CN104524547A - 菌丝霉素在抑制无乳链球菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了菌丝霉素在抑制无乳链球菌中的应用。本发明通过抑菌实验发现菌丝霉素具有很好的抑制无乳链球菌的作用；并进一步将菌丝霉素制备成相应的药剂，如菌丝霉素凝胶剂、菌丝霉素乳剂等，对乳腺炎具有很好疗效，其中凝胶剂抗菌消炎作用更好，作用时间更持久，保湿效果更好，并能有效的隔绝作用部位与空气的接触，避免伤口的感染发炎。可见菌丝霉素可用于制备无乳链球菌的抑菌剂，进一步用于治疗乳腺炎，尤其是对目前难以治疗的无乳链球菌引起的乳腺炎具有良好的疗效。

Description

菌丝霉素在抑制无乳链球菌中的应用

技术领域

本发明涉及菌丝霉素在抑制无乳链球菌中的应用。

背景技术

β-溶血性链球菌分为A到T共18个群，其中，无乳链球菌被分为B群，是除A群溶血性链球菌外最常见的致病性链球菌。无乳链球菌(S.agalactiae)是乳腺炎的病原体，常存在于乳牛的皮肤、乳头及乳房内，通过擦洗乳房用的毛巾、水、挤奶员的手、挤奶杯等。传染性致病菌的危害比较大，挤奶期治疗可以控制无乳链球菌，但不能立刻解决泌乳期牛乳中体细胞数过高问题，从而会影响牛乳的销售。奶牛乳腺炎传播非常迅速，是一直困扰奶牛业发展的主要难题。大多数国家牛乳腺炎的发病率约为40%，每头牛平均减少奶量约为15%。奶牛乳腺炎主要由无乳链球菌和金黄色葡萄球菌等细菌感染引起，其中无乳链球菌引起乳房炎后不产生明显免疫力，目前尚无可靠的多价菌苗。

无乳链球菌是还是造成孕妇产褥期脓毒血症和新生儿脑膜炎的一个重要原因。它寄生在产妇生殖道，可致婴儿感染的发生。也可引起产后感染、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染及骨髓炎。

目前无乳链球菌的治疗，可使用：庆大霉素、氧氟沙星、环丙沙星、万古霉素、先锋V等。长期使用抗生素类药物会增加耐药性，严重时导致菌群失衡。随着抗生素在临床上的广泛使用，细菌耐药性问题日趋严重，增加了疾病治愈的难度并且给患者和社会带来了严重的经济负担。特别是近年来“超级细菌”逐渐增多，使得在合理用药的同时研发新一代安全高效的抗菌制剂显得尤为迫切。

目前治疗牛乳腺炎的方法有以下几方面，一是中药提取物，如双花、蒲公英、地丁、当归、连翘、没药等，但效果均不是非常理想；二是疫苗，兰州兽医研究所研制的奶牛乳房炎多联疫苗，对链球菌有一定的作用，大肠埃希菌J5苗，在控制杆菌性乳房炎有良好应用前景，但由于乳房炎病原菌的多样性，目前还没有非常合适的疫苗。

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，多具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌等特点。迄今为止，研究者已经从细菌、真菌、两栖类、昆虫、植物、哺乳动物乃至人体中发现并分离获得了具有抗菌活性的多肽。由于这些多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibacterial peptides, ABP”。并随着研究工作的深入，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有杀伤作用。

Plectasin也称为菌丝霉素，是2005年首次由Hans-Henrik Kristensen 课题组从叫做腐生子囊菌假黑盘菌（Pseudoplectania nigrella）的一种真菌中分离得到。体外抑菌试验表明，Plectasin对于多种细菌具有很高的杀菌活性。进一步体内抑菌试验表明，在肺炎链球菌感染小鼠引起的腹膜炎和肺炎模型中，Plectasin的疗效分别与万古霉素和青霉素相当。此外，Plectasin具有选择性杀灭作用，安全性高。Plectasin与细菌细胞壁形成的前体物质Lipid Ⅱ具有很强的亲和性，可以通过与Lipid Ⅱ结合阻止病菌细胞壁的形成，从而阻止病菌繁殖。Plectasin独特的作用机制不易诱导产生耐药性菌株。

