CN107474116A - 抗菌肽msi‑1及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及到一种氨基酸序列如SEQ ID：NO：1所示多肽及其用途，药效学试验证明，本发明的多肽具有抗病原性细菌和真菌感染的功效。

Description

抗菌肽MSI-1及其用途

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及到一种多肽及其用途，即多肽MSI-1具有抗病原性细菌和真菌感染的用途。

背景技术

感染性疾病作为一种高发病率与高致死率的疾病严重威胁人类的健康，抗生素的出现使这种局面有了很大程度的改变。但是据研究数据表明抗感染新实体药物在九十年代达到了顶峰随后急剧下降，抗菌药物发现迟缓。更为严峻的是由于抗生素在临床上的不合理使用或滥用，导致越来越多的菌株对一种或多种抗生素产生耐药，给抗生素临床用药增加了困难。

抗菌肽是机体先天免疫系统的一个重要组成部分，在自然界中普遍存在，来源于多种生物体(包括：动物、植物、细菌和真菌等)。尽管来源及序列不同，但抗菌肽之间通常享有一些共性。它们一般由10-50个氨基酸组成，具有两亲性和阳离子性。大多数抗菌肽具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、原虫、真菌甚至病毒都有良好的杀伤作用。除对病原菌直接杀伤外，一些抗菌肽还具有免疫调节作用，作为免疫的一道防线间接调控病原菌的清除。抗菌肽不易产生耐药性，这是其相对于抗生素最大的优势所在。目前，抗菌肽因其抗菌谱广、作用机制独特、不易产生耐药性等优势有望成为抗生素潜在的替代物；近几十年来，引起了国内外研究人员的广泛关注

Magainin是由非洲爪蟾皮肤中提取的一类阳离子抗菌肽，MSI-78(GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK)是源于Magainin 2的一种衍生肽，由22个氨基酸组成，具有非常广谱的抗菌效果，并曾用于临床糖尿病足部溃烂的治疗。

发明内容

本发明以抗菌肽MSI-78为模板，对其N端氨基酸进行截取并进行定点突变，采用固相合成法获得具有广谱抗菌活性的多肽MSI-1。本发明抗菌多肽，氨基酸序列如SEQ ID：NO：1所示。全序列为甘氨酸-异亮氨酸-色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-赖氨酸。

本发明多肽MSI-1是以MSI-78为模板进行的设计，截取了其N末端的14个氨基酸，并将其中的第3位及第13位不利于α螺旋形成的甘氨酸替换成疏水性的色氨酸，最终达到减少多肽氨基酸个数降低成本同时维持抗菌活性的目的。

体外抗菌试验结果表明，本发明的多肽MSI-1在截掉MSI-78C末端的8个氨基酸条件下仍能保持与母肽相当的抗菌活性以及较广的抗菌谱，但相较于母肽的成本大大降低。体外杀菌曲线表明，多肽MSI-1对青霉素耐药大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌和新型隐球菌的临床菌株显示出良好的杀菌活性，可在4h内将试验用菌几近杀灭，对金黄色葡萄球菌的杀菌效果更为显著可在0.5h内将其完全杀灭。

体外毒性研究表明，本发明的多肽MSI-1对绵羊红细胞溶血活性低，在MSI-1的有效作用范围内溶血活性可以忽略。

小鼠腹腔感染细菌构建菌血症模型研究多肽MSI-1体内抗菌活性，结果表明，本发明的多肽MSI-1能够显著提高败血症小鼠的存活率，对其体重维持有一定程度的保护。此外，本发明多肽还可以显著降低血液以及组织脏器中细菌载量。所述的耐药株为大肠杆菌，所述组织器官为小鼠肝、脾、肺和肾。

下面是本发明多肽的部分药效学试验及结果：

一、本发明多肽MSI-1体外抗菌活性的测定

(1)菌种的复苏与活化

将冻存于-20℃的试验用菌种从甘油管转接至相应的琼脂斜面培养基(细菌转接至营养琼脂斜面、真菌至沙氏葡萄糖琼脂斜面)中。细菌置于37℃培养24h，真菌置于25℃培养48h，放置4℃的冰箱中备用。

(2)菌液的制备

将斜面中的菌体接种少许，转接至2ml相应的液体培养基中，37℃或25℃培养8h，用液体培养基稀释成10⁵CFU/ml的菌悬液，备用。

(3)药物的配制

称取适量的多肽，用生理盐水溶解，配制成1024μg/ml的母液，0.22μm的水相滤头过滤除菌，分装，置于-20℃保存，备用。

(4)多肽MSI-1对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定

多肽药物用液体培养基倍比稀释成不同的浓度梯度后，分别取100μl于96孔板中，之后等体积接种经液体培养基稀释至10⁵CFU/ml的菌悬液，使药物终浓度为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml，同时设置不加药物的空白对照组。细菌置37℃培养16～18h，真菌置25℃培养48h，观察并记录试验结果。以不长菌的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

