CN112569344A - 抗菌肽p2在制备停乳链球菌抗菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供抗菌肽P2在制备停乳链球菌抗菌药物中的应用。本发明首次发现抗菌肽P2对停乳链球菌及其生物膜具有抑制作用。抗菌肽P2还对停乳链球菌生物膜内细菌及其持留细菌也具有高效的抑制活性，且抑制作用显著高于万古霉素。此外，抗菌肽P2还能通过调节细胞因子和抑制细菌的增殖，有效缓解乳房炎症反应。因此抗菌肽P2具有开发成为治疗由停乳链球菌引起的奶牛乳房炎新型制剂的潜力。

Description

抗菌肽P2在制备停乳链球菌抗菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及抗菌肽P2在制备停乳链球菌抗菌药物中的应用。

背景技术

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一，其对奶牛养殖业和乳制品行业造成重大经济损失。停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)是引起该疾病的主要病原菌之一，而乳腺感染与生物膜形成密切相关。研究表明，停乳链球菌定植于乳导管中，使其具有构建细胞外聚合物(EPS)基质的能力，从而增强抗菌剂的耐药性，因此难以根除感染。目前，对奶牛乳房炎感染的防治措施主要包括抗生素、胰腺磷脂酶、溶葡萄球菌酶及噬菌体治疗等。然而，抗生素的过度使用给临床治疗带来高耐药性困扰，Zhang等关于中国14个省的74个商业奶牛场中采集的1180例临床乳房炎奶牛的牛奶样品结果显示：停乳链球菌对卡那霉素(89.8％)、磺酰胺(83.0％)、链霉素(58.0％)、红霉素(47.7％)和四环素(33.0％)均到达高耐药性检出率。因此，开发用于治疗停乳链球菌感染的高抗菌、低耐药性和强去生物膜的药物成为当务之急。

抗菌肽(AMPs)作为一类新型抗菌制剂，因其通常存在多靶点，可以相对独立地发挥其抗菌作用，也可以与其他因子协同作用，显示出更高的活性。抗菌肽P2是真菌防御素Plectasin的新突变体，与亲本肽Plectasin相比，它在三个氨基酸位置(Q14K、K32S和G33A)发生突变，并在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris X-33)中高表达。P2对猪链球菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌显示出更高的抗菌活性。另外，P2具有低溶血，无细胞毒性和高稳定性的特点。它还对感染金黄色葡萄球菌E48的小鼠的腹膜炎具有良好的保护作用，其中P2能够显著减少小鼠器官中的细菌数量并控制炎性因子的释放，从而保护小鼠免受金黄色葡萄球菌感染的伤害。目前，尚未见P2对奶牛乳房炎来源的停乳链球菌及其生物膜抑制方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供抗菌肽P2在制备停乳链球菌抗菌药物中的新应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供抗菌肽P2在制备停乳链球菌抗菌药物或组合物中的应用。

本发明中，抗菌肽P2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明提供抗菌肽P2在制备治疗或预防停乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

其中。所述疾病是指由停乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病。所述疾病包括奶牛乳房炎。

第三方面，本发明提供抗菌肽P2在抑制停乳链球菌及其产生的生物膜中的应用，包括对初期生物膜的抑制作用，对成熟生物膜的消除作用，以及对膜内持留菌的抑制作用。P2可能通过破坏细菌细胞膜达到杀菌目的。

本发明中，停乳链球菌可以是标准株CVCC 3938，也可以是从奶牛乳房炎患病动物体内分离获得的菌株。

本发明首次发现抗菌肽P2对停乳链球菌及其生物膜具有抑制作用。实验表明，P2对停乳链球菌具有高效、快速地杀菌作用。同时，P2对生物膜具有一定的抑制和消除作用，在64×MIC浓度下，P2对早期生物膜的抑制率为49.0％，在16×MIC浓度下对成熟生物膜的抑制率为73.61％。抗菌肽P2还对停乳链球菌生物膜内细菌及其持留细菌也具有高效的抑制活性，且抑制作用显著高于万古霉素。此外，抗菌肽P2还能通过调节细胞因子和抑制细菌的增殖，有效缓解乳房炎症反应。因此P2具有开发成为治疗由停乳链球菌引起的奶牛乳房炎新型制剂的潜力。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中P2对停乳链球菌CVCC 3938杀菌动力学曲线。