虽然现有信息中的公开了Plectasin可以抑制多种细菌的生长，但其是否能够抑制无乳链球菌的生长，是否可以用于乳腺炎的治疗，仍为未知。

发明内容

本发明的目的在于提供菌丝霉素在抑制无乳链球菌中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明通过抑菌实验发现菌丝霉素具有很好的抑制无乳链球菌的作用；并进一步将菌丝霉素制备成相应的药剂，如菌丝霉素凝胶剂、菌丝霉素乳剂等，对乳腺炎具有很好疗效，其中凝胶剂抗菌消炎作用更好，作用时间更持久，并能有效的隔绝作用部位与空气的接触，避免伤口的感染发炎。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现菌丝霉素具有抑制无乳链球菌的作用，可用于制备无乳链球菌的抑菌剂；可进一步用于治疗乳腺炎，尤其是对目前难以治疗的无乳链球菌引起的乳腺炎具有良好的疗效。

附图说明

图1为本发明菌株Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3表达的菌丝霉素蛋白的RP-HPLC分析图；

图2为纯化后的菌丝霉素蛋白的质谱检测图；

图3为的菌丝霉素蛋白对无乳链球菌的抑制情况：“-”为无菌水，作为阴性对照；1为20μL的1ug/uL菌丝霉素蛋白；2为40μL的1μg/μL菌丝霉素蛋白；3为60μL的的1μg/μL菌丝霉素蛋白；4为80μL的的1μg/μL菌丝霉素蛋白；5、为100μL的的1μg/μL菌丝霉素蛋白；“+”为氨苄青霉素Amp，作为阳性对照。

具体实施方式

实施例1 菌丝霉素蛋白的制备方法

本实施例采用以乳酸乳球菌NZ9700为宿主外源表达目的蛋白菌丝霉素的方法，制备高纯度的菌丝霉素。

一、重组菌株的构建

从乳酸乳球菌MG1363中克隆到Usp45蛋白信号肽的核苷酸序列，将Usp45基因片段与穿梭质粒pMG36e连接构成质粒pGMN1；将质粒pGMN1与从乳酸菌质粒pNZ8408扩增出来的Pnis-MCS段基因连接，构建质粒pGMN2；人工合成的乳酸菌密码子偏好型菌丝霉素基因片段，优化后的菌丝霉素碱基序列为：GGT TTT GGT TGT AAT GGT CCA TGG GAT GAA GAT GAT ATG CAA TGT CAT AAT CAT TGT AAA TCA ATT AAA GGT TAT AAA GGT GGT TAT TGT GCT AAA GGT GGT TTT GTT TGT AAA TGT TAT（SEQ ID NO:1），将优化后的菌丝霉素基因片段与质粒pGMN2连接，得质粒pGMN3，在pGMN3中Usp45位于菌丝霉素上游。并将pGMN3质粒电转至乳酸乳球菌NZ9700中。PCR筛选出阳性转化子，经测序验证序列正确。

上述菌丝霉素（Plectasin）有40个氨基酸，含有6个半胱氨酸，形成3对分子内二硫键，大小4.41kDa，氨基酸序列：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。

上述信号肽Usp45的氨基酸序列为：MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA。

二、菌丝霉素蛋白的表达及重组菌的筛选

将上述多个测序验证正确的重组菌均分别转接至GM17培养基，在28～30℃条件下，兼性厌氧培养48h后，离心收集菌体上清，测定上清液中的蛋白浓度进行定量，将各组所获得的上清液进行SDS-PAGE电泳检测筛选出高表达菌丝霉素的阳性重组菌株，所筛选出的阳性重组菌命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3，已于2014年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2014611。

三、菌丝霉素蛋白的纯化及鉴定

阳离子交换层析纯化

取上述阳性重组菌（命名为：Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3）的蛋白发酵液，4000rpm/min，离心20分钟，弃沉淀，留上清。上清过0.45μm滤膜，用硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，硫酸铵饱和度为50～55%。4℃，13000rpm/min，离心30分钟，收集沉淀，弃上清。用pH5.0的0.02M的PB缓冲液溶解沉淀，过0.45μm的滤膜，再上样至Sephadex G25柱层析，用pH5.0的0.02M的PB缓冲液冲洗；蛋白溶解液经Sephadex G25层析脱盐后，利用阳离子交换层析CM柱进一步纯化，脱盐后的蛋白溶解液经CM阳离子层析处理，用pH5.0的PB洗脱，收集穿透峰，再收集分别用0.3M NaCl（洗脱杂质蛋白不含菌丝霉素）、0.5 M NaCl（洗出目的蛋白菌丝霉素）洗出的洗脱峰。

