CN109106946A - 一种奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗及其制备方法。该方法首先通过对奶牛乳腺炎奶汁样品进行分离和鉴定，筛选出免疫原性良好且能够稳定传代的5、8、336型金黄色葡萄球菌各一株，并将其进行发酵培养、灭活等步骤，得到灭活菌体抗原原液；同时本发明还构建了SEB蛋白表达株和Hlɑ蛋白表达株，并将其进行诱导培养、离心、纯化和灭活等步骤，得到重组蛋白SEB和Hlɑ的抗原原液；最后将各抗原原液与佐剂混匀制成奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗。本发明的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗具有良好的安全性，可有效预防5、8、及336型金黄色葡萄球菌感染。对防控奶牛乳房炎的流行和传播具有重要意义。

Description

一种奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是由致病性或条件致病性病原微生物感染或理化刺激所引起的奶牛乳腺的一种炎性病变。因其病因复杂，反复发作，是影响全球奶牛业持续发展的三大疾病之一，也是导致奶牛养殖业经济损失最惨重的一种疾病，特别是我国表现更为严重。因此，科学防控奶牛乳房炎已成为关系到国计民生的重大现实问题。

奶牛乳房炎的致病因素多且复杂，如病原微生物感染、饲养方式、卫生环境条件、遗传等，其中病原微生物感染是最主要的致病因素。引起奶牛乳房炎的病原微生物高达150多种，主要为金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，这三种细菌占感染引起奶牛乳房炎的比例超过90％，其中金黄色葡萄球菌感染引起的乳房炎占发病总数的50％以上，且以5型、8型和336型为主，多以临床型或亚临床型出现，易于分娩或临近分娩时爆发，导致产奶量降低，劣质奶废弃，病牛淘汰，更严重的是金黄色葡萄球菌乳房炎临床治疗效果不佳，治愈率通常低于50％，一旦侵入牛群很难根除而失去价值。目前，采用抗生素治疗奶牛乳房炎是最有效的手段，但抗生素易产生耐药性，抗生素残留对畜牧业、人类健康及食品安全与公共卫生安全的危害已引起国际社会高度关注，特别是近日WHO已正式向全球发出禁止动物使用抗生素的建议。由此，在当今严格控制抗生素使用的前提下，如何科学防治病原感染致奶牛乳房炎，确保乳品食品安全是我们面临的严峻挑战。

疫苗是防控传染病最有效与价廉的手段之一，还没有任何医学手段能向疫苗那样高效的消灭传染病。对于细菌感染致奶牛乳房炎疫苗而言，美欧发达国家走在前面，抢先结合本国土优势流行菌株与奶牛自身感染特征开展了深入研究并取得了重要成果，一是美国早在上世纪80年代研发及批准上市针对大肠杆菌的J5灭活疫苗，已在美国和欧洲对控制大肠杆菌感染致奶牛乳房炎中发挥重要作用；二是美国勃林格上世纪90年代研发及批准上市针对四种噬菌体型金黄色葡萄球菌的Lysigin多价裂解疫苗，能够抵抗金黄色葡萄球菌感染及具有一定的保护力；三是西班牙本世纪初研发及批准上市针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的STARTVAC灭活疫苗，能安全、有效抵抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌感染致奶牛乳房炎。由此分析已批准上市的3个商业化产品安全有效，但效力还不能达到完全免疫保护，这与病原感染奶牛致病复杂与免疫特征密不可分，尤其是奶牛所处环境及预存免疫效应也难以所料，由此不能单纯以模式化要求像有些疫苗那样高效。同时，澳大利亚学者针对金黄色葡萄球菌荚膜多糖制成的灭活疫苗能够诱导抗荚膜多糖抗体产生并且减轻临床症状及提供小于50％的保护力，国内外学者研制的提取或重组蛋白亚单位疫苗、合成肽疫苗及基因疫苗等类型虽有报道但离临床应用距离甚远。并且批准勃林格上市的Lysigin多价裂解疫苗尽管在一定范围内投入市场使用，但其存在免疫保护效力低、使用受限的问题。综合分析，金黄色葡萄球菌感染奶牛乳房炎疫苗保护力较低不能减轻临床症状的可能原因及发展的重点如下：一是金黄色葡萄球菌感染奶牛乳房炎毒力致病与保护免疫具有特殊、复杂特性，用常规疫苗的思维设计疫苗靶分子还不够，比如在发酵及裂解过程中关键保护性抗原分子会丢失而不足，可见疫苗抗原靶标设计要弥补；二是金黄色葡萄球菌荚膜多糖具有自身特征，常规疫苗方法用荚膜多糖为靶抗原研发疫苗是可行的，而对金黄色葡萄球菌荚膜多糖免疫效力极为有限，可见疫苗抗原靶标设计荚膜多糖不是重中之重；三是感染奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌主要是5、8、336型，但不同区域来源的流行株致病力与免疫保护效力不一样，表现出毒力强而不一定免疫保护就好，可见筛选到优势疫苗株不一定兼顾检验用毒株。由此，奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗研发既要集成传统疫苗策略，又要有创新思维与先进技术来解决传统疫苗存在的瓶颈，这将是科学防控金黄色葡萄球菌感染致乳房炎疫苗创新发展的关键所在。

金黄色葡萄球菌感染致奶牛乳房炎致病机制极为复杂，重要毒力分子在免疫应答与免疫保护中发挥着重要作用，由此可筛选免疫保护性毒力分子添加到全菌灭活疫苗中以提高效力。金黄色葡萄球菌毒力分子众多且致病机制复杂，其某些细胞壁结构具有毒力因子的作用，如毒素和酶，此外还能产生系列毒力相关的成分，包括溶血素、肠毒素等。已有研究表明，参与细菌黏附与入侵的胞壁蛋白(Mntc、Csa1A、FhuD2)、毒素(SEB、H1α、ESXA、ESXB)和结合蛋白(SPA5)，常被作为金黄色葡萄球菌疫苗研制的保护性抗原，有望成为潜有力的候选疫苗靶标。由此筛选提升金黄色葡萄球菌灭活疫苗免疫保护效力的关键抗原分子是创新发展奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗的重要依据。流行病学资料显示，5型、8型、336型金黄色葡萄球菌是我国金黄色葡萄球菌感染奶牛乳房炎的主要流行菌株。已有研究表明，灭活全菌疫苗好于裂解、荚膜多糖等亚单位疫苗，但灭活全菌疫苗免疫保护效力有限还未能达到临床免疫防控的要求，推测原因可能与菌株在发酵培养过程中关键保护性蛋白抗原丢失密切相关。

在众多的毒力保护性抗原分子中，金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxin，SEs)主要由金黄色葡萄球菌血浆凝固酶或耐热核酸酶阳性的菌株产生的一类结构相似、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，是一种单链、23～29KD，且具有潜在免疫调节特性的蛋白。至今已发现十几个种类并对其进行了定位。这些毒素主要引起毒素休克综合征，按血清学分型可将其分为14型(A、B、C、D、E、G、H、I、J、K、L、M、N、O)，其中B型(SEB)在所有金黄色葡萄球菌肠毒素中被认为是最具毒性的一种，也是金黄色葡萄球菌公认的保护性抗原，一直是金黄色葡萄球菌疫苗研究的候选抗原。

α溶血素(Alpha-haemolysin)也称α毒素，是金黄色葡萄球菌主要的毒力因子，其在致病和逃避机体免疫机制过程中发挥了关键性作用。Wardenburg等报道缺失α溶血素的突变株与正常金黄色葡萄球菌株相比毒力明显减弱，α溶血素是一种分子量为34KDa的纯蛋白质，其中包含293个氨基酸残基，α毒素与靶细胞作用后，聚合成七聚体在细胞膜上形成跨膜孔道，引起钙离子跨膜内流从而导致靶细胞的裂解。α毒素也是金黄色葡萄球菌的一个公认的保护性抗原。