图2为本发明较佳实施例中流式细胞仪检测P2对停乳链球菌CVCC 3938的细胞膜完整性的影响。

图3为本发明较佳实施例中扫描电镜观察P2对停乳链球菌CVCC 3938的细胞形态的影响。

图4为本发明较佳实施例中透射电镜观察P2对停乳链球菌CVCC 3938的超微结构的影响。

图5为本发明较佳实施例中P2对停乳链球菌CVCC 3938早期生物膜形成的影响。

图6为本发明较佳实施例中P2对停乳链球菌CVCC 3938成熟生物膜的清除作用。

图7为本发明较佳实施例中P2对停乳链球菌CVCC 3938早期生物膜内持留菌的作用。

图8为本发明较佳实施例中P2对停乳链球菌CVCC 3938成熟生物膜内持留菌的作用。

图9为本发明较佳实施例中激光共聚焦观察P2对停乳链球菌CVCC 3938生物膜的影响。图中数据由激光共聚焦处理软件自动生成；下方的图为不同处理组处理后的生物膜厚度，图片高低可直观反映出生物膜厚度大小。

图10为本发明较佳实施例中P2及万古霉素对小鼠乳腺组织荷菌量的影响。

图11为本发明较佳实施例中P2及万古霉素对小鼠乳腺炎治疗后病理组织的观察。a、b、c和d分别表示空白对照组、攻菌未治疗组、P2治疗组以及万古霉素治疗组。

图12为本发明较佳实施例中P2及万古霉素对小鼠乳腺组织炎症因子调节的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的菌株、培养基及主要仪器为：

停乳链球菌S.dysgalactiae CVCC 3938购自中国兽医药品监察所；临床分离株S.dysgalactiae CAU-FRI 1-3由中国农业大学国家兽药安全评价中心惠赠。

抗菌肽P2由中国农业科学院饲料研究所基因工程室经毕赤酵母重组表达制备，纯度＞95％。

胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基购自北京奥博星生物科技有限公司；胎牛血清，购自北京政博伟业生物科技有限公司；万古霉素(Vancomycin，Van)购自中国兽医药品监察所；其它试剂均属于国产分析纯级别。高速冷冻台式离心机(Sigma 3K15)购自Sigma公司；全温振荡培养箱(ZHWY-211D)购自上海精宏实验设备有限公司；超净工作台(SWCJ-2FD)购自苏净集团设备有限公司；FACS alibur流式细胞仪购自BD公司；扫描电镜(QUANTA 2100PRO)购自荷兰Philips公司；透射电镜(H-7650)购自日本HITACHI公司。

实施例1抗菌肽P2对停乳链球菌CVCC 3938最小抑菌浓度的测定

选用微量肉汤稀释法测定P2对停乳链球菌的抑菌活性。将P2冻干粉用无菌0.01mol/L PBS(pH 7.4)充分溶解后稀释为终浓度128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/mL的溶液，同时选用相同浓度的万古霉素、林可霉素、头孢氨苄或卡那霉素作为阳性对照。将不同浓度的P2溶液、抗生素溶液按照每孔10μL加至无菌的96孔培养板中，阴性对照组加入10μL的无菌PBS，无菌TSB溶液为空白对照，设置三个平行重复，依照此方法制备MIC板。1％过夜培养的停乳链球菌CVCC 3938转接于TSB培养基(含3％胎牛血清)中培养至对数生长期，用培养基稀释至1×10⁵CFU/mL，取90μL上述菌液加入MIC板中，恒温37℃培养16-18h后观察并记录完全抑制细菌生长的最低抑菌浓度。以3个重复中均无肉眼可见细菌生长的最低浓度作为MIC值。结果如表1所示：

表1 P2和抗生素对细菌的MIC值

实施例2抗菌肽P2对停链球菌CVCC 3938的杀菌动力学曲线

将对数期的停乳链球菌CVCC 3938用TSB培养基稀释至1×10⁵CFU/mL，加入不同浓度P2或万古霉素对照，同时加入等体积的无菌PBS作为空白对照，37℃，250r/min条件下培养。每隔1h取样100μL进行梯度稀释菌落计数，绘制时间-杀菌曲线。结果如图1所示，P2对停乳链球菌CVCC 3938具杀伤作用且呈现剂量依赖性，其中4×MIC的P2在30min内杀菌率达99.9％，2×MIC和1×MIC在分别在1h和2h内杀灭99.9％的细菌。2×MIC的万古霉素杀菌速率相对缓慢，12h时菌落数降至2log10 CFU/ml。结果显示，P2比万古霉素具显著的杀菌速率优势。

