CN118005740A - 一种高稳定高活性的抗菌多肽aph318及其制备方法和应用 - Google Patents
一种高稳定高活性的抗菌多肽aph318及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了高稳定高活性的抗菌多肽APH318及其制备方法和应用,属于生物医药领域,多肽APH318其氨基酸序列为:LKKIKKIFRRILKIL。本发明制备的抗菌多肽APH318对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌及其耐药株等表现出优异的抗菌活性,并且细胞毒性低,稳定性好,对铜绿假单胞菌肺部感染的小鼠具有一定的治疗效果,可以用于制备抗菌药物,在医学上具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种高稳定高活性的抗菌多肽APH318及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素自从20世纪初被发现以来,极大地改善了人类对细菌性疾病的治疗。然而,抗生素的过度使用和滥用加速了细菌耐药性的进程,导致了一个称为“抗生素耐药性”的全球性问题。这个问题不仅威胁到人类健康,也对动物健康和环境造成了影响。抗菌肽(AMP)是一类小分子肽,由12-50个氨基酸残基组成,具有抗菌、抗炎和抗生物膜活性。AMP广泛存在于自然界中,对多种细菌、真菌和病毒具有较强的活性,同时对真核细胞毒性低、热稳定性强、溶解度高、分子量低、缺乏耐药性等优点,因此在医学上具有潜在的应用价值。
如何从已知的天然抗菌肽出发,通过对其氨基酸序列进行替换、重排的方式来设计新的肽,对铜绿假单胞菌耐药菌株有较强的体内外抗菌效果,并同时有良好的稳定性和生物相容性,是新型抗菌多肽所急需的。
发明内容
发明目的:针对现有技术存在的问题,本发明通过对抗菌肽的其氨基酸序列进行替换、重排的方式来设计新的多肽肽,增强它们的活性、稳定性或减少它们的细胞毒性。本发明提供一种全新的高稳定高活性的抗菌多肽APH318,该抗菌肽对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌及其耐药株等表现出优异的抗菌活性,并且细胞毒性低,稳定性好,可以用于制备抗菌药物,在医学上具有潜在的应用价值。
本发明还提供抗菌多肽APH318的制备方法和应用。
技术方案:为了实现上述目的,本发明所述一种高稳定高活性的抗菌多肽APH318,其氨基酸序列为:LKKIKKIFRRILKIL。
其中,所述抗菌多肽APH318以多肽LKKILKIFRIRPYIL为模板进行氨基酸替换、重排获得。
本发明所述的抗菌多肽APH318的制备方法,以多肽LKKILKIFRIRPYIL为模板,进行氨基酸替换、重排,使用固相肽合成的方法合成APH318。
本发明所述的抗菌多肽APH318在制备抗病原菌感染药物中的应用。
其中,所述抗病原菌感染药物为抗病原性细菌感染药物或者抗病原性耐药细菌感染药物。
其中,所述病原性细菌为大肠埃希杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或者多种。
其中,所述病原性耐药细菌为大肠埃希杆菌耐药株、铜绿假单胞菌耐药株、肺炎克雷伯菌耐药株、鲍曼不动杆菌耐药株、金黄色葡萄球菌耐药株中的一种或者多种。
本发明所述抗病原菌感染药物组合物,包含所述的抗菌多肽APH318及其药学上所接受的载体。
其中,所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
本发明所述的抗病原菌感染药物组合物在制备高抗菌活性、低红细胞裂解、高稳定性的抗病原菌感染药物中的应用,所述病原菌为大肠埃希杆菌及其耐药株、铜绿假单胞菌及其耐药株、肺炎克雷伯菌及其耐药株、鲍曼不动杆菌及其耐药株、金黄色葡萄球菌及其耐药株中的一种或者多种。
本发明设计特定的抗菌多肽APH318,将模板肽(LKKILKIFRIRPYIL)其氨基酸序列进行替换、重排的方式设计一系列肽,其中APH318(LKKIKKIFRRILKIL)表现出对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等有优异的抗菌活性,并且细胞毒性低,稳定性好。
本发明通过前期实验研究发现,通过A取代模板肽的12位P获得多肽APH279对这五株标准菌株肺炎克雷伯菌ATCC10031、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鲍曼不动杆菌ATCC19606和金黄色葡萄球菌ATCC25923均无显著抗菌活性,其疏水性为0.691,推测12位点P对这条肽的活性影响较为显著。