取上述MIC测定的96孔板中未见菌落生长的培养物100μl，加入900μl无菌培养基稀释后，转移至无菌平皿中，倾倒约10.0ml相应的琼脂培养基(温度55℃～56℃)，细菌置37℃培养24h，真菌置28℃培养48h，观察并记录平皿中的菌落数，菌落数小于5个的最低药物浓度即为MBC值，结果见表1：

表1多肽MSI-1对试验菌的MIC以及MBC

从表1可以看出，MSI-1具有较广谱的抗菌活性，对标准及临床耐药的多种细菌都显示出较好的抗菌活性，MIC值在8～32μg/ml范围内，对临床耐药新型隐球菌的MIC值仅为8μg/ml，甚至对携带ndm-1基因的重组大肠杆菌(超级细菌)及幽门螺旋杆菌也显示出良好的抗菌活性。

(5)多肽MSI-1对耐药细菌和真菌的杀菌曲线

将试验菌株用营养肉汤或沙氏葡萄糖液体培养基稀释至约10⁵CFU/ml，加入多肽MSI-1使其浓度为对应菌株的4×MIC，细菌置37℃恒温培养，真菌置25℃恒温培养。于0、30、60、120、240和480min定时取出200μl混合培养物，梯度稀释后进行平板活菌计数。同时设置生理盐水组为空白对照组，以多肽作用时间为横坐标，菌落对数值为纵坐标，绘制杀菌曲线，结果见图1-7：

图1-7分别是MSI-1对细菌(包括：表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌及铜绿假单胞杆菌)和真菌(包括：白色念珠菌和新型隐球菌)的杀菌作用。从图中可以看出MSI-1能在4h内杀死全部的表皮葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌及白色念珠菌，使其菌落数降低5个log值。且对金黄色葡萄球菌的杀灭速度最快，可在0.5h内将其全部杀死，表明MSI-1具有快速的杀菌作用。

二、本发明多肽MSI-1对绵羊红细胞溶血活性的影响

利用无菌注射器吸取脱纤维的绵羊血8.0ml加至无菌EP管，于冷冻离心机中3000rpm离心10min，弃上清，PBS洗涤3次。底层红细胞采用PBS重悬，制成3％的红细胞悬液。分别取100μl红细胞悬液加入96孔板中，之后等体积加入倍比稀释的多肽药物，使药物终浓度为512、256、128、64、32、16、8μg/ml。同时，以1％Triton X-100处理的红细胞为阳性对照组，以PBS缓冲液处理的红细胞为阴性对照组，每组设置3个复孔。培养板置于37℃恒温培养1h后取出，离心10min(3000rpm/min，4℃)。取上清，用酶标仪测量其在450nm处的OD值，并计算溶血率。

由附图8可以看出，虽然绵阳红细胞的溶血率随多肽浓度的增加，略有所升高。但在最高浓度512μg/ml时，绵阳红细胞的溶血率不超过16％；而浓度256μg/ml时，溶血率低于10％。结合MIC值范围可以得出：多肽MSI-1在有效作用范围内，溶血活性可以忽略。

三、本发明多肽MSI-1对菌血症模型小鼠的保护作用

取健康ICR小鼠，20～22g，雌雄各半，随机分为6组，每组16只。其中5组小鼠腹腔接种MLD浓度的细菌悬液(0.5ml/只)进行感染，建立菌血症模型；另设等体积生理盐水腹腔注射小鼠为正常对照组。感染组小鼠分别给予10mg/kg MSI-1(高剂量组)、5.0mg/kg MSI-1(中剂量组)、2.5mg/kg MSI-1(低剂量组)、2.5mg/kg多粘菌素(阳性对照组)、生理盐水(模型对照)。多肽给药组和生理盐水组分别于感染0.5h、2h后腹腔给药两次，多粘菌素组在感染2h后尾静脉给药一次。连续7天观察并记录小鼠的存活及体重变化情况。

小鼠感染8h后，眼眶静脉丛取血约300μl，肝素钠抗凝。样品用无菌生理盐水分别按×5,×10,×20倍稀释，得到不同浓度梯度的血浆稀释液，同时，感染8h后取小鼠肝、肾、肺和肾脏组织，置于无菌EP管中，加入9倍体积的生理盐水(V_组织：V_生理盐水＝1：9)，电动匀浆仪制备匀浆液(4℃条件下)。取部分组织匀浆液，分别以×2,×5,×10,×15倍进行稀释，得到不同浓度梯度的组织匀浆稀释液。分别取各稀释液1.0ml加入无菌平板中，用倾倒平板法加入恒温56℃的营养琼脂培养基约10ml，充分混匀，待凝固后，置37℃恒温培养18-24h，观察并记录平板上的菌落数。每组每个稀释梯度均有三个平行对照，最后以平均值表示各组小鼠血液和组织匀浆液中细菌的存活数量。