实施例3抗菌肽P2对停链球菌CVCC 3938细胞膜完整性分析

将1％过夜培养的停乳链球菌转接于TSB培养基(加3％胎牛血清)中培养至对数生长期，用PBS重悬洗涤两次后制备为1×10⁸CFU/mL的菌悬液，加入抗菌肽P2使终浓度分别为2×MIC和4×MIC，同时加入等体积的PBS溶液为阴性对照。两者混匀后置于37℃恒温培养箱孵育30min、120min，孵育结束后用0.01M PBS缓冲液重悬洗涤三次，以终止抗菌肽继续发挥作用。上机前加入终浓度为50μg/mL的碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染液，室温静置孵育15min后，利用FACS Calibu流式细胞仪检测和软件(CellQuest Pro software，BD，USA)分析PI着染阳性细菌数。结果如图2所示。未经P2处理的停乳链球菌CVCC 3938细胞内PI信号仅为0.673％，表明细菌细胞壁膜完整，PI几乎未进入细菌内部。经2×MIC的P2处理30min和120min后细胞膜穿透率分别为0.72％和3.97％；经4×MIC的P2处理30min和120min后细胞膜穿透率分别达0.76％和4.94％。结果表明细菌细胞膜被P2破坏，且呈时间和剂量依赖性。

实施例4抗菌肽P2对停乳链球菌CVCC 3938细胞形态的影响

向对数期的停乳链球菌CVCC 3938的PBS菌悬液(1×10⁸CFU/mL)中加入终浓度为4×MIC的P2，同时加入等体积的PBS溶液为阴性对照，两者混匀后置于37℃恒温培养箱孵育120min。室温4 000r/min离心5min后用0.01mol/L PBS重悬洗涤菌体沉淀3次，吸清上清后缓慢加入1mL用0.01M PBS配制的2.5％的戊二醛缓冲液，轻悬菌体后置于4℃固定过夜。固定后依次使用1mL 50％乙醇-70％乙醇-85％乙醇-95％乙醇2次-100％乙醇2次进行梯度脱水漂洗，每次15min，使用临界点干燥仪对处理样品进行干燥，并用离子溅射仪使样品表面镀膜，然后用S-4800型扫描电子显微镜进行观察。实验结果如图3所示，未经P2处理的停乳链球菌CVCC 3938细胞形态表面饱满且光滑，个体之间成双或排列成短链状卵圆形，无内容物泄出与形态变化。而经4×MIC的P2处理后的停乳链球菌CVCC 3938细胞表面出现变形或皱缩现象，部分细胞呈现内容物泄出和细胞裂解。

实施例5抗菌肽P2对停乳链球菌CVCC 3938超微结构的影响

透射电镜样品的前处理步骤同实施例4，经戊二醛过夜固定后的菌体用PBS洗涤5次，每次7min，加入1％的锇酸缓冲液固定1h后，依次经50％乙醇-70％乙醇-85％乙醇-95％乙醇2次-100％乙醇2次进行梯度脱水，乙醇/环氧树脂(1:1)浸泡2h，更换包埋液后浸泡12h，换一次包埋液后，再浸泡2h，烘箱60℃处理24h，用1％乙酸双氧铀染色，切片，透射电镜观察。结果如图4所示，经抗菌肽处理的对照组中停乳链球菌CVCC 3938细胞膜完整且内容物分布均匀充实。经4×MIC的P2处理后的停乳链球菌CVCC 3938细胞膜边缘不完整，大多数菌体着色较对照组相比颜色变浅，部分细胞出现“鬼影”现象。

实施例6抗菌肽P2对停乳链球菌CVCC 3938初级生物膜形成的影响

将对数期的停乳链球菌CVCC 3938的PBS菌悬液(1×10⁸CFU/mL)与不同终浓度的P2或万古霉素(1×MIC～64×MIC)混合，然后将其悬浮于96孔板中，未处理菌液为对照组，TSB为空白对照组，置于37℃培养箱中静止24小时。孵育结束后，PBS洗3遍，以去除浮游细胞，通过MTT方法评估P2对停乳链球菌初级生物膜形成的影响。P2对生物膜的抑制作用由式(I)确定：

生物膜(％)＝[(A-A_P2)/A]×100] 式(I)

