10天和第15天实验组与对照组相比，有显著的统计学意义(*P<0.05)。
3.2.3小鼠细粒棘球蚴感染早期，外周血中细胞因子MCP-1、IL-6表达先升后降
ELISA检测小鼠细粒棘球蚴感染早期外周血细胞因子MCP-1、IL-6的表达(图7G-H)。细粒棘球蚴感染早期，外周血细胞因子MCP-1、IL-6的含量第1天开始升高，在第10天达峰值，经统计学分析，有显著差异(*P<0.05)。随着感染时间的延长，外周血的细胞因子MCP-1、IL-6的含量呈先升高后下降趋势，由第1天升高到第10天，而后下降，第15天最低，与其mRNA表达水平基本一致。
3.3小鼠细粒棘球蚴感染早期，腹腔巨噬细胞M2型巨噬细胞因子表达升高
3.3.1小鼠细粒棘球蚴感染早期，腹腔巨噬细胞IL-10、TGF-β、Fizz-1、MR、Arg-1mRNA 表达水平逐渐升高
qRT-PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞中IL-10、TGF-β、Fizz-1、MR、Arg-1的mRNA相对表达量，结果显示：在小鼠细粒棘球蚴感染早期，IL-10、TGF-β、Arg-1mRNA相对表达量除第1天外，其他各个时间点实验组均高于对照组，随着感染时间的延长，IL-10、TGF-β、Arg-1mRNA的表达水平呈增高趋势，经统计学分析，任意两天感染组之间均有统计学意义 (图8A，B，E)(*P<0.05)；然而，Fizz-1、MR mRNA相对表达量从第1天开始逐渐升高，在第15天达到峰值，各实验组与对照组相比，均有显著差异，且实验组第1天与第5天，第10天与第15天之间也有统计学意义(图8C，D)(*P<0.05)。
3.3.2小鼠细粒棘球蚴感染早期，腹腔巨噬细胞Arg-1蛋白表达水平升高
图8F为细粒棘球蚴原头蚴感染后各个时间点各组小鼠腹腔巨噬细胞中Arg-1的相对表达。Western Blot结果显示：感染组小鼠腹腔巨噬细胞中Arg-1蛋白的表达与mRNA的表达趋势基本一致。第5天开始升高，在第15天显著高于对照组，达峰值，除第1天外，各实验组与对照组相比，均有统计学意义(*P<0.05)。
3.3.3小鼠细粒棘球蚴感染早期，外周血中细胞因子MR、Arg-1表达水平升高
ELISA检测小鼠细粒棘球蚴感染早期外周血细胞因子MR、Arg-1的表达(图8G-H)。细粒棘球蚴感染早期，外周血细胞因子MR的含量第1天开始升高，在第15天达峰值，经统计学分析，第5、10、15天实验组与对照组相比，有显著差异(*P<0.05)，随着感染时间的延长，外周血的细胞因子MR的含量呈逐渐升高趋势，与其mRNA表达水平基本一致；外周血细胞因子Arg-1的含量在第5天，第15天时，实验组显著高于对照组，具有统计学意义 (*P<0.05)。
实施例3：KLF4在巨噬细胞极化中的作用
目的：通过原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，探讨原头蚴诱导腹腔巨噬细胞后，KLF4的表达水平及其对巨噬细胞功能调节的作用。并在此研究基础上，使用KLF4-siRNA，沉默KLF4相关通路，进一步证实KLF4对巨噬细胞表型偏移的影响。
1材料
1.1主要仪器和试剂
主要试剂 生产公司
KLF4siRNA 上海吉玛技术有限公司
LipofectatimeTM 2000 美国Invitrogen公司
注：其它仪器、试剂同实施例1、2。
1.2主要病原体采集及细胞
原头蚴：感染细粒棘球蚴的绵羊病肝来自新疆昌吉市屠宰场。
小鼠腹腔巨噬细胞：选取健康的6-8周雌性BALB/c小鼠分离提取。
2方法
2.1原头蚴的制备(同实施例1)
2.2小鼠腹腔巨噬细胞的分离
选取健康的6-8周雌性BALB/c小鼠，分离提取方法基本同实施例2中2.4。
2.3建立细粒棘球蚴感染小鼠腹腔巨噬细胞体外模型
将分离提取的小鼠腹腔巨噬细胞以1×106种板，1mL每孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，进行下列处理。
2.3.1原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养
感染组：取浓度为1000个/mL原头蚴1mL与细胞共培养；对照组：1mL 1640培养基与细胞共培养。每个时间点3个复孔，37℃、5％CO2培养箱中培养。分别在12、24、36、 48h收集细胞用于qRT-PCR、Western Bolt检测。
2.3.2转染KLF4siRNA后，原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养
1.干扰位点的筛选：针对小鼠KLF4基因设计3种不同干扰位点的KLF4-mus-siRNA干扰质粒，随机序列阴性对照质粒Negative Control(表3)。
表3 KLF4siRNA质粒序列
2.质粒转染：按照LipofectatimeTM 2000说明书操作，步骤如下：
a)将2.3中分离培养的小鼠腹腔巨噬细胞换液培养于2mL无血清无双抗的DMEM培养液中；
a)将适量(6μL/孔)siRNA及适量(7μL/孔)LipofectatimeTM 2000分别混于一定量(200μL/孔)的无血清无双抗的DMEM中，充分混匀，室温静置5分钟；
b)再将上述siRNA混合液200μL和LipofectatimeTM 2000混合液200μL充分，室温静置15分钟；
