CN109022395A - 一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法 - Google Patents

一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纯化固定化重组α‑淀粉酶的方法，构建α‑淀粉酶‑AcmA融合蛋白重组表达载体，α‑淀粉酶与AcmA锚定区之间添加柔性蛋白Linker，诱导表达后利用GEM(革兰氏阳性基质)进行纯化固定化。该方法能够将重组α‑淀粉酶的纯化与固定化结合，减少纯化固定化过程中的步骤，通过该方法固定化的酶，具有很好的酶活和蛋白回收率，同时在长时间保存中能够维持酶活。这种方法能够简化纯化和固定化操作，降低酶活损失。

Description

一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法
技术领域
本发明涉及一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法。
背景技术
酶的固定化对于酶的应用具有重要意义，通过固定化，可以使昂贵的酶得到回收利用，同时能够避免在反应体系中引入新的蛋白杂质。酶的固定化被广泛应用于工业催化、发酵、食品等领域。用于固定化的酶可以利用产酶菌株发酵，从天然产物中分离纯化，也可以通过重组表达来得到。重组表达可以提高酶的产量，通过添加适当标签，可以进行亲和层析等方法进行纯化。这些方法需要多步进行，同时也需要一些化学试剂如硫酸铵、咪唑等。因此这些方法存在着周期长、酶活损失等缺点。
乳酸乳球菌是一种安全级别(GRAS)的菌。乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的C端的蛋白锚定域可以特异的结合到乳酸乳球菌的细胞壁上，利用这个特性，通过酸煮沸手段去除乳酸乳球菌中大部分蛋白和DNA，得到了无生命的革兰氏阳性基质(Gram-positiveenhancer matrix particles，GEM)。将蛋白与AcmA的重组融合，其可以特异的结合到GEM上。GEM锚定AcmA融合蛋白具有以下特点：具有良好的生物安全性、具有良好的机械性能和具有良好的蛋白特异结合能力。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，克服现有技术中酶的固定化周期长、酶活损失等问题。
本发明的技术方案是：一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，所描述方法步骤如下：
1)构建α-淀粉酶与AcmA的融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；
2)利用IPTG进行诱导表达；
3)制备GEM；
4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；
5)测定GEM固定化α-淀粉酶在不同温度及pH下的酶活及蛋白含量；
6)测定GEM固定化α-淀粉酶的回收效率；
7)测定GEM固定化α-淀粉酶的储藏稳定性；
8)GEM材料的回收。
步骤1)以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板，扩增得到AcmA(GenBank:ADJ59253.1)锚定区片段，连接到pET28a上得到锚定质粒pET28a-AcmA，以解淀粉芽孢杆菌BH072基因组为模板，并添加柔性Linker，扩增得到α-淀粉酶(GenBank:AJE77362.1)的基因片段，连接到质粒pET28a-AcmA上，得到重组表达质粒pET28a-α-amylase-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。
步骤2)划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.5-0.8时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.1mM-1mM，诱导温度选择为25℃-37℃，诱导时间为12小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。
步骤3)制备GEM是指利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分钟，8000rpm离心收集沉淀，利用PBS充分洗涤，得到GEM。
步骤4)4000rpm离心收集步骤2)诱导后的菌体，利用预冷的PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于预冷的PBS中，超声破碎细胞，2秒超声破碎，4秒停顿，超声时间为20分钟，8000rmp离心20分钟分离，取上清与步骤3)制备的GEM混匀，磁力搅拌进行结合，结合时间为30-50分钟，4000rmp离心分离，用预冷的PBS充分洗涤沉淀。
步骤5)是指测定固定有α-淀粉酶的GEM在不同pH2、4、6、8、10下与1％淀粉溶液进行反应，测定酶活和残留蛋白浓度；固定有α-淀粉酶的GEM在不同温度：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下与1％淀粉溶液进行反应，测定酶活和残留蛋白浓度；每个反应重复三次。
步骤6)是指将固定有α-淀粉酶的GEM重悬于1％的淀粉溶液，在60℃下反应30分钟，4000rmp离心分离，充分洗涤GEM，将这一步操作定为一个循环反应，测定酶活和蛋白含量，然后进行下一个循环；重复三次。
