CN118005741A - 一种抗菌多肽ap16a及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌多肽AP16A及其制备方法和应用，属于生物多肽领域，该抗菌多肽AP16A其序列为：Val‑Lys‑Val‑Arg‑Lys‑Leu‑Ile‑Arg‑Arg‑Leu‑Arg‑Arg‑Ile‑Arg‑Ile‑Ala‑Arg‑Leu‑Ile。本发明制备的抗菌多肽AP16A具有更好的广谱抗菌活性，不仅可以对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有显著的活性，还显著增强对耐药菌肺炎克雷伯耐药菌、铜绿假单胞耐药菌的抗菌活性，同时对于正常的细胞毒副作用小，对红细胞有极低的裂解效果，并且稳定性好，有望成为治疗细菌感染的新型药物。
Description
技术领域
本发明属于生物多肽领域，具体涉及一种抗菌多肽AP16A及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素耐药是指细菌对抗生素的抵抗能力增强，导致抗生素失去疗效的现象。这是一个全球性的健康问题，对医疗实践和公共卫生带来了严重挑战。抗生素耐药的形成是一个复杂的过程，涉及多种因素。其中，滥用和不合理使用抗生素是主要原因之一。抗生素的过度使用、自行购买和滥用、未按照医生建议完成疗程等行为会导致细菌对抗生素的适应性变化，进而培养出耐药菌株。
抗菌肽是一类存在于动植物和人类体内的天然抗菌物质，具有广谱抗菌活性。它们在免疫防御中起着重要的作用，可以直接杀死或抑制多种细菌、真菌和病毒的生长。抗菌肽能够穿透细菌的细胞膜，破坏细菌的结构和功能，导致细菌死亡。它们可以破坏细菌的细胞膜完整性，引发细胞内物质泄漏和细胞溶解，从而杀死细菌。抗菌肽具有广泛的应用前景，可以用于开发新型的抗菌药物和医疗材料，以及应对耐药菌株的威胁。
从水蛭转录组中发现的多肽具有对于革兰氏阴性菌的有较好抗菌活性，以及一定的低红细胞裂解能力，然而很多肽抗菌活性一般并且对耐药菌株抗菌活性较差。因此，为进一步提高其活性，需要通过结构改造及优化获得抗菌效果好且毒性低的新型抗菌肽。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明旨通过结构改造及优化获得抗菌效果好且毒性低的新型抗菌多肽AP16A。本发明的抗菌多肽AP16A不仅保持对各种细菌的抗菌活性，还显著增强对肺炎克雷伯耐药菌株以及铜绿假单胞耐药菌株的耐药性，此外，对红细胞有极低的裂解作用，显著增强了AP16A的治疗指数。AP16A有望成为治疗细菌感染的新型药物。
本发明还提供抗菌多肽AP16A的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种抗菌多肽AP16A，其序列为：Val-Lys-Val-Arg-Lys-Leu-Ile-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Ile-Ala-Arg-Leu-Ile。
其中，所述多肽AP16A以多肽VKVRKLIRRLRRIRIDRLI为模板，将第16位的Asp替换成Ala。
本发明所述的抗菌多肽AP16A的制备方法，多肽VKVRKLIRRLRRIRIDRLI为模板，将第16位的Asp替换成Ala，使用固相肽合成的方法合成AP16A。
本发明所述的抗菌多肽 AP16A在制备抗病原菌感染药物中的应用。
其中，所述抗病原菌感染药物为抗病原性细菌感染药物。
其中，所述病原性细菌为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯耐药菌、铜绿假单胞耐药菌中的一种或者多种。
本发明所述的抗菌多肽 AP16A在制备高抗菌活性、维持低红细胞裂解的抗病原菌感染药物中的应用。
本发明所述抗病原菌感染药物组合物，包含所述的抗菌多肽AP16A及其药学上所接受的载体。
其中，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
本发明所述的抗病原菌感染药物组合物在制备高抗菌活性、维持低红细胞裂解的抗病原菌感染药物中的应用，所述病原菌为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯耐药菌、铜绿假单胞耐药菌中的一种或者多种。