为了进一步研究肽的理化性质与其生物活性的关系,设计多肽APH283-APH286是分别使用正常生理环境下疏水性不带电氨基酸亮氨酸(L)和亲水性正电氨基酸赖氨酸(K)取代肽中13位点的酪氨酸(Y)和12位点的脯氨酸(P)的方式所设计的。相比于模板肽,APH284和APH285对铜绿假单胞菌ATCC27853抗菌活性显著增强,并且还维持母肽原有的抗菌活性,而APH283和APH286不仅对铜绿假单胞菌标准菌株无显著抗菌活性,对肺炎克雷伯菌标准菌株和大肠杆菌标准菌株抗菌活性还略低于母肽。这四条肽的抗菌活性结果表明,脯氨酸存在时提高其疏水性可以增强对铜绿假单胞菌的抗菌活性;脯氨酸不存在时降低疏水性可以提高对铜绿假单胞菌的抗菌活性,进一步说明肽中12位点脯氨酸确实影响了该肽对铜绿假单胞菌的抗菌活性。
为了避免脯氨酸带来的影响,选择APH285作为新模板,调整其亲水氨基酸与疏水氨基酸的排列位置,合理的设计了APH310至APH318,与APH285相比,这些肽的特征是亲水氨基酸与疏水氨基酸分布并不是随机散乱分布,而是更集中在一侧,因而两亲性(疏水距μH与APH285相比,相对较高)相对较高。在APH310至APH313中,并没有比APH285更优的肽。根据以上的设计,推测增加肽的正电荷数量可以提高肽的抗菌活性,因此在APH285的基础上把13位Y替换成K后,再调整亲水和疏水氨基酸的排列位置,不断提高肽的两亲性,最终设计得到APH318对大肠埃希杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等标准菌株有极为优异的抗菌活性(MIC在2μg/ml左右),各个多肽序列如表1所示,其中下述APH318、模板肽、APH283、APH284、APH285、APH286、APH310、APH311、APH312、APH313、APH314、APH315、APH316、APH317分别如SEQ ID NO.1-14所示。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1、本发明制备的抗菌多肽APH318不仅具有高稳定性,还具有非常广的抗菌活性,对大肠埃希杆菌、铜绿假单胞菌及其耐药株、肺炎克雷伯菌及其耐药株等均表现出优异的抗菌活性。
2、本发明的抗菌多肽APH318在具有广谱抗菌活性的同时对于正常的细胞毒副作用小,对红细胞有极低的裂解效果,并且稳定性好,有望成为治疗细菌感染的新型药物。
3、本发明抗菌多肽APH318的设计制备方法简单方便,设计新颖,原料来源易得,可以工业化生产应用。
附图说明
图1为抗菌多肽APH318螺旋投影图:
图2为alphafold2预测的抗菌多肽APH318二级结构;
图3为抗菌多肽APH318反向液相色谱图;
图4为抗菌多肽APH318质谱图;
图5为抗菌多肽APH318鼠源红细胞溶血率;
图6为抗菌多肽APH318的血清稳定性;
图7为抗菌多肽APH318的盐稳定性;
图8为抗菌多肽APH318的pH稳定性;
图9为抗菌多肽APH318治疗肺部感染铜绿假单胞菌D2耐药菌七天存活率。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
本发明中设计的多肽由生物公司直接进行合成,也可以按现有多肽合成方法进行合成。
本发明中的模式菌株均从菌种库购买获得,临床耐药菌株中铜绿假单胞菌耐药菌为耐碳青霉烯类均可,肺炎克雷伯菌为耐碳青霉烯类、耐头孢类或者产超广谱B-内酰胺酶耐药菌株。
实施例1
以多肽(SEQ ID NO.2: LKKILKIFRIRPYIL)为模板,将序列替换和重排,使用固相肽合成的方法合成APH318。
抗菌多肽APH318,其序列为:LKKIKKIFRRILKIL(SEQ ID NO.1)。
固相合成法合成多肽APH318:多肽APH318的合成从C端到N端逐个进行。将 Fmoc-Ile-Wang Resin 用二氯甲烷浸泡15 min,待树脂膨胀,抽去二氯甲烷;加入体积比为1:4的六氢吡啶/DMF溶液(每克树脂10 ml),通入氮气,反应 2 次,时间为5 min和 15 min,反应结束后用 DMF 洗涤树脂 6次。取少量颗洗涤后树脂加入验色剂ABC各2-3滴 (A液: 茚三酮/无水乙醇溶液;B液:吡啶; C液:苯酚/无水乙醇溶液)在 100℃下共热 3 min,溶液及树脂颜色变为蓝色,说明氨基保护完全脱除。加入过量反应两倍摩尔数的Fmoc-Leu-OH和HOBT, 用每克树脂10 ml的DMF溶解,加入两倍摩尔数的DIC和Collidine,氮气鼓动,反应1h。反应结束后用DMF洗涤树脂6次,重复进行缩合反应,依次连接各Fmoc保护氨基酸,完成直链序列的合成,将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。加入 TFA,在恒温摇床中反应2 h,摇床转速 110 r/min,温度 25℃。滤去树脂,向滤液中加入无水乙醚,离心后获得固体,加入无水乙醚洗涤,再离心,重复数次后烘干即可获得 APH318粗品多肽。
