CN111298100A

CN111298100A - 抗菌肽nz2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用

Info

Publication number: CN111298100A
Application number: CN202010225505.3A
Authority: CN
Inventors: 王建华; 单玉雪; 滕达; 毛若雨; 杨娜; 王秀敏; 郝娅; 马炫炫
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明提供抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用。本发明首次发现抗菌肽NZ2114对无乳链球菌及其生物膜具有抑制作用。实验表明，NZ2114对无乳链球菌具有高效、快速杀菌作用。同时，NZ2114对生物膜具有高效的抑制和消除作用，低浓度的NZ2114即可抑制无乳链球菌的初级生物膜，消除无乳链球菌的成熟生物膜。另外，抗菌肽NZ2114对无乳链球菌生物膜内细菌及其持留细菌也具有高效抑制活性，且抑制作用显著高于万古霉素。此外，对耐万古霉素的生物膜内持留菌具有显著杀灭作用。因此NZ2114具有开发成为治疗由无乳链球菌引起的奶牛乳房炎新型制剂的潜力。

Description

抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用。

背景技术

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一，其对奶牛养殖业和乳制品行业造成重大经济损失。无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，GBS)是引起该疾病的主要病原菌之一，由于其具有生物膜形成特性，能够有效躲避机体的免疫清除、吞噬作用及传统抗菌药物的杀菌作用，极易引起亚临床性奶牛乳房炎并出现反复感染现象。目前对无乳链球菌的治疗药物主要包括青霉素类(或与林可胺类协同作用)、林可胺类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类抗生素，但随着抗生素的大量使用，奶牛乳房炎临床分离的链球菌(包括无乳链球菌)对多种抗生素已经产生耐药性，其中对青霉素类、四环素类的耐药率高达95％，对林可胺类治疗药物也表现出较高耐药性，如对克林霉素和林可霉素的耐药率分别为56.25％和60.94％。同时，无乳链球菌在奶牛乳导管可形成生物膜，从而导致抗生素对无乳链球菌的作用效果显著降低，给奶牛乳房炎的治疗带来困难。因此，急需寻找高抗菌、低耐药和强去生物膜的新型抗菌制剂。

抗菌肽(AMPs)作为一种新型抗菌剂具有分子量小、细胞毒性低、杀菌活性强、稳定性高等特性，同时还具有多靶点作用的杀菌机制。抗菌肽NZ2114(参见 ZL201210550063.5)是真菌防御素Plectasin的衍生肽，由40个氨基酸组成，具有典型的CSαβ结构，与母体肽相比NZ2114杀菌活性更强，对金黄色葡萄球菌的活性抑制率可达母体肽的30倍，同时具有更低的溶血性和更好的稳定性。NZ2114对金黄色葡萄球菌的杀菌作用主要是通过与细菌细胞壁上的Lipid Ⅱ结合从而抑制细胞壁合成，达到杀菌效果。Klein等研究发现，NZ2114对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生物膜具有抑制作用。但未见NZ2114对奶牛乳房炎来源的无乳链球菌抑制方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供抗菌肽NZ2114在抑制无乳链球菌及其产生的生物膜方面的新用途。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物或组合物中的应用。

第二方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在制备治疗或预防无乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

所述疾病是指由无乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病。

所述疾病包括奶牛乳房炎。

第三方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在抑制无乳链球菌方面的应用。

第四方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在抑制无乳链球菌引起的生物膜方面的应用，包括对初期生物膜的抑制作用，成熟生物膜的消除作用、以及对膜内持留菌的抑制作用。