发明内容

本发明要解决的技术问题是安全、有效的预防金黄色葡萄球菌感染引发的奶牛乳房炎。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌及其与金黄色葡萄球菌肠毒素B和金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的新用途。

本发明提供了5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用。

本发明还提供了5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌肠毒素B和金黄色葡萄球菌ɑ溶血素在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种奶牛乳房炎疫苗。

本发明提供的奶牛乳房炎疫苗的活性成分为灭活的5型金黄色葡萄球菌、灭活的8型金黄色葡萄球菌、灭活的336型金黄色葡萄球菌、灭活的金黄色葡萄球菌肠毒素B和灭活的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素。

上述疫苗中，所述灭活的5型金黄色葡萄球菌、所述灭活的8型金黄色葡萄球菌、所述灭活的336型金黄色葡萄球菌、所述灭活的金黄色葡萄球菌肠毒素B和所述灭活的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的配比为(10⁸-10¹⁰)个菌：(10⁸-10¹⁰)个菌：(10⁸-10¹⁰)个菌：(60-200)μg：100μg。

进一步的，所述灭活的5型金黄色葡萄球菌、所述灭活的8型金黄色葡萄球菌、所述灭活的336型金黄色葡萄球菌、所述灭活的金黄色葡萄球菌肠毒素B和所述灭活的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的配比为10⁹个菌：10⁹个菌：10⁹个菌：100μg：100μg。

上述疫苗还包括佐剂。所述佐剂可为SP01佐剂、白油佐剂或铝盐佐剂(氢氧化铝佐剂)，优选为SP01佐剂。

更进一步的，上述应用或疫苗中，所述5型金黄色葡萄球菌为5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株；所述5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureusCGMCC No.15908；所述8型金黄色葡萄球菌为8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株；所述8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15907；所述336型金黄色葡萄球菌为336型金黄色葡萄球菌SA336菌株；所述336型金黄色葡萄球菌SA336菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15909；

所述金黄色葡萄球菌肠毒素B为重组金黄色葡萄球菌肠毒素B；所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述金黄色葡萄球菌ɑ溶血素为重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素；所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素为如下e)或f)或g)或h)的蛋白质：

e)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

f)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

g)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

h)与序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

所述5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株的分类命名为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，该菌株已于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15908。

所述8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株的分类命名为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，该菌株已于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15907。

所述336型金黄色葡萄球菌SA336菌株的分类命名为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，该菌株已于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15909。

在本发明中，所述5型金黄色葡萄球菌、所述8型金黄色葡萄球菌和所述336型金黄色葡萄球菌包括但不限于SACP5菌株、SACP8菌株、SA336菌株，可将任何适宜于制备奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗生产的当前和今后广泛流行的金黄色葡萄球菌野生株作为奶牛乳房炎疫苗的疫苗株。

在本发明的具体实施例中，通过对我国内蒙古、重庆、广州、黑龙江、甘肃、河北、山东等东西南北中30个省市90个中大型奶牛场、近3万头奶牛乳腺炎乳汁样品，分离、鉴定、确定我国奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌流行优势株为5、8、336型血清型，约占分离到金黄色葡萄球菌的96％。经过形态、生化、纯粹性、基因特征、传代稳定性等方面全面鉴定，从各型中分别挑选5份进一步进行毒力及免疫原性鉴定，最终筛选得到5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株、8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株和336型金黄色葡萄球菌SA336菌株。这些菌株不仅是流行优势株，且具有产量高、诱导免疫保护的能力强、交叉保护谱广、稳定性好的优点。

所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B和所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素包括但不限于本发明的表达重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的重组菌和表达重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的重组菌，可将任何适宜于制备奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗生产的重组蛋白表达株作为奶牛乳房炎疫苗的生产菌株。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述疫苗的制备方法。

上述疫苗的制备方法包括如下步骤：

1)5型金黄色葡萄球菌抗原原液、8型金黄色葡萄球菌抗原原液和336型金黄色葡萄球菌抗原原液的制备；

1-1)分别将5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌进行发酵培养，分别得到5型金黄色葡萄球菌发酵液、8型金黄色葡萄球菌发酵液和336型金黄色葡萄球菌发酵液；

1-2)分别将所述5型金黄色葡萄球菌发酵液、所述8型金黄色葡萄球菌发酵液和所述336型金黄色葡萄球菌发酵液进行甲醛灭活，分别得到灭活的5型金黄色葡萄球菌发酵液、灭活的8型金黄色葡萄球菌发酵液和灭活的336型金黄色葡萄球菌发酵液；

1-3)分别将所述灭活的5型金黄色葡萄球菌发酵液、所述灭活的8型金黄色葡萄球菌发酵液和所述灭活的336型金黄色葡萄球菌发酵液进行离心，收集菌体沉淀，并用PBS溶液重悬所述菌体沉淀，分别得到5型金黄色葡萄球菌抗原原液、8型金黄色葡萄球菌抗原原液和336型金黄色葡萄球菌抗原原液；

2)重组金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原原液和重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素抗原原液的制备

2-1)分别将表达金黄色葡萄球菌肠毒素B的重组菌和表达金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的重组菌进行发酵培养和诱导表达，分别得到金黄色葡萄球菌肠毒素B重组菌发酵液和金黄色葡萄球菌ɑ溶血素重组菌发酵液；

2-2)分别将所述金黄色葡萄球菌肠毒素B重组菌发酵液和所述金黄色葡萄球菌ɑ溶血素重组菌发酵液进行离心，收集菌体沉淀；然后将所述菌体沉淀重悬于裂解液中依次进行高压均质破碎和离心，收集上清液；再将所述上清液进行纯化，分别得到纯化后的重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白溶液和纯化后的重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素蛋白溶液；

2-3)分别将所述纯化后的重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白溶液和所述纯化后的重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素蛋白溶液进行甲醛灭活，分别得到重组金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原原液和重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素抗原原液；

3)疫苗的制备

将所述5型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述8型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述336型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原原液和所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素抗原原液与PBS溶液混匀，得到混合液；所述混合液与佐剂混合乳化后，即为所述疫苗。

上述方法中，所述步骤1-1)中，所述发酵培养的培养基为TSB培养基。

所述发酵培养的条件为37℃培养10h。

所述5型金黄色葡萄球菌、所述8型金黄色葡萄球菌和所述336型金黄色葡萄球菌为所述5型金黄色葡萄球菌生产种子、所述8型金黄色葡萄球菌生产种子和所述336型金黄色葡萄球菌生产种子。所述生产种子的制备方法如下：(p1)将菌株划线接种TSA培养基，37℃培养16h，挑选5个以上的典型菌落，划线接种TSA培养基，37℃培养16h，作为一级种子。(p2)用TSB培养基洗下TSA培养基上的一级种子菌落，接种于TSB培养基，37℃培养16h，作为二级种子，即得到所述生产种子。

所述步骤1-2)中，所述甲醛灭活的方法具体如下：按发酵液体积的0.6％加入40％(体积分数)的甲醛溶液进行灭活，37℃灭活96小时。

所述步骤1-3)中，所述离心的条件为6000r/min离心20min，所述PBS溶液悬浮后体积不高于原体积的1/10。

所述步骤2-1)中，所述发酵培养和诱导表达的培养基为TB培养基。

所述发酵培养和诱导表达的方法如下：37℃发酵培养4h后即对数生长期时开始进行诱导。所述诱导的条件为IPTG浓度为1mM(表达金黄色葡萄球菌肠毒素B的重组菌)或0.4mM(表达金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的重组菌)、pH值为7.2、37℃。发酵过程中pH值开始出现上升趋势时，流加补料培养基进行补料，诱导表达6h后发酵结束。

