CN112724222B - 一种鱼源抗菌肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鱼源抗菌肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明所提供的抗菌肽用于制备抗菌、抑菌制品，其中一种制品是在水凝胶上负载本发明的抗菌肽制得的水凝胶敷料。本发明所提供的抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌、真菌、临床耐药菌、超级细菌都具有很好的抗菌效果，细胞实验和溶血实验结果表明所筛选的抗菌肽具有生物安全性。

Description

一种鱼源抗菌肽
技术领域
本发明属于功能多肽筛选技术，具体涉及一种鱼源抗菌肽。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)，有时也被成为宿主防御肽(Hostdefense peptides,HDPs)，因为它们通常在抵御病原体的第一线，因此也被认为是先天免疫系统必不可少的组成部分。各种各样的生物体中都报道分离出抗菌肽，这些抗菌肽有着不相同的序列组成以及物理、化学方面的结构和性质。
抗菌肽通常是由较短的氨基酸序列组成的，一般少于100个氨基酸残基，其中有很大一部分是带正电荷的氨基酸残基。通常人们认为抗菌肽的抗菌机理是通过改变细胞膜的通透性，比如形成离散的孔道或者破坏细胞膜双分子层，导致细胞内物质的流出，进而导致细胞死亡。然而，也有相关研究揭示改变细胞膜的通透性不是抗菌肽唯一的杀菌作用机理。许多研究表明，抗菌肽转运到细胞内部可以抑制核酸、蛋白质以及细胞壁组分的合成。此外，抗菌肽也能够抑制一些必要的酶的活性。
抗菌肽在自然界中广泛存在，通常对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、霉菌等具有广谱的活性；且对包膜病毒、体内外的寄生虫甚至是癌细胞都可产生杀灭作用。
水中存在成千上万种病原体(细菌和病毒)，鱼类胚胎在水中(体外)发育时，其胚胎免疫系统还没有获得发育，且无法像哺乳类胚胎在母体内发育那样受到母体免疫系统的保护。因此，鱼类胚胎如何在恶劣条件下生存发育，是一个具有巨大潜在应用价值的研究方向，而从鱼类中寻找新的抗菌肽也成为研究的热点之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种鱼源抗菌肽，所提供的抗菌肽具有良好的抗菌、抑菌效果。
本发明所提供的鱼源抗菌肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明所述的抗菌肽是从文昌鱼中筛选的。
本发明所提供的抗菌肽，其第二位、第十位、第十三位和第十四位的氨基为LYS。
本发明所提供的抗菌肽用于制备抗菌、抑菌制品。
所述的制品，其中一种是水凝胶敷料，是在水凝胶上负载本发明的抗菌肽。
所述的水凝胶由醛基化的透明质酸和羧甲基壳聚糖制备。
所述的醛基化的透明质酸由透明质酸溶液加入高碘酸钠溶液，在黑暗条件下反应制备而成。
所述的水凝胶敷料的一种制备方法，是将抗菌肽的水溶液与羧甲基壳聚糖溶液混合，再加入醛基化的透明质酸，在室温下混合凝胶化。
本发明所提供的水凝胶敷料可用于制备辅助治疗开放性伤口的制品。
本发明所述的开放性伤口为慢性难愈合伤口、手术缝合伤口、运动损伤、烧烫伤、运动擦伤等清洁或污染伤口。
本发明所提供的抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌、真菌、临床耐药菌、超级细菌都具有很好的抗菌效果，细胞实验和溶血实验结果表明所筛选的抗菌肽具有生物安全性。
附图说明
图1为水凝胶的冻干照片图；
图2水凝胶可注射性照片图；
图3为水凝胶自愈合图片。
具体实施方式
申请人在之前的研究中筛选了一种文昌鱼来源的抗菌肽AP2S-ORI，但发现抗菌肽AP2S-ORI对具有致病性的耐药菌的抗菌效果不佳。因此，对抗菌肽AP2S-ORI进行改造获得了对耐药菌具有更好抗菌效果的新型抗菌肽AP2S，从而促成了本发明。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：抗菌肽AP2S的抗菌活性
在分析了抗菌肽AP2S-ORI的序列基础上，对AP2S-ORI进行氨基取代改造，对改造的各个突变体使用耐药性的大肠杆菌E.coli577株进行筛选，选取最低抑菌浓度值MIC(μg/mL)的抗菌肽突变体。