结果见图9-15。

由图9可以看出，模型组小鼠由于细菌感染造成大部分死亡，而多肽中、高剂量给药组相对于模型组，小鼠存活率分别提高20％和50％，证明多肽对细菌感染小鼠的存活有很大程度的保护作用，并且在一定浓度范围内多肽的体内药效呈剂量依赖性变化。

由图10可以看出，模型组小鼠感染细菌后体重有很大程度的下降，之后未死亡的小鼠体重有缓慢程度的恢复。而多肽和阳性药处理组，小鼠的体重相对于模型组有更快程度的恢复，说明多肽对小鼠的体重也有一定程度的保护作用。

由图11可以看出，感染8h后，小鼠血液中细菌数约为10⁷CFU/ml，多粘菌素能显著降低小鼠血液中的细菌数，多肽中剂量组相对于模型组细菌数降低了1个log值，而高剂量组降低了将近3个log值，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。

图12-15分别是感染小鼠肝、脾、肺、肾组织中的细菌数，从图中可以看出，虽然MSI-1低剂量(2.5mg/kg)对细菌的清除效果并不明显，但高剂量(10mg/kg)可明显降低感染小鼠组织脏器中的活菌数，下降值约1～2个log值，且与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。

综合图11-15可以看出，多肽MSI-1表现出强烈的细菌清除力，这可能与提高感染小鼠的生存率有关。

附图说明

图1是MSI-1对青霉素耐药的表皮葡萄球菌的杀菌曲线

图2是MSI-1对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌的杀菌曲线

图3是MSI-1对青霉素耐药的肺炎克雷伯菌的杀菌曲线

图4是MSI-1对青霉素耐药的大肠杆菌的杀菌曲线

图5是MSI-1对青霉素耐药的铜绿假单胞菌的杀菌曲线

图6是MSI-1对耐药白色念珠菌的杀菌曲线

图7是MSI-1对耐药新型隐球菌的杀菌曲线

图8是MSI-1对绵羊红细胞的溶血活性

图9是MSI-1对菌血症小鼠的生存保护

图10是MSI-1对菌血症小鼠的体重保护

图11是MSI-1对菌血症小鼠血液中细菌数的影响

图12是MSI-1对菌血症小鼠肺组织细菌数的影响

图13是MSI-1对菌血症小鼠肝组织细菌数的影响

图14是MSI-1对菌血症小鼠脾脏中细菌数的影响

图15是MSI-1对菌血症小鼠肾脏中细菌数的影响

具体实施方式

实施例1

固相合成法合成多肽MSI-1

制备的MSI-1的氨基酸序列为：甘氨酸-异亮氨酸-色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-赖氨酸

多肽的合成：多肽MSI-1的合成从C端到N端逐个进行。将Fmoc-Val-Wang Resin用二氯甲烷浸泡15min，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷；加入体积比为1:4的六氢吡啶/DMF溶液，使用氮气鼓动，反应2次，时间为5min和15min，反应结束后用DMF洗涤树脂9次。取少量树脂加入验色剂ABC各2-3滴(A液：茚三酮/无水乙醇溶液；B液：吡啶；C液：苯酚/无水乙醇溶液)在100℃下共热3min，溶液及树脂颜色变为蓝色，以脱除氨基保护。加入Fmoc-Val-OH和HOBT，用适量DMF溶解，加入DIC和Collidine，氮气鼓动，反应1h。反应结束后用DMF洗涤树脂6次，重复进行缩合反应，依次连接各Fmoc保护氨基酸，完成直链序列的合成，将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。加入TFA，在恒温摇床中反应2h，摇床转速110r/min，温度25℃。滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得MSI-1粗品多肽。

多肽的纯化：称取一定量粗品，加入适量乙腈，超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质。同时过制备型液相色谱仪，分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析，将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。

多肽的纯度测定(HPLC法)及质谱分析结果：

多肽合成后经纯化得到成品，成品经高效液相色谱和质谱进行鉴定。

液相色谱分析条件：C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)；流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1％三氟乙酸的纯净水。检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；进样量20μl，进行梯度洗脱。梯度洗脱条件见表2。

表2梯度洗脱条件

本发明多肽氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，纯度大于98％。MSI-1的分子量为1807.32，与理论值相吻合。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国药科大学；南京映海月生物科技有限公司

<120> 抗菌肽MSI-1及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Ile Trp Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Trp Lys

1 5 10

Claims (5)

1.一种抗菌多肽，其特征是：氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1的抗菌肽用于制备抗病原菌感染药物的用途。

3.权利要求2的用途，其中病原菌是病原性细菌或病原性真菌。

4.权利要求3的用途，其中病原性细菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠杆菌或肺炎克雷伯菌。

5.权利要求3的用途，其中病原性真菌为白色念珠菌或新生隐球菌。