c)无菌方式取出培养箱中提前备好的6孔板细胞，将混匀的转染配液(400μL/孔)加入6孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养6h；
d)取出6孔板，将培养液缓慢吸干，加入含10％FBS的DMEM完全培养基(2mL/孔) 和原头蚴(1000个/孔)，37℃、5％CO2培养箱中培养48h；
e)收集细胞，提取各组细胞RNA，qRT-PCR检测各组细胞KLF4的相对表达量，选取干扰效率最高的质粒进行后续实验。
3.瞬转KLF4siRNA，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞：实验组：干扰效率最高的KLF4siRNA瞬转后，加入一定量的原头蚴(1000个/孔)与细胞共培养；对照组：阴性对照质粒 NegativeControl瞬转后，加入一定量的原头蚴(1000个/孔)与细胞共培养。37℃、 5％CO2培养箱中培养48h，收集细胞，采用qRT-PCR、Western Bolt检测巨噬细胞相关炎性因子。
2.4 qRT-PCR法检测KLF4及腹腔巨噬细胞极化相关因子mRNA表达水平
2.5.1腹腔巨噬细胞总RNA提取(同实施例1)
2.5.2 RNA逆转录合成cDNA(同实施例1)
2.5.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测
1.目的基因KLF4、Arg-1、Fizz-1、MR、IL-10、TGF-β、IL-1β、IL-6、MCP-1及β-Actin内参基因引物均由上海生物公司合成(基因序列见表4)。
表4 qRT-PCR引物
注：其它基因序列见表1-1，2-1。
2.qRT-PCR反应体系，反应条件及结果处理同实施例1。
2.5Western Blot检测KLF4、IκB、Arg-1、iNOS及β-Actin的蛋白表达水平(同实施例 2)
2.6统计学处理(同实施例1)
3结果
3.1原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，KLF4表达水平增加
3.1.1 KLF4的mRNA表达水平上调
图9A，B为qRT-PCR检测KLF4的mRNA相对表达量，相比于对照组，感染组的KLF4mRNA表达水平于24h开始逐渐上调，48h达到峰值(*P<0.05)，并且各实验组之间相比，有统计学意义(*P<0.05)。
3.1.2KLF4的蛋白表达水平上升
Western Blot检测KLF4蛋白表达水平的变化。结果显示：小鼠腹腔巨噬细胞KLF4蛋白表达与mRNA的表达趋势基本一致，与对照组相比，感染组KLF4蛋白的表达水平在36h升高，至48h达高峰，差异有统计学意义(图9C，D)(*P<0.05)。
3.2原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，M1型巨噬细胞因子表达情况
3.2.1原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，IL-1β、MCP-1、IL-6的mRNA表达水平先升高后下降
原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，qRT-PCR检测M1型巨噬细胞因子IL-1β、MCP-1、 IL-6的mRNA相对表达量结果显示：感染组的TNF-α、MCP-1、IL-6mRNA表达水平12h最高，随后开始下降，48h降至最低；感染组12h与24h，24h与36h之间相比，均有统计学意义(图10A-C)(*P<0.05)。
3.2.2原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，iNOS，IκB蛋白表达水平
图10D为原头蚴刺激小鼠腹腔巨噬细胞后，各个时间点各组细胞中iNOS的相对表达。 Western Blot结果显示：实验组小鼠腹腔巨噬细胞中iNOS蛋白的表达12h被抑制，24h表达升高，与对照组比，差异有统计学意义(*P<0.05)，随后又下降，基本与12h相平。
Western Bolt检测各组细胞中IκB蛋白水平的表达(图10E)，从图中可见IκB在实验组小鼠腹腔巨噬细胞中12h至24h表达较低，36h开始升高，48h达峰值，且48h实验组与对照组相比，有显著的统计学意义(*P<0.05)。
3.3原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，M2型巨噬细胞因子表达情况
3.3.1原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，IL-10、TGF-β、Fizz-1、MR、Arg-1mRNA表达水平逐渐升高
qRT-PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞中IL-10、TGF-β、Fizz-1、MR、Arg-1的mRNA相对表达量，结果显示：原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，MR、IL-10、Fizz-1mRNA相对表达量在48h实验组明显高于对照组(图11A，C，D)(*P<0.05，**P<0.001)；然而，TGF-β、 Arg-1mRNA相对表达量36h开始升高，48h达峰值，与对照组相比，有显著统计学意义(图11B，E)(*P<0.05，**P<0.001)。