其中，A、A_P2分别表示未处理菌液吸光度和P2处理组吸光度。

以上实验均一式三份进行测定。结果如图5所示，P2在较高浓度下可有效停乳链球菌CVCC 3938生物膜的形成。在16×MIC～64×MIC P2处理24小时后，停乳链球菌CVCC 3938生物膜体积百分比降低了28.3％-49.8％以上，效果优于同等浓度的万古霉素，这表明P2可以有效地抑制停乳链球菌CVCC 3938生物膜的形成。

实施例7抗菌肽P2对停乳链球菌CVCC 3938成熟生物膜的清除作用

将对数生长期的停乳链球菌CVCC 3938用TSB培养基制成1×10⁸CFU/mL的菌悬液，加入96孔板中，每孔200μL菌液，TSB为空白对照组，于37℃孵育24h。轻轻吸去上清，分别加入200μL终浓度为1×MIC～64×MIC的抗菌肽P2或万古霉素继续孵育24h，对照组为未处理菌液，TSB为空白对照组，每组三个平行。孵育结束后，PBS洗3遍，以去除浮游细胞，通过MTT方法评估P2对停乳链球菌成熟生物膜消除的影响。P2对生物膜的消除作用由式(I)确定。以上实验均一式三份进行测定。结果如图6所示，P2对成熟生物膜具有破坏作用，在4-16倍MIC浓度下，P2对停乳链球菌CVCC3938生物膜形成的抑制作用呈浓度依赖性(45.73％-73.61％)。当浓度达到64×MIC时，抑制率变化不大，保持在31.23％-41.47％左右，而相同浓度的万古霉素处理组对生物膜的去除效果较差。因此P2对成熟生物膜的破坏能力大于万古霉素。

实施例8抗菌肽P2对停乳链球菌CVCC 3938早期生物膜内持留菌的杀菌作用

活化停乳链球菌CVCC 3938并转接继续培养至对数生长期，用TSB培养基稀释到1×10⁸CFU/mL，取200μL/孔加入到96孔板中，置于37℃孵育24h使生物膜形成。然后用PBS洗3遍，以去除浮游细胞。分别加入1×MIC～512×MIC等不同浓度P2或万古霉素溶液，继续于37℃孵育2h，并设置PBS作为空白对照。孵育后用超声处理菌液5min，使生物膜膜内菌逸出，取菌液稀释后涂布于TSA固体平板上统计菌落数。结果如图7所示，停乳链球菌CVCC 3938经P2处理后，菌落数量显著减少，且呈一定浓度依赖性。在64倍MIC浓度下，P2对停乳链球菌CVCC3938的杀菌率为99.9％，显著高于万古霉素对照组。

实施例9抗菌肽P2对停乳链球菌CVCC 3938成熟生物膜内持留菌的杀菌作用

为了从成熟的生物膜中获得持留菌，将停乳链球菌CVCC 3938在96孔板(200μL/孔)中37℃培养至对数中期(1×10⁸CFU/mL)，持续24h。用PBS冲洗浮游细菌后，将生物膜于37℃在200μL含100×MIC万古霉素的TSB培养基中孵育24小时，然后轻轻洗涤以去除浮游细菌，并使用200μL含16×MIC P2或万古霉素可去除包裹在生物膜中的细菌。37℃孵育24小时后，将暴露于新鲜PBS的细菌作为对照。超声5分钟后，通过TSA平板计数法对生物膜中的活菌进行计数。结果如图8所示，100倍MIC万古霉素处理24h后，生物膜包裹菌数从6.68log10CFU/mL下降到4.83log10 CFU/mL，仅下降了2个数量级。相比之下，16倍MIC P2使生物膜中的细菌数量减少了4.68-4.80个数量级(单次实验的三个组内重复)，杀菌率达到99％以上，表明P2具有杀灭包裹在生物膜中的万康霉素耐药菌的潜在活性。

实施例10激光共聚焦观察抗菌肽P2对停乳链球菌CVCC 3938生物膜的影响

为进一步研究P2对生物膜和内部细菌的抑制、消除作用，将对数生长期的停乳链球菌CVCC 3938用TSB培养基制成1×10⁸CFU/mL的菌悬液，加入360μL菌液于带有无菌引导片的24孔板中，再加入40μL抗菌肽P2或万古霉素使其终浓度为16×MIC，未处理菌液为空白对照组。于37℃培养24h后弃上清，PBS洗2遍，然后用SYTO9和PI((LIVE/DEAD BacLightBacterial Viability Kit))染色15min，PBS冲洗引导片并置于激光共聚焦显微镜下进行观察，结果如图9所示，未处理的停乳链球菌CVCC 3938形成的生物膜厚度为16.70μm，而P2处理后的生物膜厚度明显变薄(厚度为9.66μm)。此外，P2处理组死亡菌数增加，且优于万古霉素处理组(21.75μm)，说明P2对停乳链球菌CVCC 3938生物膜及其内部细菌的抑制和消除作用强于万古霉素处理组。