最终筛选的抗菌肽AP2S，是将抗菌肽AP2S-ORI第二位的Pro、第十位的Phe、第十三位的Ser和第十四位的Tyr替换为LYS，其氨基酸序列为CKVRRQVLIKGNKKTRQAFIKK(SEQ IDNO:1)。
通过商业公司进行多肽的合成，合成的多肽的纯度为95％以上，可用于各项生物测试。
一、抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S的抗菌效果
使用含TTC(氯化三苯四氮唑)的灭菌的MH肉汤培养基检测抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S的抗菌性，检测的对象包含有大肠杆菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。
将纯化后的抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S通过PBS溶液进行透析后，冷冻干燥成粉，再用预冷的PBS溶解纯化的重组蛋白粉，采用Folin酚法测其浓度后，用PBS溶液调整浓度为1.5mg/mL备用。
将大肠杆菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的种子液分别接种于100ml的LB液体培养基中，培养至OD600为0.5(菌液中菌含量约为1×108CFU/m L)，用LB液体培养基稀释至2×106CFU/m L，再分别吸取50μL稀释菌液至96孔培养板中，每孔加入50μL的抗菌肽溶液，然后在37℃培养24h，每个菌株的阴性对照组各菌液中加入50μL的PBS溶液。
测定各处理组和对照组在OD600的吸光值，计算存活细胞率。结果显示，抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S对大肠杆菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均有很好的抑制效果。
二、抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S对抗生素耐药性菌株的抗菌效果
分别使用抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S对耐药性菌株大肠杆菌E.coli 577株、克雷伯肺炎杆菌K.pneumoniae2182株和鲍氏不动杆菌A.baumannii7225株进行处理，使用最小抑菌浓度(MIC)的检测方法进行检测。
1)分别将E.coli 577株、K.pneumoniae2182株和A.baumannii7225株于10ml液体LB培养基中扩大培养至对数期，然后分别将培养后的菌液稀释成浓度为5×105CFU/mL，依次取50μL加入到96孔板的各孔内准备进行实验。
2)分别将抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S稀释液各取10μl依次加入到96孔板的各个孔中。然后在30℃振荡培养24h后，观察并用酶标仪在600nm处测量OD值并记录实验结果。以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)。
表1：抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S对耐药菌的最小抑菌浓度MIC(μg/mL)表
Figure BDA0002946278140000051
由表1结果可见，相比于出发抗菌肽，改造后的抗菌肽AP2S对耐药菌具有更好的抗菌效果。
实施例2：抗菌肽AP2S不同条件下的抑菌活性
1、高温条件下的抑菌活性
将抗菌肽AP2S分别于100℃、80℃、60℃、50℃条件下分别处理10min后，按照实施例1的方法检测，检测不同处理条件下，以及未处理的抗菌肽AP2S对大肠杆菌577株抗性的变化。
结果表明，相比于未处理组，抗菌肽AP2S在80℃处理10min后对大肠杆菌577株的抗菌活性并没有明显的降低(表2)，表明本发明的抗菌肽AP2S具有一定的耐热性。
表2：抗菌肽AP2S在不同温度处理后的抑菌活性
Figure BDA0002946278140000061
2、抗菌肽AP2S在不同pH条件下的抑菌活性
配制pH值分别为1-12的PBS缓冲液，取20μL抗菌肽溶液，分别加入等量的不同pH值缓冲液，以不加抗菌肽的不同pH值缓冲液为对照，以E.coli 577株作为受试菌进行抑菌实验。