所述表达金黄色葡萄球菌肠毒素B的重组菌和所述表达金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的重组菌为表达金黄色葡萄球菌肠毒素B的重组菌生产种子和表达金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的重组菌生产种子。所述生产种子的制备方法如下：(q1)取重组菌划线接种LB(Amp⁺100μg/ml)培养基，37℃培养16h，挑选5个以上的典型菌落，划线接种LB(Amp⁺100μg/ml)培养基，37℃培养16h，作为一级种子。(q2)用LB(Amp⁺100μg/ml)培养基洗下LB(Amp⁺100μg/ml)固体培养基上的一级种子菌落，接种于LB(Amp⁺100μg/ml)培养基，37℃培养16h，取样经纯粹检验合格后作为二级种子，即得到所述生产种子。

所述表达金黄色葡萄球菌肠毒素B的重组菌是将重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因导入宿主菌中得到的；

所述表达金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的重组菌是将重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因导入宿主菌中得到的。

所述步骤2-2)的具体方法如下：将发酵液6000r/min，4℃离心20min，收集菌体沉淀，然后将所述菌体沉淀重悬于裂解液中(按1g菌体沉淀加入20mL裂解液)，用高压匀质机以700bar压力破碎菌体4次，10000r/min，4℃离心20min，收集上清液，所述上清液经0.65μm滤器过滤后采用SP Sepharose FF离子交换凝胶层析柱进行纯化，得到纯化后的重组蛋白溶液。

所述步骤2-3)中，所述甲醛灭活的具体方法如下：向所述纯化后的重组蛋白溶液中加入甲醛溶液，使甲醛的终浓度为0.1％(体积分数)，25℃灭活24小时。

所述步骤3)中，所述5型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述8型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述336型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原原液和所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素抗原原液与所述PBS溶液的体积比为1:1:1:1:1:5；

所述混合液与所述佐剂的体积比为1:1。

所述佐剂可为SP01佐剂、白油佐剂或铝盐佐剂(氢氧化铝佐剂)，优选为SP01佐剂。在本发明中，包括但不限于SP01、白油和铝盐佐剂中的一种或几种用于奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗的制备；还可包括免疫刺激复合物、细胞因子、脂质体等适于制备奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗的佐剂。

上述方法中，所述5型金黄色葡萄球菌为5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株；所述5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15908；

所述8型金黄色葡萄球菌为8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株；所述8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15907；

所述336型金黄色葡萄球菌为336型金黄色葡萄球菌SA336菌株；所述336型金黄色葡萄球菌SA336菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15909；

所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素为如下e)或f)或g)或h)的蛋白质：

e)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

f)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

g)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

h)与序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

进一步的，所述SACP5菌株、所述SACP8菌株和所述SA336菌株在所述疫苗中的浓度均为10⁸-10¹⁰个菌/mL；

所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B和所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素在所述疫苗中的浓度均为60-200μg/mL。

上述方法中，所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因为序列1所示的DNA分子；所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因为序列3所示的DNA分子；

进一步的，所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因通过含有所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因的重组载体导入宿主菌中；所述含有所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因的重组载体为将序列1所示的DNA分子插入表达载体的NdeI和Hlαnd III酶切位点中得到的表达载体。

所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因通过含有所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因的重组载体导入宿主菌中。所述含有所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因的重组载体为将序列3所示的DNA分子插入表达载体的NdeI和Hlαnd III酶切位点中得到的表达载体。

更进一步的，所述表达载体具体为pET-22b(+)质粒。

所述宿主菌可为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BL21。

本发明方法制备的疫苗可用于不同品种、不同年龄健康易感奶牛免疫接种。

所述免疫程序包括但不限于：产前25天，产后3天、31天各免疫一次。实际应用中，可依据奶牛产生的抗体水平免疫一次或两次。

所述免疫方式可皮下注射，也可肌肉注射、无针透皮免疫或乳导管注射，还可以一种或几种方式联合免疫。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了如下A)-G)任一所述的生物材料：

A)上述5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株；

B)上述8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株；

C)上述336型金黄色葡萄球菌SA366菌株；

D)序列1所示的重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因；

E)序列3所示的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因；

F)含有序列1所示的重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因的表达盒、重组载体和重组菌；

G)含有序列3所示的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因的表达盒、重组载体和重组菌。

上述生物材料在制备奶牛乳房炎中的应用也属于本发明的保护范围。

上述疫苗或上述方法或生物材料在预防奶牛乳房炎中的应用也属于本发明的保护范围。

上述疫苗或上述方法或生物材料在制备预防奶牛乳房炎的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用或疫苗或方法中：所述奶牛乳房炎为由金黄色葡萄球菌感染所致的奶牛乳房炎。所述金黄色葡萄球菌为5型金黄色葡萄球菌和/或8型金黄色葡萄球菌和/或336型金黄色葡萄球菌。

本发明的优点如下：本发明选择我国奶牛乳房炎优势金黄色葡萄球菌流行菌株作为疫苗株、以灭活全菌+重组蛋白为疫苗靶抗原、加入疫苗佐剂制备得到奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗，该疫苗为全面有效预防5、8、336型金黄色葡萄球菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保证，将是奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗发展的新里程碑。

本发明首先是通过对奶牛乳腺炎奶汁样品进行分离及形态、生化、纯粹性、血清学、基因特征、传代稳定性、毒力及免疫原性等全方面鉴定，筛选出具有代表当前流行的免疫原性良好且能够稳定传代的5、8、336型金黄色葡萄球菌各一株作为生产用菌株，分别命名为SACP5株、SACP8株、SA336株。并通过TSB培养基放大培养工业化生产，制备SACP5株、SACP8株、SA336株培养菌液，经甲醛灭活、离心分离制备SACP5株、SACP8株、SA336株灭活菌体抗原原液。然后构建了保护性抗原表达菌株重组金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)蛋白大肠杆菌BL21株和重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素(Hlα)蛋白大肠杆菌BL21株。并通过TB培养基放大培养工业化生产，制备重组SEB蛋白大肠杆菌BL21株、重组Hlɑ蛋白大肠杆菌BL21株培养菌液，经离心分离、破碎菌体、阳离子层析纯化，甲醛灭活残留细菌制备了重组SEB蛋白、重组Hlɑ蛋白抗原原液。将上述五种抗原原液按照一定的比例混合后制备得到奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗。该疫苗中可以含有如下佐剂：白油、铝盐(氢氧化铝或磷酸铝)和SP01佐剂。该疫苗可制备成临床适用的如下注射剂型：皮下注射剂型、肌肉注射剂型、透皮注射剂型和乳导管注射剂型。通过皮下或肌肉注射奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗，结果表明：皮下注射和肌肉注射都能产生良好的免疫应答，皮下注射高于肌肉注射途径；在不同动物中有一致免疫应答趋势，在奶牛体内免疫保护率80％以上。将制备的不同佐剂的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗分别免疫豚鼠、小鼠、狗和奶牛动物，观察溶血反应、过敏性反应、毒性反应。结果表明：奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗制品接种动物是安全的。将制备的灭活疫苗分别免疫小鼠和奶牛，间断采集奶汁、血清、血细胞及脾细胞，观察记录奶牛产奶量与质量、体细胞计数、排细菌计数、临床评分及ELISA测定抗体效价、细胞免疫水平，并在末次免疫后进行攻毒，评价攻毒保护效果。结果表明，这几种佐剂均能产生较高的抗体效价及保护率、免疫效果依次是白油≈SP01＞铝盐，且在不同动物呈现一致性趋势。