多肽的纯化:称取一定量粗品,加入适量乙腈,超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质,然后过制备型液相色谱仪,分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析,将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。
多肽的纯度测定(HPLC法)及质谱分析结果:多肽合成后经纯化得到成品,成品经高效液相色谱和质谱进行鉴定。
液相色谱分析条件:C18色谱柱(4.6×250 mm, 5 µm);流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流动相B为含0.1%TFA的纯净水。检测波长为220 nm;流速为1.0 ml/min;进样量20 µl,进行梯度洗脱。
本发明抗菌多肽APH318氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,纯度大于95%。多肽APH318的理论分子量为:1909.34;抗菌多肽APH318螺旋投影图和AlphaFold2预测二级结构分别如图1和2所示:其HPLC和 MS分别如图3和4所示,与理论值相吻合。
实施例2
本发明抗菌多肽APH318体外抗菌活性的测定
本实验中涉及到的菌株分别为大肠杆菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC10031、铜绿假单胞菌ATCC27853、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、肺炎克雷伯菌耐药菌、铜绿假单胞菌耐药菌。
实验方法:
1.培养基的配置
取MHB培养基24g,加入1000ml蒸馏水中,加热煮沸溶解,分装。
2、实验器具的准备及灭菌
将MHB培养基、配套枪头、排枪槽、试管一同放入高压灭菌锅中灭菌,121℃杀菌20min。实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
3.抗菌肽母液制备
称取适量的多肽,用生理盐水溶解,配制成 1024 μg/ml 的母液,0.22 μm 的水相滤头过滤除菌,分装,置于4℃保存(一周内使用完),备用。对于不溶或难溶于生理盐水的样品,根据其特性,可采用适当浓度的DMSO去溶解。
4、菌悬液的制备
从-80℃冰箱取出用甘油保存的菌种,吸取200μL的菌液加入到4mL 的MHB培养基中,在37℃摇床中培养16h活化,取活化后的菌悬液吸取500μL转培至2.5mlMHB中,继续培养4-6h(此步目的是为了取细菌的对数生长期,是依据细菌的生长曲线来选择),然后取菌悬液用MHB稀释至OD600=0.3(菌落数约为108CFU/mL)备用。
5.样品稀释及加菌
在96孔板的每个孔加入MHB肉汤培养基100μL,然后对样品进行二倍稀释,即在A/B/C三排的第一孔加入样品100μL,用排枪充分吹打(至少三次以上)使样品与肉汤充分混匀,然后吸取100μL加入第二孔再次充分吹打与肉汤混匀,照此重复直至最后一孔,接着再在每一孔加入稀释好的菌液100μL,使得最终体系菌落数为5×105CFU,重复做三次(A/B/C三排样品)。
同时,做空白对照(只加培养基)、阴性对照(只加细菌)、模板多肽对照。
6.观察结果
将96孔板放入37℃恒温培养箱培养16-20h,观察结果,以肉眼可见不生长菌的最低样品浓度定为MIC,结果如表2-3所示。
从表2和表3中MIC结果可知,APH318对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌的抗菌活性要显著高于模板多肽,并且APH318对耐药的铜绿假单胞菌以及肺炎克雷伯菌也有较强的抗菌活性(模板肽对于铜绿假单胞菌耐药性几乎没有活性),具有临床应用的潜力。
实施例3
本发明多肽APH318溶血活性实验
实验方法:
从ICR小鼠身上收集新鲜的红细胞(RBCs)。用0.01mM PBS缓冲液清洗RBC至少3次(经过三次离心,体积大约在3ml),直到悬浮液中看不到颜色。然后将RBC在PBS中稀释,以获得体积分数2.0%的RBCs溶液。将100μlRBCs与等体积的抗菌肽APH318混合,使多肽终浓度分别为: 256、128、64、32、16、8、4,2μg/ml,在37℃孵育1小时。之后将与样品孵育1小时后RBCs离心(1500×g, 5 min)取上清液,然后将0.1ml上清液转移到96孔平底板上,使用0.1%Triton X-100 (Sigma-Aldrich)溶液和含有肽溶剂的PBS溶液,分别作为阳性对照和阴性对照。用酶标仪在540 nm处测血红蛋白定吸光度(OD540)。公式如下:
