CN102276691B - 一种抗菌肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种抗菌肽及其制备方法，其氨基酸序列为：IleTrpArgIlePheArgArgIlePhe。方法如下：1)利用抗菌肽的抑菌机理和氨基酸组成特点，设计出了由异亮氨酸、精氨酸和苯丙氨酸为基本单元所组成的一组抗菌肽；2)使用多肽合成仪，进行固相合成法合成多肽粗品；3)将合成得到的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷雾质谱法进行鉴定；4)体外活性试验结果表明，含有3个基本单元的抗菌肽B具有较强的抑菌活性和较弱的溶血活性，治疗指数最高，细胞选择性最佳，是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

Description

一种抗菌肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种人工合成的全新抗菌肽及其制备方法。
背景技术
抗生素由于产生药物残留及细菌耐药性问题，因此迫切需要发现一种绿色、无污染和无细菌耐药性的替代物。抗菌肽是生物体内广泛存在的一种具有广谱抗菌活性的小肽类物质，是生物非特异性防御系统的重要组成部分，能够抑制多种细菌或真菌，甚至包括肿瘤细胞在内的生长。抗菌肽由于带有净正电荷，从而通过物理作用与细菌胞膜产生物理作用；再通过疏水性残基与磷脂中的疏水组分相互作用而抑制或者杀死细菌。而对于细菌等微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构，因此使得抗微生物肽产生耐药性的几率大大降低。因此，抗菌肽的研究已成为基因工程和药物开发等领域的研究热点，具有极为广阔的市场应用前景。
抗菌肽的种类、数量繁多，结构也是复杂多变的。因此很难找到统一的抗菌肽模型来进行广泛的研究。另外，盲目使用基因工程的方法表达抗菌肽，而没有对抗菌肽的结构和功能以及体内外活性进行全面的探讨，导致表达得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血活性和细胞毒性。目前为止，已经有很多种方法来研究抗菌肽的结构和功能之间的关系。比如通过自然存在的天然抗菌肽的氨基酸替换或删减来产生一系列衍生物，或通过构建抗菌肽库的方法筛选抗菌肽，或利用最简化的方法来得到仅含有几种氨基酸的全新抗菌肽等方法。因此，本发明从抗菌肽的作用机制及其氨基酸组成特点入手来合成一组抗菌肽。通过使用碱性氨基酸精氨酸(Arg)残基来提供正电荷来吸引细菌表面的负电荷，再通过由脂肪族氨基酸异亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)与磷脂发生疏水性作用，从而产生生物学活性，为抗菌肽作用机制的研究及其应用提供支持。国内外还未见到利用精氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸作为结构单元来研究抗菌肽结构与功能关系的报道和研究。
发明内容
本发明是为了得到抗菌活性较高而细胞毒性相对较低的抗菌肽，从而设计并制备了一组抗菌肽，并最终筛选出抗菌肽B。
抗菌肽B的氨基酸序列是：IleTrpArgIlePheArgArgIlePhe
抗菌肽B的设计和制备方法如下：1)首先，根据抗菌肽的作用机理和氨基酸组成的特点，设计由带正电荷的氨基酸精氨酸(Arg)、脂肪族氨基酸异亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)作为基本结构单元的一组氨基酸，即表1中的A-E五个抗菌肽；二、采用固相化学合成法，通过多肽合成仪来合成设计得到的多肽；三、将合成出来的多肽粗制品经过反相高效液相色谱进行纯化，并利用点喷射质谱进行鉴定后，即完成多肽的制备。
通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现抗菌肽B不但对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌和阴性菌都有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。综合来看，抗菌肽B的治疗指数最高，细胞选择性最佳，是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
图1为抗菌肽A的质谱图。
图2为抗菌肽B的质谱图。
图3为抗菌肽C的质谱图。
图4为抗菌肽D的质谱图。
图5为抗菌肽E的质谱图。
具体实施方式
实施例1：
根据抗菌肽的作用机理和氨基酸组成的特点，通过使用碱性氨基酸精氨酸(Arg)残基来提供正电荷来吸引细菌表面的负电荷，而通过脂肪族氨基酸异亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)与磷脂发生疏水性作用，从而通过使得抗菌肽能对细菌细胞膜产生破坏作用。依据此原理，本实施方式中共有五个抗菌肽，即表1中的A-E；
实施例2：
将上述五个多肽使用多肽合成仪进行合成，选用固相有机合成，合成方向从C端到N端逐一进行，采用Fmoc保护合成法，具体步骤为：
