CN115819513A - 一种月桂酸修饰抗酶解肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种月桂酸修饰的抗酶解肽及其制备方法和应用，其氨基酸序列如序列表No.1所示，分子式如式(I)所示：

选择猪胃肠道内常见的胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶作为抵抗目标，利用脯氨酸对正电荷氨基酸残基进行保护来构建亲水带电核心，得到(RP)₇序列结构单元，将月桂酸置于短肽序列N端，避免胃蛋白酶和糜蛋白酶的切割作用，同时赋予其较高的盐离子稳定性；本发明还公开了该月桂酸修饰抗酶解肽C₁₂RP7在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。本发明具有较强的抗酶解能力，且细胞毒性相对较低，为抗菌肽成为抗生素替代物提供了借鉴。

Description

一种月桂酸修饰抗酶解肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种月桂酸修饰抗酶解肽及其制备方法和应用。

背景技术

饲用抗生素用于动物生产曾大幅度推动了畜牧养殖工业化的进程，但因其滥用所引发的细菌耐药性危机以及严重的畜产品药物残留已成为全社会关注的食品安全和公共安全问题。2019年7月中国农业农村部更是明确发文，要求自2020年起全面禁止在饲料中添加抗生素类药物。因此，开发新型、绿色的饲用抗生素替代技术，对于减少仔猪腹泻，提高养猪业生产效益无疑具有重大的意义。宿主阳离子抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)，也被称为宿主防御肽，是先天免疫系统的重要组成部分，相比于传统抗生素，天然抗菌肽不仅具有杀菌速率快、抗菌谱广、不易产生耐药性的优点，其中大多数还具备免疫调节能力，如趋化免疫细胞，增强白细胞和单核细胞的活化及分化，抑制过度炎症反应等。然而大多数天然抗菌肽抗菌活性较低，部分还存在系统性毒性，作用过程中易被Na⁺、Mg²⁺或Ca²⁺等盐离子所拮抗。抗菌肽对蛋白酶敏感和生产成本高的缺点更是限制了其在实际生产中的应用。因此，如何高效低成本的解决饲用抗菌肽的应用难题成为了当前抗菌肽研究的焦点。

脂肪酸酰化是多种真核蛋白中常见的翻译后修饰，在蛋白质分选、细胞内转运和膜内微观定位中起到非常重要的作用。脂肪酸具有较高的疏水性，附着于蛋白质或短肽结构表面会增加蛋白质或短肽的疏水值以及与细胞膜的亲和力。受此启发，将脂肪酸链引入抗菌肽结构中可以有效调节抗菌肽的抗菌活性，构建全新的脂肪酸修饰抗菌肽(又名脂酰肽)。脂肪酸是细胞膜的重要组成，所以脂肪酸链的存在可以大幅度提高脂酰肽与细菌细胞膜的亲和力，进而降低盐离子的屏蔽作用。因此与非脂酰化母肽相比，脂酰化衍生肽拥有更高的盐离子稳定性。

然而，由于大部分脂酰肽都富含阳离子和疏水性氨基酸，使其成为蛋白酶水解的优异底物。有研究发现，虽然蛋白酶的酶切位点不尽相同，但是这些特异性酶切位点都会受到氨基酸排布的影响，例如，胰蛋白酶优先切割脂酰肽的Arg和Lys，且对脂酰肽的Arg的特异性更高，但是当Pro处于该位置时可阻碍胰蛋白酶对Arg和Lys的切割作用。因此，理论上氨基酸的合理排布可以大幅度增强脂酰肽的蛋白酶稳定性。但根据之前的研究发现，该策略的有效性高度依赖氨基酸在脂酰肽序列中的精确定位，在提高脂酰肽蛋白酶稳定性的同时，很可能会破坏原肽的结构参数平衡，进而降低原肽的抗菌活性，增加其细胞毒性。因此该策略的成功实施还需进一步研究探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种月桂酸修饰抗酶解肽C₁₂RP7，对猪胃肠道内常见的胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶均具有较强的抵抗能力，且细胞毒性相对较低,解决了传统抗菌肽抗菌活性低、盐离子稳定性差和易被胃肠道中蛋白酶降解的问题。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种经过月桂酸修饰的抗酶解肽C₁₂RP7，其氨基酸序列如SEQ No.1所示，分子式如式(I)所示：