本发明中，无乳链球菌可以是标准株ATCC 13813，也可以是从奶牛乳房炎患病动物体内分离获得的菌株。

本发明首次发现抗菌肽NZ2114对无乳链球菌及其生物膜具有抑制作用。实验表明，NZ2114对无乳链球菌具有高效、快速杀菌作用。NZ2114通过破坏细菌壁膜并进入细菌内部与内容物结合的双重作用机制来杀菌。同时，NZ2114对生物膜具有高效的抑制和消除作用，低浓度的NZ2114即可抑制无乳链球菌的初级生物膜，消除无乳链球菌的成熟生物膜。另外，抗菌肽NZ2114对无乳链球菌生物膜内细菌及其持留细菌也具有高效抑制活性，且抑制作用显著高于万古霉素。此外，对耐万古霉素的生物膜内持留菌具有显著杀灭作用。因此NZ2114具有开发成为治疗由无乳链球菌引起的奶牛乳房炎新型制剂的潜力。

附图说明

图1为本发明实施例2中NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813杀菌动力学曲线。

图2为本发明实施例4中扫描电镜观察NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813的细胞形态的影响。

图3为本发明实施例5中透射电镜观察NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813的超微结构的影响。

图4为本发明实施例6中NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813早期生物膜形成的影响。

图5为本发明实施例7中NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813成熟生物膜的清除作用。

图6为本发明实施例8中扫描电镜观NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813生物膜及其中菌落的影响。

图7为本发明实施例9中NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813早期生物膜内持留菌的作用。

图8为本发明实施例10中NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813成熟生物膜内持留菌的作用。

图9为本发明实施例11中激光共聚焦电子显微镜观察NZ2114对无乳链球菌ATCC13813生物膜作用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的菌株、培养基及主要仪器为：

无乳链球菌ATCC 13813购自美国微生物菌种保藏中心。临床分离株(无乳链球菌CAU-FRI 1、无乳链球菌CAU-FRI 2、无乳链球菌CAU-FRI 3)由中国农业大学国家兽药安全评价中心惠赠。纯化的抗菌肽NZ2114由中国农业科学院饲料研究所基因工程室制备，纯度＞95％。万古霉素(Vancomycin，Van)购自中国兽医药品监察所，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基均购自北京奥博星生物科技有限公司。胎牛血清购自北京政博伟业生物科技有限公司，其它试剂均属于国产分析纯级别。高速冷冻台式离心机SIGMA 3K15购自德国SIGMA公司；紫外分光光度计UV759购自上海精密科学仪器有限公司；精密天平AL204，PL202-L购自瑞士 METTLER TOLEDO公司；蒸汽灭菌锅LS-3780购自日本SANYO公司；多功能酶标仪 ELX-808IU购自上海拜格生物科技发展有限公司；全温振荡培养摇床ZHWY-211D购自上海精宏实验设备有限公司；激光共聚焦显微镜Zeiss 780购自德国Zeiss公司。

实施例1抗菌肽NZ2114对无乳链球菌最小抑菌浓度的测定

无乳链球菌ATCC 13813过夜培养，1％接种量转接于含3％胎牛血清的TSB培养基中，37℃、250r/min培养至对数生长期，用TSB培养基将菌液稀释为1×10⁵CFU/mL 并加入96孔板中，每孔90μL菌液，另外分别加入10μL不同浓度的抗菌肽NZ2114或万古霉素使菌液终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL，置于37℃培养箱静置培养12h。阴性对照组(磷酸盐缓冲液PBS)和空白对照组(TSB培养基)做相同处理，每个处理组3个重复。结果如表1所示：

表1

实施例2抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813的杀菌动力学曲线

将对数生长期的无乳链球菌ATCC 13813用TSB稀释为1×10⁵CFU/mL的菌悬液，分装至50mL无菌三角瓶中，9mL/瓶，5瓶。分别加入1mL不同浓度抗菌肽NZ2114 使其终浓度分别为1×MIC、2×MIC和4×MIC，阳性对照组加入终浓度为2×MIC的万古霉素，空白组加入等体积的PBS。分别在0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12和24h 取100μL菌液样品，稀释后涂板并统计单菌落数，绘制时间-杀菌曲线。结果如图1 所示，无乳链球菌ATCC 13813在1×MIC浓度的NZ2114处理后，在1h内菌落数显著降低，但5h后菌落出现反弹现象，24h后菌落可达到10⁸CFU/mL。当NZ2114浓度为 2×MIC和4×MIC时，细菌菌落数在0.5h内急速下降，并且分别在0.5h和1h内达到99％的杀菌率，未出现菌落数反弹现象，表明NZ2114杀菌具有时间和浓度依赖性。对照组万古霉素处理后，菌落数呈缓慢下降趋势，且在8h后出现反弹，24h后菌落数为 10⁴CFU/mL。