本发明设计特定的抗菌多肽AP16A，将模板肽（VKVRKLIRRLRRIRIDRLI）第16位的Asp替换成Ala，显著提高多肽抗菌活性。此外，前期实验时也尝试分别将模板肽第六位、第十九位的Leu、Ile分别替换为Ala后，得到AP6A、AP19A两条多肽。与模板肽相比，AP6A、AP19A活性大幅降低。推测可能是由于多肽的疏水性降低引起的活性降低。将模板肽第二位的Lys替换为Ala，得到AP2A，部分活性较模板肽降低，推测由于净电荷数减少，降低了抗菌肽与细菌膜的静电相互作用，从而降低了多肽活性，同时上述设计对于耐药菌没有抑制效果。此外，通过上述氨基酸的变化也会导致多肽溶血性的显著增加的。
本发明设计的AP16A不仅显著提高了抗菌活性，同时具有低红细胞裂解能力，有效解决了对耐药菌株抗菌活性较差的问题，可以有效用于制备抗病原菌感染药物。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明制备的抗菌多肽AP16A具有更好的广谱抗菌活性，不仅可以对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有显著的活性，还显著增强对耐药菌肺炎克雷伯耐药菌、铜绿假单胞耐药菌的抗菌活性。
2、本发明的抗菌多肽AP16A在具有广谱抗菌活性的同时对于正常的细胞毒副作用小，对红细胞有极低的裂解效果，并且稳定性好，有望成为治疗细菌感染的新型药物。
3、本发明抗菌多肽AP16A的设计制备方法简单方便，设计新颖，原料来源易得，可以工业化生产应用。
附图说明
图1为AP16A螺旋投影图：
图2为alphafold2预测的AP16A二级结构；
图3 为AP16A反向液相色谱图；
图4为抗菌多肽AP16A质谱图；
图5为抗菌多肽AP16A鼠源红细胞溶血率。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中设计的多肽由生物公司直接进行合成，也可以按现有多肽合成方法进行合成。
本发明中的模式菌株均从菌种库购买获得，临床耐药菌株中铜绿假单胞菌耐药菌为耐碳青霉烯类均可，肺炎克雷伯菌为耐碳青霉烯类、耐头孢类或者产超广谱B-内酰胺酶耐药菌株。
实施例1
以从水蛭转录组中的多肽（SEQ ID NO.2:VKVRKLIRRLRRIRIDRLI）为模板，将序列上的第16位的Asp替换成Ala，使用固相肽合成的方法合成AP16A。
抗菌多肽AP16A，其序列为：Val-Lys-Val-Arg-Lys-Leu-Ile-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Ile-Ala-Arg-Leu-Ile（SEQ ID NO.1）。
固相合成法合成多肽AP16A
多肽的合成：多肽AP16A的合成从C端到N端逐个进行。将 Fmoc-Phe-Rink Resin用二氯甲烷浸泡15 min，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷；加入体积比为1:4的六氢吡啶/DMF溶液（每克树脂10 mL），通入氮气，反应 2 次，时间为5 min和 15 min，反应结束后用 DMF 洗涤树脂 6次。取少量颗洗涤后树脂加入验色剂ABC各2-3滴 （A液： 茚三酮/无水乙醇溶液；B液：吡啶； C液：苯酚/无水乙醇溶液）在 100℃下共热 3 min，溶液及树脂颜色变为蓝色，说明氨基保护完全脱除。加入过量反应两倍摩尔数的Fmoc-Lys-Phe-OH和HOBT， 用每克树脂10 ml的DMF溶解，加入两倍摩尔数的DIC和Collidine，氮气鼓动，反应1 h。反应结束后用DMF洗涤树脂6次，重复进行缩合反应，依次连接各Fmoc保护氨基酸，完成直链序列的合成，将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。加入 TFA，在恒温摇床中反应2 h，摇床转速 110 r/min，温度 25℃。滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得 AP16A粗品多肽。
多肽的纯化：称取一定量粗品，加入适量乙腈，超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质，然后过制备型液相色谱仪，分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析，将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。