结果显示抗菌肽AP2S在实验的pH值范围内都均具有活性，在中性条件下(PH值7.0-7.4)时活性最好。
实施例3：抗菌肽AP2S-ORI和抗菌肽AP2S的毒性及溶血性分析
1、抗菌肽的细胞毒性
以RAW264.7小鼠巨噬细胞细胞系为实验材料，通过MTT比色法测定细胞在抗菌肽AP2S-ORI和AP2S作用下的存活率，实验结果表明在实验浓度范围内，抗菌肽AP2S-ORI和AP2S对RAW264.7小鼠巨噬细胞未出现明显的毒害损伤作用，表明抗菌肽AP2S对哺乳动物正常组织细胞不具有显著毒性。
2、抗菌肽的溶血性研究
以人类血红细胞为实验材料，检测抗菌肽AP2S-ORI和AP2S对哺乳动物细胞的溶血作用。实验结果表明抗菌肽AP2S-OR和AP2S在浓度高达30M仍不具有显著的溶血作用。
实施例4：制备抗菌的制品
所提供的抗菌肽AP2S能够负载在水凝胶上制成抗菌、抑菌制品，用于辅助伤口愈合。
其中一种具体的水凝胶，是由醛基化的透明质酸和羧甲基壳聚糖制备的；其中羧甲基壳聚糖与醛基化的透明质酸的摩尔比为2:1～8:1，
其一种具体制备方法如下：
将羧甲基壳聚糖NOCC和醛基化透明质酸A-HA分别按30mg/mL的浓度溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中。NOCC亲水性极好，在粉末溶解过程中应避免其聚集成团。通过将NOCC和A-HA溶液以2:1、3:1、4:1、6:1、8:1的摩尔比混合，搅拌，避免气泡的产生，影响水凝胶的致密程度，缓慢搅拌促进其原位交联形成水凝胶。
制备的水凝胶颜色透明，有一定的粘性，流动性高，通透性好，状态稳定，具有可注射性和自愈合性，在水中不易降解。制备的水凝胶可以通过26G针头连续注入，并且在注入后保持其完整性(图2)。
为了评估其自修复性能。将2块不同颜色的NOCC/A-HA水凝胶样品切成两个半圆形的碎片。室温下两块水凝胶的整合时间为5分钟，整合的水凝胶取下并可支撑其自身的重量(图3)。
制备的水凝胶的三维网状结构可为药物和各种生物活性物质等提供较大的表面积，做为细胞支架材料，为细胞生长提供三维空间结构，且较大的孔隙尺寸可为细胞提供足够的传输营养的通道。
将本发明的抗菌肽AP2S负载在水凝胶上，其制备方法如下：
将抗菌肽AP2S的水溶液与10-40mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液混合，使混合液中抗菌肽AP2S的浓度为20-200mg/mL，再加入醛基化的透明质酸，在室温下混合凝胶化。
制备出的负载抗菌肽AP2S的水凝胶可用于辅助治疗各种开放性伤口，避免伤口发生感染，并有效促进伤口愈合。
序列表
<110> 青岛森盛生物医药科技有限公司
<120> 一种鱼源抗菌肽
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Lys Val Arg Arg Gln Val Leu Ile Lys Gly Asn Lys Lys Thr Arg
1 5 10 15
Gln Ala Phe Ile Lys Lys
20

Claims (8)

1.一种抗菌肽，其特征在于，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.权利要求1所述的抗菌肽在制备抗菌、抑菌制品中的应用。
3.一种水凝胶敷料，其特征在于，所述的水凝胶敷料是在水凝胶上负载权利要求1所述的抗菌肽。
4.如权利要求3所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述的水凝胶由醛基化的透明质酸和羧甲基壳聚糖制备。
5.如权利要求4所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述的醛基化的透明质酸由透明质酸溶液加入高碘酸钠溶液，在黑暗条件下反应制备而成。
6.如权利要求3所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述的水凝胶敷料的制备方法，是将权利要求1所述的抗菌肽的水溶液与羧甲基壳聚糖溶液混合，再加入醛基化的透明质酸，在室温下混合凝胶化。
7.权利要求3-6任一所述水凝胶敷料在制备用于辅助治疗开放性伤口的制品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的开放性伤口为慢性难愈合伤口或运动损伤伤口。
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