综上所述，本发明制备的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗免疫实验动物和靶动物均具有良好的安全性，并可以有效预防5、8、336型金黄色葡萄球菌感染实验动物和靶动物。对防控奶牛乳房炎的流行和传播具有重要的实际意义，应用前景广阔。

附图说明

图1为pET22b-SEB质粒双酶切。1～4：pET22b-SEB双酶切产物；M：DNA Marker2000。

图2为pET22b-Hlα质粒双酶切鉴定。1～3：pET-22b-Hlα双酶切产物；M：DNA MarkerDL15000。

保藏说明

菌种名称：金黄色葡萄球菌

拉丁名：Staphylococcus aureus

菌株编号：SACP8

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年6月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15907

菌种名称：金黄色葡萄球菌

拉丁名：Staphylococcus aureus

菌株编号：SACP5

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年6月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15908

菌种名称：金黄色葡萄球菌

拉丁名：Staphylococcus aureus

菌株编号：SA336

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年6月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15909

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的结果评判期中，只要满足如下(1)、(2)和(3)三项中的一项，则判断为乳房炎发病个体：(1)临床评分不低于2分；临床评分标准：0分：乳房外观和乳汁正常；1分：乳汁中无结块；2分：乳汁中有结块；3分：乳房有炎性反应，硬块，乳汁中有淡黄色组织分泌物；4分：乳房有重度炎性反应，硬块，乳汁中有淡黄色或血性组织分泌物，奶牛存在战栗、出血、厌食精神萎靡等症状。(2)乳汁中体细胞数高于30万个/mL。(3)乳汁中有金黄色葡萄球菌检出。

下述实施例中的BHI琼脂平板的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：蛋白胨10.0g/L、牛脑浸粉12.5g/L、牛心浸粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、琼脂15.0g/L。pH为7.4±0.1。

下述实施例中的新鲜脱纤维绵羊血平板的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：胰蛋白胨15.0g/L、大豆蛋白胨5.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L、新鲜脱纤维绵羊血100mL/L。pH为7.3±0.1。

下述实施例中的麦康凯琼脂培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：蛋白胨20.0g/L、乳糖10.0g/L、牛胆盐5.0g/L、氯化钠5.0g/L、中性红0.075g/L、琼脂12.0g/L。pH为7.1±0.2。

实施例1：灭活菌体疫苗株及检验用菌株的筛选及保藏

一、金黄色葡萄球菌感染奶牛乳房炎流行优势菌株的筛选并确定

从覆盖我国东西南北中的内蒙古、重庆、广东、黑龙江、甘肃、河北、山东、新疆等30个省市地90个中大型奶牛场采集近3万份临床奶牛乳房炎奶汁样品，分离检定，筛选并确定奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌优势流行菌株。具体步骤如下：

1、奶牛乳样的采集

选取出现乳房炎临床症状(或者怀疑为亚临床型乳房炎)奶牛，先用温水，再用0.2％新洁尔灭擦洗乳房，最后用70％的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头2～3把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样至少5mL于无菌乳样杯中，待检。

2、菌落形态和生理生化鉴定

将乳样混合摇匀，分别取适量接种于BHI琼脂平板、新鲜脱纤维绵羊血平板、麦康凯琼脂平板后，置于37℃温箱培养24～48h。观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长状况。

BHI琼脂平板上，37℃培养24～72h后，可见到湿润、光滑、隆起的圆形金黄色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、镜检呈葡萄状排列，革兰氏染色阳性，并挑取单个可疑菌落移植于营养肉汤和斜面培养基，37℃培养24～48h后，营养肉汤中呈浑浊生长，管底有少量灰白色沉淀。新鲜脱纤维绵羊血平板中菌落较大，呈乳白色、圆形，周围出现明显的β-溶血。麦康凯琼脂平板上不生长。金黄色葡萄球菌生化鉴定，可分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，产酸不产气。甲基红反应阳性。接触酶反应阳性。凝固酶反应阳性。耐热核酸酶反应阳性。

3、基因鉴定

提取生化鉴定好的金黄色葡萄球菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR检验。引物序列如下：

16S rRNA P1：5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′；

16S rRNA P2：5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′；

23S rRNA P1：5′-ACGGAGTTACAAAGGACGAC-3′；

23S rRNA P2：5′-AGCTCAGCCTTAACGAGTAC-3′。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45秒、56℃退火45秒、72℃延伸50秒，共25个循环，72℃终延伸7min，4℃终止。PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳。同时扩增出450bp及1250bp的目的条带的样品为金黄色葡萄球菌。

4、血清型鉴定

将鉴定好的金黄色葡萄球菌用5、8、336型阳性血清进行玻片凝集试验。结果显示，分离、筛选的5、8、336型金黄色葡萄球菌与同型免疫血清出现特异性凝集反应阳性。

5、SDS分析菌体蛋白组分

将分离的5、8和336型金黄色葡萄球菌株进行SDS-PAGE，可见呈26-30余条大小不等蛋白条带，进一步免疫印迹符合奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌各血清型蛋白条带特征。

以上通过选择性培养基分离与筛选、生化鉴定、基因鉴定和血清学鉴定，确定了我国流行金黄色葡萄球菌血清型为5、8和336三个血清型，占分离奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的96％，为候选奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌优势疫苗株提供了依据。

二、灭活菌体疫苗株及检验用菌株的筛选确定

1、毒力分析

将步骤一分离的5、8和336型金黄色葡萄球菌菌株分别在TSB培养基培养，培养物用PBS稀释成不同浓度，分别尾静脉注射18～22g Balb/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，乳导管注射2～6岁健康奶牛，测定对小鼠的最小致死剂量(MLD)。

对小鼠的最小致死剂量结果见表1，由表1结果可见，5型菌株GS02和CQ170菌株对小鼠致病性强于其他3株菌株；8型菌株NM11菌株致病性最强，LZ145菌株毒力略低于NM11菌株，但强于其它三株；336型菌株XJ44与NM210菌株毒力相当，对小鼠致病性强于其他3株菌株；对小鼠的最小致死量：GS02菌株为4×10⁸CFU；CQ170菌株为4×10⁸CFU；NM11菌株为2×10⁸CFU；LZ145菌株为3×10⁸CFU；XJ44菌株与NM210菌株均为2×10⁸CFU。因此，选择5型金黄色葡萄球菌(GS02、CQ170)、8型金黄色葡萄球菌(NM11、LZ145)、336型金黄色葡萄球菌(XJ44、NM210)菌株作为生产及检验用菌的候选株。

表1.临床分离5型、8型、336型金黄色葡萄球菌株对小鼠致病性结果

采用乳房内注射菌液的方法检测5型金黄色葡萄球菌株(GS02株、CQ170株)、8型金黄色葡萄球菌株(NM11株、LZ145株)、336型金黄色葡萄球菌株(XJ44株、NM210株)对奶牛(荷斯坦奶牛，购自内蒙古呼和浩特市赛罕区颜军养殖场)的最小感染量(MID)。

对奶牛的最小感染量结果见表2，由表2中结果显示，GS02菌株MID为6×10²个菌、CQ170菌株MID为8×10²个菌；NM11菌株MID为4×10²个菌、LZ145菌株MID为6×10²个菌；XJ44菌株MID为4×10²个菌、NM210菌株MID为6×10²个菌。由此可见GS02菌株对奶牛的毒力强于CQ170菌株，NM11菌株对奶牛的毒力强于LZ145菌株，XJ44菌株对奶牛的毒力强于NM210菌株。