多肽的纯度测定（HPLC法）及质谱分析结果：多肽合成后经纯化得到成品，成品经高效液相色谱和质谱进行鉴定。
液相色谱分析条件：C18色谱柱（4.6×250 mm, 5 µm）；流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1%TFA的纯净水。检测波长为220 nm；流速为1.0 ml/min；进样量20 µl，进行梯度洗脱。
本发明多肽氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，纯度大于95％。AP16A的分子量为：2429.16；抗菌多肽AP16A螺旋投影图和AlphaFold2预测二级结构分别如图1和2所示：其HPLC和 MS分别如图3和4所示，与理论值相吻合。
实施例2
本发明多肽AP16A体外抗菌活性的测定
本实验中涉及到的菌株有铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯耐药菌、铜绿假单胞耐药菌。
实验方法：
1.培养基的配置
取MHB培养基24g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装。
2、实验器具的准备及灭菌
将MHB培养基、配套枪头、排枪槽、试管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌20min。实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
3．抗菌肽母液制备
称取适量的多肽，用生理盐水溶解，配制成 1024 μg/ml 的母液，0.22 μm 的水相滤头过滤除菌，分装，置于4℃保存（一周内使用完），备用。对于不溶或难溶于生理盐水的样品，根据其特性，可采用适当浓度的DMSO去溶解。
4、菌悬液的制备
从-80℃冰箱取出用甘油保存的菌种，吸取200μL的菌液加入到4mL 的MHB培养基中，在37℃摇床中培养16h活化，取活化后的菌悬液吸取500μL转培至2.5mlMHB中，继续培养4-6h（此步目的是为了取细菌的对数生长期，是依据细菌的生长曲线来选择），然后取菌悬液用MHB稀释至OD600=0.3(菌落数约为108CFU/mL)备用。
5．样品稀释及加菌
在96孔板的每个孔加入MHB肉汤培养基100μL，然后对样品进行二倍稀释，即在A/B/C三排的第一孔加入样品100μL，用排枪充分吹打（至少三次以上）使样品与肉汤充分混匀，然后吸取100μL加入第二孔再次充分吹打与肉汤混匀，照此重复直至最后一孔，接着再在每一孔加入稀释好的菌液100μL，使得最终体系菌落数为5×105CFU，重复做三次（A/B/C三排样品）。
同时，做空白对照（只加培养基）、阴性对照（只加细菌）、模板多肽对照、阳性对照（其他抗菌肽，其中：将模板肽第二位的Lys替换为Ala得到AP2A；将模板肽第六位Leu替换为Ala得到AP6A；将模板肽第十九位的Ile替换为Ala得到AP19A）。
6.观察结果
将96孔板放入37℃恒温培养箱培养16-20h，观察结果，以肉眼可见不生长菌的最低样品浓度定为MIC，结果如表1-3所示。
表1 AP16A对五个标准菌株的抑菌活性
表2 多肽对肺炎克雷伯耐药菌株的抗菌活性
表3 多肽对铜绿假单胞耐药菌株的抗菌活性
其中：铜绿假单胞菌D1至D5和肺炎克雷伯菌B1至B3均为医院分离的耐药菌株，其中D1-D5为耐碳青霉烯类，B1-B2为耐头孢类，B3为产超广谱B-内酰胺酶类。
从表1-3可以看出，AP16A具有较好的抗菌活性，对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌具有显著的活性，并且效果明显优于模板多肽以及多肽AP2A、AP6A、AP19A，同时更为重要的是，相对于模板多肽等，本发明的抗菌多肽可以显著增强对肺炎克雷伯耐药菌、铜绿假单胞耐药菌抗菌活性。
实施例3
本发明多肽AP16A溶血活性实验
实验方法：