本发明的另一目的是提供一种月桂酸修饰抗酶解肽C₁₂RP7的制备方法，步骤如下：

(1)选择猪胃肠道内常见的胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶作为抵抗目标，利用脯氨酸对正电荷氨基酸残基进行保护来构建亲水带电核心，抵抗胰蛋白酶的切割作用，得到(RP)_n序列结构单元，其中，n＝7；将月桂酸置于肽序列N端，形成具有疏水相互作用的疏水尾，并以此作为脂酰肽的疏水活性中心，避免胃蛋白酶和糜蛋白酶的切割作用，同时赋予其较高的盐离子稳定性；将其C端酰胺化提高正电荷数，得到氨基酸序列如SEQ No.1所示；

(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽；

(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备。

本发明的另一目的是提供如上所述的一种月桂酸修饰抗酶解肽C₁₂RP7在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果及优点：对得到的抗酶解肽C₁₂RP7进行生物学活性、蛋白酶抗性和机制检测，发现抗酶解肽C₁₂RP7对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌菌种有明显的抑制作用，平均抗菌活性达到2.90μM。同时，C₁₂RP7的溶血活性和细胞毒性较低，细胞选择性指数高达88.3；最重要的是，C₁₂RP7对人工模拟肠胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液具有很高的抵抗力，表明C₁₂RP7具有较高的体内应用潜力。机制研究发现，C₁₂RP7对细菌细胞膜具有典型的破坏作用，可以有效降低细菌耐药性的产生。因此，综合看来，C₁₂RP7是一种具有较高临床应用价值的抗酶解肽。

附图说明

图1为抗酶解肽C₁₂RP7的质谱图；

图2为抗酶解肽C₁₂RP7的色谱图；

图3为抗酶解肽C₁₂RP7溶血活性的测定图；

图4为抗酶解肽C₁₂RP7细胞毒性的测定图；

图5为抗酶解肽C₁₂RP7的杀菌动力曲线图；

图6为经蛋白酶处理后的C₁₂RP7 Tricine-SDS-PAGE图；

图7C₁₂RP7对大肠杆菌E.coli ATCC 25922细胞外膜的透化作用图；

图8C₁₂RP7对大肠杆菌E.coli ATCC 25922质膜电势影响；

图9为经C₁₂RP7处理后的E.coli 25922的SEM图像；

图10为经C₁₂RP7处理后的E.coli 25922的TEM图像。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

根据蛋白酶酶切位点理论和先前的研究结果，利用脯氨酸对正电荷氨基酸残基进行保护来构建亲水带电核心，抵抗胰蛋白酶的切割作用，得到(RP)_n序列结构单元，其中，n＝7。舍弃常用的疏水性氨基酸，将月桂酸置于短肽序列N端，形成具有疏水相互作用的疏水尾，并以此作为脂酰肽的疏水活性中心；将其C端酰胺化以提高正电荷数，所获得的多肽命名为抗酶解肽C₁₂RP7。抗酶解肽C₁₂RP7的氨基酸序列如表1所示。

表1抗酶解肽C₁₂RP7的氨基酸序列

实施例2

固相化学合成法合成抗酶解肽C₁₂RP7：

1、多肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，最后将十二烷酸的羧基和精氨酸的氨基酰胺化，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干。

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的多肽肽经过电喷雾质谱法分析，结果如图1、图2所示。质谱图中显示的分子量与表1中的理论分子量基本一致，多肽的纯度大于95％。

实施例3：抗酶解肽的生物学活性测定

1、抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用倍比稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。检测结果见表2。

表2抗酶解肽C₁₂RP7的抑菌活性

通过表2可以看出，抗酶解肽C₁₂RP7对大部分所测试革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有显著的抑菌活性，表明抗酶解肽C₁₂RP7具有成为新一代抗菌药物的潜力。

2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；lh后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见图3及表3。

表3抗酶解肽C₁₂RP7的溶血活性测定

通过图3可以看出，抗酶解肽C₁₂RP7在检测范围内对血细胞的破坏率均小于10％，说明抗酶解肽C₁₂RP7溶血活性较低。

综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过选择性指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出，抗酶解肽C₁₂RP7的选择性指数高达88.36，说明设计得到的抗酶解肽C₁₂RP7具有成为抗生素替代品的潜力。

3、细胞毒性测定：将冻存于液氮中的细胞复苏后接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的培养基中，在37℃、5％CO₂条件下传代培养。将培养好的细胞用0.25％胰酶消化，用培养基将其调整至2～4×10⁵cells/mL。将50μL细胞悬液与50μL不同浓度的多肽混合于96孔板中，在37℃、5％CO₂条件下孵育24h，随后每孔加入25μL MTT(5mg/mL)，继续孵育4h。孵育结束后，弃去上清，用100μL DMSO溶解孔底结晶，用酶标仪在570nm处测定每孔吸光度值。培养基孔作为空白对照。检测结果见图4。