实施例3抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813的抗生素后效应(PAE)

将对数生长期的无乳链球菌ATCC 13813用TSB培养基制成1×10⁸CFU/mL的菌悬液，取0.8mL菌悬液分别加入0.2mL NZ2114或万古霉素溶液使其终浓度为1×MIC，2×MIC，4×MIC，空白组加入等体积的PBS，在37℃孵育2h后重建体系，0.1％接种到10mL TSB培养基中，记为0h，每小时取样进行菌落计数。计算公式如下：

PAE(min)＝T-C

其中，T：重建体系后试验组菌落数高于0h菌落数10倍所需时间；

C：重建体系后空白组菌落数高于0h菌落数10倍所需时间。

抗菌肽NZ2114与细菌短暂接触，重建系统后细菌生长仍受到持续抑制。菌落计数显示，当抗菌肽的浓度为1×、2×和4×MIC时，无乳链球菌ATCC 13813恢复菌落数 10倍所需的时间分别为15min、270min和123min，2×MIC浓度的万古霉素对无乳链球菌ATCC 13813的PAE为64min。该结果表明2×和4×MIC的NZ2114对无乳链球菌 ATCC 13813的PAE分别提高了4.22(270/64)倍和1.92(123/64)倍，作用时间长。

实施例4抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813细胞形态的影响

将对数生长期的无乳链球菌ATCC 13813用0.01mol/L PBS(pH＝7.4)稀释成浓度相当于1×10⁸CFU/mL的菌悬液，加入抗菌肽NZ2114溶液使其终浓度为4×MIC，万古霉素和未处理组分别为阳性和阴性对照组。37℃静置孵育2h后4000r/min离心5 min，PBS洗菌体3次后弃上清并加入2.5％戊二醛1mL。4℃固定2h后菌体用无菌水洗3遍，分别用时4min、5min和6min。50％乙醇-70％乙醇-85％乙醇-95％乙醇2次-100％乙醇2次梯度脱水后，用临界点干燥仪干燥样品，离子溅射仪喷金制样，制样后扫描电子显微镜观察(S-4800，HITACHI，日本)。实验结果如图2所示，未经过药物处理的细菌表面比较光滑，大小均匀呈卵圆形，无穿孔，无内容物泄漏。万古霉素处理的细菌仍然能够维持卵圆形形态，但大多数细胞呈现变形、拉长甚至褶皱现象(图2 中箭头1)，表面无孔洞，无内容物泄漏。NZ2114处理的细胞表面粗糙，大部分严重变形，大小不均匀，表面皱缩严重，部分细胞表面有穿孔，造成细胞死亡(图2中箭头2)。

实施例5抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813超微结构的影响

前期菌体固定与实施例4中处理方法相同，2.5％戊二醛固定后用PBS清洗菌液5次，每次7min，1％锇酸缓冲液中固定1h，PBS清洗菌液3次，丙酮梯度脱水。环氧树脂包埋过夜，60℃烘箱处理样品24h，1％乙酸双氧铀染色，切片，制样后透射电子显微镜观察(H-7650，HITACHI，日本)。结果如图3所示，透射电镜观察经抗菌肽和抗生素处理后的无乳链球菌内部超微结构变化。未经药物处理的细菌细胞壁和细胞膜完整，内容物分布均匀，细胞形态没有变化。万古霉素处理的细胞略有变形，内容物轻微泄漏，内容物分布不均匀。抗菌肽NZ2114处理的细胞严重变形(图3中箭头2)，细胞壁部分断裂(图3中箭头1)，电子密度降低，细胞内容物溶解。