溶血率(%)=[(A-A0)/(A100-A0)]×100。
A表示多肽APH318组的吸光值。A0表示PBS组的吸光值,A100表示Triton X-100组的吸光值。进行三次独立重复实验。评价了APH318对小鼠红细胞(RBC)的溶血活性。
实验结果如图5所示,在浓度为256μg/mL时,多肽APH318溶血毒性依然较低,且在药物有效剂量范围内无溶血毒性。
实施例4
1、多肽APH318血清稳定性实验
实验方法:
将多肽溶解在缓冲液(生理盐水含20%牛胚胎血清)中配置成2mg/ml,将溶液放置在37°C水浴锅中进行孵育,分别在0、1、2、3、4时用HPLC测定其纯度。进行了三次重复的实验,评估了APH318对胎牛血清的敏感性。
结果如图6,APH318在20%牛胚胎血清中孵育4小时后剩余量在80%左右,在血清中有好的稳定性。
2、多肽APH318盐敏感性实验
实验方法:
在96孔板中,调节盐溶液/样品溶液/细菌溶液的体积为50μL/50μL/100μL,使得氯化钠、氯化铵、氯化锌、氯化镁、三氯化铁的最终浓度为150 mM、6μM、8μM、1 mM和4μM,然后再按上述实施例2的MIC测定方法以菌株铜绿假单胞菌D2进行实验,结果如图7所示。
结果如图7,在不同浓度的五种盐溶液中,APH318对D2菌的抗菌活性基本保持不变,意味着APH318具有良好的耐盐性。
3、pH稳定性实验
实验方法:
将配制的多肽APH318溶液分别在不同的pH条件下(pH=3、5、7和9)在37℃恒温水浴锅孵育2h,然后再按上述实施例2的MIC测定方法以菌株铜绿假单胞菌D2进行实验(用HCl和NaOH来调节样品溶液pH值),结果如图8所示。
图8结果表明,APH318在测试的四种pH条件下,活性均没有影响,依然对铜绿假单胞菌D2为4μg/ml,说明本发明的多肽APH318具有优异的pH稳定性。
实施例5
治疗肺部感染动物模型实验
实验方法:
1:小鼠组别设置:
购买22g的雄性BALB/c 36只,分为三组,具体为:模型组(12只);APH318组(12只)多粘菌素B组(12只)。
2:模型建立:
第一天给小鼠注射75mg/kg环磷酰胺,第三天继续给小鼠注射75mg/kg环磷酰胺,第四天将小鼠注射腹腔注射4%水合氯醛80μl/10 g麻醉,再将1×108cfu/ml 铜绿假单胞菌D2,滴鼻感染小鼠20μl/只。
3:给药:
小鼠给菌3小时后,将10mg/kg的APH318和10mg/kg多粘菌素B分别通过滴鼻给药到小鼠体内,连续给药,记录小鼠的存活率。
实验结果如图9,在连续给药五天后,APH318组小鼠在第6天存活率为41.16%,说明APH318对D2肺部感染的小鼠具有一定的治疗效果。
Claims (10)
1.一种高稳定高活性的抗菌多肽APH318,其特征在于,其氨基酸序列为:LKKIKKIFRRILKIL。
2.根据权利要求1所述的抗菌多肽APH318,其特征在于,所述抗菌多肽APH318以多肽LKKILKIFRIRPYIL为模板进行氨基酸替换、重排获得。
3.一种权利要求1所述的抗菌多肽APH318的制备方法,其特征在于,以多肽LKKILKIFRIRPYIL为模板进行氨基酸替换、重排,使用固相肽合成的方法合成APH318。
4.一种权利要求1所述的抗菌多肽APH318在制备抗病原菌感染药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述抗病原菌感染药物为抗病原性细菌感染药物或者抗病原性耐药细菌感染药物。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述病原性细菌为大肠埃希杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或者多种。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述病原性耐药细菌为大肠埃希杆菌耐药株、铜绿假单胞菌耐药株、肺炎克雷伯菌耐药株、鲍曼不动杆菌耐药株、金黄色葡萄球菌耐药株中的一种或者多种。
8.一种抗病原菌感染药物组合物,其特征在于,包含权利要求1所述的抗菌多肽APH318及其药学上所接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
10.一种权利要求8所述的抗病原菌感染药物组合物在制备高抗菌活性、低红细胞裂解、高稳定性的抗病原菌感染药物中的应用,所述病原菌为大肠埃希杆菌及其耐药株、铜绿假单胞菌及其耐药株、肺炎克雷伯菌及其耐药株、鲍曼不动杆菌及其耐药株、金黄色葡萄球菌及其耐药株中的一种或者多种。
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant |