CN116874613A

CN116874613A - 一种广谱高效的抗菌多肽aph143及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116874613A
Application number: CN202311142927.4A
Authority: CN
Inventors: 孙周; 孔毅; 林志昊; 郑佳茵; 孙向阳; 龚勋
Original assignee: Nanjing Huagai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Nanjing Huagai Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-09-06
Filing date: 2023-09-06
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2043-09-06
Also published as: CN116874613B

Abstract

本发明公开了一种广谱高效的抗菌多肽APH143及其制备方法和应用，该抗菌多肽APH143的氨基酸序列为SEQ ID NO.1：LWKKFKLKKKFLWLWKKF‑NH₂。本发明从天蚕素与蜂毒肽的杂合肽P18出发，通过构效关系的研究，获得非完美两亲性α‑螺旋抗菌肽APH143。本发明所制备的多肽APH143具有良好的体外广谱抗菌活性，对于肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌具有较好的体外抗菌活性，并且稳定性较好。同时本发明制备所得的多肽APH143，原料来源易得，可以规模化生产，其在应用于治疗细菌和真菌感染性疾病方面具有潜在应用价值。

Description

一种广谱高效的抗菌多肽APH143及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种广谱高效的抗菌多肽APH143及其制备方法和应用。

背景技术

自发现青霉素以来，医药工业迅速发展，各种新的抗生素的开发及临床应用使许多感染性疾病得到了有效的控制和治疗，显著地降低了因感染引起的死亡率。但是，因抗生素的不合理使用引起的耐药性问题限制了传统抗生素的临床治疗。全球每年因耐药性感染导致的大量人死亡，因此，世界卫生组织（WTO）和美国传染病学会（IDSA）将抗生素耐药性问题列为威胁公共卫生的三大问题之一。由于抗生素耐药性机制复杂多样且新抗生素的发现和生产既费时又昂贵，因此除了选择抗生素作为治疗手段外，开发针对抗生素耐药性感染的替代治疗手段已成为解决该问题的关键所在。

抗菌肽（Antimicrobial peptides）因具有较强的广谱抗菌活性、不同于传统抗生素的作用机制、不易诱导耐药性等特点，作为潜在的新型抗菌药物已成为全球抗感染领域的研究热点。昆虫体液免疫系统有许多抗菌物质，目前已有研究将天蚕素的N端8个氨基酸以及蜂毒肽的N端12个氨基酸杂合成杂合肽P18，该杂合肽能够对铜假绿单胞菌、肺炎克雷伯菌有一定的抗菌活性，但是其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抗菌活性较低。为了获得安全性高的多肽，提高多肽抗菌谱、不易产生耐药性等优势，已经成为国内外研究人员广泛重视的焦点。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种广谱高效的抗菌多肽APH143，本发明的多肽具有良好的体内外抗菌活性，而且溶血毒性较低，可以应用于各种普通感染及顽固感染性疾病，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物，有效解决了现有多肽P18抗菌活性单一，对部分细菌抗菌活性较低的问题。

本发明还提供抗菌多肽APH143的制备方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种广谱高效的抗菌多肽APH143，其序列为：LWKKFKLKKKFLWLWKKF-NH₂。

其中，所述多肽APH143以蜂毒肽的杂合肽P18为模板，将该多肽序列的K1、L4、K7、I8、P9、H13、A15分别替换为L1、K4、L7、K8、K9、W13、W15得到APH143。

本发明所述的广谱抗菌的抗菌多肽APH143的制备方法，以蜂毒肽的杂合肽P18（KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH₂）为模板，将该多肽序列的K1、L4、K7、I8、P9、H13、A15分别替换为L1、K4、L7、K8、K9、W13、W15，使用固相肽合成的方法合成APH143。

本发明所述的广谱高效的抗菌多肽 APH143在制备抗病原菌感染药物中的应用。

其中，所述抗病原菌感染药物为抗病原性细菌感染药物。

其中，所述病原性细菌为于肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、溶血葡萄球菌中的一种或者多种。

本发明所述的抗病原菌感染药物组合物，包含所述的抗菌多肽APH143及其药学上所接受的载体。

其中，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

本发明所述的抗病原菌感染药物组合物在制备治疗各种普通感染及顽固感染性疾病药物中的应用，所述感染的病原性细菌为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌大肠杆菌、溶血葡萄球菌中的一种或者多种。

本发明的抗菌多肽APH143是以P18为模板进行设计的。先将P18的第9位点的脯氨酸替换为赖氨酸，通过改变其二级结构使之成为完整α-螺旋肽来提高体外抗菌活性，再通过α-螺旋多肽的螺旋投影图调整多肽的两亲面组成，在其疏水面插入亲水氨基酸、亲水面插入疏水氨基酸，将该肽序列的第1位点的赖氨酸、第4位点的亮氨酸、第7位点的赖氨酸、第8位点的异亮氨酸、第13位点的组氨酸、第15位点的丙氨酸分别替换为第1位点的亮氨酸、第4位点的赖氨酸、第7位点的亮氨酸、第8位点的赖氨酸、第13位点的色氨酸、第15位点的色氨酸，产生了不完美两亲性抗菌肽，最终到达了提高抗菌活性的同时维持了溶血毒性较低的目的，得到多肽APH143。同时，本发明还设计了其它抗菌多肽，其中APH124为亲水面完整、疏水面完整的完美两亲性抗菌肽，APH129以及APH142为疏水面完整，亲水面插入疏水氨基酸的多肽；APH132以及APH131为亲水面完整，疏水面插入亲水氨基酸的多肽。各多肽的体外抗菌活性见表1及表2。从结果可知APH143为本发明特定改造系列中活性最优抗菌多肽，并且血清稳定性提高，对红细胞的溶血性低，各多肽的螺旋投影图见图4。

本发明基于不同两亲性情况以及调整其α-螺旋程度对P18进行了改造产生以下多肽：

APH124（FWKLFKKIAKFLHKALKK-NH₂）（SEQ ID NO.2）；

APH129（WWKLFKKIWWKLKWKLKK-NH₂）（SEQ ID NO.3）；

APH131（LWKLFWKIAKFKLKKKKF-NH₂）（SEQ ID NO.4）；

APH132（LWKLFWKLAKFKLKKKKF-NH₂）（SEQ ID NO.5）；

APH142（LWKLKLKIKKFLWKWKKF-NH₂）（SEQ ID NO.6）；

APH143（LWKKFKLKKKFLWLWKKF-NH₂）（SEQ ID NO.7）。

本发明不仅对完美两亲性以及非完美两亲性多肽进行对比，还进一步对非完美两亲性的若干情况（亲水面插入疏水氨基酸、疏水面完整性；疏水面插入亲水氨基酸、亲水面完整性；亲水面插入疏水氨基酸的同时疏水面插入亲水氨基酸等）进行设计和比较，最终设计得到本发明特定的抗菌多肽序列。全序列为亮氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-亮氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸。根据表2的实验结果可知：本发明中设计替换的色氨酸（第13位点的色氨酸、第15位点的色氨酸）与其他疏水氨基酸不同，其具有吲哚侧链，有带正电荷倾向，将色氨酸作为疏水氨基酸插入亲水面不会显著影响整条抗菌肽与细菌细胞膜的静电作用力；同时亲水面插入色氨酸能够调整整条抗菌肽的疏水性。由于抗菌肽发挥作用时是动态进行，其亲水面与疏水面交替与细菌细胞膜进行接触，亲水面在与细菌细胞膜接触后由于其整体缺乏疏水氨基酸且通过静电作用力与细菌细胞膜靶向，因此很难嵌入细菌细胞膜，抗菌肽的亲水面只是起到了一个靶向作用将抗菌肽固定在细菌细胞膜表面，在其中插入疏水氨基酸意义不大。而在亲水面的靶向固定下，抗菌肽的疏水面接触细菌细胞膜表面发挥抗菌肽的破膜作用。在疏水序列中插入亲水氨基酸可能会帮助细菌细胞膜与疏水面更好的接触细菌细胞膜表面甚至镶嵌在细胞膜内，并有利于之后抗菌肽疏水序列与细菌细胞膜的相互作用。因此本发明通过特定的氨基酸改进和设计，使其疏水面插入亲水氨基酸、亲水面插入疏水氨基酸，从而使得抗菌肽的活性显著提高，同时发现与其他不同两亲性情况的抗菌多肽相比其溶血毒性也相对较低。

本发明中涉及多种非完美两亲性情况对抗菌肽的影响，通过实验验证本发明特定设计亲水面不完美和疏水面不完美的抗菌肽能够显著影响抗菌活性，并降低溶血毒性。

进一步地，体外抗菌试验结果表明，本发明的多肽APH143在改变了二级结构以及两亲性后，对于金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜假绿单胞菌、大肠杆菌有较好的抗菌活性。体外毒性研究表明，本发明的抗菌多肽APH143对鼠源红细胞溶血活性低，在APH143的有效作用范围内溶血活性可以忽略。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明制备的抗菌多肽APH143相对于多肽P18，具有更好的广谱抗菌活性，不仅可以对肺炎克雷伯菌，铜假绿单胞菌有显著的抗菌活性，同时对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌也有很好的抗菌效果。

2、本发明制备的抗菌多肽APH143具有抗菌活性的同时，具有较好的血清稳定性。

3、本发明抗菌多肽APH143的设计制备方法简单方便，设计新颖，原料来源易得，可以工业化生产应用。

4、本发明制备的抗菌多肽APH143可以应用在制备抗细菌感染药物中，具有良好的体内外抗菌活性；相对于P18，本发明APH143的抗菌活性显著提高，可以作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

附图说明

图1是本发明抗菌多肽APH143的HPLC图谱；

图2是APH143的质谱图；

图3是抗菌多肽APH143二级结构图；

图4是不同两亲性抗菌多肽的螺旋投影图；

图5是不同两亲性抗菌多肽对鼠红细胞的溶血活性；

图6是APH143对pH的稳定性量化图；

图7 是APH143对血清的稳定性HPLC图；

图8是APH143的热稳定性HPLC图；

图9 是APH143对金黄色葡萄球菌的杀菌曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明中设计的多肽由生物公司直接进行合成，也可以按现有多肽合成方法进行合成。

实施例1

抗菌多肽APH143的制备：

以多肽P18为模板，先将P18的第9位点的脯氨酸替换为赖氨酸改变其二级结构使之成为完整的α-螺旋肽，之后将该肽序列的第1位点的赖氨酸、第4位点的亮氨酸、第7位点的赖氨酸、第8位点的异亮氨酸、第13位点的组氨酸、第15位点的丙氨酸分别替换为第1位点的亮氨酸、第4位点的赖氨酸、第7位点的亮氨酸、第8位点的赖氨酸、第13位点的色氨酸、第15位点的色氨酸，得到多肽APH143。

固相合成法合成多肽APH143

多肽的合成：多肽APH143的合成从C端到N端逐个进行。将 Fmoc-Phe-Rink Resin用二氯甲烷浸泡15 min，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷；加入体积比为1:4的六氢吡啶/DMF溶液（每克树脂10 ml），使用氮气鼓动，反应 2 次，时间为5 min和 15 min，反应结束后用DMF 洗涤树脂 6 次。取20~40颗加入验色剂ABC各2-3滴（A液：茚三酮/无水乙醇溶液；B液：吡啶； C液：苯酚/无水乙醇溶液）在 100℃下共热 3 min，溶液及树脂颜色变为蓝色，以脱除氨基保护。加入过量反应两倍摩尔数的Fmoc-Val-OH和HOBT，用每克树脂10 ml的DMF溶解，加入两倍摩尔数的DIC和Collidine，氮气鼓动，反应1 h。反应结束后用DMF洗涤树脂6次，重复进行缩合反应，依次连接各Fmoc保护氨基酸，完成直链序列的合成，将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。加入 TFA，在恒温摇床中反应2 h，摇床转速 110 r/min，温度 25℃。滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得 APH143粗品多肽。

多肽的纯化：称取一定量粗品，加入适量乙腈，超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质。同时过制备型液相色谱仪，分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析，将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。

多肽的纯度测定（HPLC法）及质谱分析结果：多肽合成后经纯化得到成品，成品经高效液相色谱和质谱进行鉴定。

液相色谱分析条件：C18色谱柱（4.6×250 mm, 5 µm）；流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1%TFA的纯净水。检测波长为220 nm；流速为1.0 ml/min；进样量20 µl，进行梯度洗脱。

本发明多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1：LWKKFKLKKKFLWLWKKF-NH₂，纯度大于98％。APH143的分子量为1906.3，其HPLC和 MS分别如图1和2所示，与理论值相吻合；且APH143的二级结构为α-螺旋如图3所示，螺旋投影图如图4所示。

实施例2

本发明多肽APH143和P18体外抗菌活性的测定

本发明涉及的病原性细菌，包括：ATCC来源的标准菌株和临床分离的常规菌株。

本实验中涉及到的菌株有大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌，分别为大肠杆菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC10031、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌耐药菌、铜绿假单胞菌耐药菌，肺炎链球菌耐药菌，金黄色葡萄球菌ATCC25923。

实验方法：

1.培养基的配置

取MHB培养基24g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装。

2、实验器具的准备及灭菌

将MHB培养基、配套枪头、排枪槽、试管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌20min。实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。

3．抑菌剂母液制备

称取适量的多肽APH143以及P18，用生理盐水溶解，配制成 1024 μg/ml 的母液，0.22 μm 的水相滤头过滤除菌，分装，置于4℃保存（一周内使用完），备用。对于不溶或难溶于生理盐水的样品，根据其特性，可采用适当浓度的DMSO去溶解。

4、菌悬液的制备

从-80℃冰箱取出用甘油保存的菌种，吸取200μL的菌液加入到4mL 的MHB培养基中，在37℃摇床中培养16h活化，取活化后的菌悬液吸取500μL转培至2.5mLMHB中，继续培养4-6h（此步目的是为了取细菌的对数生长期，是依据细菌的生长曲线来选择），然后取菌悬液用MHB稀释至OD600=0.3(菌落数约为10⁸CFU/mL)备用。

5．样品稀释及加菌

在96孔板的每个孔加入MHB肉汤培养基100μL，然后对样品进行二倍稀释，即在A/B/C三排的第一孔加入样品100μL，用排枪充分吹打（至少三次以上）使样品与肉汤充分混匀，然后吸取100μL加入第二孔再次充分吹打与肉汤混匀，照此重复直至最后一孔，第9列吸入100μL扔掉，接着再在每一孔加入稀释好的菌液100μL，使得最终体系菌落数为5×10⁵CFU，重复做三次（A/B/C三排样品）。

同时，在同一个板的第10列做空白（只加培养基），11列做阴性（只加细菌），12列做阳性（抗菌肽P18）。

6、观察结果

将96孔板放入37℃恒温培养箱培养16-20h，观察结果，以肉眼可见不生长菌的最低样品浓度定为MIC。实验结果如表1所示。

7、进一步，按上述方法比较不同两亲性改造肽对不同细菌的MIC值，结果如表2所示。

从表1可以看出，APH143具有较好的广谱抗菌活性，对标准的多种细菌都显示出较好的抗菌活性，MIC值在2-4μg/mL范围内，表明本发明多肽对鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，溶血葡萄球菌均具有较好的杀灭作用，尤其是对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌其抗菌效果明显优于现有抗菌肽P18。

从表2可以看出，APH131、APH132具有较好的抗菌活性，其特征均为疏水面不完整，插入亲水氨基酸，而亲水面完整，表明疏水面的合理非完整能够提高显著抗菌肽的抗菌活性，但根据图5显示APH131、APH132其溶血活性也较高。而APH129、APH142抗菌活性较差，其特征均为亲水面非完整，插入疏水氨基酸，而疏水面完整，根据图5显示APH142溶血活性较低，APH129溶血活性较高。表明亲水面的非完整无法显著提高抗菌肽的抗菌活性，但亲水面的合理非完整能够维持抗菌肽的溶血活性较低。APH124为本次设计抗菌活性最差抗菌肽，其特征为完美两亲性抗菌肽，其疏水面与亲水面均完整，表明非完美两亲性抗菌肽的抗菌活性由于完美两亲性抗菌肽。而APH143为本次设计最优肽，其亲特征为疏水面与亲水面均不完整， APH143具有优异的抗菌活性，根据图5显示又具有较低的溶血活性。表明本发明特定设计的抗菌肽 APH143显著提高抗菌肽的抗菌活性的同时维持溶血活性较低。