实施例6抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813初级生物膜形成的影响

将对数期生长期的无乳链球菌ATCC 13813用TSB培养基制成1×10⁸CFU/mL的菌悬液，加入96孔板中每孔180μL菌液，分别加入20μL抗菌肽NZ2114或万古霉素使其终浓度为0.125×MIC～8×MIC，未处理菌液为对照组，TSB为空白对照组，置于37℃培养箱孵育24h，每组3个平行。弃上清，PBS洗3遍，自然晾干。加入200μL 2.5％戊二醛固定90min，轻轻吸去上清，PBS洗2遍，200μL 0.1％结晶紫染色15min，弃上清，蒸馏水洗2遍，自然晾干，加入200μL 95％乙醇溶解30min，于波长570nm下测OD值。

计算公式如下：

生物膜(％)＝[(OD570nm菌液-OD570nm空白)/(OD570nm未处理-OD570nm空白)]×100％

结果如图4所示，当NZ2114作用浓度为0.125×MIC～1×MIC时，无乳链球菌ATCC13813初级生物膜形成率为21.3％～54.2％，即NZ2114对初级生物膜的抑制率为 45.8％～78.7％，万古霉素的抑制率为46.1％～79.2％；当NZ2114作用浓度为 2×MIC～8×MIC时，对无乳链球菌ATCC 13813初级生物膜的抑制率可达99.9％，效果优于同等浓度的万古霉素(抑制率84％-92％)，表明NZ2114以浓度依赖性方式抑制无乳链球菌初级生物膜的形成。

实施例7抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813成熟生物膜的清除作用

将对数生长期的无乳链球菌ATCC 13813用TSB培养基制成1×10⁸CFU/mL的菌悬液，加入96孔板中，每孔200μL菌液，TSB为空白对照组，于37℃孵育24h。轻轻吸去上清，分别加入200μL终浓度为0.5×MIC～64×MIC的抗菌肽NZ2114或万古霉素继续孵育24h，对照组为未处理菌液，TSB为空白对照组，每组三个平行。弃上清，PBS 洗3遍，自然晾干。加入200μL2.5％戊二醛固定90min，弃上清，PBS洗2遍，200μL 0.1％结晶紫染色15min，弃上清，蒸馏水洗2遍，自然晾干，加入200μL 95％乙醇溶解30min，于波长570nm下测OD值。计算公式如下：

结果如图5所示，在NZ2114和万古霉素1×MIC浓度作用下，成熟生物膜形成率分别为43.7％和57.1％，即NZ2114和万古霉素对无乳链球菌ATCC13813成熟生物膜的清除率分别为56.3％和42.9％；在2×MIC～16×MIC浓度作用下，NZ2114和万古霉素对无乳链球菌ATCC13813成熟生物膜的清除率分别为85.5％～94.4％和46.5％～67.7％；在 32×MIC～64×MIC浓度作用下，NZ2114对成熟生物膜清除率可达到99.9％，万古霉素清除率为86.2％～90.9％，结果表明NZ2114对无乳链球菌成熟生物膜的清除作用要优于万古霉素。

实施例8抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC13813生物膜及其中菌落的影响

将对数生长期的无乳链球菌ATCC 13813用TSB培养基制成1×10⁸CFU/mL的菌悬液，加入360μL菌液于带有无菌引导片的24孔板中，再加入40μL抗菌肽NZ2114或万古霉素使其终浓度分别为4×MIC，空白组加入磷酸缓冲液PBS，37℃培养2h后弃上清，PBS洗3遍，加入2.5％戊二醛400μL在4℃固定2h。后续步骤同实施例4。实验结果如图6所示，未经药物处理组细菌聚集在一起，细丝和网状生物膜均匀地包裹在细菌周围(图6中箭头1)，细菌均匀地分布于生物膜中。万古霉素治疗组的生物膜数量减少，生物膜中的细菌略有变形。NZ2114治疗组细菌产生的生物膜几乎消失，生物膜中的细菌变形甚至破裂(图6中箭头2)。