表2.临床分离5型、8型、336型金黄色葡萄球菌株对奶牛致病性结果

2、免疫原性分析

从确定具有代表性5、8和336型金黄色葡萄球菌流行优势株中筛选毒力最强的两株进行免疫原性鉴定。具体步骤如下：分别制备5型金黄色葡萄球菌株(GS02株、CQ170株)、8型金黄色葡萄球菌株(NM11株、LZ145株)和336型金黄色葡萄球菌株(XJ44株、NM210株)抗原原液(此处制备方法与实施例4步骤一的灭活菌体抗原原液的制备方法相同)，与等体积SP01佐剂乳化制成1×10⁹个/ml的灭活疫苗，分别皮下注射免疫健康易感奶牛，三免后14日，静脉采血，间接ELISA分别检测金黄色葡萄球菌株的抗体效价。并用5型GS02菌株(6×10²CFU/头)、8型NM11菌株(4×10²CFU/头)、336型XJ44菌株(4×10²CFU/头)进行攻毒，攻毒后连续观察21日，记录奶牛发病情况。

结果显示，5型CQ170菌株产生的抗体效价及对奶牛的免疫保护率均高于GS02菌株；8型LZ145菌株产生的抗体效价及对奶牛的免疫保护率均高于NM11菌株；336型NM210菌株产生的抗体效价及对奶牛的免疫保护率均高于XJ44菌株。由此选择5型CQ170菌株、8型LZ145菌株、336型NM210菌株作为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗疫苗株，分别命名为SACP5株、SACP8株和SA336株。将毒力较强的5型GS02菌株、8型NM11菌株、336型XJ44菌株作为检验用菌株。

三、灭活菌体疫苗株的保藏

SACP8菌株为金黄色葡萄球菌，其分类命名为金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus，该菌株已于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15907。

SACP5菌株为金黄色葡萄球菌，其分类命名为金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus，该菌株已于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15908。

SA336菌株为金黄色葡萄球菌，其分类命名为金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus，该菌株已于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15909。

实施例2：重组SEB蛋白大肠杆菌BL21株的构建

1、SEB序列的优化

将金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因序列进行优化，优化后的SEB基因序列如序列表中序列1所示，编码的SEB蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。具体步骤如下：依据GenBank(AB479118.1)及已报道定点突变人用疫苗SEB基因序列，获得其空间三维结构模型突变SEB与MHCII分子结合残端的两个氨基酸和TCRβ链上的一个氨基酸，达到降低SEB毒力，其蛋白抗原保守性、免疫原性及抗原中和表位特征得以保留。分别对第46、90和95位SEB疏水结合区、极性结合区和二硫化物区的3个位点进行点突变。应用vector NTI advance11软件对定点突变的SEB基因序列碱基密码子优化为大肠埃希菌偏爱密码子，长度为723bp。由上海生工生物工程有限公司合成。

2、重组载体的构建

将序列1所示的DNA分子插入pET-22b(+)质粒(购自novagen公司，货号：69744-3)的NdeI和Hlαnd III酶切位点中，得到pET-22b-SEB表达载体。

3、重组载体的双酶切鉴定

以pET-22b-SEB表达载体为模板进行双酶切鉴定；内切酶为NdeI和Hlαnd III；酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，在723bp处出现单一条带，与预期SEB目的片段大小一致。

4、质粒的转化

取重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与合成序列进行比对分析。将测序正确的质粒加入200μL BL21感受态(购自北京全式金生物技术有限公司，货号：CD601)中，冰浴30min；42℃、90s，冰浴2min；加入500μL无抗LB液体培养基，37℃，120r/min振荡1h；取全部菌液涂平板(Amp⁺，100μg/mL)，37℃倒置培养12h，得到重组菌BL21/SEB。

实施例3：重组Hlα蛋白大肠杆菌BL21株的构建

1、Hlα序列的优化

将金黄色葡萄球菌ɑ溶血素(Hlα)基因序列进行优化，优化后的Hlα基因序列如序列表中序列3所示，编码的Hlα蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。具体步骤如下：依据GenBank(X55185.1)及已发表的文献设计Hlα基因序列，首先鉴于Hlα具有极强的毒性，因此在其活性位点H35进行突变，用亮氨酸Leu代替组氨酸His。同时为提高可溶性Hlα蛋白的表达量，应用vector NTI advance 11软件对Hlα基因序列碱基密码子优化为大肠埃希菌偏爱密码子，长度为885bp。优化的Hlα碱基序列由苏州金维智生物科技有限公司进行合成。

2、重组载体的构建

将序列3所示的DNA分子插入pET-22b(+)质粒的NdeI和Hlαnd III酶切位点中，得到pET-22b-Hlα表达载体。

3、重组载体的双酶切鉴定

以pET-22b-Hlα表达载体为模板，进行双酶切鉴定，内切酶为Nde I和BamH I。酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示，在885bp处出现单一条带，与预期Hlα目的片段大小一致。

4、质粒的转化

取重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与合成序列进行比对分析。将测序正确的质粒加入200μL BL21感受态中，冰浴30min；42℃热休克90s，冰浴2min；加入500μL无抗LB液体培养基，37℃，摇床120r/min培养1h；取全部菌液涂平板(Amp⁺，100μg/mL)，37℃倒置培养12h，得到重组菌BL21/Hlα。

实施例4：奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗的制备

一、SACP5株、SACP8株、SA336株灭活菌体抗原原液的规模化制备及检定

1、菌液发酵培养

按发酵罐容积的50-60％加入TSB培养基，121℃高压灭菌。待温度降至37～38℃时，将SACP5株、SACP8株、SA336株生产种子分别按培养基总量的2％接种于TSB培养基中进行发酵培养。发酵条件为：温度37℃，初始转速200rpm/min，罐压保持在0.05MPa(SA336株发酵罐压为0.03MPa)，10％氨水自动调节pH值为7.0，调节转速和通气量。随着菌体生长，溶氧量不断下降，通过调整转速和通气量调节溶氧量。溶氧或pH值出现上升趋势时进行补料，培养10h后停止培养，得到发酵液。

SACP5株、SACP8株、SA336株生产种子的制备方法如下：

(1)一级种子制备：取SACP5株/SACP8株/SA336株工作种子菌种(冻干菌用0.5mlTSB培养基溶解)，划线接种TSA培养基，37℃培养16h，挑选5个以上的典型菌落，划线接种TSA培养基，37℃培养16h，作为一级种子。在2～8℃保存，应不超过7日。在培养基上继代不超过5代。

(2)二级种子制备：用TSB培养基洗下TSA培养基上的一级种子菌落，接种于TSB培养基，37℃培养16h，取样经纯粹检验合格后作为二级种子，在2～8℃保存，应不超过7日。

2、发酵液灭活

按发酵液体积的0.6％加入40％(体积分数)的甲醛溶液进行灭活，37℃灭活96小时，得到灭活后的发酵液。

3、发酵液浓缩

将灭活后的发酵液6000r/min离心20min。收集菌体，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)悬浮，悬浮后体积不高于原体积的1/10，得到抗原原液，置2～8℃保存备用，保存期不超过6个月。

4、抗原原液无菌检验

将制备的抗原原液接种两支TG小管和TSA斜面，分别置于37℃和25℃培养7天，观察有无细菌生长。结果显示制备的SACP5株、SACP8株、SA336株灭活菌抗原原液均无菌生长。