高效液相色谱纯化

取上述纯化实验中0.5M NaCl洗脱液溶液100μL进行反相高效液相色谱纯化，RP-HPLC（反相高效液相色谱）的条件为：C18，300Å，5μm，4.6mm×250mm；梯度洗脱60min，浓度为8%～80% 乙腈，添加0.1%TFA，流速0.8mL/min；RP-HPLC色谱图如图1所示。

从图1中可以看出，纯化后的菌丝霉素蛋白纯度很高，可达到95%以上，为药用级。

质谱鉴定

对上述纯化后的菌丝霉素蛋白进行质谱检测，检测结果如图2所示。从质谱图中可以看出在4412.69处有最高峰，菌丝霉素预计分子量为4410道尔顿，与预计结果一致，说明纯化后的蛋白的确为菌丝霉素蛋白。

实施例2 菌丝霉素蛋白对无乳链球菌的抑制作用

取上述高效液相色谱纯化后的菌丝霉素蛋白，配成浓度为1μg/μL，点样到含有无乳链球菌的琼脂平板上；同时，平板中还点有氨苄青霉素Amp和无菌水分别作为阳性对阴性对照；37℃过夜培养，观察结果。

结果如图3所示，所有点有不同体积菌丝霉素溶液和氨苄青霉素地方均出现了明显的抑菌圈，还点有无菌水处列抑菌圈，说明菌丝霉素具有抑无乳链球菌的作用。

实施例3 菌丝霉素对无乳链球菌的最小抑菌浓度MIC测试

将无乳链球菌菌液用生理盐水调节至在625nm波长检测，吸收值为0.09～0.10，然后用灭菌的肉汤按不同比例进行稀释，摇匀。往各支试管中加入不同量上述纯化后的菌丝霉素或Amp，使菌丝霉素在每支样品试管中的浓度分别为1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL；每支样品试管中的Amp 中浓度分别为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62μg/ml、31μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.062μg/ml、0.031μg/ml。然后置于37℃条件下，培养12小时。

检测结果发现菌丝霉素对无乳链球菌的MIC为纯化后的菌丝霉素蛋白1μg/mL，Amp对无乳链球菌的MIC是0.25μg/mL。上述结果说明，菌丝霉素对无乳链球菌具有很好的杀菌效果。

实施例4 菌丝霉素在动物体内的急性毒性试验

本试验旨在研究菌丝霉素对动物有无毒性影响。我们用纯化后的菌丝霉素为主要活性成分，用生理盐水制备菌丝霉素0.01%，将其肌注到昆明小鼠中。

采用健康的昆明小鼠40只，雌雄各半，体重27±0.25g。每日注射1次，连续注射7天。观察动物在最大剂量下的毒性反应。实验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，饮食及活动正常，40只昆明小鼠全部存活。证明菌丝霉素对动物无毒性作用。

实施例5 菌丝霉素在制备治疗乳腺炎药剂中的应用

一种治疗乳腺炎的菌丝霉素凝胶剂

菌丝霉素凝胶剂的配方为：菌丝霉素0.005%，卡波姆5%，甘油8%，山梨酸钾 0.1%，三乙醇胺0.5%，余量为水，其中百分比均指质量百分比。

菌丝霉素凝胶剂的制备方法为：将菌丝霉素蛋白用蒸馏水溶解备用，加入卡波姆50g、甘油80g、山梨酸钾1g，搅拌溶解，加入三乙醇胺5g调节pH值到5，加入蒸馏水至全量，搅拌均匀，制成凝胶1000g，即为菌丝霉素凝胶剂。

菌丝霉素凝胶剂的应用

将上述制备的菌丝霉素凝胶剂用于牛乳腺炎的治疗，选择泌乳期的4-8岁青壮年黑白花奶牛，共40头，急性乳腺感染引发炎症（含有无乳链球菌感染），其症状为乳房肿胀，牛奶异常：有凝块或者絮片，但无其它症状。随机分为3组，每组10头。第1组为空白对照组，不给予药物；第2组为菌丝霉素治疗组，按上述制剂配方每天给药2次，每次涂抹20mL；第3组为实施例1中制备的菌丝霉素蛋白，用量与第2组制剂中菌丝霉素蛋白的量相同，采取乳房灌注方法，每天给药2次，每次给药20mL；第4组为阳性药物组，按青霉素G钾10万单位，每天给药2次，进行乳房内注射给药。连续给药7天。

