CN115724914B - 抗菌肽hlfp-5及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗菌肽HLFP‑5及其应用。HLFP‑5是由天然氨基酸构成的具有强稳定性抗菌肽，具备广谱抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌和阳性菌都具备抗菌效果，并且在模拟体内盐环境存在的条件下保留了抗菌活性，也能够抵抗高浓度蛋白酶的裂解，具有极强的稳定性，具有非常好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种新型的抗菌肽HLFP-5及其应用。
背景技术
近年来，随着我国医疗技术的发展和医药卫生条件的改善，各种传染性疾病在一定程度上均得到有效控制。然而抗生素的频繁使用进一步加剧了细菌耐药性发展的进程。寻找一种合适的抗生素替代物变的更为迫切。抗菌肽由于其具备独特的膜破坏机制，使细菌产生耐药性的几率大大降低，因此抗菌肽成为抗生素的理想替代物之一。然而抗菌肽在临床上的应用常受到稳定性差的制约。
具体而言，抗菌肽发挥抗菌活性主要依靠其所包含的正电荷氨基酸与菌膜之间的负电荷成分发挥静电作用，但体内环境中存在的盐离子通常会影响抗菌肽和菌膜之间的静电作用，从而拮抗抗菌肽的抗菌活性。此外，体内存在的蛋白酶也会影响抗菌肽的抗菌效果。例如胰蛋白酶会特异性识别并切割序列中的正电荷氨基酸，如赖氨酸、精氨酸。糜蛋白酶会特异性识别并切割序列中的疏水性氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸等。目前公认的提高抗菌肽蛋白酶稳定性的方法包括在分子内形成二硫键以设计环肽、D型氨基酸取代、脂质修饰等。然而，这些策略都涉及化学修饰方法，导致肽链必须使用化学合成的方式获得，无法使用细菌融合表达系统获得，大大增加了抗菌肽的合成成本。因此，需借助于天然氨基酸的合理排列以最大限度地保证肽的盐离子稳定性和蛋白酶稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的抗菌肽HLFP-5及其应用。
本发明基于对抗菌肽结构与功能关系和杀菌机制的理解，设计一种抗菌肽以解决稳定性不足的弊端。主要包括以下设计原则：1)选择芳香族氨基酸(苯丙氨酸)作为肽链的疏水核心，使肽能够深入而牢固地插入细菌膜中，有利于诱导膜扰动并最大限度的确保肽具备强的盐稳定性。2)将脯氨酸(Pro)置于苯丙氨酸的C端以防止胰凝乳蛋白酶裂解。3)在芳香族氨基酸的N末端放置一个脂肪族疏水性氨基酸(亮氨酸)，以进一步增加肽链的疏水性和极性面的深度。4)将组氨酸(His)置于亮氨酸的N端，以防止胃蛋白酶对芳香族氨基酸苯丙氨酸的切割。5)将由HLFP构成的疏水核心重复五次，满足抗菌所需疏水性的基本要求。6)赖氨酸(Lys)作为阳离子氨基酸位于序列的两端，为序列提供正电荷，为肽与细菌的相互作用提供必要的驱动力。同时，在每个Lys的C末端放置一个Pro，以防止被胰蛋白酶切割。在这里没有采用精氨酸作为阳离子氨基酸，因为即使在Pro的保护下，赖氨酸的蛋白酶稳定性依然强于精氨酸。序列中一共加入6个赖氨酸，以满足基本的正电荷要求，确保肽能够与菌膜充分发生。7)肽的C末端被胺化以进一步增强抗菌活性并提高稳定性。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种抗菌肽HLFP-5，氨基酸序列如下：KPKPKPHLFPHLFPHLFPHLFPHLFPKPKPKP-NH2(SEQ ID NO:1)。
第二方面，本发明提供所述抗菌肽HLFP-5的以下任一应用：
1)用于制备广谱抗菌剂；
2)用于制备防腐剂；
3)用于制备抗菌药物或组合物。
所述菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
优选地，所述菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、柠檬酸杆菌(Citrobacterrodentium)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)等。
第三方面，本发明提供一种广谱抗菌剂，活性成分为抗菌肽HLFP-5。所述抗菌剂耐胃肠道环境，耐高盐，耐蛋白酶裂解。可以实现在酶和盐离子存在下对细菌的杀灭作用。
本发明提供的抗菌肽HLFP-5，具备广谱抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌和阳性菌都具备抗菌效果，并且在模拟体内盐环境存在的条件下保留了抗菌活性，也能够抵抗高浓度蛋白酶的裂解，具有非常好的应用前景。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中抗菌肽HLFP-5的质谱图。
图2为本发明较佳实施例中抗菌肽HLFP-5的液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1固相化学合成法合成抗菌肽HLFP-5
抗菌肽HLFP-5的氨基酸序列为：KPKPKPHLFPHLFPHLFPHLFPHLFPKPKPKP-NH2。合成方法如下：
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干。
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(图1)与理论分子量基本一致，另外，HLFP-5的反向高效液相色谱显示其纯度大于95％(图2)。
实施例2强稳定性抗菌肽HLFP-5的抗菌活性的测定
利用微量稀释法测定肽最小抑菌浓度。用含有0.01％乙酸和0.2％胎牛血清白蛋白作为稀释液加入96孔板中，使用倍比稀释法依次配置系列梯度的肽溶液，使每个孔中的溶液体积为50μL。然后分别添加50μL的待测菌液(约105CFU/mL)于各孔中，培养基为MHB。于37℃恒温培养18-24小时，然后用酶标仪测定波长492nm处的光密度值，确定肽HLFP-5对细菌的最小抑菌浓度。测定值小于0.1被认为细菌被抑制。每次测试两个平行，重复三次。
表1肽HLFP-5对细菌的抑菌活性(μM)
表1结果表明抗菌肽HLFP-5对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌具有广谱抗菌活性。
实施例3抗菌肽HLFP-5的蛋白酶稳定性测定
将不同浓度的蛋白酶与浓度为2560μM的抗菌肽HLFP-5在37℃条件下混合孵育8h，然后采用实施例2中所述的微量稀释法测定肽对大肠杆菌25922的最低抑菌浓度。对照组为不含有蛋白酶的最小抑菌浓度测试结果。
表2抗菌肽HLFP-5的蛋白酶稳定性
由表2可以看出，抗菌肽HLFP-5能抵抗8mg/mL的胃蛋白酶和胰蛋白酶，2mg/mL的糜蛋白酶的裂解作用，在经过8小时的孵育后依然保持原有的抗菌活性。
实施例4抗菌肽HLFP-5的盐离子稳定性测定
在150mM NaCl,4.5mM KCl,6μM NH4Cl,8μM ZnCl2,1mM MgCl2,and 4μMFeCl3存在下测定肽的抗菌活性，具体操作方法同实施例3。对照组为不含有盐离子的最小抑菌浓度测定结果。
表3抗菌肽HLFP-5的盐离子稳定性
由表3可以看出，在生理盐浓度下，肽HLFP-5基本保留了原有的抗菌活性，只在生理浓度的NaCl和MgCl2存在下活性轻微下降，这表明肽HLFP-5具备强的盐稳定性。
综上，由天然氨基酸构成的肽HLFP-5具有广谱抗菌活性，强盐稳定性和蛋白酶稳定性，临床应用前景广阔。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.抗菌肽HLFP-5，其特征在于，氨基酸序列如下：KPKPKPHLFPHLFPHLFPHLFPHLFPKPKPKP-NH2。
2.权利要求1所述抗菌肽HLFP-5在制备广谱抗菌剂中的应用，所述菌选自大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。
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