5、抗原原液抗原含量检测

采用比浊计数法测定抗原原液细菌含量，每毫升抗原原液中所含的细菌数应不低于2.0×10¹¹个。

二、重组蛋白抗原原液的制备及检定

1、菌液发酵培养

按发酵罐容积的50-60％加入TB培养基，121℃高压灭菌。待温度降至37-38℃时，按终浓度为100μg/mL加入氨苄青霉素，搅拌均匀。将重组菌BL21/SEB、重组菌BL21/Hlα生产种子分别按培养基总量的8％接种于TB培养基中进行发酵培养。发酵条件为：温度37℃，初始转速为200r/min，罐压保持在0.05MPa，10％氨水自动调节pH值为7.2，调节转速和通气量保证溶氧量为25％。培养4h后即对数生长期时开始IPTG诱导。重组菌BL21/SEB和重组菌BL21/HlαIPTG的诱导浓度分别为1.0mM和0.4mM。pH值为7.2，发酵过程中pH值开始出现上升趋势时，流加补料培养基进行补料，诱导培养6h后停止培养，得到发酵液。

重组菌BL21/SEB、重组菌BL21/Hlα生产种子的制备方法如下：

(1)取重组菌BL21/SEB、重组菌BL21/Hlα株工作种子菌种(冻干菌用0.5ml LB(Amp⁺100μg/ml)培养基溶解)，划线接种LB(Amp⁺100μg/ml)培养基，37℃培养16h，挑选5个以上的典型菌落，划线接种LB(Amp⁺100μg/ml)培养基，37℃培养16h，作为一级种子。在2～8℃保存，应不超过7日。在培养基上继代不超过5代。

(2)二级种子制备与鉴定：用LB(Amp⁺100μg/ml)培养基洗下LB(Amp⁺100μg/ml)固体培养基上的一级种子菌落，接种于LB(Amp⁺100μg/ml)培养基，37℃培养16h，取样经纯粹检验合格后作为二级种子，在2～8℃保存，应不超过7日。

2、发酵液浓缩与破碎

将发酵液6000r/min，4℃离心20min，收集菌体，称重菌体，按1g菌体加入20mL裂解液重悬。用高压匀质机以700bar压力破碎菌体4次，10000r/min，4℃离心20min，收集上清液，经0.65μm滤器过滤。

3、过柱纯化

取过滤后的上清液上SP Sepharose FF离子交换凝胶层析柱纯化，得到纯化后的蛋白液。纯化的具体步骤如下：将介质装入50/60的层析柱，3倍柱床体积1M NaOH清洗层析柱，用3倍柱体积的阳离子洗脱液进行清洗，接着再用3倍柱体积的阳离子平衡液平衡层析柱至流出液的pH、电导与平衡缓冲液相同。取过滤后的上清液14000mL上样，流速400cm/h。待样品充分吸附后，平衡液洗脱介质上未结合蛋白，用0.3mM NaCl、50mM乙酸钠(重组SEB蛋白纯化洗脱液pH 5.5，重组Hlɑ蛋白纯化洗脱液pH 5.0)进行洗脱，流速400cm/h，收集紫外监测蛋白峰。

4、残留细菌灭活

向纯化后的蛋白液中加入甲醛溶液，使甲醛的终浓度为0.1％(体积分数)，25℃灭活24h，即为重组蛋白抗原原液，置于-20℃保存，保存期不超过6个月。

5、抗原原液无菌检验

将制备的抗原原液接种两支TG小管和LB斜面，分别置于37℃和35℃培养7天，观察有无细菌生长。结果显示制备的重组SEB蛋白、重组Hlɑ蛋白抗原原液均无菌生长。

6、抗原原液蛋白含量检测

采用BCA测定法测定蛋白含量。

7、抗原原液免疫原性检测

将重组SEB蛋白抗原原液、重组Hlɑ蛋白抗原原液分别用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)稀释至200μg/mL，与等量SP01佐剂混合乳化后免疫16～18g小鼠10只。免疫组小鼠各皮下注射疫苗0.25mL，对照组10只小鼠各皮下注射PBS(0.01mol/L，pH值7.2)0.25mL。间隔14日，再以同剂量同途径注射2次，三免后14日，静脉采血，分离血清，间接ELISA检测血清中SEB、Hlɑ抗体效价，结果显示免疫组各小鼠抗体效价均≥1:6400，对照组各小鼠抗体效价均≤1:100。

三、灭活疫苗的配制

1、疫苗抗原混合原液的配制

将SACP5株灭活菌体抗原原液、SACP8株灭活菌体抗原原液、SA336株灭活菌体抗原原液分别用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)稀释至1×10¹⁰个菌/mL。将重组SEB蛋白抗原原液、重组Hlα蛋白抗原原液分别用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)稀释至2mg/mL。将稀释后的抗原原液标记为制苗抗原液。

取1份SACP5灭活菌体制苗抗原液、1份SACP8灭活菌体制苗抗原液、1份SA336灭活菌体制苗抗原液、1份重组SEB蛋白制苗抗原液、1份重组Hlα蛋白制苗抗原液和5份PBS混合后制备成奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗全抗原混合液，2～8℃放置保存备用。

2、与佐剂混合乳化

将奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗抗原混合液分别与白油佐剂、SP01佐剂、氢氧化铝佐剂按体积比为1:1比例混合乳化，制备成不同佐剂的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗，适量分装，2～8℃保存。

白油佐剂：购自法国Esso公司，货号为122735。

氢氧化铝佐剂：购自北京来福赛思科技有限公司，货号为2013120070602。

SP01佐剂的制备方法如下：

初乳制备：用PBS(0.01M，pH值7.2)按重量与体积比配制5％角鲨烯(购于SIGMA公司，货号为442785)、2.5％聚氧乙烯蓖麻油(购于SIGMA公司，货号为C5135，密度1.05g/ml，粘度850cP)和2.5％聚醚(购于SIGMA公司，货号为435449，密度1.05g/ml，粘度850cP)的原料，将原料用高速分散机混匀3min以上，速度为6000rpm以上，当油状原料均匀分散后，再加入4倍体积缓冲液混匀，转速6000rpm或以上，时间3min或以上，当油状原料均匀分散后，初乳制备完毕，用纳米粒径仪检测其粒径及均一度，平均粒径约为2000～3000nm，该初乳静置后分层。

半成品制备：取制备的初乳，用高压均质机在5000-8000psi压力条件下均质5-8个循环，测量其平均粒径约为250nm。用高压均质机在10000-15000psi压力条件下再次均质5-8个循环，从第6次开始用纳米粒径仪检测其粒径，当平均粒径在145～155nm区间，粒径均一度大于95％时，停止均质。

成品制备：取制备成品，用0.22um高压滤膜过滤除菌。分装，2-8℃保存。

以上注射疫苗剂型可为皮下注射剂型、肌肉注射剂型、无针透皮注射剂型或乳导管注射剂型。

实施例5：奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗的评价

一、安全性试验

1、溶血性试验

选取体重为350g左右的豚鼠(军事医学科学院实验动物中心)，采集新鲜豚鼠血1mL，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释灭活疫苗(由实施例4制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检疫苗中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，制备的灭活疫苗无溶血反应。

2、毒性试验

1)体重为12-18g Balb/C小鼠体内的毒性实验

取实施例4制备的灭活疫苗腹腔注射体重为12-18g Balb/C小鼠，每只注射剂量为0.5mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗在试验的浓度下对小鼠是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。

2)在体重为8～10kg的Beagle狗体内的毒性实验

取实施例4制备的灭活疫苗肌肉注射体重为8～10kg的Beagle狗(军事医学科学院实验动物中心)，每只注射剂量为15mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗无急性毒性反应，使用是安全的。