从ICR小鼠身上收集新鲜的红细胞(RBCs）。用0.01mM PBS缓冲液洗RBC至少3次（经过三次离心，体积大约在3ml），直到悬浮液中看不到颜色。然后将RBC用PBS稀释，以获得体积分数2.0%的RBCs溶液。将100μl RBCs与等体积的抗菌肽AP16A混合，使多肽终浓度分别为： 256、128、64、32、16μg/ml，37℃孵育1小时。之后将与样品孵育1小时后RBCs离心（1500×g, 5 min）取上清液，然后将0.1ml上清液转移到96孔平底板上，2%Triton X-100(Sigma-Aldrich)溶液和等体积2.0%红细胞溶液的混合做为阳性对照，PBS与等体积2.0%红细胞溶液的混合做为阴性对照。用酶标仪在540nm处测血红蛋白定吸光度(OD540)。公式如下：
溶血率（%）=[（A-A0）/（A100-A0）]×100。
A表示多肽AP16A组的吸光值。A0表示 PBS 组的吸光值，A100 表示 Triton X-100组的吸光值。
进行三次独立重复实验。评价了AP16A对小鼠红细胞（RBC）的溶血活性，实验结果如图5所示。在浓度为256μg/mL时，AP16A溶血毒性较低，且在药物有效剂量范围内无溶血毒性。
实施例4
1、多肽AP16A的盐敏感性实验
在96孔板中，调节盐溶液/样品溶液/细菌溶液的体积为50μL/50μL/100μL，使得氯化钠、氯化铵、氯化锌、三氯化铁的最终浓度为150 mM、6μM、8μM和4μM，然后再按上述实施例2的MIC测定方法以菌株肺炎克雷伯菌ATCC10031进行实验，结果如表4所示。
表4 AP16A在肺炎克雷伯菌ATCC10031中的盐敏感性
表4结果显示，AP16A在生理浓度Na1+、NH4 1+、Zn2+、Fe3+存在时，本发明的多肽APH16A仍保持原有活性，具有优异的盐稳定性。
2、多肽AP16A的pH稳定性实验
样品溶液分别在pH＝2、5、7和9（用盐酸和氢氧化钠溶液调节体系pH值）中，在37℃恒温水浴锅孵育2h，然后再按上述实施例2的MIC测定方法以菌株肺炎克雷伯菌ATCC10031进行实验，实验结果，如表5所示。
表5 AP16A在肺炎克雷伯菌ATCC10031中的pH稳定性
表5结果显示，AP16A在测试的四种pH条件下，活性均没有影响，对肺炎克雷伯菌的活性为1μg/ml，说明本发明的多肽AP16A具有优异的pH稳定性。
Claims (10)
1.一种抗菌多肽AP16A，其特征在于，其序列为：Val-Lys-Val-Arg-Lys-Leu-Ile-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Ile-Ala-Arg-Leu-Ile。
2.根据权利要求1所述的抗菌多肽AP16A，其特征在于，所述多肽AP16A以多肽VKVRKLIRRLRRIRIDRLI为模板，将第16位的Asp替换成Ala。
3.一种权利要求1所述的抗菌多肽AP16A的制备方法，其特征在于，以多肽VKVRKLIRRLRRIRIDRLI为模板，将第16位的Asp替换成Ala，使用固相肽合成的方法合成AP16A。
4.一种权利要求1所述的抗菌多肽 AP16A在制备抗病原菌感染药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗病原菌感染药物为抗病原性细菌感染药物。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病原性细菌为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯耐药菌、铜绿假单胞耐药菌中的一种或者多种。
7.一种权利要求1所述的抗菌多肽 AP16A在制备高抗菌活性、维持低红细胞裂解的抗病原菌感染药物中的应用。
8.一种抗病原菌感染药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的抗菌多肽AP16A及其药学上所接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
10.一种权利要求8所述的抗病原菌感染药物组合物在制备高抗菌活性、维持低红细胞裂解的抗病原菌感染药物中的应用，所述病原菌为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯耐药菌、铜绿假单胞耐药菌中的一种或者多种。
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