实施例9抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813早期生物膜内持留菌的杀菌作用

将制备好的1×10⁸CFU/mL的菌悬液加入96孔板中，每孔200μL菌液，37℃孵育 24h后，轻轻吸去上清，分别加入200μL终浓度为0.5×MIC～16×MIC的抗菌肽NZ2114 或万古霉素，于37℃处理2h，对照组为未处理菌液，TSB为空白对照组，每组三个平行。超声5min，菌液梯度稀释后铺于TSA平板上，培养16-18h后进行菌落计数。结果如图7所示，NZ2114在浓度为0.5×MIC时，无乳链球菌ATCC13813初级生物膜内菌落数由1×10⁸CFU/mL迅速减少至4.9×10⁴CFU/mL，在16×MIC浓度下杀菌率可达 99.9％，而万古霉素在16×MIC浓度时生物膜内菌落数仍为2.8×10⁵CFU/mL。在 0.5×MIC～16×MIC浓度下，NZ2114处理组与万古霉素处理组之间差异极显著(P＜ 0.01)，表明NZ2114对无乳链球菌ATCC13813早期生物膜内细菌的清除作用优于万古霉素，并具一定浓度依赖性。

实施例10抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813成熟生物膜内持留菌的杀菌作用

将制备好的1×10⁸CFU/mL的菌悬液加入96孔板中，每孔200μL菌液，37℃孵育24h。弃上清，加入终浓度为25×MIC万古霉素37℃继续孵育24h。再次吸去上清去除浮游细菌，分别加入200μL终浓度为0.5×MIC的抗菌肽NZ2114或万古霉素，37℃孵育24h，对照组为未处理菌液，TSB为空白对照组，每组三个平行。超声5min，菌液梯度稀释后铺于TSA平板上，培养16-18h后进行菌落计数。结果如图8所示，用 25×MIC万古霉素处理生物膜24h后，无乳链球菌ATCC13813成熟生物膜内仍有5×10³ CFU/mL的持留菌，继续使用0.5×MIC的NZ2114处理持留菌24h，NZ2114对生物膜内持留菌消除率可达99.9％，与未处理组差异极显著(P＜0.01)；而0.5×MIC万古霉素则对持留菌无消除作用，24h后生物膜内细菌与未处理组无显著差异。

实施例11抗菌肽NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813生物膜的作用

将对数生长期的无乳链球菌ATCC 13813用TSB培养基制成1×10⁸CFU/mL的菌悬液，加入360μL菌液于带有无菌引导片的24孔板中，再加入40μL抗菌肽NZ2114或万古霉素使其终浓度为4×MIC，未处理菌液为空白对照组。于37℃培养24h后弃上清， PBS洗2遍，SYTO9和PI((LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit))染色15min， PBS冲洗引导片并置于激光共聚焦显微镜下进行观察，结果如图9所示，未经处理的无菌引导片上形成的生物膜厚度为28.48μm，几乎都是活细胞(图9中箭头1)；万古霉素处理组生物膜厚度为22.85μm，除死细胞外(图9中箭头2)还有一些活细胞附着在引导片上；NZ2114处理组生物膜厚度为10.32μm，存在极少量的活细胞。与未处理组相比，NZ2114处理组生物膜厚度明显降低，菌落减少，说明其对生物膜及膜内细菌具抑制消除作用，且效果优于万古霉素。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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Claims

1.抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物或组合物中的应用。

2.抗菌肽NZ2114在制备治疗或预防无乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病是指由无乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病包括奶牛乳房炎。