3.3.2原头蚴与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，Arg-1蛋白表达水平升高
图11F为原头蚴刺激腹腔巨噬细胞后，各个时间点各组小鼠腹腔巨噬细胞中Arg-1的相对表达。Western Blot结果显示：感染组小鼠腹腔巨噬细胞中Arg-1蛋白的表达逐渐升高，在36h，48h时，显著高于对照组(*P<0.05)。
3.5转染KLF4siRNA，筛选出高效率KLF4-mus-1331
原代腹腔巨噬细胞瞬转Negative Control及KLF4siRNA(901,1331,1796)后，一定量的原头蚴刺激细胞。48h，qRT-PCR分析KLF4的mRNA相对表达量，选取干扰效率最高的质粒，结果显示：转染KLF4siRNA后，KLF4mRNA相对表达量降低，统计学分析， KLF4-mus-1331使KLF4mRNA相对表达量最低，其转染效率最高，可作为后续实验运用(*, #P<0.05；*versuscontrol group(ctrl),#negative control(NC))(图12A)。
3.6巨噬细胞转染KLF4-mus-1331，KLF4蛋白表达水平情况
如图12B所示，与Ctrl组相比，48h腹腔巨噬细胞的KLF4蛋白相对表达量明显上调，差异有统计学意义(*P<0.05；*versus Ctrl)；NC组与48h相比无显著差异(P>0.05)；与NC组相比，1331组腹腔巨噬细胞的KLF4蛋白相对表达量明显下降，差异有统计学意义 (#P<0.05；#versus NC)。
3.7低表达KLF4对巨噬细胞M1型的影响
3.7.1低表达KLF4对巨噬细胞M1型mRNA的影响
通过原头蚴诱导激活，巨噬细胞M1型表面标志物IL-1β、MCP-1及IL-6mRNA相对表达量48h无显著差异，如图13A-C所示，与Ctrl组相比，48h各M1型标记物的表达无显著差异(P>0.05)；NC组与48h相比无显著差异(P>0.05)。而1331组与NC组相比，IL-1β、 MCP-1及IL-6表达上调，说明KLF4低表达促进了M1型表面标志物IL-1β、MCP-1及IL-6 的表达(*,#P<0.05；*versus control group(ctrl),#negative control(NC))。
3.7.2低表达KLF4对巨噬细胞iNOS，IκB蛋白的影响
如图13D所示，与Ctrl组相比，48h腹腔巨噬细胞的iNOS蛋白相对表达量明显上调，差异有统计学意义(*P<0.05；*versus Ctrl)；NC组与48h相比无显著差异(P>0.05)；与NC组相比，1331组腹腔巨噬细胞的iNOS蛋白相对表达量明显上调，差异有统计学意义 (#P<0.05；#versus NC)，说明KLF4低表达促进了iNOS蛋白的表达。
如图13E所示，与Ctrl组相比，48h腹腔巨噬细胞的IκB蛋白相对表达量明显上调，差异有统计学意义(*P<0.05；*versus Ctrl)；NC组与48h相比无显著差异(P>0.05)；与NC组相比，1331组腹腔巨噬细胞的IκB蛋白相对表达量明显下调，差异有统计学意义 (#P<0.05；#versus NC)，因此，KLF4低表达抑制了IκB蛋白的表达。
3.8低表达KLF4对巨噬细胞M2型的影响
3.8.1低表达KLF4对巨噬细胞M2型mRNA的影响：通过原头蚴诱导激活，巨噬细胞M2型表面标志物IL-10、TGF-β、Fizz-1、MR及Arg-1mRNA相对表达量48h明显上调，如图14A-E所示，与Ctrl组相比，48h各M2型标记物的表达均有所上调(*P<0.05；*versus Ctrl)；NC组与48h相比无显著差异(P>0.05)；而1331组与NC组相比，IL-10、TGF-β、 Fizz-1、MR及Arg-1表达下调，说明KLF4低表达抑制了M2型表面标志物IL-10、TGF-β、 Fizz-1、MR及Arg-1的表达(#P<0.05；#negative control(NC))。
3.8.2低表达KLF4对巨噬细胞M2型Arg-1蛋白的影响：如图14F所示，与Ctrl组相比， 48h腹腔巨噬细胞的Arg-1蛋白相对表达量明显上调，差异有统计学意义(*P<0.05；*versus Ctrl)；NC组与48h相比无显著差异(P>0.05)；与NC组相比，1331组腹腔巨噬细胞的Arg-1蛋白相对表达量明显下调，差异有统计学意义(#P<0.05；#versus NC)，说明KLF4低表达抑制了Arg-1蛋白的表达。
结论：原头蚴刺激RAW264.7细胞，诱导巨噬细胞KLF4高表达，巨噬细胞相关炎性因子发生变化。细粒棘球蚴感染小鼠早期，腹腔巨噬细胞KLF4及IκB表达上调，巨噬细胞从 M1型转向M2型，使其对棘球蚴的杀伤力降低，有利于包虫逃避宿主的免疫杀伤。干扰KLF4， M1巨噬细胞表达明显升高，M2巨噬细胞表达下降。推测细粒棘球蚴感染早期，由于KLF4表达上调，从而抑制了促炎因子活化，使炎症水平降低，降低对病原体的清除，从而使细粒棘球蚴逃避宿主的免疫应答。
序列表
<110> 陈雪玲
<120> 一种KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattccatca tgaagtgtga 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actcctgctt gctgatccac 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