步骤7)是指将固定有α-淀粉酶的GEM置于4℃进行保存，取不同时间点测定酶活和蛋白含量残留；重复三次。
步骤8)是指将固定有钝化α-淀粉酶的GEM利用0.1-0.2MHCl煮沸30分钟，4000rpm离心分离，利用PBS充分洗涤，回收GEM。
本发明的有益效果为：本发明利用制备的GEM作为一种新的纯化固定化材料，将重组α-淀粉酶的纯化与固定化结合，并研究了固定化的酶的特性、重复利用情况及储藏稳定性。经过系列实验证明，GEM能够将带有AcmA标签的重组α-淀粉酶纯化固定化，固定化后的α-淀粉酶的最适催化pH是5.0-7.0，最适催化温度是50-70℃，GEM固定化的α-淀粉酶具有良好的酶活和蛋白回收效率，GEM固定化的α-淀粉酶具有良好的储存稳定性。
附图说明
图1重组α-淀粉酶的诱导表达与纯化固定化；其中M：蛋白Marker；1、2：诱导前后全菌蛋白组成；3、4：诱导后超声破碎离心分离得到的上清和沉淀；5：制备的GEM；6：GEM纯化固定化上清中的α-淀粉酶；7：纯化固定化的残留的上清；
图2不同pH对酶活和蛋白含量的影响；其中A：不同pH对酶活和蛋白含量的影响；B：SDS-PAGE检测蛋白含量；
图3不同温度对酶活和蛋白含量的影响；其中A：不同温度对酶活和蛋白含量的影响；B：SDS-PAGE检测蛋白含量；
图4固定化α-淀粉酶的回收效率；
图5固定化α-淀粉酶的储藏稳定性；
图6GEM的回收；其中M：蛋白Marker；1：固定有钝化α-淀粉酶的GEM；2：回收的GEM；3：回收GEM重新固定α-淀粉酶。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步详细的说明。
实施例1：α-淀粉酶与AcmA的融合表达载体的构建与诱导表达
1)引物设计
根据乳酸乳球菌NZ9000的AcmA的序列，设计引物AF和AR，引物分别添加HindIII和XhoI酶切位点，并在引物AF的5’端添加6×Gly的柔性Linker；根据解淀粉芽孢杆菌BH072的α-淀粉酶的基因序列，设计引物αF和αR，引物分别添加NcoI和HindIII酶切位点。
2)载体构建
以乳酸乳球菌NZ9000的基因组为模板，利用PCR扩增得到AcmA的基因片段，双酶切后与质粒pET28a连接，测序正确后得到质粒pET28a-AcmA；以解淀粉芽孢杆菌BH072的基因组为模板，利用PCR扩增得到α-淀粉酶的基因片段，双酶切后与质粒pET28a-AcmA连接，测序正确后得到质粒pET28a-α-amylase–AcmA。
构建得到的重组质粒转入大肠杆菌BL21中。
3)诱导表达
用含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基过夜培养，制备种子液，按照1-5％的接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，震荡培养3-5小时，当菌液OD600在0.5-0.8之间时，加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.1mM-1mM，诱导温度选择为25℃-37℃，诱导时间为12小时-24小时。
4)超声破碎
4000rmp离心收集菌体，利用预冷的PBS洗涤沉淀，离心，用预冷的PBS重悬细胞，超声破碎，2秒超声破碎，4秒停顿，超声时间为20分钟，8000rmp离心20分钟分离，取上清。
利用10％的SDS-PAGE测定诱导前、诱导后、超声破碎上清及沉淀的蛋白分布情况。
实施例2：GEM纯化固定化重组α-淀粉酶
1)GEM制备
利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分钟，8000rpm离心收集沉淀，利用PBS充分洗涤，得到GEM。
2)GEM纯化固定化重组α-淀粉酶
取实施例1中得到的超声上清与GEM混匀，室温下搅拌30-50分钟，4000rmp离心分离，利用PBS充分洗涤GEM以去除非特异性结合。SDS-PAGE测定纯化固定化的蛋白分布情况。
本实施例得到GEM固定化重组α-淀粉酶，重组α-淀粉酶的纯化与固定化合并为一步。利用SDS-PAGE检测发现，制备的GEM几乎不含有任何蛋白，GEM能够与超声破碎的上清中的重组重组α-淀粉酶特异性结合，而结合后剩余的上清中无可见的重组α-淀粉酶条带，证明GEM具有良好的结合能力，能够绝大部分重组α-淀粉酶纯化固定化。
实施例3：GEM固定化α-淀粉酶性能研究
1)不同pH对GEM固定化α-淀粉酶的影响
将固定有α-淀粉酶的GEM在不同pH(2、4、6、8、10)下与1％淀粉溶液进行反应，反应时间为3分钟，离心分离，测定酶活和蛋白含量，重复三次。
2)不同温度对GEM固定化α-淀粉酶的影响
固定有α-淀粉酶的GEM在不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)下与1％淀粉溶液进行反应，反应时间为3分钟，离心分离，测定酶活和残留蛋白浓度。重复三次。
3)GEM固定化α-淀粉酶的回收
将固定有α-淀粉酶的GEM重悬于1％的淀粉溶液，在60℃下反应30分钟，4000rmp离心分离，充分洗涤GEM，将这一步操作定为一个循环反应，测定酶活和蛋白含量，然后进行下一个循环。重复三次。
4)GEM固定化α-淀粉酶储藏稳定性
将固定有α-淀粉酶的GEM置于4℃进行保存，取不同时间点测定酶活和蛋白含量残留。重复三次。