选取已经和C端第一个氨基酸连接的Wang树脂，即Fmoc-A(trt)-Wang(9-芴甲氧羧基-三甲基-A，其中A为C端第一个氨基酸)，使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡15min左右以除去杂质；用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，反应20min，洗涤树脂直至完全。用DMF清洗掉哌啶，剩余的固体悬浮物即是脱保护的A-Wang。用印三酮检测剂检查A-Wang脱保护的质量。
将Fmoc-B(trt)-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-B，B为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)与上述得到的脱保护的Wang树脂进行缩合反应；然后再脱去Fmoc基团。按照这个程序依次从C端到N端逐个延伸，直至将整个肽链合成完毕，当最后一个氨基酸脱保护后，用DMF洗涤8次，再用乙醇和二氯甲烷(DCM)交叉洗涤8次。将三氟乙酸(TFA)∶三异丙基氯硅烷(TIS)∶水＝95∶2.5∶2.5(体积比)进行混合，配制成为切割试剂与上述得到的多肽20℃下反应2小时，把多肽从树脂上切割下来。旋转蒸发仪蒸发TFA，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚沉淀多肽3h，析出白色粉末状固体。真空干燥，得到粗品多肽。
将上述粗品多肽使用90％乙腈水溶液溶解，使用制备色谱柱进行纯化，分析型色谱柱检测纯度。半制备型高效液相色谱仪为Waters Delta Prep 4000，制备色谱柱为WatersX-Bridge C18、5μm反相柱。洗脱液A为含有0.1％TFA的水溶液，B为含有0.1％TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm，洗脱方式为30％B～65％B的线性浓度梯度洗脱，流速为30ml/min。收集纯度高于95％的馏分，并冷冻干燥。分析型高效液相色谱仪为Agilent 1100，分析型色谱柱为SepaxGP-C18反相柱(4.6mm×150mm，5μm)，洗脱液A液为0.1％TFA的水溶液，B液为含0.1％TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。洗脱方式为50％B～75％B的线性浓度梯度洗脱，流速为1.0ml/min。
多肽的质谱鉴定：将上述得到的多肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图1-5)与表一中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
表1抗菌肽的氨基酸序列和分子量
Figure BSA00000550759100031
实施例3：
1)抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。
抑菌活性的检测结果见表2。通过表2可以看出，抗菌肽B肽和C对于革兰氏阴性和阳性菌都表现出较强的抑菌活性；抗菌肽D次之；抗菌肽A和E的抑菌浓度最小，抑菌活性最弱。
表2抗菌肽的抑菌和溶血活性
2)溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mlPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取100μL红细胞悬液与100μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在540nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中100μl PBS作为阴性对照；100μl 0.2％Tritonx-100作为阳性对照。
检测结果见表2。其中，溶血浓度的数值越大，表明该抗菌肽的溶血活性越低。通过表2可以看出，该组抗菌肽表现出了不同程度的溶血活性，溶血活性由弱到强为：A＜B＜E＜C＜D。其中抗菌肽A的溶血活性最低，B次之。
Figure BSA00000550759100041
以上结果显示，随着由精氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸组成的基本单元的叠加，抗菌活性先增强再减弱，溶血活性也有类似的趋势，揭示了随着抗菌肽肽链长度的增加，其抗菌和溶血等生物学活性会呈现出二次曲线变化的趋势。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。由表2可以看出，抗菌肽B的治疗指数为21.3，为五个抗菌肽中最高。治疗指数最高，表明细胞选择性最佳。因此设计和制备的这一组抗菌肽中，抗菌肽B最具有发展潜力。
Figure ISA00000550759300011
Figure ISA00000550759300021

Claims (1)

1.一种抗菌肽，其特征在于，氨基酸序列为：IleTrpArgIlePheArgArgIlePhe。
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