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agttctcatc tcaaggcaca cc 22
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggtcagtt catcggagcg 20
<210> 5
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<212> DNA
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cagaagaatg gaagagtcag 20
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cagatatgca gggagtcacc 20
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actcgttgac tggaccactg 20
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<212> DNA
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aagaagcagg gtaaatgggc a 21
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caaggaaggt tggcatttgt 20
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gcttgaggtg gttgtgga 18

Claims (4)

1.一种KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、通过体外实验探讨原头蚴对巨噬细胞极化的影响；
建立细粒棘球绦虫原头蚴与RAW264.7细胞共培养体系，分别在12,36,48,84h收集细胞和培养上清液，qRT-PCR检测KLF4，M1(TNF-α、IL-6、MCP-1)，M2(Arg-1、Fizz-1、MR)巨噬细胞因子的表达；ELISA检测相关因子分泌的含量；
步骤2、通过体内实验探讨细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的影响；
采用腹腔接种法建立小鼠细粒棘球蚴感染模型，BALB/c小鼠随机分组，实验组：0.2mL/只(原头蚴浓度：10000个/mL)；对照组：PBS 0.2mL/只；分别于第1、5、10、15天处死小鼠，收集腹腔巨噬细胞及外周血；qRT-PCR检测KLF4，M1(TNF-α、IL-6、MCP-1、iNOS)，M2(IL-10、TGF-β、Arg-1、Fizz-1、MR)巨噬细胞因子的mRNA表达；Western Blot检测KLF4、iNOS、Arg-1及IκB的蛋白表达；ELISA检测血清M1(IL-6、MCP-1)，M2(Arg-1、MR)巨噬细胞因子的表达；
步骤3、通过干扰KLF4的转录探讨其在巨噬细胞极化中的作用；
建立原头蚴与腹腔巨噬细胞共培养体系，12、24、36、48h收集细胞，qRT-PCR检测KLF4，M1(IL-1β、IL-6、MCP-1)，M2(IL-10、TGF-β、Arg-1、Fizz-1、MR)巨噬细胞因子的mRNA表达；Western Blot检测KLF4、iNOS、Arg-1及IκB的蛋白表达；通过小干扰RNA沉默KLF4，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，48h收集细胞，重复上述实验。
2.根据权利要求1所述的KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法，其特征在于，步骤1中，原头蚴与RAW264.7细胞共培养，实验组(84h)的KLF4mRNA水平较对照组明显升高；随着感染时间延长，M2巨噬细胞Arg-1、Fizz-1、MR的mRNA和蛋白水平呈上升趋势，M1巨噬细胞的TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平呈先升后降趋势。
3.根据权利要求1所述的KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法，其特征在于，步骤2中，细粒棘球蚴感染小鼠早期，腹腔巨噬细胞中KLF4的mRNA及蛋白表达水平上调；M1巨噬细胞相关因子的mRNA及蛋白表达水平先升高后下降；M2巨噬细胞相关因子的mRNA及蛋白表达水平呈上升趋势；IκB的蛋白表达也随感染时间延长而升高。
4.根据权利要求1所述的KLF4在细粒棘球蚴感染早期对巨噬细胞极化的研究方法，其特征在于，步骤3中，
a)原头蚴与腹腔巨噬细胞共培养12、24、36、48h后，KLF4的mRNA及蛋白表达上调，48h达高峰；IL-1β、MCP-1、IL-6、iNOS的表达水平下降，IL-10、TGF-β、Arg-1、Fizz-1、MR的表达在感染后期升高，48h有显著差异；IκB蛋白在36h开始升高，48h达峰值；
b)沉默KLF4后，原头蚴刺激腹腔巨噬细胞，KLF4表达降低，M1巨噬细胞表达水平上调，M2巨噬细胞表达下降，IκB蛋白表达也下降。
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