3)2～6岁健康易感奶牛体内的毒性实验

取实施例4制备的灭活疫苗双侧颈部皮下注射免疫2～6岁健康易感奶牛(荷斯坦奶牛，购自土默特左旗与芳牧场)，每头注射剂量为10mL，每组5头，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察注射部位、全身状态。结果可见，奶牛精神状态良好，无明显局部或全身不良反应。因此，奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗无急性毒性反应，使用是安全的。

3、过敏试验

取实施例4制备的灭活疫苗皮下接种体重为250-350g Hartley豚鼠，每个样品腹腔注射接种豚鼠5只，每只接种0.5mL，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，腹腔注射给予相同灭活疫苗1mL，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，灭活疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗在动物体内无过敏反应。

二、本发明的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗对动物的免疫效力评价

1、对小鼠的免疫效力评价

1)效价检测

将本发明实施例4制备的灭活疫苗分别以皮下注射、肌肉注射两种途径免疫16-18g Balb/c小鼠，每只小鼠免疫0.25mL，间隔14日以同等剂量及途径加强免疫两次，三免后14日，静脉采血，分离血清，ELISA法测定血清中IgG抗体效价均≥1:6400，采用ELISPOT仪测定免疫细胞中重要细胞因子、炎性分子、趋化因子等动态变化，结果显示TH2/Th1应答平衡。说明制备的灭活疫苗均能产生满意的双重免疫应答，而阴性照组没有产生双重免疫应答；制备的奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活疫苗不管是皮下注射还是肌肉注射均能产生良好的双重免疫应答，且皮下注射血清抗体效价高于肌肉注射。

2)攻毒

将三免后14日的各组小鼠，分别尾静脉注射GS02菌株菌液0.1mL(含4×10⁸CFU)、NM11菌株菌液0.1mL(含2×10⁸CFU)、XJ44菌株菌液0.1mL(含2×10⁸CFU)进行攻毒，每株攻毒株每个疫苗组注射10只小鼠，攻毒后连续观察14日，SP01佐剂和白油佐剂组小鼠均达到80％以上的保护率，氢氧化铝佐剂疫苗组小鼠保护率略低，约保护60％。

2、对奶牛的免疫效力评价

1)效价检测

将本发明实施例4制备的灭活疫苗分别皮下注射免疫健康易感奶牛(荷斯坦奶牛，购自土默特左旗与芳牧场)，每头奶牛免疫5.0mL，间隔28日以同等剂量及途径加强免疫两次，三免后14日，静脉采血，分离血清，采集乳汁，ELISA法测定血清中和乳汁中IgG、IgA抗体效价。结果显示，血清中IgG、IgA抗体效价均≥1:3200；乳汁中IgG、IgA抗体效价均≥1:800。不同佐剂的灭活疫苗产生的效价依次是SP01佐剂疫苗≈白油佐剂疫苗＞氢氧化铝佐剂疫苗。

2)攻毒

将三免后14日的各组奶牛，分别通过乳导管注射GS02菌株菌液1mL(含6×10²CFU)、NM11菌株菌液1mL(含4×10²CFU)、XJ44菌株菌液1mL(含4×10²CFU)进行攻毒，每株攻毒株每个疫苗组注射5头奶牛，攻毒后连续观察21日，记录奶牛产奶量、临床评分、乳样中体细胞数及细菌检出数。

结果显示：攻毒后，SP01灭活疫苗免疫组15头奶牛中有13头奶牛未出现奶牛乳房炎症状，产奶量、乳汁中体细胞数、临床评分与攻毒前无差异，均在正常范围内，且乳汁中无金黄色葡萄球菌检出。另2头奶牛体细胞数明显升高，乳房红肿，乳汁中有金黄色葡萄球菌检出，表现出发病症状。白油佐剂免疫组15头奶牛中12头未出现奶牛乳房炎症状，其余3头表现出发病症状。铝盐佐剂免疫组保护9头不发病。由此说明，各佐剂灭活疫苗均能对奶牛产生有效的免疫保护效果。

以上结果说明，不同佐剂的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗能诱导试验动物小鼠和靶动物奶牛产生有效的抗体效价和免疫保护效果，其中以SP01佐剂的免疫保护效果最佳。

三、本发明灭活疫苗在奶牛体内的长效免疫保护评价

将本发明实施例4制备的SP01佐剂奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗颈部皮下注射2-3岁即将进入泌乳期(即产前25d，怀孕8个月20d)健康易感奶牛(荷斯坦奶牛，购自土默特左旗与芳牧场)20头，免疫程序是0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)，第二年后加强免疫1次，每次每头免疫5mL，观察1083天，其间每隔3个月取血、奶汁，测定血清及奶汁中IgG、IgA抗体效价，记录奶牛产奶量。试验结果显示，SP01佐剂奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗具有长效免疫应答和免疫保护，第一年免疫3次后，以后每年加强免疫一次，产奶量高于未免疫奶牛，血清和乳汁中IgG抗体效价可维持在较高水平。

序列表

<110>内蒙古华希生物科技有限公司

<120>一种奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗及其制备方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>723

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggaaagcc agccggatcc gaaaccggat gaactgcata agagcagcaa atttaccggc 60