实施例11抗菌肽P2在小鼠乳腺炎模型体内治疗效果评价

为了研究P2对靶动物的治疗效果，本实施例中构建了小鼠乳腺炎模型。在本试验中，参照Lianbin L等(2017)的方法诱导乳腺炎模型。选取产后4天SPF级ICR母鼠，攻毒前2h将仔鼠与母鼠分离，攻毒前1h恢复哺乳，使仔鼠尽量吸尽乳汁。使用异氟烷经呼吸道吸入麻醉小鼠，75％酒精消毒腹部皮肤，置于解剖镜下，调整焦距使镜下小鼠乳头清晰可见。左手持无菌眼科镊轻轻固定乳头，右手持100μL微量注射器将100μL菌液(1×10⁵CFU/mL停乳链球菌CVCC 3938)或PBS溶液通过乳导管注入第4对乳腺内。攻毒后不继续哺乳，3h后再次麻醉小鼠乳导管灌注给药。P2及万古霉素给药剂量均为100μg/乳腺(溶解于100μLPBS溶液)，对照组给予相同剂量的无菌PBS。攻菌24h后对小鼠实施安乐死，无菌收集第四对乳腺称重并进行菌落计数。采用ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α及MCP-1指标，各组剩余乳腺组织分别用10％多聚甲醛处理，苏木精和伊红(HE)过滤，进行组织病理学分析。所有小鼠实验和动物福利均按照中国农业科学院饲料研究所动物护理与使用委员会-实验动物伦理委员会批准的方案(AEC-CAAS-20090609)进行。在空白对照组中，小鼠乳腺导管灌注停乳链球菌CVCC 3938 24h后，小鼠乳腺出现红肿症状。结果如图10所示，在乳腺导管内注射P2(100μg/乳腺)后，小鼠乳腺中的细菌数量与对照组相比明显减少了2.60log10个数量级(p<0.01)，而万古霉素治疗组中细菌数量减少了1.37log10个数量级。结果表明，P2能有效减少小鼠乳腺中的细菌，优于万古霉素。乳房组织切片的观察结果示于图11所示，其中PBS对照组的小鼠乳腺未显示出组织病理学损伤，乳腺内未出现巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞；停乳链球菌CVCC 3938诱导的小鼠乳腺组织显示充血、肿胀；腺泡减少和乳凝块，这证明成功建立了乳腺炎模型。P2及万古霉素治疗后炎症反应明显改善，腺泡中的巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞明显减少，乳凝块减少，其中用P2和万古霉素治疗后炎症反应明显改善且P2缓解炎症的效果优于万古霉素。结果说明P2在小鼠的保护性免疫中起着一定的作用。

为进一步研究P2的保护作用是否与炎症因子的调节有关，选用ELISA法测定小鼠乳腺组织促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)，抗炎细胞因子(IL-10)和趋化因子(MCP-1)变化。结果如图12所示，经P2处理后，IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MCP-1的水平分别为1.66-2.45、18.71-22.08、1.69-2.42、7.11-8.77和4.92-5.81pg/mg。P2治疗组IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平明显低于阴性对照组(分别为2.51-2.68、23.33-25.27、11.97-12.82、6.59-6.78pg/mg)，P2的调节作用与万古霉素治疗组相似(分别为1.92-2.63、19.69-24.16、6.10-11.14、4.65-6.24pg/mg)。但各治疗组IL-10的水平均远优于相应对照组。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

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序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 抗菌肽P2在制备停乳链球菌抗菌药物中的应用

<130> KHP201118005.8

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Lys Cys His

1 5 10 15

Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Ser

20 25 30

Ala Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

35 40

Claims (4)

1.抗菌肽P2在制备停乳链球菌抗菌药物或组合物中的应用；其中，抗菌肽P2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.抗菌肽P2在制备治疗或预防停乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用；其中，抗菌肽P2同权利要求1中所述。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病是指由停乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述疾病包括奶牛乳房炎。

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