从图4可以看出，经过抗酶解肽C₁₂RP7处理后，除了RAW264.7在高浓度下具有一定的毒性外，其他细胞系的存活率均在70％以上，说明抗酶解肽C₁₂RP7细胞毒性较低，具有成为抗生素替代品的潜力。

4、杀菌动力学测定：(1)菌液准备：细菌：取冻存于-20℃的菌种划线接种于MHA固体培养基，37℃过夜培养。随后挑单菌落接种于MHB中，220rpm，37℃培养至对数生长期，用PBS调整其浓度至OD_600nm＝0.1，最后用PBS进一步稀释1000倍至0.5-1×10⁵CFU/mL。(2)杀菌动力曲线测定：将菌液与1×MIC浓度抗菌肽混合，于不同时间点(0、15s、30s、45s、60s、3min、5min、10min、15min、30min、45min、60min)取样50μL倍比稀释，取20μL点板于相应的固体培养基进行培养，随后计算每个时间点细菌数，绘制曲线。检测结果见图5。

从图5可以看出，抗酶解肽C₁₂RP7在1×MIC浓度下，1min内就杀灭了100％的大肠杆菌菌体细胞，展现出极快的杀菌速率。

5、蛋白酶稳定性测定

取适量体积的抗酶解肽C₁₂RP7母液(2.56mM)，真空干燥后加入等体积模拟人胃肠液或10mg/mL糜蛋白酶溶液，37℃条件下孵育6h后，超声震荡，取出适量体积样品直接检测其对待测菌株MIC值的变化。剩余样品100℃水浴加热30min，13000×g离心30min后取上清，利用SDS-PAGE蛋白胶检测经模拟人胃肠液和10mg/mL糜蛋白酶溶液处理后的C₁₂RP7的留存情况。测试结果见表4和图8。

表4蛋白酶处理后的抗酶解肽C₁₂RP7对E.coli 25922的最小抑菌浓度

^a人工模拟胰液配方：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使其溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合，加水稀释至1000mL.

^b糜蛋白液配方：10mg/mL

^c人工模拟胃液配方：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000mL。

通过表4可以看出，人工模拟胰胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液对抗酶解肽C₁₂RP7的抑菌活性均没有明显影响；从图6可以看出，经蛋白酶处理后的抗酶解肽C₁₂RP7拥有与对照组相似的蛋白条带，说明抗酶解肽C₁₂RP7可以抵抗人工模拟胰胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液对其的切割作用。以上结果表明，全新设计的抗酶解肽C₁₂RP7具有优异的抵抗高浓度蛋白酶水解的能力。

实施例4：抗菌肽的抑菌机理

1、细胞外膜通透性试验：本试验采用1-N-phenylnaphthylamine(NPN)摄入试验来检测多肽对待测菌株细胞壁的穿透性。具体步骤如下：(1)菌液准备：将处于对数生长期的菌离心(5000×g，5min)收集，用5mM HEPES缓冲液(pH＝7.2，含5mM葡萄糖)冲洗三遍后，重悬至OD_600nm＝0.4(大肠杆菌)或OD_600nm＝0.2(金黄色葡萄球菌)，加入终浓度为10μM NPN，室温条件下避光孵育30min。(2)样品测定：将等体积菌液与不同浓度的多肽混合于黑色96孔板中，使用荧光分光光度计在激发波长350nm、发射波长420nm条件下检测样品荧光强度。检测结果见图7。

从图7可以看出，抗酶解肽C₁₂RP7在1～64μM时对大肠杆菌细胞外膜的破坏作用呈剂量依赖效应，肽浓度越高，荧光强度越高，说明其对细胞外膜破坏程度越高。。

2、细胞质去极化性试验：本试验采用膜电势敏感染料DiSC₃-5来检测抗菌肽对细胞质膜电势的影响。具体步骤如下：(1)菌体准备：将处于对数生长期的菌离心(5000×g，5min)收集，用5mM HEPES缓冲液(pH＝7.2，含20mM葡萄糖)冲洗三遍后，重悬至OD_600nm＝0.05，加入终浓度为0.4μM DiSC₃-5，室温条件下避光孵育1.5h。再加入终浓度为100mM K⁺，继续孵育30min。(2)向1cm石英比色皿中加入2mL准备好的菌液，在622nm激发光波长、670nm发射光波长条件下，使用F-4500荧光分光光度计检测菌液基础荧光值。(3)再向菌液中加入不同浓度的待测抗菌肽，记录荧光强度变化。检测结果见图8。

从图8可以看出，抗酶解肽C₁₂RP7对大肠杆菌细胞质膜的去极化作用呈剂量和时间依赖效应。C₁₂RP7可以快速引起荧光强度的上升，说明抗酶解肽C₁₂RP7可以通过破坏革兰氏阴性菌的细胞质膜电势平衡或形成孔洞达到杀灭细菌的效果。