ctgatggaaa acatgaaagt gctgtatgat gataaccatg tgagcgccat taacgtgaaa 120

agcattgatc agtttcgcta ttttgatctg atttatagca ttaaagatac caaactgggc 180

aactatgata acgtgcgcgt ggaattcaag aacaaagatc tggccgataa gtataaagat 240

aaatatgtgg atgtgtttgg cgccaacgcc tattatcagt gcgcctttag caagaaaacc 300

aacgatatta acagccatca gaccgataaa cgcaaaacct gcatgtatgg cggcgtgacc 360

gaacataacg gcaaccagct ggataaatat cgcagcatta ccgtgcgcgt gtttgaagat 420

ggcaagaacc tgctgagctt tgatgtgcag accaacaaga agaaagtgac cgcccaggaa 480

ctggattatc tgacccgcca ttatctggtg aagaacaaga aactgtatga atttaacaac 540

agcccgtatg aaaccggcta tatcaaattc attgaaaacg aaaacagctt ttggtatgat 600

atgatgccgg caccgggcga taagtttgat cagagcaaat atctgatgat gtataacgat 660

aacaaaatgg tggatagcaa agatgtgaag attgaagtgt atctgaccac caagaagaaa 720

taa 723

<210>2

<211>240

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser

1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn

20 25 30

His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Arg Tyr Phe

35 40 45

Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn

50 55 60

Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp

65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gln Cys Ala Phe

85 90 95

Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu Asp

115 120 125

Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu

130 135 140

Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu

145 150 155 160

Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr

165 170 175

Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu

180 185 190

Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys

195 200 205

Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val

210 215 220

Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys

225 230 235 240

<210>3

<211>885

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

atggcagatt ctgatattaa tattaaaacc ggtactacag atataggaag caatactaca 60

gtaaaaacag gtgatttagt cacttatgat aaagaaaatg gcatgctgaa aaaagtattt 120

tatagtttta tcgatgataa aaatcacaat aaaaaaatat tagtcatcag aacgaaaggt 180

accattgctg gtcagtatag agtttatagc gaagaaggcg ctaataaaag cggtttagcc 240

tggccttcag catttaaggt acagttgcaa ctacctgata atgaagtagc acaaatttct 300

gattactacc ctagaaattc aattgatact aaagaatata tgagtacatt aacttatgga 360

ttcaacggta acgtgactgg tgatgattct ggaaaaattg gcggtttgat tggtgcaaat 420

gtttcaattg gtcatacact caaatatgtt caaccagatt tcaaaacaat tttagaaagt 480

ccaactgata aaaaagtagg ttggaaagtt atatttaaca atatggtgaa tcaaaattgg 540

ggaccatatg acagagattc ttggaaccca gtatatggca atcaactttt catgaaaaca 600

agaaacggtt caatgaaagc agcagagaac ttccttgacc ctaacaaagc aagttcttta 660

ttatcttcag gattctcacc agactttgct acagttatta ctatggatag gaaagcaacc 720

aaacaacaaa caaatataga tgtaatatac gaacgagttc gtgatgacta tcaactacat 780

tggacttcaa caaattggaa aggtaccaat actaaagata aatggacaga tcgttcttca 840

gaaagatata aaatcgattg ggaaaaagaa gaaatgacaa attaa 885

<210>4

<211>294

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

Met Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly

1 5 10 15

Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu

20 25 30

Asn Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn

35 40 45

His Asn Lys Lys Ile Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly

50 55 60

Gln Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala

65 70 75 80

Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val

85 90 95

Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu

100 105 110

Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp

115 120 125

Asp Ser Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly

130 135 140

His Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser

145 150 155 160

Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val

165 170 175

Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr

180 185 190

Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala

195 200 205

Glu Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly

210 215 220

Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Thr

225 230 235 240

Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp

245 250 255

Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys

260 265 270

Asp Lys Trp Thr Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu

275 280 285

Lys Glu Glu Met Thr Asn

290

Claims (10)

1.5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用；

或，5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌肠毒素B和金黄色葡萄球菌ɑ溶血素在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用。

2.一种奶牛乳房炎疫苗，其活性成分为灭活的5型金黄色葡萄球菌、灭活的8型金黄色葡萄球菌、灭活的336型金黄色葡萄球菌、灭活的金黄色葡萄球菌肠毒素B和灭活的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述灭活的5型金黄色葡萄球菌、所述灭活的8型金黄色葡萄球菌、所述灭活的336型金黄色葡萄球菌、所述灭活的金黄色葡萄球菌肠毒素B和所述灭活的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的配比为(10⁸-10¹⁰)个菌：(10⁸-10¹⁰)个菌：(10⁸-10¹⁰)个菌：(60-200)μg：100μg；

或，所述疫苗还包括佐剂；

或，所述佐剂为SP01佐剂、白油佐剂或铝盐佐剂。

4.根据权利要求1所述的应用或权利要求2或3所述的疫苗，其特征在于：

所述5型金黄色葡萄球菌为5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株；所述5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15908；

或，所述8型金黄色葡萄球菌为8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株；所述8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15907；

或，所述336型金黄色葡萄球菌为336型金黄色葡萄球菌SA336菌株；所述336型金黄色葡萄球菌SA336菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15909；

或，所述金黄色葡萄球菌肠毒素B为重组金黄色葡萄球菌肠毒素B；所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

或，所述金黄色葡萄球菌ɑ溶血素为重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素；所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素为如下e)或f)或g)或h)的蛋白质：

e)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

f)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

g)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

h)与序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

5.权利要求2-4任一所述的疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)5型金黄色葡萄球菌抗原原液、8型金黄色葡萄球菌抗原原液和336型金黄色葡萄球菌抗原原液的制备

1-1)分别将5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌进行发酵培养，分别得到5型金黄色葡萄球菌发酵液、8型金黄色葡萄球菌发酵液和336型金黄色葡萄球菌发酵液；

1-2)分别将所述5型金黄色葡萄球菌发酵液、所述8型金黄色葡萄球菌发酵液和所述336型金黄色葡萄球菌发酵液进行甲醛灭活，分别得到灭活的5型金黄色葡萄球菌发酵液、灭活的8型金黄色葡萄球菌发酵液和灭活的336型金黄色葡萄球菌发酵液；

1-3)分别将所述灭活的5型金黄色葡萄球菌发酵液、所述灭活的8型金黄色葡萄球菌发酵液和所述灭活的336型金黄色葡萄球菌发酵液进行离心，收集菌体沉淀，并用PBS溶液重悬所述菌体沉淀，分别得到5型金黄色葡萄球菌抗原原液、8型金黄色葡萄球菌抗原原液和336型金黄色葡萄球菌抗原原液；

2)重组金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原原液和重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素抗原原液的制备

2-1)分别将表达金黄色葡萄球菌肠毒素B的重组菌和表达金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的重组菌进行发酵培养和诱导表达，分别得到金黄色葡萄球菌肠毒素B重组菌发酵液和金黄色葡萄球菌ɑ溶血素重组菌发酵液；

2-2)分别将所述金黄色葡萄球菌肠毒素B重组菌发酵液和所述金黄色葡萄球菌ɑ溶血素重组菌发酵液进行离心，收集菌体沉淀；然后将所述菌体沉淀重悬于裂解液中依次进行高压均质破碎和离心，收集上清液；再将所述上清液进行纯化，分别得到纯化后的重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白溶液和纯化后的重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素蛋白溶液；

2-3)分别将所述纯化后的重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白溶液和所述纯化后的重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素蛋白溶液进行甲醛灭活，分别得到重组金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原原液和重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素抗原原液；

3)疫苗的制备

将所述5型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述8型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述336型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原原液和所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素抗原原液与PBS溶液混匀，得到混合液；所述混合液与佐剂混合乳化后，即为所述疫苗。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述表达金黄色葡萄球菌肠毒素B的重组菌是将重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因导入宿主菌中得到的；

或，所述表达金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的重组菌是将重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因导入宿主菌中得到的；

或，所述5型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述8型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述336型金黄色葡萄球菌抗原原液、所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B抗原原液、所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素抗原原液与所述PBS溶液的体积比为1:1:1:1:1:5。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

所述5型金黄色葡萄球菌为5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株；所述5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15908；

或，所述8型金黄色葡萄球菌为8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株；所述8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15907；

或，所述336型金黄色葡萄球菌为336型金黄色葡萄球菌SA336菌株；所述336型金黄色葡萄球菌SA336菌株为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CGMCC No.15909；

或，所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

或，所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素为如下e)或f)或g)或h)的蛋白质：

e)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

f)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

g)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

h)与序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

或，所述SACP5菌株、所述SACP8菌株和所述SA336菌株在所述疫苗中的浓度均为10⁸-10¹⁰个菌/mL；

或，所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B和所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素在所述疫苗中的浓度均为60-200μg/mL；

或，所述佐剂为SP01佐剂、白油佐剂或铝盐佐剂。

8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：

所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因为序列1所示的DNA分子；

或，所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因为序列3所示的DNA分子；

或，所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因通过含有所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因的重组载体导入宿主菌中；

或，所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因通过含有所述重组金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因的重组载体导入宿主菌中；

或，所述宿主菌为大肠杆菌。

9.如下A)-G)任一所述的生物材料：

A)权利要求4中所述的5型金黄色葡萄球菌SACP5菌株；

B)权利要求4中所述的8型金黄色葡萄球菌SACP8菌株；

C)权利要求4中所述的336型金黄色葡萄球菌SA366菌株；

D)序列1所示的金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因；

E)序列3所示的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因；

F)含有序列1所示的金黄色葡萄球菌肠毒素B的编码基因的表达盒、重组载体和重组菌；

G)含有序列3所示的金黄色葡萄球菌ɑ溶血素的编码基因的表达盒、重组载体和重组菌。

10.权利要求9所述的生物材料在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用；

或，权利要求2-4任一所述的疫苗或权利要求5-8任一所述的方法或权利要求9所述的生物材料在预防奶牛乳房炎中的应用；

或，权利要求2-4任一所述的疫苗或权利要求5-8任一所述的方法或权利要求9所述的生物材料在制备预防奶牛乳房炎的产品中的应用。