实施例3

本发明多肽APH143溶血活性实验

实验方法：

从ICR小鼠身上收集新鲜的红细胞(RBCs）。用0.01mM PBS缓冲液清洗RBC至少3次（经过三次离心，体积大约在3ml），直到悬浮液中看不到颜色。然后将RBC在PBS中稀释，以获得体积分数2.0%的RBCs溶液。将100μlRBCs与等体积的抗菌肽APH76混合，使多肽终浓度分别为：256、128、64、32、16、8、4，2μg/ml，在37℃孵育1小时。之后将与样品孵育1小时后RBCs离心（1500×g, 5 min）取上清液，然后将0.1ml上清液转移到96孔平底板上，使用0.1%Triton X-100 (Sigma-Aldrich)溶液和含有肽溶剂的PBS溶液，分别作为阳性对照和阴性对照。用酶标仪在540 nm处测血红蛋白定吸光度(OD₅₄₀)。公式如下：

溶血率（%）=[（A-A₀）/（A₁₀₀-A₀）]×100。

A表示多肽APH143组的吸光值。A₀表示 PBS 组的吸光值，A₁₀₀ 表示 Triton X-100组的吸光值。

进行三次独立重复实验。评价了APH124、APH129、APH131、APH132、APH142、APH143对小鼠红细胞（RBC）的溶血活性，实验结果如图5所示，根据结果显示，APH143即使在最高浓度256μg/ml也几乎没有的溶血活性。而其他不同两亲性抗菌肽除APH142、APH143之外溶血活性均较高，但APH142相较于APH143抗菌活性较差，因此APH143为该系列中最优肽。

实施例4

稳定性实验

1、pH稳定性实验

实验方法：

将实施例2中配制的多肽APH143溶液分别在不同的pH条件下（pH=3、5、7和9）放置2h，然后再按上述实施例2的MIC测定方法进行实验（用HCl 和NaOH来调节样品溶液pH值），实验结果，如图6所示。结果显示，APH143在测试的四种pH条件下，活性均没有显著影响，依然为2-4μg/ml，说明本发明的多肽APH143具有优异的pH稳定性。

2、血清稳定性实验

实验方法：

512μg/ml的多肽APH143与20%牛胚胎血清等体积混合，37℃孵育，分别在0、1、2、3、4、5、16、24小时取样品少许通过RP-HPLC监测，液相色谱分析条件：C18色谱柱（4.6×250mm, 5 µm）；流动相A为含0.1%三氟乙酸的纯净水，流动相B为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；检测波长为220 nm；流速为1.0 ml/min；进样量20 µl，进行梯度洗脱。洗脱条件为线性梯度浓度递增，洗脱条件具体为：有机相初始浓度为10%，25 min时递增至80%。峰面积被用作计算暴露于胎牛血清酶后剩余肽的含量，肽的百分比由如下式计算：

肽剩余量% = 100 x(AUCt /AUC0）

AUCt:t小时肽的峰面积

AUC0:0小时肽的峰面积

结果如图7，显示APH143在与血清孵育4h后基本没有被降解，说明APH143具有较好的血清稳定性。

3、热稳定性

将浓度为1024 μg/ml的APH143与等体积的PBS（pH 7.4）混合，分别置于0、20、37、50、70、90℃恒温水浴1 h。将孵育后的样品用RT-HPLC检测，液相色谱分析条件： C18色谱柱（4.6×250 mm, 5 µm）；流动相A为含0.1%三氟乙酸的纯净水，流动相B为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；检测波长为220 nm；流速为1.0 ml/min；进样量20 µl，进行梯度洗脱。洗脱条件为线性梯度浓度递增，洗脱条件具体为：有机相初始浓度为10%，25 min时递增至80%。