3、扫描电镜：应用扫描电子显微镜来检测经过抗酶解肽C₁₂RP7处理后菌体表面的变化。具体步骤如下：(1)菌体准备：将处于对数生长期的菌体离心收集，PBS冲洗三遍后重悬至OD_600nm＝0.05。(2)抗菌肽处理：将待测抗菌肽加入菌液中，使其最终浓度达到1×MIC，37℃条件下孵育1h，以未处理菌液作为对照。(3)样品固定：将孵育后的菌液离心收集菌体细胞，PBS冲洗三遍，向菌体沉淀中加入500μL 2.5％戊二醛，重悬菌体，4℃固定过夜。(4)梯度脱水：将固定完毕的菌体离心收集沉淀，PBS冲洗三遍后除去固定液，随后分别用50％、70％、90％和100％乙醇溶液将菌体按梯度脱水，每次10min，再用100％乙醇脱水15min。(4)置换：将菌体用乙醇和叔丁醇(1:1，v/v)混合溶液置换15min，最后换成纯叔丁醇，置于-20℃。(5)干燥和镀膜：使用冷冻干燥机对样品进行干燥，并将样品涂布于导电胶布上，最后用离子溅射仪在样品表面镀一层金属膜。(6)样品观察：用场发式扫描电镜观察菌体表面变化情况。

结果如图9所示，与对照组相比，经抗酶解肽C₁₂RP7处理后的大肠杆菌细胞表面出现凹陷，部分细菌膜表面出现破损或断裂。

4、透射电镜分析：应用透射电子显微镜观察经过抗酶解肽C₁₂RP7处理后菌体结构变化。挑取大肠杆菌E.coli 25922单菌落在MHB培养基中培养过夜，并转移至新的MHB中生长到对数中期。然后将上述细菌溶液离心并重悬于磷酸缓冲液中至终浓度为OD_600nm＝0.2。加入抗酶解肽C₁₂RP7母肽，使其终浓度为MIC值。室温孵育2h后离心去上清，将菌体沉淀用1％锇酸固定液固定2h。随后将固定完毕的菌体离心收集沉淀，PBS冲洗三遍后除去固定液，随后分别用50％、70％、90％和100％乙醇溶液将菌体按梯度脱水，每次8min，再用100％乙醇脱水10min，用乙醇和丙酮(1:1，v/v)混合溶液置换10min，最后换成纯丙酮置换10min。置换完成后，离心收集菌体沉淀，加入丙酮和树脂(1:1，v/v)包埋液包埋30min，然后换成100％纯树脂，包埋过夜。样品成块后用超薄切片机切片，经过醋酸铀-枸橼酸铅双染后上机观察。结果见图10。

如图所示，与对照组相比，经抗酶解肽C₁₂RP7处理后的大肠杆菌细胞膜表面出现深度凹陷，这与扫描电镜观察结果一致，细胞内部细胞质分布稀疏，出现固缩现象，说明细菌开始凋亡。

以上结果显示，所设计的抗酶解肽C₁₂RP7不仅拥有优异的抗菌活性、低毒性和高细胞选择性，对人工模拟胰胃液也表现出了极强的抵抗力，表明抗酶解肽C₁₂RP7具有较高的临床应用潜力，具有较高的替代抗生素的潜力。

Claims (3)

1.一种经过月桂酸修饰的抗酶解肽C₁₂RP7，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ No.1所示，分子式如式(I)所示：

2.根据权利要求1所述的一种月桂酸修饰抗酶解肽C₁₂RP7的制备方法，其特征在于，方法如下：

(1)选择猪胃肠道内常见的胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶作为抵抗目标，利用脯氨酸对正电荷氨基酸残基进行保护来构建亲水带电核心，抵抗胰蛋白酶的切割作用，得到(RP)_n序列结构单元，其中，n＝7；将月桂酸置于肽序列N端，形成具有疏水相互作用的疏水尾，并以此作为脂酰肽的疏水活性中心，避免胃蛋白酶和糜蛋白酶的切割作用，同时赋予其较高的盐离子稳定性；将其C端酰胺化，得到氨基酸序列如SEQ No.1所示；

(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽；

(3)经过反相高效液相色谱纯化及质谱鉴定后，完成该多肽的制备，再进行体外抗菌活性、溶血活性和细胞毒性、抗酶解能力及作用机制的检测，最后将所述的多肽命名为月桂酸修饰抗酶解肽C₁₂RP7。

3.根据权利要求1所述的一种月桂酸修饰抗酶解肽C₁₂RP7在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。

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