观察指标为痊愈和有效：痊愈指临床乳腺炎的症状全部消失，乳房组织柔软，牛奶中没有凝块，牛奶颜色较白。有效指临床乳腺炎的症状减轻，或者不再恶化，牛奶正常，但乳房肿胀没有完全消失。

结果显示，第一组空白对照组对牛乳腺炎改善没有效果；第2组菌丝霉素凝胶剂处理组痊愈6头，有效3头；第3组菌丝霉素蛋白处理组痊愈头数5头，有效头数2头；第4组青霉素G钾痊愈5头，有效2头。本发明制剂的抗感染的有效率在90%以上，而抗生素的有效率只有70%。细菌学检测证明菌丝霉素治疗前后，牛乳腺感染区的金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的数目显著下降，对耐药金葡菌也有很好的抑制作用。试验结果表明，菌丝霉素和制备成的菌丝霉素凝胶剂可以有效地治疗奶牛乳腺炎，并且以菌丝霉素凝胶剂的疗效更佳。

实施例6 菌丝霉素在制备治疗乳腺炎药剂中的应用

一种治疗乳腺炎的菌丝霉素乳

菌丝霉素乳的配方为：菌丝霉素 0.005%，霍霍巴油2%，单硬酯酸甘油酯 5%，司盘80 1%，泊洛沙姆 5%，丙三醇 5%，丙二醇 2%，卡波姆 20%，尼泊金乙酯 0.10%，余量为蒸馏水，其中百分比均指质量百分比。

菌丝霉素乳的制备方法为：按照处方量将霍霍巴油、单硬酯酸甘油酯、司盘80，混合均匀，加热至75℃使其充分溶解，形成油相。将泊洛沙姆、丙二醇、丙三醇与适量蒸馏水混合均匀，加热至75℃使其充分溶解，形成水相。在75℃时将水相加入油相搅拌5~15min，使其混合均匀，待其冷却至室温时加入菌丝霉素、尼泊金乙酯以及溶胀完全的卡波姆溶液，混合均匀后补充蒸馏水至全量即得。

菌丝霉素乳的应用

将上述制备的菌丝霉素乳剂用于牛乳腺炎，选择泌乳期的4-8岁青壮年黑白花奶牛，共30头，急性乳腺感染引发炎症（含有无乳链球菌感染），其症状为乳房肿胀，牛奶异常：有凝块或者絮片，但无其它症状。随机分为3组，每组10头。第1组为空白对照组，不给予药物；第2组为菌丝霉素治疗组，按上述制剂配方每天给药2次，每次涂抹20mL；第3组为阳性药物组，按青霉素G钾10万单位，每天给药2次，进行乳房内注射给药。连续给药7天。

观察指标为痊愈和有效：痊愈指临床乳腺炎的症状全部消失，乳房组织柔软，牛奶中没有凝块，牛奶颜色较白。有效指临床乳腺炎的症状减轻，或者不再恶化，牛奶正常，但乳房肿胀没有完全消失。

结果显示，空白对照组对牛乳腺炎改善没有效果；菌丝霉素乳处理组痊愈头数5头，有效头数3头；青霉素G钾痊愈5头，有效2头。本发明制剂的抗感染的有效率在80%以上，而抗生素的有效率是70%。细菌学检测证明菌丝霉素治疗前后，牛乳腺感染区的金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的数目显著下降，对耐药金葡菌也有很好的抑制作用。试验结果表明，菌丝霉素乳可以有效地治疗奶牛乳腺炎。

上述结果说明菌丝霉素、菌丝霉素凝胶剂、菌丝霉素乳剂对乳腺炎具有很好疗效，其中凝胶剂抗菌消炎作用更好，由于凝胶的胶黏特性，作用时间更持久，保湿效果更好，并能有效的隔绝作用部位与空气的接触，避免伤口的感染发炎，并降低过敏的发生率。使用方便，清洗简单。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

<110> 广东海纳川药业股份有限公司

<120> 菌丝霉素在抑制无乳链球菌中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工合成菌丝霉素序列

<400> 1

ggttttggtt gtaatggtcc atgggatgaa gatgatatgc aatgtcataa tcattgtaaa 60

tcaattaaag gttataaagg tggttattgt gctaaaggtg gttttgtttg taaatgttat 120

Claims (4)

1.菌丝霉素在制备抑制无乳链球菌的抑菌剂中的应用。

2.菌丝霉素在制备治疗乳腺炎药剂中的应用。

3.菌丝霉素在制备治疗奶牛乳腺炎药剂中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的乳腺炎为无乳链球菌引起的乳腺炎。