结果如图8，结果显示APH143在不同温度下孵育1 h后，与0℃组相比，多肽的剩余量都没有发生下降，即使是孵育温度高达90℃，APH143仍能保持很高的完整性，说明APH143具有较高的热稳定性。

实施例5

杀菌曲线实验

1、培养基的配置

取MHB培养基24g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装。

取LB培养基20g，琼脂15g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装。

2、实验器具的准备及灭菌

3、抑菌多肽母液制备

称取适量的APH143、P18，用生理盐水溶解，配制成母液，0.22 μm 的水相滤头过滤除菌，分装，置于4℃保存，备用。

4、菌悬液的制备

从-80℃冰箱取出用甘油保存的金黄色葡萄球菌（ATCC25923），吸取200μL的菌液加入到含有4mL 的MHB培养基的试管中，在37℃振荡培养箱中培养16h活化，取活化后的菌悬液吸取500μL转培至含有2.5mlMHB的试管中，继续培养4-6h（此步是为了取对数生长期的细菌，是依据细菌的生长曲线来选择），然后取菌悬液用MHB稀释至OD600=0.3(菌落数约为10⁸CFU/mL)备用。

5、样品制备及菌液混合

样品制备：APH143、P18用MHB培养基稀释。

实验组：在10mLEP管中按体积比1：1加入稀释好的金黄色葡萄球菌与样品APH143（浓度为64μg/ml），使得终体系为5mL，并将5mL分装为2个2.5mL/管。

空白组：在10mLEP管中加入稀释好的菌，使得终体系为5mL，并将5mL分装为2个2.5mL/管。

阳性组：在10mLEP管中按体积比1：1加入稀释好的金黄色葡萄球菌与P18（浓度为64μg/mL），使得终体系为5mL，并将5mL分装为2个2.5mL /管。

注：为减少由于重复打开同一管菌造成的染菌，因此每组混匀后分装，前2h取第一管中菌悬液，2h后取第二管菌悬液。

6、涂板

将三个不同组别菌悬液：实验组、空白组、阳性组分别同时（含菌量均约为1×10⁶CFU/mL）共孵育。然后将不同时间点（在37°C下孵育0min、60min、120min、180min，240min后）的共孵育液，三组按同等比例稀释后涂抹于LB琼脂平板上，涂板后将平板放置于37℃培养箱培养20h。三个独立的实验重复进行。

6、菌落计数

对不同时间的不同浓度的平板分别进行菌落计数，并绘制时间-菌落计数对数值曲线。

结果如图9，64μg/mL的APH143在1h内即可完全杀死金黄色葡萄球菌，具有良好的杀菌作用，而64μg/mL的P18只能起到抑制细菌生长的效果，进一步说明本发明的抗菌肽可以快速高效杀灭金黄色葡萄球菌。

Claims

1.一种广谱高效的抗菌多肽APH143，其特征在于，其序列为：LWKKFKLKKKFLWLWKKF-NH₂。

2.根据权利要求1所述的广谱高效的抗菌多肽APH143，其特征在于，所述多肽APH143以蜂毒肽的杂合肽P18为模板，将该多肽序列的K1、L4、K7、I8、P9、H13、A15分别替换为L1、K4、L7、K8、K9、W13、W15得到APH143。

3.一种权利要求1所述的广谱抗菌的抗菌多肽APH143的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以蜂毒肽的杂合肽P18为模板，其序列为KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH₂，将该多肽序列的K1、L4、K7、I8、P9、H13、A15分别替换为L1、K4、L7、K8、K9、W13、W15，使用固相肽合成的方法合成APH143。

4.一种权利要求1所述的广谱高效的抗菌多肽 APH143在制备抗病原菌感染药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗病原菌感染药物为抗病原性细菌感染药物。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病原性细菌为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、溶血葡萄球菌、大肠杆菌中的一种或者多种。

7.一种抗病原菌感染药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的抗菌多肽APH143及其药学上所接受的载体。

8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

9.一种权利要求7所述的抗病原菌感染药物组合物在制备治疗各种普通感染及顽固感染性疾病药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述感染的病原性细菌为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、溶血葡萄球菌中的一种或者多种。