本实施例获得GEM固定化重组α-淀粉酶的最适催化pH和催化温度。GEM固定化的重组α-淀粉酶的最适催化pH为5.0-7.0，其在pH4-8的范围仍内均具有较高的催化活性。GEM固定化重组α-淀粉酶的最适催化温度为50-70℃，与大多数来自芽孢杆菌的α-淀粉酶相同，该重组的α-淀粉酶属于嗜热酶。GEM固定化α-淀粉酶具有良好的酶活回收效率，经过8次重复使用，仍有超过60％的蛋白残留和37％的酶活残留。GEM固定化α-淀粉酶在4℃下具有良好的储藏稳定性，储藏32天仍具有超过75％的酶活残留和超过65％的蛋白残留。
实施例4：GEM回收
1)GEM回收
将固定有钝化α-淀粉酶的GEM利用0.1-0.2MHCl煮沸30分钟，4000rpm离心分离，利用PBS充分洗涤，回收GEM。
2)回收的GEM纯化固定化能力测定
将回收的GEM与实施例1中得到的上清混匀，室温下搅拌30-60分钟，离心分离，用PBS充分清洗。
利用10％的SDS-PAGE测定回收的GEM的蛋白分布和纯化固定化蛋白的能力。
本实施例能够将固定有钝化酶的GEM进行回收，固定的酶钝化后失去催化能力，利用制备GEM的方法重新处理，能够将固定的酶去除，得到具有重新纯化固定化重组酶能力的GEM。经验证，回收的GEM仍具有良好纯化回收效率。
尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于所描述方法步骤如下：
1)构建α-淀粉酶与AcmA的融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；
2)利用IPTG进行诱导表达；
3)制备GEM；
4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；
5)测定GEM固定化α-淀粉酶在不同温度及pH下的酶活及蛋白含量；
6)测定GEM固定化α-淀粉酶的回收效率；
7)测定GEM固定化α-淀粉酶的储藏稳定性；
8)GEM材料的回收。
2.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤1)以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板，扩增得到AcmA锚定区片段，连接到pET28a上得到锚定质粒pET28a-AcmA，以解淀粉芽孢杆菌BH072基因组为模板，并添加柔性Linker，扩增得到α-淀粉酶的基因片段，连接到质粒pET28a-AcmA上，得到重组表达质粒pET28a-α-amylase-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。
3.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤2)划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.5-0.8时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.1mM-1mM，诱导温度选择为25℃-37℃，诱导时间为12小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。
4.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤3)制备GEM是指利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分钟，8000rpm离心收集沉淀，利用PBS充分洗涤，得到GEM。
5.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤4)4000rpm离心收集步骤2)诱导后的菌体，利用预冷的PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于预冷的PBS中，超声破碎细胞，2秒超声破碎，4秒停顿，超声时间为20分钟，8000rmp离心20分钟分离，取上清与步骤3)制备的GEM混匀，磁力搅拌进行结合，结合时间为30-50分钟，4000rmp离心分离，用预冷的PBS充分洗涤沉淀。
6.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤5)是指测定固定有α-淀粉酶的GEM在不同pH2、4、6、8、10下与1％淀粉溶液进行反应，测定酶活和残留蛋白浓度；固定有α-淀粉酶的GEM在不同温度：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下与1％淀粉溶液进行反应，测定酶活和残留蛋白浓度；每个反应重复三次。
7.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤6)是指将固定有α-淀粉酶的GEM重悬于1％的淀粉溶液，在60℃下反应30分钟，4000rmp离心分离，充分洗涤GEM，将这一步操作定为一个循环反应，测定酶活和蛋白含量，然后进行下一个循环；重复三次。
8.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤7)是指将固定有α-淀粉酶的GEM置于4℃进行保存，取不同时间点测定酶活和蛋白含量残留；重复三次。
9.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤8)是指将固定有钝化α-淀粉酶的GEM利用0.1-0.2MHCl煮沸30分钟，4000rpm离心分离，利用PBS充分洗涤，回收GEM。
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